CN101787374A - 一种基于微小rna调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途。其特征在于：在该腺病毒至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入一个微小RNA靶位点核苷酸序列：所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而正常细胞表达正常。从而使该重组腺病毒选择性地在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞内增殖，而在正常表达该微小RNA的细胞中不增殖，避免对正常细胞的损害。

Description

一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途

发明领域

本发明一般地涉及重组腺病毒载体。更具体地说，本发明涉及一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途。

背景技术

基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。过去几年里，全球基因治疗取得了巨大的进步。截止2008年9月，临床试验总数已达1432项，第一个基因治疗药物-“今又生”已由我国深圳赛百诺公司自主研发，并获准上市(参见数据库http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)。

腺病毒是目前基因治疗最常用的载体之一，全球近1/4的基因治疗临床试验方案采用腺病毒作为载体。究其原因，主要是腺病毒与其它载体相比，具有如下优势：(1)装载容量较大；(2)感染范围广，转导率较高，可有效转导分裂期和非分裂期细胞；(3)在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组，不会引起插入突变，无致癌性；(4)滴度高(可以达到10¹²VP/ml)，稳定性好，储藏和运送方便，易于进行规模化生产和运输。

人腺病毒分为A、B、C、D、E、F六个亚属共49个血清型。目前应用于基因治疗的腺病毒载体极大多数采用C亚属的2及5血清型腺病毒。随着腺病毒学、分子生物学等学科的发展，人们已完成了多个腺病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对腺病毒基因进行改造。例如，以组织特异性启动子调控E1A、E1B的表达、缺失E1A的24bp Rb蛋白的结合区、缺失E1B 55KDa、19KDa基因等。改造后的腺病毒能在目标细胞内进行选择性复制增殖，而在正常细胞内这种能力一定程度上得到减弱。

但改造后的腺病毒仍有局限性，以肿瘤基因治疗为例，首先，肿瘤形成的机制非常复杂，异质性非常强，病人与病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显差异，就端粒酶而言，某一肿瘤病人的肿瘤细胞的端粒酶阳性，这并不意味着该病人的所有肿瘤细胞端粒酶阳性，因此利用某一肿瘤机制而增殖的腺病毒不足以杀灭所有肿瘤细胞。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化、混入正常细胞以及坏死区域也可能限制腺病毒扩散。再次，某此肿瘤的腺病毒受体(如柯萨奇腺病毒受体)表达不充分限制腺病毒对其感染。第四，病人的免疫反应限制腺病毒增殖和播散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用E1b 55kDa蛋白缺失型腺病毒(ONYX-015)治疗肿瘤，其临床有效率只有15-20％(Nemunaitis et al.，2000；US 5677178；US 5801029)。

因此，基因治疗领域非常需要可以选择性地在肿瘤细胞中增殖而在正常细胞不增殖的腺病毒载体系统。从而实现更有效，更特异性地在肿瘤细胞中表达外源基因，同时可以实现正常组织的副作用减至最小的目标。

微小RNA(microRNA)是生物体内源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3’非翻译区中的靶位点核苷酸序列结合，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大。近几年的研究表明，微小RNA的表达失调与肿瘤的发生相关，多个在正常组织细胞中表达的微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或显著下调。

因而可借助微小RNA的调控机制及其在肿瘤组织与正常组织的表达差异，利用在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常的微小RNA调控腺病毒的增殖必需基因的表达，使腺病毒增殖必需基因在正常细胞中不表达，病毒无法复制与增殖，避免对正常细胞的毒性，而在肿瘤细胞中腺病毒增殖必需基因的表达不受影响，能大量增殖与复制，达到治疗目的。

发明概述

本发明提供了一种重组腺病毒载体，其特征在于：在该腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列：所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。

在一个实施方案中，所述微小RNA可以选自let-7，miR-15，miR-16，miR-18，miR-29，miR-34，miR-101，miR-127，miR-128，miR-181，miR-223中的至少一种。所述微小RNA优选选自let-7，miR-34和miR-127中的至少一种。

在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列由1个或数个相同的微小RNA靶位点序列以串联重复的方式构成。其中，微小RNA靶位点序列的单元个数为100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个，1-7个，1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。

在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列由1个或数个不同的微小RNA靶位点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。其中，不同的微小RNA靶位点序列的单元个数分别为100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或者1个。优选1-3个，1-5个，1-7个，1-9个，1-11个，1-15个，1-20个。

在一个实施方案中，所述的腺病毒增殖必需基因是腺病毒早期表达基因(E1A，E1B，E2，E4)或晚期表达基因。

在一个实施方案中，所述的腺病毒增殖必需基因可以同时受肿瘤特异激活顺式元件的调控，或被缺失与突变。

在一个实施方案中，所述重组腺病毒的基因组中可操作地连接有外源基因，所述外源基因选自抑癌基因、血管抑制基因、细胞因子基因，前药转换酶基因，细胞凋亡基因，抗体基因，疫苗基因中的至少一种。所述外源基因优选选自抑癌基因、血管抑制基因和抗体基因中的至少一种。

在一个实施方案中，本发明还涉及重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于：在所述腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。

在一个实施方案中，本发明还涉及重组病毒载体的用途：其用于使重组腺病毒选择性地在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞中增殖，而在正常表达该微小RNA的正常细胞内不增殖。

在一个实施方案中，本发明还涉及重组病毒载体的用途：其用于使重组腺病毒基因组中可操作地连接的外源基因选择性地在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞中表达，而在正常表达该微小RNA的正常细胞内不表达。本发明还涉及所述重组腺病毒载体用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。

附图简述

图1：pPE3-F11的载体图谱。主要由pBHGlox(delta)E1，3Cre改造而成，E1区缺失，可与包含腺病毒左臂的质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒；增加了来源于pBHGE3的E3区，含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attR1和attR2序列，ccdB基因，其纤毛蛋白基因被5/11 fiber替换。

图2：表示插入了不同拷贝数的微小RNA靶位点核苷酸序列构建的重组腺病毒载体在正常细胞与肿瘤细胞中的复制能力差别分析。其中的正常细胞为正常细胞株为肺成纤维细胞MRC-5与IMR-90，均为let-7阳性，肿瘤细胞为肝癌细胞株Hep GII与肺癌细胞株A549，二者均为let-7阴性。

图3：表示携带内皮抑素基因的重组腺病毒载体在正常细胞与肿瘤细胞中的复制能力差别分析。

图4：表示接受携带内皮抑素基因的重组腺病毒载体治疗的动物与对照组动物在不同时间里的移植瘤体积的差别统计分析结果。

发明详述

如上文所述，本发明涉及一种重组腺病毒载体，其特征在于：该腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而正常细胞表达正常。

微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内源，长度约为19-25个核苷酸的非编码小RNA，它通过与靶基因mRNA上的靶序列互补配对结合，在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制(Lai，2002)。据估计，在人类基因组中存在约1000个miRNAs，大多数微小RNA位于基因间隔区或蛋白编码基因的内含子区，少数位于外显子区或者mRNA非翻译区。大部分微小RNA单独存在，部分微小RNA聚集在一起，成为一个微小RNA基因簇。生物信息学数据显示，人类约1/3的蛋白编码基因受微小RNA的调控，每个微小RNA可以调节100-200个靶基因，而多个微小RNA可调节同一个基因，组成了一个复杂的调控网络(Berezikov et al.，2006)。

微小RNA在物种进化中相当保守，只在特定的组织和发育阶段表达，具有高度的组织特异性和时序性。如miR-1和miR-133在心脏和骨骼肌组织中特异表达，miR-1可调控心肌细胞在分化与增殖之间的平衡，而miR-133可调控肌肉细胞的分化，其表达下降可以促进斑马鱼鱼鳍的再生；miR-122在人和小鼠的肝脏中高量特异表达，其含量可占肝脏所有miRNA的70％；miR-126在心、肺内皮细胞中特异表达，可抑制淋巴细胞与内皮细胞的相互作用，防止血管炎症的发生；miR-142、miR-181、miR-223在造血组织中特异表达，其中miR-181在小鼠胸腺细胞发育的CD4⁺CD8⁺双阳性期特异性表达，调控B细胞的成熟，miR-223在骨髓中表达高，可调控粒细胞的成熟；miR-143在脂肪组织中特异表达，能调控脂肪细胞的分化，敲除miR-143将导致甘油三酯的累积；miR-371-373簇(包括miR-271，miR-272，miR-273)在人的胚胎中特异表达，而mir-290-295簇(包括miR-290，miR-291，miR-292，miR-293，miR-294，miR-295)则在小鼠的胚胎中特异表达，它们在胚胎干细胞的分化过程中起重要作用；miR-375在鼠胰岛细胞中特异表达，调控胰岛细胞发育和胰岛素分泌，另外，miR-375还在斑马鱼脑下垂体高效表达，调节其他激素和神经内分泌产物的分泌(参见综述Landgraf et al.，2007及微小RNA数据库http://www.microrna.org/microrna/)。

微小RNA表达与多种癌症相关，并且这些微小RNA可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作用。最近的研究发现，大约50％的得到注解的微小RNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site)、杂合型丢失区(minimal regions of loss of heterozygosity)、扩增区(minimal regions of amplication)或断裂点区(commonbreakpoint region)(Calin et al.，2004)。例如，miR-125b-1，位于基因组11q24区，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中常有11q24区缺失。miR-15a和miR-16-1位于基因组13q14区，65％的B细胞慢性淋巴型白血病(CLL)病人，50％的套细胞淋巴瘤病人，16-40％的骨髓瘤病人，60％的前列腺癌病人中均有13q14区的缺失(Calin et al.，2005)。mir-17-92簇(包括miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1和miR-92-1)位于基因组13q31区，该区在散布的B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常发生位点的扩增(He et al.，2005)。

let-7是较早发现的微小RNA之一，表达于多数正常组织细胞，然而在肺癌的研究中发现，肺癌病人的let-7表达显著降低，且let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短(Takamizawa et al.，2004)。研究表明，let-7可通过与Ras基因3’非翻译区的靶序列结合，抑制癌基因Ras的翻译。在肺癌细胞中瞬时表达let-7，可抑制细胞的增殖(Johnson et al.，2005)。miR-122高量表达于哺乳动物成体肝脏，可抑制抗凋亡蛋白Cyclin G1的表达。研究发现，在近70％的原代肝癌组织样本中，miR-122均表达下调(Gramantieri et al.，2007)。miR-34参与P53调控网络，其表达水平与P53含量正相关。研究表明，和P 53在多种肿瘤中的突变或表达下降相似，miR-34的表达水平在很多肿瘤组织中表达下调(He et al.，2007)。miR-29c在鼻癌组织中的表达仅为正常组织中四分之一，导致细胞基质外蛋白表达异常上调，促进肿瘤细胞的迁移(Sengupta et al.，2008)。miR-101在37.5％的前列腺癌中发生位点缺失，导致组蛋白甲基转移酶EZH2表达异常上调，促进肿瘤细胞的迁移(Varambally et al.，2008)。miR-127在正常前列腺和膀胱组织细胞中高水平表达而在前列腺癌和膀胱癌组织中显著下调或沉默，miR-127下调导致致癌基因BCL6表达增加进而促进肿瘤的发生发展(Saito et al.，2006)。miR-223在多种肝癌细胞系和原代肝癌组织中表达均显著下调(Wong et al.，2008)。

实际上，同一类型肿瘤中，常有多种微小RNA表达异常，一部分微小RNA常在肿瘤中表达降低，而另一部分微小RNA在肿瘤中的表达增加。如在乳腺癌中miR-10b，miR-125b和miR-145表达常降低，而miR-21和miR-155则升高(Iorio et al.，2005)；又如在恶性胶质瘤中miR-128，miR-181表达水平降低，而miR-21表达则升高(Ciafret al.，2005)。而同一类型肿瘤不同分期，微小RNA表达水平也不同，而且肿瘤恶性程度越高，微小RNA表达水平变化也越大。通过检测肿瘤组织标本微小RNA的表达谱，和不同肿瘤微小RNA表达谱比对分析，可以协助临床上诊断肿瘤。对同一肿瘤不同微小RNA表达的定量分析，可以对肿瘤进行分期，预测患者预后(Zhang and Farwell，2008)。

本发明在腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列：所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而正常细胞表达正常。通过该设计，使腺病毒增殖必需基因只能在缺失或降低该微小RNA表达的肿瘤细胞中合成蛋白，而在正常表达该微小RNA的细胞不合成蛋白。保证腺病毒只能在上述缺失或降低相应微小RNA的细胞中增殖，而在上述正常表达相应微小RNA的细胞中基本不增殖，从而提高基因治疗的靶向性，减少对正常细胞的损害。利用该重组腺病毒携带外源基因，可使外源基因选择性的在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，减少对正常细胞的毒性。

在本发明的实施方案中，所指的术语按如下方式理解。

“肿瘤细胞中表达缺失或降低而正常细胞中正常表达的微小RNA”是指在肿瘤细胞与正常细胞之间表达水平差异大的微小RNA，即在正常细胞中表达水平高，而在肿瘤细胞表达水平低或无。如let-7，它在肺癌细胞中表达缺失，而在正常人肺细胞系中表达正常。通常，所述的“表达降低”是指与正常细胞相比，肿瘤细胞中微小RNA的表达量不足正常细胞的1/3。

“微小RNA的靶位点核苷酸序列”是指微小RNA可与之结合从而发挥调控作用的DNA序列。它既可以是与成熟微小RNA完全反向互补配对的DNA序列，也可以是已知的微小RNA靶基因中与微小RNA结合，与微小RNA不完全反向互补配对的DNA序列。

“相同微小RNA靶位点序列的串联重复”是指2个以上相同微小RNA靶位点序列不间隔的首尾相连，或者2个以上相同微小RNA靶位点序列首尾相连但中间相隔若干个核苷酸序列。

“不同微小RNA靶位点序列连续串联”是指一种微小RNA靶位点序列串联重复后连接另一种微小RNA靶位点序列的串联重复。

“不同微小RNA靶位点序列间隔串联”是指一种微小RNA靶位点序列后连接另一种微小RNA靶位点序列，并以此为单元重复2次以上。

“3’非翻译区”是指基因成熟mRNA中编码序列下游不翻译的区域，它位于基因终止密码子和polyA尾之间。

“腺病毒增殖必需基因”可以是早期表达基因和晚期表达基因。其中E1A基因在腺病毒感染后即表达(0-2小时)，是最早表达腺病毒蛋白，它作为反式激活转录调节因子，是其它腺病毒早期基因蛋白表达所必需的，同时它反式激活其它腺病毒启动子。因此，缺乏E1A基因的表达，腺病毒DNA复制的必需基因产物不能产生，腺病毒不能有效复制及增殖。E1B基因的转录受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期腺病毒基因mRNA从细胞核转运到细胞浆中所必需的，E1B基因表达缺失可导致腺病毒后期基因表达不佳及不能关闭宿主细胞蛋白的合成。E4基因位于腺病毒基因组的右末端，其开放阅读框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其腺病毒滴度比野生滴度低10⁶倍。

在本发明的一个实施方案中，所述微小RNA可以选自let-7，miR-15，miR-16，miR-18，miR-29，miR-34，miR-101，miR-127，miR-128，miR-181，miR-223中的至少一种。

在本发明的一个实施方案中，所选用的腺病毒载体为人类腺病毒载体，其包括A、B、C、D、E及F6个亚属。

在本发明的一个实施方案中，因为在非翻译区插入的微小RNA靶位点核苷酸序列并不影响其它顺式作用元件(如肿瘤特异性启动子)对腺病毒增殖必需基因表达的调控。所以，可结合肿瘤特异性激活的顺式作用元件，共同调控腺病毒增殖必需基因表达。

在一个实施方案中，选用的顺式作用元件可以选自，但不限于：缺氧反应元件，细胞S期特异性启动子(E2F启动子)，甲胎蛋白增强子及启动子，癌胚抗原增强子及启动子，酪氨酸酶增强子及启动子，尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子，ErbB2增强子及启动子，ErbB3增强子及启动子，ErbB4增强子及启动子，DF3乳腺癌相关抗原增强子，前列腺素特异性抗原增强子及启动子，腺血管舒缓素增强子及启动子，EB腺病毒中的Orip，EB腺病毒Orip中的FR增强子，EB腺病毒BamHI C-启动子。

在一个实施方案中，某些腺病毒增殖必需基因的蛋白功能缺失或突变，可在一定程度上限定腺病毒在肿瘤细胞内特异性增殖。因而，也可结合这些蛋白的缺失或突变，进一步提高重组腺病毒在肿瘤细胞内增殖的特异性，提高治疗的靶向性和安全性。

在一个实施方案中，腺病毒增殖必需基因的蛋白功能缺失或突变可以选自，但不限于：腺病毒E1B 55Kda基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B 55Kda蛋白质功能异常；E1B 19kDa基因通过点突变、缺失突变、插入突变，导致E1B 19kDa蛋白质功能异常；E1A基因通过点突变、缺失突变、插入突变而导致E1A蛋白质功能异常。

在一个实施方案中，利用修饰过的重组腺病毒可以携带外源基因，使其在缺失或降低该微小RNA表达的细胞中，随着病毒的复制增殖而大量扩增，达到治疗目的。而在正常表达该微小RNA的细胞中不合成蛋白，减少对正常细胞的毒性。

在一个实施方案中，外源基因可以选自，但不限于：抑癌基因：P53、P21、Rb、NF1、VHL及APC；血管抑制基因：内皮抑素基因，血管生成抑素基因，血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构、Kringle1-5结构、Kringle1-3结构、Kringle1-3加上Kringle5结构、干扰素-α基因、干扰素-β基因、干扰素-γ基因、血小板反应蛋白基因、血小板因子4基因、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因、白细胞介素-12及纤维结合素基因；细胞因子基因：白细胞介素2、白细胞介素12、白细胞介素24、粒-单集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、Light及Flt3配体；前药转换酶基因：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶及大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶；细胞凋亡基因：ICE、capase-3、capase-8、capase-9；抗体基因：美罗华(Rituxan)、赫赛汀(Herceptin)、爱必妥(Erbitux)和阿瓦斯汀(Avastin)全长抗体，及其嵌合抗体、Fab片段、Fv片段；疫苗基因：卵巢癌抗原、乳腺癌抗原、头颈癌抗原、乙肝抗原、丙肝抗原、艾滋病抗原。

在本发明中还例示性地公开了采用本发明的设计策略的重组腺病毒、构建方法及其其用途。例如将该重组腺病毒载体携带人内皮抑素基因，使重组腺病毒只在缺失let-7的肺癌细胞中复制与增殖，裂解肺癌细胞，同时大量扩增人内皮抑素基因，分泌到细胞外后作用于血管内皮细胞，使肿瘤细胞无法获得足够的营养而衰亡。

与现有的基因治疗方法相比，本发明具有如下有益效果：

本发明在至少一个腺病毒增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入一个肿瘤细胞中表达缺失或降低而正常细胞表达正常的微小RNA靶位点核苷酸序列，成功实现了腺病毒在缺失或降低该微小RNA的肿瘤细胞内特异性复制和增殖，使外源基因随腺病毒复制而大量表达，达到治疗效果。而在正常表达该微小RNA的细胞，腺病毒的增殖必需基因不能合成，腺病毒不能增殖与复制，减少对正常细胞的损害。本发明还可联合肿瘤细胞特异激活的顺式作用元件(如肿瘤特异性启动子)控制腺病毒相同或其它增殖必需基因，进一步提高基因治疗的靶向性与安全性。

本发明中的实施例仅用于例示性说明本发明的具体实施方案，其不限制本申请的保护范围，任何本领域技术人员可以根据现有技术进行的等价的改良都包含在本申请的保护范围之内。

具体实施方式

人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本发明以5/11嵌合型腺病毒作为例证，对本发明加以进一步具体说明，但不限于该例证。本发明构建手段均是现有技术人员能够实现。

1.携带let-7靶位点核苷酸序列的克隆载体的构建

1)pXC.1的改造：

pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790，包括完整的E1区基因序列。采用定位突变双次PCR技术，在该载体中1546bp处(E1A基因TAA终止密码子后)创立2个新的、唯一的酶切位点：BstBI和SalI。即以pXC.1质粒为模板，分别使用引物1与引物2，引物3与引物4两个组合的引物进行PCR扩增，回收237bp和538bp两个片段。将237bp和538bp片段混合，以引物1与引物4进行第二次PCR扩增，回收748bp片段。

引物1：TCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGA(SEQ ID NO：1)

引物2：TACACC

GTA

TTATGGCCTGGGGC(SEQ ID NO：2)

引物3：CCATAATAC

GGTGTAAACCTGTGA(SEQ ID NO：3)

引物4：GAAAATCCAGCA

CCCCGCTCAGATGGGTT(SEQ ID NO：4)

应用KpnI+XbaI进行双酶切，将该片段插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果(5’-3’)见下：

GAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACAC

CTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTT

GGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACC

TTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCATAA

TAC

GGTGTAAACC

TGTGATTGCGTGTGTGGTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATA

AAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTA

TATAATGCGCCGTGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTT

TGGAAGATTTTTCTGCTGTGCGTAACTTGCTGGAACAGAGCTCTAACAGTACCTCTTGG

TTTTGGAGGTTTCTGTGGGGCTCATCCCAGGCAAAGTTAGTCTGCAGAATTAAGGAGGA

TTACAAGTGGGAATTTGAAGAGCTTTTGAAATCCTGTGGTGAGCTGTTTGATTCTTTGA

ATCTGGGTCACCAGGCGCTTTTCCAAGAGAAGGTCATCAAGACTTTGGATTTTTCCACA

CCGGGGCGCGCTGCGGCTGCTGTTGCTTTTTTGAGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGA

AGAAACCCATCTGAGCGGGG

(SEQ ID NO：5)

测序结果显示：在E1A终止密码子TAA位点后插入了序列

TAC

，从而产生新的BstBI和SalI酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用KpnI+XbaI双酶切pUC19质粒，回收748bp的片段插入pXC.1质粒中，使pXC.1中1546bp处插入

TAC

，从而产生BstBI和SalI酶切位点，该位点位于E1A终止密码子后，将该质粒命名为pXC-MIRT。

2)长序列的合成：

分别合成包含2个、4个及8个拷贝let-7靶位点序列的DNA片段(2×let-7T，4×let-7T，8×let-7T)，并在5’-末端与3’-末端分别加入BstBI和SalI的酶切位点，DNA片段由上海生工生物工程技术有限公司进行全长基因合成。经测序正确，命名为pUC57-2×Let7T，pUC57-4×Let7T，pUC57-8×Let7T，其核苷酸序列如下(5’-3’)。其中带下划线的部分显示的是let-7的靶位点序列，方框部分显示的是限制性内切酶的酶切位点序列。

2×let-7T：

AACTATACAACGTCTACCTCAGATAACTATACAACGTCTACCTCA (SEQ ID NO：6)

4×let-7T：

AACTATACAACGTCTACCTCAGATAACTATACAACGTCTACCTCATCGAAACTATACAACGTCTAC CTCAGTAACTATACAACGTCTACCTCA

(SEQ ID NO：7)

8×let-7T：

AACTATACAACGTCTACCTCAGATAACTATACAACGTCTACCTCATCGAAACTATACAACGTCTAC CTCAGTAACTATACAACGTCTACCTCAGAGTACAACTATACAACGTCTACCTCAAGATCAACTATACAACGTCTAC CTCATAGAACTATACAACGTCTACCTCATTCAAACTATACAACGTCTACCTCA

(SEQ ID NO：8)

3)克隆载体的构建：

利用BstBI和SalI双酶切pUC57-let-7T质粒，回收2×let-7T，4×let-7T，8×let-7T片段，将其分别连接到pXC-MIRT载体，使E1A终止密码子TAA后加入2个、4个及8个拷贝的let-7靶位点核苷酸序列，将此质粒命名为pXC-2×Let7T，pXC-4×Let7T，pXC-8×Let7T。

2.携带let-7靶位点核苷酸序列的的减毒增殖腺病毒载体的重组。

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC.1、pXC-2×Let7T、pXC-4×Let7T、pXC-8×Let7T分别与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pPE3-F11主要由pBHGlox(delta)E1，3Cre改造而成，E1区缺失，可与包含腺病毒左臂的质粒胞内同源重组，获得有感染能力的腺病毒；增加了来源于pBHGE3的E3区，含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attR1和attR2序列，ccdB基因，其纤毛蛋白基因被5/11fiber替换，具体载体图谱见附图1。pBHGlox(delta)E1，3Cre与pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)。共转染后9-14天出现腺病毒空斑，经过三次腺病毒空斑纯化，即得Ad5/11嵌合型腺病毒和E1A受let-7控制的腺病毒，分别命名为Ad5-F11及Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×let7T，Ad11-E1a-8×let7T(CCTCC-V200901，2009年1月9日，中国典型培养物保藏中心)

腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒。

3.携带let-7靶位点核苷酸序列的的减毒增殖腺病毒在正常细胞及肿瘤细胞株的复制情况比较

正常细胞株肺成纤维细胞MRC-5与IMR-90均为let-7阳性，肝癌细胞株Hep GII与肺癌细胞株A549均为let-7阴性，上述细胞株购于美国ATCC公司。将上述细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天换无血清培养基1ml，然后分别加入Ad5-F11，Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×let7T，Ad11-E1a-8×let7T，其腺病毒量＝5MOI，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测腺病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)，可见在正常细胞中，相对于Ad5-F11腺病毒，Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×let7T，Ad11-E1a-8×let7T增殖倍数显著降低，且随着插入的let-7靶位点核苷酸序列拷贝数的递增，Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×let7T，Ad11-E1a-8×let7T增殖倍数依次降低；而在肿瘤细胞中腺病毒增殖倍数Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×let7T，Ad11-E1a-8×let7T腺病毒与Ad5-F11腺病毒无显著差异(见图2)。表明let-7a靶位点核苷酸序列的插入可显著降低重组腺病毒在正常细胞中的增殖效率，而在肿瘤细胞中增殖效率相对于非调控的Ad5/11嵌合型腺病毒无明显差异。

应用蛋白印迹杂交技术(Western blot)观察Ad11-E1a-2×let7T，Ad11-E1a-4×Let7T，Ad11-E1a-8×let7T腺病毒在正常细胞株肺成纤维细胞MRC-5及IMR-90中E1A均不表达，而在肿瘤细胞株Hep GII及A549中E1A则高效表达。

4.携带人内皮抑素(endostatin)基因受let-7调控的腺病毒载体的构建

应用多聚酶链反应(PCR)技术获得人内皮抑素(endostatin)基因：自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应，以合成的单链cDNA为模板，扩增人内皮抑素(endostatin)基因，并用两次PCR技术在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信号肽及信号肽前、基因结尾引入EcoR I和Sal I两个酶切位点。

引物5：5’GGG

ACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC 3’(SEQ ID NO：9)

引物6：5’CTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATG GCGAGCCACCGCGACTTCCAG3’(SEQ ID NO：10)

引物7：5’GC

CTATTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTGTTCTCAATGCATAGCACGATGTAGGCGTG 3’(SEQ ID NO：11)

引物6与引物7进行第一次PCR扩增，回收615bp片段，再用引物5与引物7对615bp片段进行第二次PCR扩增，回收647bp片段，应用EcoR I+SalI双酶切，将该基因插入pENTR^TM载体(购于invitrogen公司)中，命名为pENTR-endostatin，其测序结果见下：5’

ACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACT

CCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGC

GCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCA

GCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGA

CCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGA

GCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGC

ACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGT

GTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGAC

GGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAG

TGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTC

CAAGTAATA

3’(SEQ ID NO：12)

pENTR^TM含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attL1和attL2序列，pPE3-F11含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attR1和attR2序列，ccdB基因，以及5型腺病毒右臂。将pENTR-endostatin质粒和pPE3-F11质粒共同转化细菌，可通过LR反应重组获得携带人内皮抑素基因及5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11-endostatin。

5.携带人内皮抑素(endos tatin)基因受let-7调控的腺病毒的重组

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。将包含5型腺病毒左臂的质粒pXC.1和pXC-8×Let7T分别与含有5型腺病毒右臂以及人内皮抑素基因的质粒pPE3-F11-endostatin通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得携带人内皮抑素基因的重组腺病毒和携带人内皮抑素E1A基因受let-7控制的增殖腺病毒，分别命名为Ad11-endostatin与Ad11-E1a-8×let7T-endostatin。

腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒。

6.携带人内皮抑素E1A基因受let-7调控的腺病毒在let-7表达缺失的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人内皮抑素

正常细胞株肺成纤维细胞MRC-5与IMR-90均为let-7阳性，肝癌细胞株Hep GII与肺癌细胞株A549均为let-7阴性，上述细胞株购于美国ATCC公司。将上述细胞株按5×10⁵细胞/孔铺在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天换无血清培养液体1ml，然后，分别携带内皮抑素的腺病毒(Ad11-endostatin)、携带人内皮抑素E1A基因受let-7控制的增殖腺病毒(Ad11-E1a-8×let7T-endostatin)，其腺病毒量＝5MOI，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将腺病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时及48小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测腺病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasy^TM操作手册)，可见携带内皮抑素的腺病毒(Ad-endostatin)在正常细胞及肿瘤细胞均复制及增殖，携带人内皮抑素E1A基因受let-7控制的增殖腺病毒(Ad11-E1a-8×let7T-endostatin)只在let-7表达阴性的肿瘤细胞内增殖与复制，而在let-7阳性的正常细胞基本不复制(见图3)。

将肿瘤细胞株Hep GII 及正常人成纤维细胞分别感染携带人内皮抑素E1A基因受let-7控制的增殖腺病毒(Ad11-E1a-8×let7T-endostatin)，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Blood mini kit(德国QIAGEN公司)提取腺病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。以上述提取的DNA为模板，引物8与引物9进行定量PCR分析，以pENTER12-endostatin作为人内皮抑素拷贝数对照。结果表明，Ad11-E1a-8×let7T-endostatin在肿瘤细胞株Hep GII及正常人成纤维细胞的每个细胞人内皮抑素拷贝数分别为2×10⁴及＜10。

引物8：ACTTCCAGTGCTTCCAGCAG(SEQ ID NO：13)

引物9：ACCCTCAGAGCCTGAGAACA(SEQ ID NO：14)

由此可知，通过本发明的设计策略，在微小RNA调控下，可以选择性地在肿瘤细胞中表达外源基因，同时降低对正常细胞的毒副作用。

7.携带人内皮抑素E1A基因受let-7调控的腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤

将4-5周龄的SCID小鼠皮下接种细胞株Hep GII细胞1×10⁷，两周后给予腺病毒Ad5-F11、携带人内皮抑素的腺病毒Ad11-endostatin、携带人内皮抑素E1A基因受let-7调控的腺病毒Ad11-E1a-let7T-endostatin治疗，每次2×10⁸pfu，共5次，其未治疗组4周后肿瘤体积增加3倍以上，而治疗组则肿瘤增加不明显，Ad11-E1a-let7T-endostatin与Ad11-endostatin的疗效优于Ad5-F11，且Ad11-E1a-let7T-endostatin相对于Ad11-endostatin具有更好的安全性(见图4)。

由此可知，通过本发明的设计策略，在微小RNA调控下，可以选择性地在肿瘤细胞中表达外源基因，进而实现外源基因功能。

最后将在本文中出现的参考文献按照字母排序方式整理如下：参 考文献：

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序列表

<110>第二军医大学东方肝胆外科医院

<120>一种基于微小RNA调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方

     法及其用途

<130>IDC080122

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>引物1

<400>1

tcacctgtgt ctagagaatg caatagtagt acgga     35

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>引物2

<400>2

tacaccgtcg acgtattcga attatggcct ggggc     35

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>引物3

<400>3

ccataattcg aatacgtcga cggtgtaaac ctgtga    36

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>引物4

<400>4

gaaaatccag caggtacccc ccgctcagat gggtt                               35

<210>5

<211>730

<212>DNA

<213>重组测序结果

<400>5

tctagagaat gcaatagtag tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa cacacctcct    60

gagatacacc cggtggtccc gctgtgcccc attaaaccag ttgccgtgag agttggtggg    120

cgtcgccagg ctgtggaatg tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca acctttggac    180

ttgagctgta aacgccccag gccataattc gaatacgtcg acggtgtaaa cctgtgattg    240

cgtgtgtggt taacgccttt gtttgctgaa tgagttgatg taagtttaat aaagggtgag    300

ataatgttta acttgcatgg cgtgttaaat ggggcggggc ttaaagggta tataatgcgc    360

cgtgggctaa tcttggttac atctgacctc atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt    420

tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt    480

ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa    540

tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag    600

gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg    660

gctgctgttg cttttttgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc    720

ggggggtacc                                                           730

<210>6

<211>57

<212>DNA

<213>2×let-7T

<400>6

ttcgaaaact atacaacgtc tacctcagat aactatacaa cgtctacctc agtcgac       57

<210>7

<211>105

<212>DNA

<213>4×let-7T

<400>7

ttcgaaaact atacaacgtc tacctcagat aactatacaa cgtctacctc atcgaaacta    60

tacaacgtct acctcagtaa ctatacaacg tctacctcag tcgac                    105

<210>8

<211>207

<212>DNA

<213>8×let-7T

<400>8

ttcgaaaact atacaacgtc tacctcagat aactatacaa cgtctacctc atcgaaacta    60

tacaacgtct acctcagtaa ctatacaacg tctacctcag agtacaacta tacaacgtct    120

acctcaagat caactataca acgtctacct catagaacta tacaacgtct acctcattca    180

aactatacaa cgtctacctc agtcgac                                        207

<210>9

<211>63

<212>DNA

<213>引物5

<400>9

ggggaattca ccatgggggt actgctcaca cagaggacgc tgctcagtct ggtccttgca    60

ctc                                                                  63

<210>10

<211>60

<212>DNA

<213>引物6

<400>10

ctgctcagtc tggtccttgc actcctgttt ccaagcatgg cgagccaccg cgacttccag    60

<210>11

<211>65

<212>DNA

<213>引物7

<400>11

gcgtcgacct attacttgga ggcagtcatg aagctgttct caatgcatag cacgatgtag    60

gcgtg                                                                65

<210>12

<211>641

<212>DNA

<213>pENTR-内皮抑素

<400>12

gaattcacca tgggggtact gctcacacag aggacgctgc tcagtctggt ccttgcactc    60

ctgtttccaa gcatggcgag ccacagccac cgcgacttcc agccggtgct ccacctggtt    120

gcgctcaaca gccccctgtc aggcggcatg cggggcatcc gcggggccga cttccagtgc    180

ttccagcagg cgcgggccgt ggggctggcg ggcaccttcc gcgccttcct gtcctcgcgc    240

ctgcaggacc tgtacagcat cgtgcgccgt gccgaccgcg cagccgtgcc catcgtcaac    300

ctcaaggacg agctgctgtt tcccagctgg gaggctctgt tctcaggctc tgagggtccg    360

ctgaagcccg gggcacgcat cttctccttt aacggcaagg acgtcctgag gcaccccacc    420

tggccccaga agagcgtgtg gcatggctcg gaccccaacg ggcgcaggct gaccgagagc    480

tactgtgaga cgtggcggac ggaggctccc tcggccacgg gccaggcctc ctcgctgctg    540

gggggcaggc tcctggggca gagtgccgcg agctgccatc acgcctacat cgtgctatgc    600

attgagaaca gcttcatgac tgcctccaag taatagtcga c                        641

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物8

<400>13

acttccagtg cttccagcag    20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物9

<400>14

accctcagag cctgagaaca    20

Claims (11)

1.一种重组腺病毒载体，其特征在于：该腺病毒载体的至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA可以选自let-7，miR-15，miR-16，miR-18，miR-29，miR-34，mi R-101，miR-127，miR-128，miR-181和miR-223中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶位点序列由1个或多个相同微小RNA靶位点序列以串联重复的方式构成。

4.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶位点序列由1个或多个不同微小RNA靶位点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。

5.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因选自腺病毒早期表达基因：E1A，E1B，E2和E4中的至少一个。

6.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因选自腺病毒晚期表达基因。

7.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于重组腺病毒基因组中还可操作地连接有外源基因，所述外源基因选自抑癌基因、血管抑制基因、细胞因子基因，前药转换酶基因，细胞凋亡基因，抗体基因和疫苗基因中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述重组腺病毒还可操作地连接有选自缺氧反应元件、细胞S期特异性启动子、甲胎蛋白增强子及启动子、癌胚抗原增强子及启动子、酪氨酸酶增强子及启动子、尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子、ErbB2增强子及启动子、ErbB3增强子及启动子、ErbB4增强子及启动子、DF3乳腺癌相关抗原增强子、前列腺素特异性抗原增强子及启动子、腺血管舒缓素增强子及启动子、EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR增强子和EB病毒BamHI C-启动子中的至少一种顺式作用元件，所述顺式作用元件调控所述增殖必需基因的转录。

9.根据权利要求1所述重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于在所述腺病毒至少一个增殖必需基因的3’非翻译区中至少插入有一个微小RNA靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的重组腺病毒载体的用途，其特征在于所述重组腺病毒用于选择性地在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞中增殖，而在正常表达该微小RNA的正常细胞内不增殖。

11.根据权利要求7所述的重组腺病毒载体的用途，其特征在于所述重组腺病毒用于使在其基因组中可操作地连接的的外源基因选择性地在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞中表达，而在正常表达该微小RNA的正常细胞内不表达。

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