CN108913695B

CN108913695B - Zeb1在人心脏成纤维细胞中的应用

Info

Publication number: CN108913695B
Application number: CN201810821050.4A
Authority: CN
Inventors: 张豪; 王希龙; 温丽娟; 潘金春; 黄韧; 杨丰华; 龚宝勇; 谭伟江
Original assignee: South China Agricultural University; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: South China Agricultural University; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN108913695A

Abstract

本发明公开一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本发明以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR‑590‑3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明干扰ZEB1后，验证能够回复由miR‑590‑3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR‑590‑3p的一个重要功能靶标，miR‑590‑3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本发明通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。

Description

ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。

背景技术

心肌梗死状动脉的血液流动不畅，心肌长时间缺氧、缺血而导致的局部心肌坏死。在心肌梗死发生的早期，细胞外基质合成和沉积能加强心脏的收缩力，形成瘫痕防止心脏破裂，在一定程度上改善心脏功能；但是在疾病的后期，由于细胞外基质的合成过多，在心脏组织中大量积累，导致心肌纤维化的发生。心脏成纤维细胞在心肌纤维化过程中大量增殖，同时分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原等成分堆积于心肌间，致使心肌组织中胶原纤维降解异常、各种胶原比例失衡和间质与血管周围的蛋白积累过度。因此，心脏成纤维细胞是心肌纤维化过程的重要效应细胞，它的功能改变能影响心肌纤维化进程。

锌指E盒结合的同源盒蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)位于人染色体10p11.2上，是非常重要的一种细胞核转录因子。TGF-β是重要的致纤维化因子，ZEB1的基因结构上含有一个能与Smad蛋白结合的区域，可与磷酸化的Smad蛋白结合，从而促进TGF-β的活化转录。此结果说明，ZEB1可能参与调控器官的纤维化过程。研究发现在肝纤维化的大鼠模型中静脉注射重组ZEB1蛋白，HE和Masson染色结果显示，炎症与肝纤维化程度有所加重，纤维间距变宽，并且TGF-β表达水平上调，这些结果说明了ZEB1也许可以通过激活化某些途径促进TGF-β的转录进而促进大鼠肝纤维化进程。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid，mRNA)的3′非翻译区(untranslated region，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。以确定ZEB1对人心脏成纤维细胞功能的调节作用。

通过基因工程技术改变ZEB1基因在成纤维细胞的表达量，进而影响成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化；通过生物信息学软件预测该基因靶向的miRNA，研究该miRNA的功能，来达到ZEB1在人心脏成纤维细胞中应用的目的。

本发明的另一目的在于提供抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(siRNA)。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。

本发明提供抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：

si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；

si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；

si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；

本发明提供靶向ZEB1基因的miRNA，序列如下：

miR-590-3p：5'-UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'；

在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段后，能回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。

验证结果如下：

1、合成3对干扰ZEB1基因的小片段/对照(si-ZEB1/si-ZEB1-NC)，转染干扰小片段到成纤维细胞中(转染浓度为50nM)，qRT-PCR检测其干扰效率，最终确定干扰效果较好的si-ZEB1-2小片段进行后续实验。

si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；

si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；

si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；

2、干扰ZEB1基因小片段(si-ZEB1-2)转染心脏成纤维细胞，研究其对人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成的应用。通过EdU法、Transwell、qRT-PCR与Westernblotting分别检测ZEB1受到si-ZEB1-2小片段干扰后心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成情况，发现ZEB1促进纤维细胞增殖与迁移，促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞与合成Ⅰ型与Ⅲ型胶原。

3、通过TargetScan、MiRanda、RNAhybrid 3个生物信息学软件预测调控ZEB1的miRNA，发现ZEB1的3'UTR区含有miR-590-3p结合位点，分别扩增ZEB1的野生型3'UTR区及与miR-590-3p种子区结合位点突变的突变型3'UTR区，并将其连接到pmirGLO真核表达载体中，通过双荧光素酶报告基因系统检测，发现ZEB1野生型(WT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性受到miR-590-3p调控而表达量下降，而ZEB1突变型(MUT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性不受miR-590-3p调控。通过qRT-PCR与Western blotting验证，ZEB1在蛋白水平受miR-590-3p调控(miR-590-3p mimic的转染浓度为25nM)。

4、ZEB1回复miR-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞中共转染miR-590-3pinhibitor与si-ZEB1-2后，检测能否回复由miR-590-3p引起的细胞迁移改变。通过Transwell检测结果显示，miR-590-3p inhibitor的促细胞迁移功能可以被si-ZEB1-2回复。

本发明以ZEB1为研究对象，采用细胞生物学方法研究其在人心脏成纤维细胞中的应用。关键点和欲保护点：(1)ZEB1在人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成中的应用；(2)通过靶基因回复验证，即在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(si-ZEB1-2)后，验证能否回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。

成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本发明第一次证实ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本发明补充si-ZEB1-2能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，进一步表明ZEB1在成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可以通过ZEB1来调节人心脏成纤维细胞的功能。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR-590-3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明干扰ZEB1后，验证能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本发明通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。

附图说明

图1是qRT-PCR检测3对ZEB1干扰小片段的干扰效率结果图。

图2是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞增殖。

图3是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞迁移。

图4是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞分化标志基因α-SMA在心脏成纤维细胞中的表达；其中图4A是qRT-PCR结果；图4B是Western blotting结果。

图5是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞胶原合成标志基因Col1A1、Col3A1在心脏成纤维细胞中的表达；其中图5A是qRT-PCR结果；图5B是Westernblotting结果。

图6是验证miR-590-3p靶向ZEB1；其中图6A、图6B、图6C分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Western blotting验证。

图7是ZEB1回复miR-590-3p抑制心脏成纤维细胞迁移的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1人心脏成纤维细胞的培养

本实验所用的细胞模型人心脏成纤维细胞来自来自美国ScienCell ResearchLaboratories。所用培养基为美国ScienCell Research Laboratories提供的心脏成纤维细胞培养基(Fibroblast Medium-2)。

(1)实验前准备：a.打开水浴锅，调节温度35.8～37℃；b.超净台开紫外灭菌30min。

(2)从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，并不时摇动使其尽快融化。

(3)从37℃水浴锅中取出冻存管，外部喷洒75％酒精后转移到超净台，小心打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

(4)1000rpm，离心5min。

(5)弃上清，加入完全培养基重悬细胞，接种细胞培养瓶，37℃ 5％CO₂培养箱静置培养。

(6)24h后更换新的完全培养基，继续培养。

实施例2人心脏成纤维细胞的接种和转染

(1)镜下观察心脏成纤维细胞汇合度达到90％时，弃培养基，用预热的含1％双抗(双抗为青霉素和链霉素)的PBS清洗细胞两次；

(2)预热的0.25％胰酶加入培养瓶，放入培养箱中静置2min，显微镜下观察到细胞大部分细胞飘起时，加入终止液(10％FBS的DMEM)终止消化。

(3)用枪头轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，转移至15mL离心管，1000rpm离心5min。

(4)适量PBS清洗细胞两次。

(5)适量完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后，均匀分布到每一个孔中，补足完全培养基至推荐的体积，放入培养箱中继续培养。

(6)24h左右观察细胞形态及汇合度，细胞形态良好且汇合度达到70％～90％时，可以用于转染。本发明取第3或第四代传代的心脏成纤维细胞进行转染，转染步骤参照Invitrogen公司的

3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；

(7)转染后，细胞在37℃，5％ CO₂培养箱中继续培养；

(8)根据实验目的，在转染后的2～4d收集细胞。

实施例3qRT-PCR

(1)冷PBS清洗贴壁细胞2～3次，倾斜细胞培养皿，吸净PBS，加入1mL的Trizol，静置5min，直至镜下观察到细胞全部裂解后，用枪头吹打均匀并转移到1.5mL RNase-free EP管。

(2)每管加入200μL预冷氯仿(Trizol组织液:氯仿为5：1)，剧烈震荡15～30s，冰上放置5min后，12000rpm，4℃，离心15min；液体分三层：上层为无色的RNA，中层为含有酚-氯仿的白色水相，下层为浅红色。小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(约300μL)移入新的1.5mL EP管中，加入等量异丙醇溶液(300μL)，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10min。12000rpm，4℃，离心10min。

(3)弃上清、留沉淀，沿管壁加入预冷的1mL 75％乙醇-DEPC以洗涤RNA，12000rpm，4℃，离心5min后尽量去上清。

(4)将液体吸干，室温自然干燥5～10min，同时避免RNA沉淀干燥过度。

(5)根据沉淀量，加入30～50μL的DEPC水以溶解RNA沉淀。分光光度计测定RNA浓度和纯度。

逆转录反应采用TAKARA公司的PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect RealTime)Kit。qRT-PCR分别采用Thermo公司的SYBR Green qRT-PCR Master Mix(2X)，ROXSolution provided Mix。以2^-△△Ct法计算mRNA与miRNA的相对表达量。

本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-α-SMA Forward：5'-GACAATGGCTCTGGGCTCTGTAA-3'；

Reverse：5'-CTGTGCTTCGTCACCCACGTA-3'；

qRT-PCR-Col1A1Forward：5'-CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC-3'；

Reverse：5'-TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC-3'；

qRT-PCR-Col3A1Forward：5'-AATCAGGTAGACCCGGACGA-3'；

Reverse：5'-TCGAGCACCGTCATTACCC-3'。

qRT-PCR-GAPDH Forward：5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'；

Reverse：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'；

qRT-PCR-ZEB1Forward：5'-AACGCTTTTCCCATTCTGGC-3'；

Reverse：5'-TTGCCGTATCTGTGGTCGTG-3'；

实施例4Western Blotting

(1)人心脏成纤维细胞总蛋白的提取

细胞转染后48h，用PBS清洗细胞3次，6孔板细胞每孔加入100～200μL蛋白裂解液进行蛋白质裂解，细胞裂解液转移到1.5mL EP管中。12000rpm，4℃离心15min，取上清至新的1.5mL EP管中，低温保存防止蛋白降解。

(2)SDS-PAGE电泳

BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5：1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。

(3)转膜

甲醛浸泡聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)5min，清水冲洗后与吸附滤纸一起用转膜液浸泡。从正极开始依次按照吸附滤纸(4张)-凝胶-PVDF膜-吸附滤纸(4张)顺序叠放，合上负极。装入电泳槽中。转膜过程在冰上进行，恒流300mA，根据目的蛋白不同选择转膜时间。

(4)蛋白检测与结果分析

转膜完成后，将膜放入1×TBST中漂洗，用5％脱脂奶粉室温下封闭2h。1×TBST洗膜，用抗体稀释液稀释所需抗体，4℃孵育过夜。回收一抗(ZEB1一抗；α-SMA一抗；Col1A1一抗；Col3A1一抗；上述4个一抗均为常规市售产品)，1×TBST洗膜。室温孵育二抗(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG-HRP，购置美国SANTA CRUZ公司)2h。1×TBST洗膜。用ECL化学发光法进行检测，用Bio-Rad曝光系统曝光并采集图片。使用Image J进行电泳条带灰度值测定。

实验例5心脏成纤维细胞增殖实验

本发明中EdU细胞增殖实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-Light^TMEdU Apollo 567In vitro Kit进行。具体步骤如下(以96孔板为例)：

(1)用细胞培养基按1000：1的比例稀释Edu溶液，制备适量浓度为50μM的Edu培养基；

(2)每孔加入100μL浓度为50μM的Edu培养基孵育2h，弃培养基；

(3)PBS清洗细胞1～2次，每次5min；

(4)每孔加入50μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；

(5)每孔加入50μL浓度为2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；

(6)每孔加入100μL的PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；

(7)每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；

(8)加入100μL渗透剂(0.5％Triton X的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次5min，弃渗透剂；

(9)用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst3342反应液，避光保存；

(10)每孔加入100μL的1×Hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；

(11)每孔加入150μL的PBS清洗1～3次；

(12)每孔加入100μL的PBS保存待用；

(13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。

实验例6心脏成纤维细胞迁移实验

本发明使用试剂耗材：Transwell细胞培养板(BD，REF353097)

(1)将细胞培养板放置于室温，PBS润洗培养板内细胞2次，去除培养板内PBS；

(2)加入不含EDTA的胰酶消化细胞，用100μL无血清细胞培养基重悬细胞，计数1×10⁵个细胞，加入Transwell细胞培养板的小室上室，下室加入600μL完全培养基；

(3)在37℃，5％CO₂孵育12～48h，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，并拍照统计。

实验例7荧光素酶报告基因活性检测

按照Promega公司的Dual-

Reporter Assay System(E1960)试剂盒说明书在荧光化学发光微孔板检测仪上操作，具体步骤如下：

(1)5×PLB室温解冻后，使用ddH₂O按1：4的比例将其稀释成1×PLB；

(2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200μL的PBS，轻轻晃动培养板，吸除PBS，此PBS清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；

(3)每孔加入100μL的1×PLB；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；

(4)将裂解的细胞取75μL转移到96孔酶标板中，每孔加入75μL的LARⅡ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Firefly luciferase荧光强度；

(5)再加入75μL的Stop&Glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Ranillaluciferase荧光强度；

(6)Firefly luciferase与Ranilla luciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组4个重复)。

结果分析：

1、合成3对干扰ZEB1基因小片段/对照(si-ZEB1/si-ZEB1-NC)，利用qRT-PCR手段，检测上述片段转染到心脏成纤维细胞之后在细胞中的表达情况(转染浓度为50nM)。结果如图1所示，选择干扰效率最好的si-ZEB1-2进行后续实验。后续统一将si-ZEB1-2与si-ZEB1-NC书写成siZEB1与NC。

si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；

si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；

si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；

上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成。

2、siZEB1转染到心脏成纤维细胞后，研究靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞功能的应用。EdU结果如图2所示，siZEB1抑制心脏成纤维细胞增殖，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞增殖。Transwell结果如图3所示，siZEB1抑制心脏成纤维细胞迁移，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞迁移。

3、siZEB1转染到心脏成纤维细胞后，qRT-PCR与Western blotting验证靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞分化标志基因α-SMA的作用，结果如图4所示，与对照相比，siZEB1显著抑制α-SMA在mRNA与蛋白的表达，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞中α-SMA的mRNA与蛋白的表达。

4、qRT-PCR与Western blotting验证靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞胶原合成标志基因Col1A1与Col3A1的作用，结果如图5所示，与对照相比，siZEB1显著抑制Col1A1与Col3A1在mRNA与蛋白的表达，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞中Col1A1与Col3A1的mRNA与蛋白的表达。

5、利用生物信息学软件预测调控ZEB1的miRNA，发现ZEB1的3'UTR中含有miR-590-3p结合位点，将ZEB1野生型3'UTR和含有种子序列突变的3'UTR构建到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶报告系统分析，发现ZEB1野生型(WT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性受到miR-590-3p调控而表达量下降，而突变型(MUT-ZEB1)载体上报告基因活性则不受miR-590-3p调控(miR-590-3p mimic转染浓度为25nM)。通过qRT-PCR与Western blotting验证，ZEB1在翻译水平受miR-590-3p的调控(miR-590-3p mimic转染浓度为25nM，miR-590-3p inhibitor转染浓度为50nM)，结果如图6所示。

6、ZEB1回复miR-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞同时共转染miR-590-3pinhibitor和siZEB1后，检测能否回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型变化。通过Transwell检测心脏成纤维细胞迁移情况，发现miR-590-3p inhibitor引起的促迁移功能可以被siZEB1回复，结果如图7所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

广东省实验动物监测所

<120> ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-ZEB1-1

<400> 1

ggcaaguguu ggagaauaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-ZEB1-2

<400> 2

ccagaaauac acaggguua 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-ZEB1-3

<400> 3

ggacagcaca guaaaucua 19

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miR-590-3p

<400> 4

uaauuuuaug uauaagcuag u 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-α-SMA Forward

<400> 5

gacaatggct ctgggctctg taa 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-α-SMA Reverse

<400> 6

ctgtgcttcg tcacccacgt a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Col1A1 Forward

<400> 7

cccgggtttc agagacaact tc 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Col1A1 Reverse

<400> 8

tccacatgct ttattccagc aatc 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Col3A1 Forward

<400> 9

aatcaggtag acccggacga 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Col3A1 Reverse

<400> 10

tcgagcaccg tcattaccc 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Forward

<400> 11

ggatttggtc gtattggg 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse

<400> 12

ggaagatggt gatgggatt 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-ZEB1 Forward

<400> 13

aacgcttttc ccattctggc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-ZEB1 Reverse

<400> 14

ttgccgtatc tgtggtcgtg 20

Claims

1.抑制ZEB1基因的siRNA在制备抑制人心脏成纤维细胞ZEB1基因药物中的应用，其特征在于：

抑制ZEB1基因的siRNA，序列如si-ZEB1-1或si-ZEB1-2所示：

si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；

si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的siRNA后，能回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型；

所述的miR-590-3p：5'-UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'。