CN113265428B

CN113265428B - 一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用

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Publication number: CN113265428B
Application number: CN202110655541.8A
Authority: CN
Inventors: 梁洋; 滕春波; 马明君; 于泽; 聂玉哲; 刘淼
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113265428A

Abstract

一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用，它涉及生物检测领域，本发明有效地感知细胞内铜的变化，为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制提供帮助。本发明的检测系统是由金属硫蛋白的MT1F与EGFP结合形成的检测系统；所述的MT1F为启动子与EGFP结合，其中，MT1F启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明的P_MT1F‑EGFP报告系统能有效地感知细胞内铜的改变，可作为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制的工具。本发明应用于生物领域。

Description

一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用。

背景技术

铜离子是生物体中不可或缺的微量元素之一。它以Cu(I)和Cu(II)的形式存在于生物中。由于其具有氧化还原特性，铜离子可以用作许多酶的辅助因子，并在与酶结合后参与一些重要的生命活动。结缔组织的形成，抗氧化作用，细胞呼吸作用，神经信号传导以及细胞外基质的成熟都与铜离子有关。细胞内铜离子的异常水平与威尔逊氏病，孟克斯病，老年性痴呆等疾病的发生发展密切相关。

肿瘤细胞中铜离子的水平高于正常细胞，并且肿瘤细胞的增殖和扩散与细胞内铜离子密切相关。目前有一些工具可用于检测细胞内铜离子，例如同位素标记，ICP-MS和化学荧光探针。尽管使用化学荧光探针跟踪金属离子在细胞内的存储已取得很好的进展，但它们仍存在许多需要解决的问题，例如铜探针可以检测到的铜离子浓度范围很小，无法实时检测细胞内铜离子变化的动态等。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜离子的活细胞检测的方法，有效地感知细胞内铜的变化，为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制提供帮助。

本发明的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统，它是由金属硫蛋白的MT1F与EGFP结合形成的检测系统；所述的MT1F为MT1F启动子与EGFP结合，其中，MT1F启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

进一步地，所述的检测系统用于检测活细胞内Cu(I)变化。

进一步地，所述的检测系统是将MT1F启动子连接到含有GFP的慢病毒干扰载体pLV3-GFP-Puro-H1上形成慢病毒载体作为检测系统。

进一步地，所述的MT1F启动子是以8988T人胰腺导管上皮癌细胞基因组DNA为模板，通过以下引物进行PCR扩增得到；

MT1F-P-LV3 F：ATCGCTATTACCATGTCTAGATATTGAAGGGAATTAACCACTTGTCT；MT1F-P-LV3 R：CTCTCCATGGTGGCGTCTAGATGCAAGCCGAGGAGAGACTG。

本发明的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统应用，它用于检测活细胞内铜变化，所述的铜为Cu(I)。

进一步地，所述的活细胞为Panc-1细胞、8988T细胞、293T细胞、HepG2细胞和肝细胞

本发明的P_MT1F-EGFP报告系统的工作机制：

本实施例建立的铜报告系统工作机制为：细胞外铜离子通过SLC31A1进入细胞，然后与细胞内铜结合蛋白如MT1F，以及含有铜离子结合位点并对铜敏感的MTF1结合。MTF1作为与MT1F启动子结合的转录因子进入细胞核，促进MT1F的表达。MT1F在细胞质中表达，反映细胞中铜离子的水平(图6)。

本发明建立一个铜离子的活细胞报告系统。首先，寻求能特异性反映细胞内铜离子变化的铜敏感基因。金属硫蛋白(Metallothioneins,MT)是富含半胱氨酸的小分子量蛋白质，是一种典型的铜离子结合蛋白，在铜离子浓度的增加中起着重要作用。MT分为四个亚型MT1，MT2，MT3，MT4，它们位于细胞质中，并参与生物系统中铜的吸收，转运和调节。已经证实MTs防止细胞受到氧化应激的影响，并参与正常细胞和癌细胞的分化、增殖或凋亡。各个MT具有各种不一的金属离子的结合偏好，这与功能特异性有关。我们通过数据挖掘分析、RNA-seq和qPCR分析对胰腺癌细胞中的铜反应MTs进行了筛选。发现外源铜离子诱导后，MT1E、MT1F和MT1X mRNA均显著上调。通过构建以MT1E、MT1F或MT1X启动子启动的EGFP为报告系统的的稳定细胞系，发现只有P_MT1F-EGFP能够特异性、稳定地报告多种细胞中(包括Panc-1、8988T、293T、HepG2和正常肝细胞)的细胞内Cu(I)变化，表明P_MT1F-EGFP是体内Cu(I)理想的报告系统。利用P_MT1F-EGFP报告系统，我们发现MEK抑制剂(U0126)和黄芪甲苷可以显著增加细胞内铜离子。根据这些结果，本发明的P_MT1F-EGFP报告系统能有效地感知细胞内铜的改变，可作为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制的工具。

附图说明

图1为本发明P_MT1F-EGFP铜离子报告系统的建立过程图；其中，A为MT1E、MT1F、MT1X启动子区的结构和铜报告系统的载体构建示意图，B为慢病毒感染8988T细胞2天的图像；放大倍数：200倍；

图2为本发明P_MT1F-EGFP铜离子报告系统鉴定图；其中，A为用CuSO₄处理8小时或24小时的报告细胞的荧光强度通过Varioskan LUX多功能酶标仪测量图，±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001；B为用荧光读数法测定用CuSO₄处理8小时或24小时的1,2-D染色细胞的荧光强度，±SEM，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，**p<0.001(注：图中左侧部分的4附图中，右下角的一副图为B，其余三幅图均为A)；C为慢病毒LV3-EGFP感染的细胞作为对照，用CuSO₄处理它们24小时，然后通过荧光读数计算它们的荧光水平；

图3为本发明P_MT1F-EGFP报告系统对硫酸铜(CuSO₄)、柠檬酸铁铵(FAC)或硫酸锌(ZnSO₄)反应图；其中，A为经CuSO₄、FAC或硫酸锌处理24h的PMT1F-EGFP 8988T细胞荧光强度的变化；B为8988T细胞用1,2-D处理，流式细胞仪检测作为对照，C为对照报道细胞用流式细胞仪或硫酸锌处理24h，然后通过荧光读数进行分析图；

图4为本发明P_MT1F-EGFP报告系统对铜离子特异性反应图；A为用si-SLC31A1或si-ATOX1转染PMT1F-EGFP 8988T细胞24h，并通过流式细胞仪分析EGFP荧光强度；B为SLC31A1分别与MT1E、MT1F或MT1X的相关性分析；C为EGFP阳性细胞经CuSO₄或吐温处理后用流式细胞仪计数；所有数据代表平均扫描电镜，n＝3，*P<0.05，**P<0.01；

图5为几种稳定表达P_MT1F-EGFP报告系统的细胞系对铜离子的响应图；A为P_MT1F-EGFP HL细胞(人正常肝细胞)用浓度梯度的铜(0，20，40μM)处理并通过流式细胞仪检测；B为P_MT1F-EGFP HepG2肝癌细胞经铜浓度梯度处理后，流式细胞仪检测；C为P_MT1F-EGFP 293T细胞经铜浓度梯度处理，流式细胞仪检测；

图6为P_MT1F-EGFP报告系统的运行机理图；

图7为P_MT1F-EGFP报告系统监测抑制剂对8988T细胞的铜离子影响图；其中，A为10μM U0126、10μM LY294002或10μM STTATIC处理P_MT1F-EGFP 8988T细胞48h；通过蛋白质印迹分析AKT、ERK1/2和STAT3的磷酸化，并分别对总AKT、ERK或STAT3进行定量图；B为处理48h后用流式细胞仪检测P_MT1F-EGFP细胞；C为用CCK-8法检测20μM黄芪类药物对细胞增殖的影响图；用黄芪甲苷处理48h后，用蛋白质印迹法分析ERK1/2的磷酸化，±SEM，n＝3。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001；D为流式细胞仪检测黄芪药物培养细胞的EGFP变化图；

图8为P_MT1F-EGFP报告系统监测黄芪甲苷影响细胞内铜离子水平图；其中，A为用20μM黄芪甲苷处理细胞24h，显微镜观察细胞迁移能力图；B为用20和40μM黄芪甲苷分半处理细胞24h，检测细胞ROS水平图；C为细胞用或不用TM预处理(50μM)24h，然后用20μM黄芪甲苷处理24h，EGFP荧光由流式细胞仪检测图；D为用20μM黄芪甲苷处理细胞48h，并使用AnnexinV/PI试剂盒检测细胞凋亡图；

图9为pLV3-GFP-Puro-H1质粒图。

具体实施方式

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

一、实验试剂

1)Cu探针，1,2-D，粉末使用DMSO溶解，配置成母液，用0.22μM滤器过滤，-20℃长期避光贮存，使用时以千分之一的比例加入培养基；

2)RPMI-1640完全培养基：向50mL管中加入400μL Glumax，4mLFBS，400μL双抗，再加入RPMI1640基础培养基补齐至40mL，均匀混合，放置4℃封存。

3)细胞冻存液：9mL FBS，1mL DMSO混合均匀，配置10mL。

4)1×PBS溶液：称取0.2g KCl，10.0g NaCl，1.15g Na₂HPO₄，0.2g KH₂PO₄，加入ddH₂O直至1000mL，灭菌锅选择液体灭菌程序，2h后置于4℃保留。

5)CuSO₄溶液：称取2.49g CuSO4·5H₂O，加入ddH₂O定容至10mL，用0.22μM滤器过滤得到浓度为1M的CuSO₄长期储存液。将1M的CuSO₄储存液取10μL加入990μL灭过菌的ddH₂O得到10mM CuSO₄储存液，置于-20℃保存备用。

6)TM溶液：称取0.26g TM，加入DMSO至100mL，用0.22μM滤器过滤得到浓度为10mM的TM长期贮存液，分装后置于-20℃保存。

二、实验方法

利用Promoter 2.0和EPD等启动子分析软件分析MT1E、MT1F、MT1X的启动子序列，据此及稳定表达载体pLV3-GFP-Puro-H1设计MT启动子克隆引物和酶切位点。

1、含有GFP载体的构建

利用XbaI限制性内切酶对慢病毒干扰载体pLV3-GFP-Puro-H1质粒(购买得到)进行单酶切，37℃PCR仪酶切1h，酶切体系如表1所示：

表1 酶切反应体系

设计的MT亚型启动子的同源重组引物(见表4)，以8988T人胰腺导管上皮癌细胞的基因组DNA为模板，启动PCR扩增，克隆得到的即为MT亚型启动子区域，50μL体系，95℃预变形两分钟，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，34个循环，终延伸5min，最后4℃终止反应；PCR反应体系见下表：

表2 PCR反应体系(50μL)

酶切反应结束后加入loading buffer终止酶切反应，将pLV3-GFP-Puro-H1质粒酶切产物以及PCR扩增所得到的产物利用Thermofisher的GeneJET Gel Extraction Kit进行胶回收。

将胶回收的载体片段和MT亚型启动子(MT1E、MT1F、MT1X)PCR产物利用诺唯赞的同源重组ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒进行连接，设置程序50℃、5min，结束后放置于4℃保存，连接体系见下表。

表3 连接体系

将连接产物转化至感受态细胞Trelief^TM 5α内进行扩增后提取纯化质粒，分别得到

2、病毒包装、收集和侵染胰腺癌细胞

1)HEK293T细胞铺板20-24h后观察细胞状态，密度达70％-80％后可开始转染的准备。三质粒混合物准备(A液)，如下表：

表5 病毒转染体系

PEI转染稀释物配置(B液)：15μl PEI solution，100μl 5％glucose；

2)A液和B液配置完成后涡旋1min，室温静置10min。之后将A液和B液加在一起，仍然旋涡振荡1min，室温静置10min；

3)将10cm皿中培养基弃去，用PBS洗1遍，加入6mL没有血清的基础培养基。A液和B液混匀十分钟后，将混合液滴加入培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱培养6-8h，6-8h后补加800μL ES-FBS血清。转染24h后补加7ml的RPMI-1640完全培养基；

4)慢病毒收集：转染48h或72h后，可分别收集慢病毒液，将培养皿中上清吸取，转移到干净的15mL管中，用0.45μM滤膜过滤；

5)将过滤后的慢病毒液分装至1mL离心管中，-80℃储存。病毒避免反复冻融。

6)病毒侵染：取出-80℃保存的病毒，4℃解冻，待8988T细胞在6cm皿细胞汇合度70％左右时，加入1.5mL慢病毒液和1.5mL完全培养基，以及3μL的polybrane(聚凝胺)，37℃培养箱培养24h；

7)24h后荧光显微镜观察是否有绿色荧光产生，有则说明有细胞被成功侵染；

8)病毒侵染24h或48h后，加入终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，筛选24h或48h后换成正常的完全培养基，挑8988T单克隆细胞进行培养，培养成细胞集落后继续传代培养。

3、铜离子探针检测细胞内铜离子水平

1)以每孔1×10⁵个细胞的密度将上一步慢病毒浸染并筛选后的8988T细胞铺一个12孔板；待细胞贴壁后分别用终浓度为30μM CuSO₄溶液和50μM TM溶液处理细胞。

2)48h后换液，用PBS洗两遍，加入基础培养基；向培养基中加入千分之一浓度的铜离子探针1,2-D，轻轻摇匀，避光放置于37℃培养箱中20min；

3)将细胞消化，PBS洗两遍后用PBS制成细胞悬液，利用流式细胞仪BD C6检测FL3通道内的荧光强度，以分析游离Cu含量。

4、细胞转染

1)将步骤2慢病毒浸染并筛选后的8988T细胞用胰酶消化后计数，以每孔5×10⁴个细胞铺一个24孔板。

2)细胞贴壁后，等到细胞密度达到70％时进行转染；

3)利用Lipofectamine RNAi MAX(购买自北京全式金技术有限公司)的说明书进行细胞转染，实验组每孔转染15pm si-Atox1，对照组每孔转染15pm Control。

4)转染4-6h后将培养基更换为RPMI-1640完全培养基。

5、流式细胞仪检测GFP荧光

将步骤2转染并筛选后的8988T细胞铺6孔板，分别用终浓度为10、20、30、40及50μMCuSO₄处理细胞48h，胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，最后用200μL PBS将细胞重悬，流式细胞仪BD C6检测FL-1变化。

6、荧光酶标仪检测GFP荧光

将步骤2转染并筛选后的8988T细胞铺24孔板，分别用终浓度为10、20、30、40及50μM CuSO₄处理细胞48h，利用酶标仪检测，设置读底，激发光为480nm±20nm，发射光为535nm±20nm。

二、实验结果

1、铜报告系统的建立

金属硫蛋白对铜离子的反应主要是由于金属调节转录因子MTF1与金属硫蛋白基因启动子上的MRE结合。因此，本实施例分析了MT1亚型启动子，发现MRE核心区主要由“TGCRCNC”组成。对转录起始位点上游约2000bp的MT亚型DNA序列的分析表明，在MT1E上有三个MRE，集中在-600附近，而在MT1F或MT1X启动子上分别有五个MRE区域(见图1A)。因此根据MRE的位置分别截取了MT1E、MT1F启动子前1000bp，以及MT1X前2000bp替换了病毒载体中的CMV启动子。

MTF1与MT基因启动子的MRE区结合，在高铜离子存在下激活其表达。因此，本实施例使用MT特异性启动子驱动的EGFP构建了几个慢病毒载体，命名为P_MT1E-EGFP、P_MT1F-EGFP和P_MT1X-EGFP，CMV-EGFP作为对照。分别用这些载体中慢病毒侵染8988T细胞2天的图像如图1B，用嘌呤霉素筛选以获得稳定表达的细胞系，筛选之后挑单克隆细胞，待单细胞长成集落后传代培养。

2、铜报告系统的鉴定

然后分别用20μM、30μM和50μM CuSO₄处理上述获得的报告细胞系(步骤2转染并筛选获得的8988T细胞)，结果显示，通过铜化学探针1,2-D检测证实细胞内铜离子增加(图2A)。在LV3-EGFP对照细胞中没有检测到EGFP水平的变化(图2C)，而在P_MT1F-EGFP细胞中，随着铜离子在8h和24h的增加，荧光强度也稳定增加(图2A)。相比之下，通过自动酶标仪检测，P_MT1E-EGFP或P_MT1X-EGFP细胞在两个时间点都没有线性增加(图2B)。以上结果显示，只有P_MT1F-EGFP报告显示稳定和及时的铜特异性反应。

3、铜报告系统的特异性

通过对细胞进行硫酸铜(CuSO₄)、柠檬酸铁铵(FAC)或硫酸锌(ZnSO₄)浓度梯度处理来确定P_MT1F-EGFP是否对其他的金属离子有反应。结果表明，P_MT1F-EGFP细胞仅对铜离子浓度变化有反应(由铜探针证实(如图3-B))，而对锌或铁离子的浓度变化没有明显的响应(图3-A)，CMV-EGFP对照细胞对硫酸锌或柠檬酸铁铵处理无反应(图3C)。

本实施例通过干扰细胞表面铜转运蛋白CTR1的表达来研究P_MT1F-EGFP报告系统对内源性铜变化的反应。与预期结果相一致，通过流式细胞术检测的si-CTR1转染的P_MT1F-EGFP细胞中，荧光强度显著降低(图4-A)。数据挖掘分析表明，CTR1与PDAC样本中的MT1E、MT1F或MT1X mRNA水平之间没有相关性(图4-B)，表明这些MT表达与生理条件下CTR1的表达无关。这些发现进一步说明P_MT1F-EGFP报告系统仅对铜离子的变化敏感。同时，Atox1的干涉显著增加了EGFP水平，表明细胞内铜水平增加(图4-C)，这与先前的报导一致。当使用铜螯合剂TM处理P_MT1F-EGFP细胞得到了与RNA-seq数据相似的结果，即TM处理增加了细胞内铜离子水平(图4-C)。

4、报告系统适合多种细胞系

为了进一步说明P_MT1F-EGFP作为铜离子检测的报告系统适用于其他细胞系，本实施例测试了P_MT1F-EGFP在HEK293T人肾上皮细胞、HepG2人肝癌细胞和HL人正常肝细胞中的铜反应(测试过程与8988T细胞相同)结果如图5。结果表明，P_MT1F-EGFP针对上述所有细胞系均可有效报告细胞内铜离子的变化。

实施例2

本实施例以P_MT1F-EGFP铜报告系统进行应用，证明P_MT1F-EGFP系统能够有效检测活细胞内的铜变化。

将报告细胞(病毒侵染并筛选的胰腺癌细胞8988T)复苏后传3代进行如下实验：

1、实验试剂

1)PMSF、Proteinase K等由北京全式金技术有限公司购得；

2)Western blot所用抗体见下表：

表6抗体

3)信号通路抑制剂：U0126、LY294002、STTATIC均购于MCE，粉末用DMSO溶解，配置成浓度为10mM母液储存在-20℃冰箱，使用时按比例稀释。

4)黄芪类药物：异黄芪苷I、薯蓣皂苷元、黄芪苷IV(黄芪甲苷)、黄芪苷I和黄芪苷II，母液浓度为10mM，-20℃冰箱保存。

2、实验方法

2.1、Western blot检测蛋白

1)取6cm皿的待检测报告细胞，药物处理48h，弃去培养基，PBS洗两遍，吸干净液体后加入200μL RIPA裂解液，4℃摇床裂解10min，之后用细胞刮下贴壁的细胞，将裂解液转移至1.5mL离心管中，冰上静置10min。

2)离心管置于4℃离心机以12,000rpm的转速离心10min，将上清转移至新的离心管中。

3)利用BCA试剂盒检测蛋白浓度，20μg每管分装蛋白，-80℃冰箱保存。

4)洗净1.0mm玻璃板和梳子并晾干，组装配胶仪器，配制8mL 10％的分离胶，加入ddH₂O压平，待分离胶凝固，和ddH₂O之间形成一条线之后，倒掉上层的ddH₂O，用滤纸吸干。而后配制5mL 5％的浓缩胶，灌入玻璃板中。

5)分装的蛋白样品冰上融化后加配好的5×SDS-PAGE loading buffer后，利用移液器吹打混匀，沸水中煮10min，使得蛋白变性充分，冰上静置冷却。

6)将准备好的样品加入胶孔内，调节电压跑胶电泳，电压150V，50-60min。

7)将硝酸纤维膜以及滤纸放置于转膜缓冲液中浸湿，浸泡15min。

8)电泳结束后，将胶板中的胶取下，在转膜缓冲液中按照海绵、滤纸、硝酸纤维膜、胶、滤纸、海绵从转膜器印板的正极到负极依次叠压，在叠放过程用玻璃棒赶走气泡。转膜槽置于冰中。转膜时间为300mA，70min。

9)蛋白封闭。配置5％BSA(用1×TBST溶液配置)，将膜置于37℃，5％BSA中封闭1h。

10)孵育一抗：根据所需抗体说明书推荐浓度，使用一抗稀释液稀释一抗，4℃摇床孵育过夜。

11)将一抗做好标记回收。室温摇床洗膜。用1×TBST溶液洗5次，每次5min。

12)孵育二抗：5％BSA稀释二抗，根据所用一抗来源选择辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠或山羊抗兔的二抗，1：3000稀释，37℃孵育1h。

13)重复步骤11。

14)将ECL超敏发光液的A液和B液1：1的比例混合，覆盖滴加到NC膜孵育，利用Tanon全自动化学发光成像分析系统对NC膜上的ECL发光成像。

15)利用Image J-pro plus软件定量灰度分析Western条带数值。

2.2、检测细胞内活性氧

原位装载探针法：

1)首先按照比例1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(终浓度10μM)。

2)吸走待检测报告细胞中培养液，1×PBS清洗2次，加入稀释好的DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20-30min(在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup)。

3)吸走稀释液，再用PBS洗细胞2-3遍(尽量去掉未进入细胞内的DCFH-DA)。

通常活性氧阳性对照在处理实验细胞20-30min后显著提高活性氧含量。

4)收集细胞后用PBS重悬，利用流式细胞仪BD C6检测。

2.3、CCK8检测细胞增殖

1)按每孔5,000个细胞，将待检测报告细胞接种到96孔板中，待细胞密度达到60％左右时加药处理。

2)加药处理48h后弃去培养基，用1×PBS洗两遍细胞。

3)根据每孔10μL CCK8，90μL基础培养基配制公共体系。

4)将配制好的公共体系混匀，每孔加入100μL配制好的工作液

5)将96孔板放置在37℃培养箱进行孵育，0.5h左右后取出，并由铝箔纸包好避光，用酶标仪检测各孔吸光值。

2.4、流式细胞仪检测细胞死亡

使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit试剂盒染色并通过流式细胞仪检测细胞死亡。

1)报告细胞铺24孔板按每孔50％细胞即5×10⁴个细胞进行铺板。

2)对细胞进行AS-IV处理，使其终浓度分别为0、20、40μM。

3)药物处理48h后，弃去培养基，PBS清洗2遍，胰酶消化细胞后计数，将×10⁵个细胞收集到离心管中，1,000rpm离心4min。

4)离心后弃掉上清，用200μL 1×Binding Buffer重悬细胞，吹打混匀后加入2μLAnnexin V-FITC和2μL PI Staining Solution轻轻吹打混匀。

5)避光室温静置20-30min，利用流式细胞仪BD C6分析所有样品。

2.5、划痕实验检测细胞迁移

1)以每孔4×10⁵个报告细胞的密度铺一个六孔板；

2)细胞贴壁后，用PBS洗两遍，每个孔加入含有DMSO或AS-IV的完全培养基处理24h；

3)药物处理24h后，将培养基弃去，PBS洗两遍，用黄枪头于板子底部划出三条平行的直线；

4)划完直线后用PBS冲洗细胞三次，直至没有悬浮的细胞，加入无血清的基础培养基于六孔板中；

5)放入37℃、5％CO₂培养箱培养，24h后拍照观察细胞迁移情况。

3、结果

(1)P_MT1F-EGFP报告系统监测抑制MEK1活化升高细胞内铜离子变化

铜已被证明在MAPK途径中发挥了极其关键的作用。体外研究表明，重组MEK1以高亲和力结合两个铜原子，铜以剂量依赖性方式增强ERK的MEK1磷酸化。本实施例使用P_MT1F-EGFP报告系统监测MEK1/2抑制是否也能改变细胞内铜离子水平。用MEK1/2抑制剂U0126、PI3K抑制剂Ly294002或STAT3抑制剂Sttatic处理8988T细胞，其抑制作用通过蛋白质印迹分析得到证实(图7-A)。流式细胞仪分析结果表明，对甲乙酮的抑制提高了细胞内铜离子，而Ly294002和Sttatic对铜离子水平无影响。同时，用探针1,2-D检测细胞内铜离子证实了本实施例的结果(图7B)。

有报道表明，黄芪类药物对癌细胞的增殖等信号通路具有影响。于是本实施例用不同类型和浓度的黄芪类药物，包括异黄芪苷I、薯蓣皂苷元、黄芪苷IV(黄芪甲苷)、黄芪苷I和黄芪苷II处理8988T细胞。并利用本发明的P_MT1F-EGFP报告系统进行检测上述黄芪类药物对8988T细胞铜离子含量的影响。结果表明，只有黄芪甲苷显著抑制细胞增殖，并以浓度依赖性方式促进细胞凋亡(图7-C)。通过蛋白质印迹证实了黄芪甲苷对ERK激活的抑制作用(图7-C)。有趣的是，黄芪甲苷也显著增加细胞内铜离子含量(图7-D)。

(2)P_MT1F-EGFP报告系统监测黄芪甲苷通过影响细胞内铜离子水平引起细胞凋亡

为了研究药物对细胞凋亡的影响，本实施例用黄芪甲苷IV处理细胞，并利用本发明的P_MT1F-EGFP报告系统进行检测处理后的活细胞内铜离子变化。结果发现细胞迁移能力减弱(图8-A)，ROS水平上升(图8-B)。用流式细胞仪检测细胞凋亡。黄芪甲苷IV可以诱导细胞凋亡(图8-D)。由于AS-IV可能会将铜离子带入细胞，利用铜螯合剂TM对细胞进行预处理，以去除培养基中的铜离子。黄芪甲苷仍然增加低铜环境中细胞内铜离子的水平(图8-C)。

综上，本实施例利用P_MT1F-EGFP报告系统，发现即使在低铜微环境下，黄芪甲苷也能显著升高细胞内铜水平，说明黄芪甲苷能促进内源性铜的释放，使得细胞内游离的铜离子浓度升高。总之，无论是外源性补铜还是内源性铜变化，P_MT1F-EGFP报告系统都能及时报告细胞内铜离子的变化。此外，该报告系统为铜依赖性药物筛选及铜对正常或病理生理影响的机制研究提供了一种新的有用工具。

序列表

<110> 东北林业大学

<120>一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用

<160> 7

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213>脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）。

<400> 1

tattgaaggg aattaaccac ttgtctttct tacttcttat gttaagtttt tctttttctt 60

tttcttttct ttcttttctt ttcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttgag 120

agggagtttc actcttgttg cccaggatgg agtgcaaaaa tggtgcgatc tcggctcacc 180

gcaaactccg ccttcagtga tctcgcttct gggggcatcc catattttcc aaactgccat 240

cctatagtgg ggtgcccgtc gaggctgtgg ggagaccccg gagagattta tgcaaaggag 300

gacccagaca aatgtgccca ttcagcctct caagagtgaa gaatggaaga gaggggggca 360

gagccctgtg tcttccgtgt tgctgtgcgc aggagaaaca tggccaaagg actgaggtgg 420

ggtgacaggg acaggcaatg ctagagatcc gaaggtcaca tcctcggcct gtcctttgca 480

cactactccc ttgctaggct ccctgctccc gccaatctag acagtggcgc aagagactgg 540

ggttgcactg ggactccagg aaaggcttag ctgttgacga aggaccgggg cggggccggg 600

gggcggggcg aaggccagga tctccaggta cccggaaccc caaggggcgg gtgtagcagg 660

caatcttggc gaaactggga agggcgggca ggagggcagg gaagccgctc acccaggcac 720

aaagcgcctc ccgcttgagc ggactccaaa gggacggtcc gcggtgtgca gcgagctgcg 780

ctcaggggac cttgcgcccg gcccttctgc tgcacacagc ccacccagga cctcccgcag 840

cgctgacagg cggggcgggt gcaaagacgg ggcggggtct ctgcgcccgg ccccctcccc 900

tgactatcaa agcagcggcc ggctgttggg gtccaccacg ccttccacct gccccactgc 960

ttcttcgctt ctctcttgga aagtccagtc tctcctcggc ttgca 1005

<210>2

<211>39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1E-P-LV3 F。

<400> 2

ATCGCTATTACCATGTCTAGAAGCCACCGCTCCCGGCCT 39

<210>3

<211>40

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1E-P-LV3 R。

<400> 3

CTCTCCATGGTGGCGTCTAGATTCGAGCAAAGGGGATGCT 40

<210>4

<211>47

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1F-P-LV3 F。

<400> 4

ATCGCTATTACCATGTCTAGATATTGAAGGGAATTAACCACTTGTCT 47

<210>5

<211>41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1F-P-LV3 R。

<400> 5

CTCTCCATGGTGGCGTCTAGATGCAAGCCGAGGAGAGACTG 41

<210>6

<211>45

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1X-P-LV3 F。

<400> 6

ATCGCTATTACCATGTCTAGAGTCTAAGGCATCTGGTGATAGCAG 45

<210>7

<211>41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> MT1X-P-LV3 R。

<400> 7

CTCTCCATGGTGGCGTCTAGATTCGAGGCAAGGAGAAGCAG 41

Claims

1.一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测产品，其特征在于它是由金属硫蛋白的MT1F基因的启动子与EGFP结合形成的检测产品；其中，MT1F基因的启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测产品，其特征在于所述的检测产品是将所述MT1F基因的启动子替换慢病毒干扰载体pLV3-GFP-Puro-H1上的CMV启动子所形成的。

3.如权利要求1所述的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测产品的应用，其特征在于它用于检测活细胞内铜变化，所述的铜为Cu(I)。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的活细胞为Panc-1人胰腺癌细胞、8988T人胰腺导管上皮癌细胞、 HEK293T人肾上皮细胞、HepG2人肝癌细胞和HL人正常肝细胞。