CN103981155A

CN103981155A - 靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用

Info

Publication number: CN103981155A
Application number: CN201410147652.8A
Authority: CN
Inventors: 王毅刚; 刘涛; 黄芳; 马步云; 黄盼盼; 周秀梅; 刘新垣
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Ancrowei Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: CN103981155B

Abstract

本发明公开了一种靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，包括如下步骤：1）、制备携带GP73核心启动子的pXC2-GP73质粒；2）、制备pSD55-GP73-gene质粒；3）、将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；4）、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒GD55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。

Description

靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是涉及一种肝癌特异性的启动子GP73启动子的核心序列的筛选和克隆，以及携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用。

背景技术

对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极高的热情，64.2%的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。

2001年，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士突破性的提出了癌症的靶向基因-病毒治疗（Cancer Targeting Gene-Viro Therapy）概念，综合了基因治疗和病毒治疗两者的优势，表现出良好的协同作用，大量的体内、外研究实验表明靶向基因-病毒治疗的效果要明显优于单独的基因治疗或者病毒治疗的效果。其主要是以溶瘤腺病毒为载体，将目的基因插入到病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抗癌基因也随之发生数百倍乃至千倍的复制，从而大量表达抗癌基因，克服了基因治疗中，基因转染效率低和基因拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，成为今后癌症基因治疗、病毒治疗的新趋势。

腺病毒载体具有许多独特的优点：腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大（36kb），插入大片段外源性基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞；细胞及动物实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。

利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。近年研究表明，GP73同肝癌关系密切。2010年北京协和医院的毛一雷教授用免疫沉淀法检测，率先完成了超过4000例的大样本的GP73的研究，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了75%和95%，而AFP的仅有58%及85%。2013年汤绍辉博士收集已经发表的用酶联免疫法检测GP73相关的文献，整理得到样本5279例，其中肝癌2075例，进行Meta分析，GP73诊断肝癌的敏感度和特异度分别达到了78%和84%，而AFP的仅有55%及80%。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用，在调节白细胞和造血功能中有重要作用，可以维持造血前体细胞和成熟血细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞)的存活；能够促进造血前体细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞)增殖分化，GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。GM-CSF作为目前已知功能最强大的免疫调节分子，在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景，并被广泛应用于肿瘤的免疫治疗。GM-CSF可通过以下机制参与免疫调节：(1)提高肿瘤细胞MHC分子的表达；(2)诱导树突状细胞的成熟、分化并增强抗肿瘤体液免疫；(3)上调共刺激分子CD86表达，逆转T淋巴细胞免疫耐受；(4)促进效应性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤部位浸润，杀伤肿瘤细胞。以病毒为载体携带GM-CSF基因用于癌症治疗，已经有多个进入临床试验，例如JX-594、OncoVEX、CGTG-102等，并且显现出非凡的治疗效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene的构建方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种靶向肝癌溶瘤腺病毒（肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene）的构建方法，包括如下步骤：

1）、将作为GP73核心启动子的p-19/-677质粒，用Xho I和SnaB I双酶切后，替换掉pXC2上E1A的野生型启动子，得到携带GP73核心启动子的pXC2-GP73质粒；

所述p-19/-677，其序列如SEQ ID NO：3所示（659bp）；

2）、用Xho I和Xba I双酶切pXC2-GP73得到GP73-E1A片断，与同样用Xho I和Xba I双酶切的pSD55相连，得到pSD55-GP73；当需要携带基因时，可通过PCR获得目的基因，连接到经HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13载体上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ单酶切得到完整的基因表达框，连接到同样经BglⅡ酶切的pSD55-GP73载体上，得到pSD55-GP73-gene质粒；

3）、将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

4）、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后（备注：细胞病变是指病毒在细胞内大量扩增而出现的细胞先膨胀变圆，后死亡的现象），得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。

本发明还同时提供了上述溶瘤腺病毒GD55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。

在本发明中，

本发明克隆并筛选一种新型的肝癌特异性启动子GP73的核心序列，得到具有较高启动活性的转录序列片段，通过筛选的该启动子的核心序列得到具有较高肝癌启动活性的序列。

本发明将肝癌特异性GP73启动子和缺失腺病毒E1B55kDa区域两种肿瘤靶向优势结合在起来，共同调控腺病毒，从而提供一种更安全的肿瘤双靶向腺病毒载体。

本发明提供一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene的构建方法。

本发明提供一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene在肝癌治疗中的用途。

为达到上述目的，本发明提供了一种肝癌双靶向溶瘤腺病毒载体GD55-gene，该载体具有双重肿瘤靶向性，能作为一种更好的基因－病毒治疗载体平台。

本发明筛选并克隆GP73启动子的核心序列，将其用于控制腺病毒E1A基因转录，从而提高肿瘤基因治疗的靶向性，并且删除了腺病毒的E1B55区，缺失E1B55的腺病毒不能够与正常细胞内p53蛋白结合，而在p53缺失或者突变的肿瘤细胞中能够大量复制，从而达到双靶向性消灭肿瘤的目的。

备注说明：本发明提供肝癌特异性GP73核心启动子，为以下任意一种：

p-19/-413，其序列如SEQ ID NO：1所示（395bp）；

p-19/-613，其序列如SEQ ID NO：2所示（595bp）；

p-19/-677，其序列如SEQ ID NO：3所示（659bp）；

p-19/-729，其序列如SEQ ID NO：4所示(711bp)。

上述肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法，包括如下步骤：

1）、用PCR方法，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，使用GP73特异性引物，得到PCR产物为GP73启动子全长序列p-19/-2616，用Mlu I和Hind III双酶切与同样双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-L2598质粒；

所述GP73特异性引物为p-19:(Hind III)和p-2616:(Mlu I)；

p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG，

p-2616:(Mlu I)CGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA；

2）、以pGL3-L2598为模板，用携带Mlu I和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-L711（即，p-19/-729）、pGL3-L659（即，p-19/-677）、pGL3-L595（即，p-19/-613）、pGL3-L395（即，p-19/-413）质粒；

所述pGL3-L711质粒对应引物为p-19/p-729；

所述pGL3-L659质粒对应引物为p-19/p-677；

所述pGL3-L595质粒对应引物为p-19/p-613；

所述pGL3-L395质粒对应引物为p-19/p-413；

p-413:(Mlu I)CGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA；

p-613:(Mlu I)CGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG；

p-677:(Mlu I)CGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA；

p-729:(Mlu I)TGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA。

作为本发明的肝癌特异性GP73核心启动子的筛选构建方法的改进：

所述步骤1）和步骤2）中的PCR体系均为：

PCR条件均为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。

本发明筛选得到具有肝癌特异性、高效性的启动子GP73核心启动子，采用选择性复制溶瘤腺病毒策略进行肝癌基因治疗，为了解决肝癌基因治疗中的靶向性、特异性问题，构建了GP73核心启动子调控的删除E1B55和E3区的肝癌靶向性溶瘤腺病毒GD55-gene，并进行初步体外肝癌细胞特异杀伤研究，取得了预期的对肝癌细胞的特异杀伤效果。利用本发明的重组溶瘤腺病毒，可以制备用于治疗肝癌的新型基因-病毒药物。本发明的重组溶瘤腺病毒可作为肝癌生物治疗的选择之一，为肝癌患者带来福音。

综上所述，本发明具有如下有益效果：

1、本发明克隆GP73的启动子序列，筛选得到了GP73核心启动子，该启动子具有高效的肝癌特异性；

2、本发明有机的结合了两种靶向肿瘤的方法，进一步提高了腺病毒载体的靶向性和安全性，可以有效的用于治疗肝癌；

3、本发明提供了双靶向GD55-gene溶瘤腺病毒的构建方法，该方法易于掌握；

4、本发明构建的双靶向腺病毒GD55-gene经实验证明能选择性的杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞；这种新型双靶向溶瘤腺病毒治疗，能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为GP73启动子在不同肝癌和肝正常细胞系中的转录效率。

图2为GP73启动子不同长度的片段在肝癌Huh7中的转录效率。

备注说明：Basic是一个Promego公司的商业化质粒，就是不携带启动子的阴性对照；SV40是一种猴肿瘤病毒的启动子，具有很强的启动活性，一般用作阳性参照；AFP是甲胎蛋白，一般作为肝癌的传统分子标记物，在这里作为对照相对于GP73是否具有优势。设置这3个对比的目的是为了说明在此构建的GP73启动子序列p-19/-677具有较高的肝癌特异性。

图3为体外实验对肝正常细胞QSG-7701的存活率影响实验图。

图4为体外对肝癌细胞Huh7的特异性杀伤效应图。

图5为Ad-AFP-EGFP和GD55-EGFP分别感染肝癌细胞Huh748h的荧光表达图。

图6为肿瘤双靶向性腺病毒GD55、GD55-mGM-CSF在裸鼠体内治疗肝癌细胞移植瘤的结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

实施例1、GP73和AFP基因在不同细胞系内的本底转录情况

相关引物：

GP73基因引物：

Sense：GGATGTCCTCCAGTTTCAGA；

Anti-sense：TTCCTCCACTTCCTTGTCAC

AFP基因引物：

Sense：CTTACACAAAGAAAGCCCC

Anti-sense：GTCCGATAATAATGTCAGCC

GAPDH基因引物：

Sense：ATTCCACGGCACAGTCAAGG

Anti-sense：ACATACTCAGCACCAGCATCG

用TRIZOL方法提取处于对数生长期的肝正常细胞QSG-7701和肝癌细胞SMMC-7721、Huh7、Hep3B的总RNA，逆转录成cDNA，根据AFP基因和GP73基因的引物，以GAPDH为内参通过Q-PCR得到AFP和GP73两种基因的相对表达情况。

具体如下：

注：Q-PCR反应体系和反应条件为：

将上样好的八连管放入ABI7300荧光定量PCR仪，设置Q-PCR程序，循环条件为：

仪器在60s退火延伸时，收集数据。

所得到的AFP和GP73两种基因的相对表达情况为：如图1所示GP73相对于AFP在肝正常细胞内表达量较低，在肝癌细胞Huh7和Hep3B中表达量要高于AFP；根据该相对表达情况，得出GP73的肝癌特异性要高于传统的肝癌标志蛋白AFP的结论。

综上所述，将GP73启动子替换腺病毒的野生型启动子，比AFP启动子具有相对较高的安全性和较好的杀伤性。

实施例2、新型GP73启动子在细胞内的活性评估

报告基因质粒phRL-TK购自Promega公司，TK启动子控制下表达海肾荧光素酶；萤火虫荧光素酶报告基因分析用质粒pGL3-Basic(不含启动子及增强子)、pGL3-Control(含SV40启动子)购自Promega公司。

1）相关质粒构建

先设计如下引物：

p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG

p-2616:(Mlu I)CGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA

p-413:(Mlu I)CGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA

p-613:(Mlu I)CGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG

p-677:(Mlu I)CGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA

p-729:(Mlu I)TGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA

备注说明：下划线代表酶切位点。

利用上述GP73启动子两端特异性引物p-19:(Hind III)和p-2616:(MluI)，以人肝癌细胞Huh7的总DNA基因组为模板，通过PCR方法扩增出GP73启动子，PCR体系为：

PCR条件为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。所得序列具体如p-19/-2616片段的碱基序列所示（已发表）；用限制性内切酶MluI和Hind III双酶切PCR产物和pGL3-Basic载体，然后进行连接，构建得到含有p-19/-2616片段的质粒---pGL3-L2598质粒。

以pGL3-L2598质粒为模板，用携带MluI和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR（PCR反应体系和反应条件同上）获得含有不同GP73片段长度的质粒，与Mlu I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接得到pGL3-L711（即，p-19/-729）、pGL3-L659（即，p-19/-677）、pGL3-L595（即，p-19/-613）、pGL3-L395（即，p-19/-413）质粒。

备注说明：所述p-19/-2616片段的碱基序列为：

p-19/-2616（2598bp）

tagtcccaccactctcgaaggctgaggcaggtggattgcttgagcccaggagtttgagaccagcctgggccacatgtcaaaacctcatctctacaaaaaataccaaaaaaattagctgagcatgatggcatacacctgtagtcccagttactcaggaggctgaggtgggagaatcacctgagcccaggaggttgaggctgtagtgagccatgatcacaccactgcacttctgccggggggacagagtgaaaccctgtctcaaaataaataaataaataaataaatattaaagcctttagggctgttgggatggaataaatgtattttgtatgtgagaaggatatgaactgggggtggtggggggcatagaagcagaatgctatggtttgaatgtgtgctccataaagcacgtgttgaaaactgaatctccagtgcaacagtgttgggaggtggggcccaaagggaggtgtttaggtcataaaggctccactcttataaataaattaatgccaattatagagggtttgaggctgcaagttcaatttcacatacaccctcttgcccttctgccttccaccacaggctgatgcagcaagaaggcccttgcaagatgccagcaccttgatattagacttcctagccttcagaactatgagaaatacatttcttttctttataaattactgagtctgtggaattgtgttatagcaacacaaaatggactaagacattaaggaaaggatgcttaacaggcaaaacatggatgcttccttcaaccaaccactgtagccccttgcacattgtttaatcaaaacccatccaattgaattttcagggccagcaactgattagcttttttataaggaatgtaaattatgtatatagatatatataaaactgcatcttaaaattttcaacttttgtcataaagaatctaacgaaaaggactaattcatcttcaattaaaatatagctcattcagccagctgccttagcacctagacatatggacctgttccataaagtgtttaagaatcactgagtgagtcgctaattagttgctgataaatgagagactaatggagaccctccttagaggcaaatgatatagaagttacagtccaccagtctaagaatgtaaactataccaagagagctaaaatgggcaagaaagggaatttcctgtacctgtccccgattatggttatttaagctcactagaagatcaaagtgacacaacttaagtctgcaaaaccagggctgacatctgatacagcctcagcttctgaatgctttggtctgaccctacaacagtttaacagttgcagataacaaaaatatcattttggaatatagtagaacattcctctaaaggggtcatgtatggtcagcttctaattcagctaagaggttttagctggtaaagatacgtttcctgcagttaagaagctccatgctcaggtagcaatagggtatcttgatcaccttttttaaggtgactctttgttctggttaaaatcaatttcagctgtgagcattcctttaggtgttcatgtatttacttgtttttttattgtgatttgagagaggcgcagaggaaggagtttcctttcccagacaccagagctaggaagacatgaagacatgattctaggaaaactgttctcaatcttggccgtatactgtattaggattatctgggaagctcaaaacaaacaaaaaatatcaagttcactttgaactctggaagtgggaccctggttcctaaatgctctaaaagctccccaaataattctaatggatggcaggtgctgccagagttaagaaccattgctttagaattttctagcatggtttccctgtaggtcactagttttgtggcattctctccgggaggtacggcctcatagggcttctcaaacatcagtgcgcctgagcgtcatctgaggcgctgtttcaaatgcagctgcccgggctataagatcacacccgaaggcgtccgggaatcttcactttttccgttgctagcagtggaagggtcacagaccaaacactaaggcctgagcggtgacaatcgaggcgagatgatggtcaacagggaatgcctcgtgggagaaaaaagacaattttgtgagtataagccccctaaaaacctgtttttcgttcgcttccttctctgggcagttttgacccgacgacttttataaagaaggtaacgtgagtgtggcgctgggtgcggttggctgttcgggaacattccctcggggcggaacgtgggatgggggctccccccaggtaccctttccccacagccgcttccccgctccgcgtcgctgctcaggcgccagctcccgcgtcggaaggggcgatggggtggcccgggggaaggggcaacgcccagcggcgagaactgggcgcacgctggcgttcctgctcccgccgaggggcggccaccggccggggcgcgcgcaccgtggggccgggagtccgcgcggccccggcagcccctgcctcgcttctccgcgctcgcggcgccgcctcctcccttcgcgccgccggcgctgctcgggggcggggccttgccgctgcggaggccgg

2）GP73启动子在细胞内的活性评估

将处于对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721、Huh7、Hep3B、Bel-7404和肝正常细胞QSG-7701按1×10⁴个/孔接种于96孔培养板中（培养条件为：10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone公司），于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养），分别进行如下操作：

待细胞贴壁后，用Thermo公司的R^#0531转染试剂将p-19/-2616含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK1×10^-3μg共转染细胞。培养48h后（培养条件为：10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone公司），于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养），去除培养基，用PBS洗两次，加入20μL PLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液（即，裂解后所得的液态物）转移到检测试管中，检测萤火虫荧光素酶活性，加入65μL的LARⅡ(Promega公司)反应（室温，2sec），用化学发光仪读取10sec发光光子数（RLU），然后检测海肾荧光素酶活性，加入Stop&Glo试剂(Promega公司)65μL反应（室温，2sec），用化学发光仪读取10sec发光光子数（RLU）。计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU（按照试剂说明书操作），即得相对荧光素酶活性。

如图1所示，在肝癌Huh7中GP73启动子具有较高的启动效率。

同样将处于对数生长期的肝癌Huh7细胞按1×10⁴个/孔接种于96孔培养板中，细胞贴壁后，用Thermo公司的R^#0531转染试剂将上面构建得到p-19/-2616、p-19/-729、p-19/-677、p-19/-613、p-19/-413质粒含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK1×10^-3μg共转染细胞。48h后，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μLPLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液转移到检测试管中，分别检测萤火虫荧光素酶RLU和海肾荧光素酶RLU，然后计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU即得相对荧光素酶活性。

如图2所示，在所有质粒中p-19/-677质粒在肝癌Huh7细胞中具有较高的启动活性。

实施例3、双靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建

1）相关质粒的构建(下划线为所列酶切位点序列)

p-19:(SnaB I)TAGTACGTACCGGCCTCCGCAGCGGCAAG

p-677:(Xho I)CGCTCGAGTCATCTGAGGCGCTGTTTC

GM-CSF（sense）：（Hind III）CCAAGCTTATGTGGCTGCAGAGCCTGCT

GM-CSF（Anti-sense）：（BamH I）ATGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC

mGM-CSF（sense）：（Hind III）CCCAAGCTTATGTGGCTGCAGAATTTAC

mGM-CSF（Anti-sense）：（BamH I）CGGGATCCTCATTTTTGGCCTGGTT

EGFP（sense）：（BamHI）ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

EGFP（antisense）：（HindIII）CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC

以健康人外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用GM-CSF上下游引物PCR得到GM-CSF基因，PCR反应体系为：

PCR条件为94℃×45s，55℃×30s，72℃×30s。

以小鼠外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用mGM-CSF上下游引物PCR得到mGM-CSF基因，PCR反应体系为：

PCR条件为94℃×45s，56℃×30s，72℃×30s。

以质粒pEGFP-C1为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR反应体系和所用引物具体如下；PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×1min。扩增的产物即为EGFP基因；

所用引物：EGFP（sense）：（BamH I）ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，

EGFP（antisense）：（Hind III）CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC；

反应体系：

将以上基因用BamH I和Hind III双酶切，克隆到同样双酶切的pCA13上，得到pCA13-GM-CSF、pCA13-mGM-CSF、pCA13-EGFP质粒。

备注说明：pCA13属于常规载体，购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40poly A加尾信号。

用p-19(SnaBI)和p-677(XhoI)引物以构建好的p-19/-2616质粒为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR体系为：

PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×45s。得到产物用SnaBI和XhoI双酶切，克隆到pXC2（常规载体，事先用SnaBI和XhoI双酶切）上，得到携带GP73核心启动子的pXC2-GP73质粒。

备注：以p-19/-2616质粒为模板，上述扩增所得为p-19/-677。

用Xho I和Xba I双酶切pXC2-GP73得到GP73-E1A片断，与同样用Xho I和Xba I双酶切的pSD55相连，得到pSD55-GP73。如需携带基因，要通过PCR获得目的基因，连接到用HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ酶切得到完整的基因表达框，连接到同样BglⅡ酶切的pSD55-GP73上，得到pSD55-GP73-gene质粒。

备注说明：pSD55属于pShuttle质粒添加Ad5E1区（删除了E1B55区）构建而成的，pShuttle质粒为常规载体。

将pSD55-GP73-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体。

备注说明：发表于2007年Nature Protocols上的《A protocol for rapid generation ofrecombinant adenoviruses using the AdEasy system》已经详细叙述了上述含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183。

2）双靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建

将重组构建好的GP73核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒用Pac I线性化，去磷酸酸化后，转染到人胚肾细胞293A中包装病毒。以捷瑞公司Blood Kit抽提所得的病毒DNA（即上文中所告知的通过重组所构建的在293A细胞中扩增包装的病毒）作为模板，同时以野生型病毒DNA作为对照，以上述GP73核心启动子和目的基因引物、野毒上游引物：CGCGGGAAAACTGAATAAGA野毒下游引物：ACCGCCAACATTACAGAGTC进行PCR反应。

PCR反应体系为：

PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min。对PCR产物进行检测，如PCR产物含GP73核心启动子和/或目的基因，不含E1B55野生型腺病毒DNA，病毒包装成功。重复此过程一次，得到重组正确的腺病毒（即，肝癌双靶向溶瘤腺病毒，目的溶瘤腺病毒GD55-gene）。

备注说明：重复此过程一次的目的是：防止假阳性的现象，确保正确。

肝癌双靶向溶瘤腺病毒在293A细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。具体操作方法见Microbix Biosystem Inc.的操作说明。

实施例4、肝癌双靶向溶瘤腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤能力检测

细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将肝癌细胞株Huh7及人正常肝细胞QSG-7701以5000个每孔的量铺入96孔板，贴壁后分别加入5MOI的病毒（肝癌双靶向溶瘤腺病毒），每隔24h测一次，连续四天，加入20μl的5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h后，去除孔内培养液，然后每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床缓慢振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定OD490值。细胞存活率=（病毒感染孔吸光值-调零孔吸光值）/（对照孔吸光值-调零孔吸光值）×100%。

备注说明：上述细胞培养均为37℃，5%CO₂恒温培养；培养基为10%小牛血清的DMEM培养基（DMEM购自Hyclone）。

结果如图3和图4所示，肝癌双靶向溶瘤腺病毒对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤靶向性。

备注说明：图3和图4中，“ZD55”、“GD55”、“GD55-GM-CSF”这3组都是腺病毒。ZD55是带有内源性E1A启动子且删除E1B55区的腺病毒；GD55是上述构建的用GP73启动子替换了ZD55内源性E1A启动子的腺病毒；GD55-GM-CSF是在GD55腺病毒的上面携带了GM-CSF基因的腺病毒。

实施例5、溶瘤腺病毒GD55-EGFP和AD55-EGFP在肝癌Huh7中增殖能力的比较

备注说明：GD55-EGFP为在GD55腺病毒的上面携带了EGFP基因的腺病毒；

AD55-EGFP为在AD55腺病毒的上面携带了EGFP基因的腺病毒。

将对数生长期的肝癌细胞Huh7按4×10⁴每孔的量铺于24孔板中，贴壁后每孔分别加入1MOI、5MOI、10MOI、20MOI的GD55-EGFP或AD55-EGFP，培养48h后置于荧光显微镜下观察，结果如图5所示GP73核心启动子调控的溶瘤腺病毒的EGFP荧光量明显多于AFP启动子调控的溶瘤腺病毒的EGFP荧光量。

备注说明：图5中AFP指的是感染AD55-EGFP病毒后表达EGFP绿色荧光的情况，GP73是指感染GD55-EGFP病毒后表达EGFP绿色荧光的情况。

实施例6、双靶向溶瘤腺病毒在裸鼠体内治疗肿瘤移植瘤

将4-5周龄的雌性裸鼠皮下接种肝癌细胞Huh7，每只裸鼠为3×10⁶细胞，1-2周后当肿瘤达到100～250mm³进行动物分组。治疗组为两组分别给予2×10⁹pfu/mice的GD55、GD55-mGM-CSF进行治疗，对照组分两组，第1组是磷酸缓冲液（PBS），第2组是2×10⁹pfu/mice的ZD55进行尾静脉注射，试验结果如图6所示，肝癌双靶向性溶瘤腺病毒能够抑制肿瘤的生长，延长荷瘤裸鼠生命周期。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建方法，其特征是包括如下步骤：

所述p-19/-677，其序列如SEQ ID NO：3所示；

4）、将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。

2.如权利要求1所述的溶瘤腺病毒GD55-gene在制备治疗肝癌药物中的应用。