CN113528432B - 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法 - Google Patents

一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113528432B
CN113528432B CN202110813180.5A CN202110813180A CN113528432B CN 113528432 B CN113528432 B CN 113528432B CN 202110813180 A CN202110813180 A CN 202110813180A CN 113528432 B CN113528432 B CN 113528432B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
bovine
differentiation
culture medium
transfection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110813180.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113528432A (zh
Inventor
梁洋
滕春波
孟博文
孔德麟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Forestry University
Original Assignee
Northeast Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Forestry University filed Critical Northeast Forestry University
Priority to CN202110813180.5A priority Critical patent/CN113528432B/zh
Publication of CN113528432A publication Critical patent/CN113528432A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113528432B publication Critical patent/CN113528432B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Abstract

一种利用miR‑18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，本发明涉及一种利用miR‑18inhibitor促牛成肌细胞分化的方法，本发明公开了一种新型高效的利用miR‑18inhibitor促牛成肌细胞分化方法，包括牛成肌细胞复苏培养、传代培养以及分化培养技术。本发明通过转染miR‑18抑制剂到牛成肌细胞，培养后利用免疫染色鉴定，荧光定量PCR鉴定等，发现了miR‑18抑制剂有明显促牛成肌细胞分化作用，得到高效率分化结果的方法。本发明应用于促牛成肌细胞分化领域。

Description

一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法。
背景技术
骨骼肌能维持机体正常运动和能量代谢平衡，是哺乳动物中分布最广泛的重要组织器官。探索肌细胞增殖、分化和再生的作用机制，对提高畜牧业生产性能、揭示动物和人类多种肌肉疾病至关重要。在畜牧业生产中，肉牛产业是重要的组成部分，随着国民经济的发展，人们生活条件大幅度改善，对牛肉的需求也逐渐增加。20世纪90年代以来，我国牛肉产量已经成为仅次于美国和巴西的第三大国。虽然我国肉牛存栏量高，但肉牛胴体重的水平远远低于世界平均水平，且需求大于供给，价格不断上涨，影响了人们的消费需求。其中肌肉发育是影响肉牛品质和产量的关键因素，目前的研究并没有完全揭示成肌分化等机制，并且牛成肌细胞系被建立以来，一直缺乏有效的分化手段，分化效率低且参差不齐，因此，发现高效的牛成肌细胞分化方法至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种促牛成肌细胞分化的方法。
本发明一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法按以下步骤实现：
一、牛成肌细胞传代培养
将牛成肌细胞进行复苏培养，培养至70％-80％细胞融合，进行传代培养；
二、配制转染试剂
取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiR-18抑制剂预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uL RNAiMAX，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；
三、转染
牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，添加增殖培养基培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染，转染24h后用分化培养基更换1/2培养基，转染后培养3-7d，即完成利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法。
本发明的有益效果是：通过添加miR-18inhibitor(miR-18抑制剂)能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。
附图说明
图1为牛成肌细胞分化过程示意图；
图2为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂分化效果；
图3为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂7天后的细胞融合率；
图4为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂7天后的细胞分化率；
图5为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+19分化效果；
图6为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+193天后的细胞融合率；
图7为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+193天后的细胞分化率；
图8为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+197天后的细胞融合率；
图9为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+197天后的细胞分化率；
图10为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYH3检测；
图11为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYOG检测；
图12为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYOD1检测。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法按以下步骤实现：
一、牛成肌细胞传代培养
将牛成肌细胞进行复苏培养，培养至70％-80％细胞融合，进行传代培养；
二、配制转染试剂
取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiR-18抑制剂预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uLRNAiMAX，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；
三、转染
牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，添加增殖培养基培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染，转染24h后用分化培养基更换1/2培养基，转染后培养3-7d，即完成利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法。
本实施方式通过添加miR-18inhibitor能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，牛成肌细胞复苏培养的方法为：取冻存的牛成肌细胞，37度水浴摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，增殖培养基配方：DMEM高糖细胞培养基(DMEM-HIGH GLUCOSE培养基)+15％胎牛血清(ES-FBS)+10％马血清(HSR)+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，步骤一牛成肌细胞传代培养按照1:2传代。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
本实施方式中牛成肌细胞传代培养按照1:2传代是指：一个6cm培养皿的细胞，经过消化、离心、重新悬浮后，平均分配到2个6cm培养皿中。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，步骤一的传代方法为：向装有牛成肌细胞的培养皿加入2mLPBS清洗，清洗2次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，添加1mL增殖培养基重新悬浮细胞沉淀，按照1:2的比例接种传代，每个6cm培养皿补齐增殖培养基到3mL，37℃5％CO2培养箱中扩大培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，步骤三铺板传代方法为：向传代至第三代的牛成肌细胞中加入2mL PBS清洗，清洗两次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照每孔传30000个细胞的数量传至24孔板，24孔板全部铺满，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO2培养箱中继续培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，步骤三采用24孔板进行转染时，每孔转染体系为：
其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是，分化培养基为DMEM-HIGH GLUCOSE培养基+2％HSR+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是，双抗为青霉素和链霉素的混合溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
本实施方式中双抗为青链霉素混合液，青链霉素混合液(100X)(Penicillin-Streptomycin Solution)双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：
一、牛成肌细胞复苏培养和传代培养
超净台和无菌间用紫外照射灭菌40min，然后关闭紫外设备，打开排风系统，5min后进入无菌间。打开水浴锅，调节水温至37℃，预热增殖培养基。液氮罐中取实验室冻存的牛成肌细胞，37℃水浴快速摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，取约1*106个细胞接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。观察复苏培养细胞，待细胞80％汇合，取出细胞培养皿，加入2mLPBS清洗2次，去除残留PBS后添加200uL胰酶及1mL的PBS混合溶液，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，轻轻吹打使细胞脱壁，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照1:2的比例接种传代，37℃5％CO2培养箱中扩大培养。
二、配制转染试剂
取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiRNAs/或miRNAsinhibitor预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uL lipofectamine RNAiMAX转染试剂，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；
Opti-MEM无血清培养基培养基购自Thermo公司，lipofectamine RNAiMAX转染试剂购自invitrogen公司。miRNAs买自广州市锐博生物科技有限公司，储存浓度：20μM，使用浓度：50nM；用DEPC处理水溶解，分装后置于-20℃冰箱备用；miRNAs inhibitor：购买自广州市锐博生物科技有限公司，储存浓度：20μM，使用浓度：50nM；DEPC处理水溶解，分装后置于-20℃冰箱备用；miR-17、miR-18、miR-19、miR-17inhibitor、miR-18inhibitor和miR-19inhibitor的序列如序列表所示，其中m代表2'-Ome(甲基化修饰)，inhibitor是miRNA成熟体序列的反向互补序列的单链序列，全链甲基化修饰。
三、转染
牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，即24孔板中每孔传30000个细胞，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO2培养箱中继续培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染；其中分化培养基配方：2％HSR，1％双抗，1％谷氨酰胺替代物，DMEM-HIGH GLUCOSE培养基；
转染方案为：
实验组次 对照 miRNA
1 NC miR-17
2 NC miR-18
3 NC miR-19
4 NC miR-17inhibitor
5 NC miR-18inhibitor
6 NC miR-19inhibitor
转染24h后更换1/2分化培养基，即每次吸出250uL，加入新培养基250uL；以后每48h更换1/2分化培养基。转染后3-7天进行MYHC免疫染色进行分化鉴定。牛成肌细胞分化过程示意图如图1所示。
四、牛成肌细胞分化的鉴定
(一)免疫荧光分析
转染后，在第3，第7天取样，进行免疫荧光染色，检测肌肉分化标志物表达情况
1.分化后的细胞孔板用PBS清洗两次，每次5min，常温，静置；
2.吸出PBS后，每孔加入200uL 4％PFA-PBS溶液固定细胞，常温静置20min；
3.弃去PFA溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床上，60转/min；
4.每孔添加0.3％Triton-PBS 200uL，处理17min，常温静置，使抗体进入细胞；
5.弃去triton溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min；
6.每孔加入10％HSR-PBS溶液200uL进行封闭处理，37℃培养箱静置50min；
7.加入10％HSR-PBS-MYHC一抗溶液300ul进行孵育(MYHC一抗使用浓度1:500，购买于博奥森试剂公司，为兔多抗)，4℃过夜处理；
8.第二天，回收一抗溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min；
9.添加1％BSA-PBS-Aleax-488二抗溶液300ul(二抗使用浓度1:200，购买于中衫金桥试剂公司，为羊抗兔多克隆绿色荧光二抗)，37℃培养箱孵育1h，避光；
10.弃去二抗溶液，PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min，避光；
11.加入Hoechst-Water溶液300ul，避光常温孵育5min(Hoechst使用1:1000浓度，购买于中衫金桥)；
12.弃去Hoechst溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min，避光；
13.倒置荧光显微镜镜检结果。
(二)融合比例分析
根据免疫染色结果，统计分析多核肌管中的细胞核数与总细胞核数比率。
(三)分化效率分析
根据免疫染色结果，统计分析分化的细胞数与总细胞数比率。以上结果采用prism软件进行统计分析。
(四)收集转入miR-18inhibitor后分化第5天的细胞，实时荧光定量PCR(qRT-RCR)分析成肌分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达情况。
五、分化结果
1.分别在牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂，转染后培养7天，利用免疫荧光染色检测分化标志性基因，倒置荧光显微镜观察结果。与对照组相比，miR-17、miR-18inhibitor、miR-19对牛成肌细胞分化均有促进作用，其中miR-18inhibitor处理组分化效果最好(图2)。
2.根据上述免疫染色结果，统计分析多核肌管中的细胞核数与总细胞核数，转入miR-18inhibitor组细胞融合率显著高于其它实验组(p<0.01)；同样根据免疫染色结果，统计分析分化的细胞数与总细胞数比率，转入miR-18inhibitor组，细胞分化率显著高于其它实验组(p<0.01)(图3和4)。
3.由于上述结果显示，miR-17、miR-19、miR-18inhibitor对牛成肌细胞均有促分化效果，为了进一步分析miR-18inhibitor的促分化能力，设置miR-17和miR-19联合添加组，NC组和转染miR-18inhibitor组。结果显示：从转染miRNA后第三天开始，miR-18inhibitor组分化效果与miR-17+19组类似，均显著高于对照组；转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组(免疫组化结果、细胞融合结果和细胞分化量化结果一致)(图5-图9)。
4.为了进一步说明miR-18inhibitor对牛成肌细胞促分化效果，在转染的第五天收集miR-18inhibitor处理后的成肌细胞，提取RNA，反转后进行实时荧光定量PCR(qRT-RCR)检测分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达量。结果显示；牛成肌细胞中转入miR-18inhibitor后，分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达量均有显著性提高(p<0.01)(图10-12)。
由上述实施例可知，通过添加miR-18inhibitor能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。
序列表
<110>东北林业大学
<120>一种利用miR-18 抑制剂促牛成肌细胞分化的方法
<160> 12
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-18的核苷酸序列。
<400> 1
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-18 mimic中正义链的核苷酸序列。
<400> 2
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-18 mimic中反义链的核苷酸序列。
<400> 3
AUUCCACGUAGAUCACGUCUAUC 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-18 inhibitor 的核苷酸序列。
<400> 4
mCmUmAmUmCmUmGmCmAmCmUmAmGmAmUmGmCmAmCmCmUmUmA 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-19的核苷酸序列。
<400> 5
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-19 mimic中正义链的核苷酸序列。
<400> 6
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-19 mimic中反义链的核苷酸序列。
<400> 7
ACACGUUUAGGUACGUUUUGACU 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-19 inhibitor 的核苷酸序列。
<400> 8
mUmCmAmGmUmUmUmUmGmCmAmUmGmGmAmUmUmUmGmCmAmCmA 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 的核苷酸序列。
<400> 9
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 23
<210>10
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 mimic中正义链的核苷酸序列。
<400> 10
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 mimic 中反义链的核苷酸序列。
<400> 11
GUUUCACGAAUGUCACGUCCAUC 23
<210>12
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>miR-17 inhibitor 的核苷酸序列。
<400> 12
mCmUmAmCmCmUmGmCmAmCmUmGmUmAmAmGmCmAmCmUmUmUmG 23

Claims (7)

1.一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于它按以下步骤实现：
一、牛成肌细胞传代培养
将牛成肌细胞进行复苏培养，培养至70％-80％细胞融合，进行传代培养；其中牛成肌细胞传代培养按照1:2传代；
二、配制转染试剂
取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiR-18抑制剂预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uLRNAiMAX，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；
三、转染
牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，添加增殖培养基培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染，转染24h后用分化培养基更换1/2培养基，转染后培养3-7d，即完成利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法；其中分化培养基为DMEM-HIGHGLUCOSE培养基+2％马血清+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。
2.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于牛成肌细胞复苏培养的方法为：取冻存的牛成肌细胞，37度水浴摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。
3.根据权利要求2所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于增殖培养基配方：DMEM高糖细胞培养基+15％胎牛血清+10％马血清+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。
4.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤一的传代方法为：向装有牛成肌细胞的培养皿加入2mL PBS清洗，清洗2次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，添加1mL增殖培养基重新悬浮细胞沉淀，按照1:2的比例接种传代，每个6cm培养皿补齐增殖培养基到3mL，37℃、5％CO2培养箱中扩大培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。
5.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤三铺板传代方法为：向传代至第三代的牛成肌细胞中加入2mL PBS清洗，清洗两次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照每孔传30000个细胞的数量传至24孔板，24孔板全部铺满，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO2培养箱中继续培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。
6.根据权利要求5所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤三采用24孔板进行转染时，每孔转染体系为：1.5μL miR-18抑制剂，1μLRNAiMAX，100μL Opti-MEM无血清培养基。
7.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于双抗为青霉素和链霉素的混合溶液。
CN202110813180.5A 2021-07-19 2021-07-19 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法 Active CN113528432B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110813180.5A CN113528432B (zh) 2021-07-19 2021-07-19 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110813180.5A CN113528432B (zh) 2021-07-19 2021-07-19 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113528432A CN113528432A (zh) 2021-10-22
CN113528432B true CN113528432B (zh) 2024-04-19

Family

ID=78100153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110813180.5A Active CN113528432B (zh) 2021-07-19 2021-07-19 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113528432B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114276986A (zh) * 2021-12-30 2022-04-05 广西大学 一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2877350A1 (fr) * 2004-11-03 2006-05-05 Centre Nat Rech Scient IDENTIFICATION ET UTILISATION DE miRNAs IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES ISSUES D'UNE LEUCEMIE MYELOIDE
CN101787374A (zh) * 2009-01-23 2010-07-28 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种基于微小rna调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途
CN111363718A (zh) * 2020-03-25 2020-07-03 东北农业大学 通过外源添加能显著促进小鼠c2c12成肌细胞分化的促分化试剂yyq1

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2877350A1 (fr) * 2004-11-03 2006-05-05 Centre Nat Rech Scient IDENTIFICATION ET UTILISATION DE miRNAs IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES ISSUES D'UNE LEUCEMIE MYELOIDE
CN101787374A (zh) * 2009-01-23 2010-07-28 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种基于微小rna调控可在肿瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体、其构建方法及其用途
CN111363718A (zh) * 2020-03-25 2020-07-03 东北农业大学 通过外源添加能显著促进小鼠c2c12成肌细胞分化的促分化试剂yyq1

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孔德麟.miR-17-92家族对骨骼肌成肌细胞分化调节机制的研究.中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑.2021,(第1期),摘要，正文第16、18-19、25、29、67页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113528432A (zh) 2021-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schop et al. Expansion of mesenchymal stem cells using a microcarrier‐based cultivation system: growth and metabolism
CN105039248B (zh) 树鼩骨髓间充质干细胞培养系统
CN112574946B (zh) 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法
CN104388465A (zh) Mdfi在调控猪骨骼肌生长发育中的应用
CN105200005A (zh) 一种牙鲆肌卫星细胞系的构建方法及其鉴定牙鲆肌卫星细胞标记基因的特异性引物和应用
CN113528432B (zh) 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法
CN111454953A (zh) 一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂
CN105648050B (zh) 一种快速鉴定山羊绒周期发育的方法及其分子靶标和应用
CN116355843A (zh) 一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体
CN115851972B (zh) 一种绵羊毛囊发育标志物miR-23b及其应用
Wu et al. Experimental study of millimeter wave-induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes
CN108913695B (zh) Zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用
CN114292850B (zh) 一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用
CN104862316A (zh) 具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400
CN106497885B (zh) miR-10b在体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和抑制其分化为成脂细胞的用途
CN108992457A (zh) miR-144-3p及其靶基因在制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物中的应用
CN113832235A (zh) 一种与仔猪细菌性腹泻抗性相关的lncRNA标志物及其应用
CN111893091A (zh) 一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法
CN112011628A (zh) 一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用
CN116355898B (zh) miRNA-133在调节绵羊胚胎毛囊发育中的应用
CN111944751B (zh) 一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用
CN111793609B (zh) 一种促进脂肪干细胞增殖和分化的方法
CN116004625B (zh) 一种与羊被毛弯曲相关的环状rna及其应用
CN107177555A (zh) 一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法
CN107338243B (zh) 重组间充质干细胞及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Liang Yang

Inventor after: Teng Chunbo

Inventor after: Meng Bowen

Inventor after: Kong Delin

Inventor before: Teng Chunbo

Inventor before: Liang Yang

Inventor before: Meng Bowen

Inventor before: Kong Delin

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant