CN113215194B - 一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用 - Google Patents

一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用，所述制作方法包括如下步骤：1)获取响应启动子：提供能被重金属诱导表达的基因的启动子序列，设计引物，扩增得到对重金属有响应的启动子，即响应启动子；2)载体构建：将步骤1)获得的响应启动子连接到载体中，得到连接有响应启动子的载体，即响应载体，所述响应载体还包括荧光蛋白序列；3)注射培养：将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至海水青鳉的受精卵，培养获得能够监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉。本发明提供了一种方便快捷、灵敏度高的生物监测手段，对实现海洋重金属污染的实时监测有重要的推动作用。

Description

一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用
技术领域
本发明涉及基因工程与环境科学技术领域，特别是涉及一种监测海水重金属的转荧光蛋白海水青鳉的制作与应用。
背景技术
生物监测是指从生物学角度评价环境质量状况的过程，通过观测生物个体、种群或群落对环境质量及其变化所产生的反应和影响，进而阐明其所处环境污染的性质、程度和范围，包括生物种群及群落调查、急性慢性毒性试验、水体微生物测试和鱼类组织污染物分析。早在20世纪初，科研者已经开展利用水生生物监测水质的工作；我国于1993年随着《水生生物监测手册》的出版，建立了国家水生生物监测网，开始在全国范围内开展水生生物监测工作。在21世纪初，我国生物监测工作得到很好地完善。但是针对海水环境的生物监测方法目前还是在起步阶段，许多技术方法还不成熟，迫切需要大量的技术支撑。
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一种低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，能够被重金属高效诱导表达。因此，金属硫蛋白可作为监测重金属含量的重要生物标记物。虽然，翡翠贻贝和斑马鱼的金属硫蛋白已克隆并构建转基因的斑马鱼，用于监测环境水体中的重金属，但是由于它们的金属硫蛋启动子没有进行优化筛选，所获得的转基因的斑马鱼并不能高灵敏度地监测水体中的重金属，实际应用价值不大。而且，这类转基因的斑马鱼只能针对淡水环境进行监测，在海水或咸水环境中不能进行应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用，用于解决现有技术中金属硫蛋白转基因斑马鱼对水体重金属监测灵敏度低、不适于监测海洋环境中重金属等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种监测海水中重金属的转荧光蛋白基因鱼的培养方法，包括如下步骤：
1)获取响应启动子：提供能被重金属诱导表达的基因的启动子序列，设计引物，扩增得到对重金属有响应的启动子，即响应启动子；
2)载体构建：将步骤1)获得的响应启动子连接到载体中，得到连接有响应启动子的载体，即响应载体，所述响应载体还包括荧光蛋白序列；
3)注射培养：将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至海水青鳉的受精卵，培养获得能够监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉。
本发明培养的用于监测海水重金属的鱼选自海水青鳉，当然，其他鱼类如斑马鱼、淡水青鳉、稀有鮈鲫、罗非鱼、黄颡鱼等也可适用。根据鱼的种类扩增其mt启动子序列。进一步，步骤1)中，被重金属诱导表达的基因为海水青鳉金属硫蛋白(mt)基因。
进一步，步骤1)中，所述响应启动子为海水青鳉金属硫蛋白启动子(即mt启动子)，所述金属硫蛋白启动子含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步，所述重金属选自Zn、Cd、C和Hg中的至少一种。
进一步，步骤1)中，提取并纯化海水青鳉的基因组DNA，通过巢式PCR获得响应启动子。
进一步，步骤1)中，巢式PCR第一轮反应的引物为mt-nested-F和mt-nested-R，mt-nested-F的序列如SEQ ID NO.2所示，mt--nested-R的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，步骤2)中，所述响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统。
进一步，步骤2)中，所述荧光蛋白选自eGFP，所述eGFP序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，步骤2)中，采用转染试剂将响应载体瞬时转染至细胞中，重金属暴露，筛选得到对重金属有响应效果的响应载体，转入下一步进行注射。
进一步，步骤2)中，将步骤1)的PCR产物(即mt启动子，mt promoter)与pEASY-Blunt3 Cloning Kit克隆连接，获得pEASY-mt promoter载体；在质粒pI-Sce1-SPG3000-LUC后面加上荧光蛋白eGFP，再将pEASY-mt promoter载体与质粒pI-Sce1-SPG3000-LUC双酶切后获得mt启动子和pI-SceI–eGFP骨架，将mt启动子和pI-SceI–eGFP骨架连接，PCR培养后获得响应载体pI-Sce1-OmMT-eGFP质粒；所述质粒pI-Sce1-SPG3000-LUC的序列如SEQ IDNO.4所示。其中，Om是指海水青鳉(Oryzias melastigma)。
进一步，步骤2)中，对pI-Sce1-OmMT promoter质粒进行质粒改造，获得对重金属响应最显著的质粒，步骤如下：海水青鳉金属硫蛋白启动子包括两个金属调节元件MRE，一个位于TATA盒附近，一个在末端，还包括三个连续的激活蛋白ap1，将海水青鳉金属硫蛋白启动子进行截断或插入多重串联MRE，通过筛选验证获得对重金属响应最显著的质粒(即OmMT(D1&2)质粒)，其序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步，步骤2)中，对pI-Sce1-OmMT promoter质粒进行质粒改造，获得对重金属响应最显著的质粒，具体步骤如下：将质粒pI-Sce1-OmMT-eGFP进行PCR扩增，敲除D2片段，得到OmMT(D2)启动子，敲除的D2片段序列如SEQ ID NO.21所示；在敲除D2的基础上，敲除D1片段，敲除的D1片段序列如SEQ ID NO.18所示。
进一步，步骤3)中，所述核酸酶选自I-SceI酶。
进一步，步骤3)中，将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至海水青鳉的受精卵，培养获得F0代海水青鳉，筛选获得对重金属有响应的F0代海水青鳉，将有响应的F0代海水青鳉与未注射核酸酶与响应载体的野生型海水青鳉杂交，收集F1代受精卵，加入重金属暴露，筛选得到对重金属有响应的F1代海水青鳉，F1代海水青鳉再次与未注射核酸酶与响应载体的野生型海水青鳉杂交，收集F2代受精卵，加入重金属暴露，筛选得到对重金属有响应的F2代海水青鳉，将F2代海水青鳉自交，获得F3代海水青鳉，从F3代海水青鳉中筛选得到对重金属有响应的纯系转荧光蛋白基因海水青鳉。
本发明第二方面提供一种采用第一方面所述的方法培养获得的转荧光蛋白基因海水青鳉。
本发明第三方面提供如第二方面所述的转荧光蛋白基因海水青鳉在监测海水重金属中的应用。
本发明第四方面提供一种响应载体，所述响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统，所述响应载体包括响应启动子序列以及荧光蛋白序列，所述响应启动子为海水青鳉金属硫蛋白启动子(即mt启动子)，所述金属硫蛋白启动子含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步，所述荧光蛋白选自eGFP，所述eGFP序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明第五方面提供如第四方面所述的响应载体在培养用于对海水重金属进行生物监测的转荧光蛋白基因海水青鳉上的用途。
如上所述，本发明的一种监测海水中重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用，具有以下有益效果：
针对目前传统海洋环境中重金属监测方法繁琐，且需昂贵的仪器及专业的技术人员，不能实现对环境重金属进行有效的监测等缺陷，本发明利用海水青鳉这一个新兴的海水毒理模式动物，通过PCR技术，通过克隆它自身的金属硫蛋白(mt)，利用删减和增减关键识别元件，获得对重金属敏感的海水青鳉金属硫蛋白启动子，并构建携带I-SceI大范围核酸酶转移系统和绿色荧光蛋白的响应载体pI-Sce1-OmMT-eGFP，并在此基础上改造质粒得到对重金属响应程度最高的质粒，命名为OmMT(D1&2)质粒，最后通过显微注射技术，获得可以对海洋环境中重金属进行简单、高效、直观监测的转绿色荧光蛋白基因海水青鳉。
本发明是第一次报道并应用的海水环境重金属生物监测方法，解决了传统重金属监测手段中的金属硫蛋白转基因斑马鱼不适于监测海洋环境中重金属的问题；而且，本发明还实现了低阈值水平监测海水环境中的重金属含量，与传统的重金属监测手段相比，本发明对水体重金属监测灵敏度更高。
因此，本发明提供了一种方便快捷的生物监测手段，对实现海洋重金属实时监测具有重要的推动作用。
附图说明
图1显示为本发明实施例中载体pI-Sce1-OmMT-eGFP的结构图。
图2显示为本发明实施例中构建的8个质粒的启动子结构图。
图3显示为本发明实施例中OmMT(D1&2)质粒的图谱。
图4显示为本发明实施例中通过双荧光素酶实验筛选对重金属响应较强的质粒的结果图。
图5显示为本发明实施例中不同浓度的重金属暴露不同质粒转染细胞的荧光图及柱状定量图。
图6显示为本发明实施例中经Zn2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+暴露后的细胞的荧光定量图。
图7显示为本发明实施例中未注射、注射重组质粒OmMT(D1&2)和I-SceI酶、注射重组质粒OmMT(D1&2)和I-SceI酶加重金属这三种海水青鳉的荧光比较图以及它们在白场、绿色激发光和合并下的图像。
图8显示本发明实施例中四种重金属暴露转绿色荧光海水青鳉之后的荧光显微镜图(A图)及荧光强度定量图(B图)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的实质下进行各种修饰或改变。
实施例1
本实施例中涉及的核苷酸序列如表1所示。
表1
Figure GDA0004097580020000041
Figure GDA0004097580020000051
备注：
“OmMT(D1&2)质粒”中的“Om”是代表海水青鳉(Oryzias melastigma)；“m-mt-F”、“m-mt-R”、“m-actin-F”、“m-actin-R”中的“m”是代表Marine海洋；“h-actin-F”、“h-actin-R”、“h-mt-F”、“h-mt-R”中的“h”是代表human。
一、mt启动子扩增
1、海水青鳉基因组DNA提取：取野生型AB海水青鳉，剪取尾鳍20-30mg于蒸馏水中漂洗数次，吸水纸吸干表面水分，置于1.5mL离心管中，眼科剪剪碎，按TaKaRa组织提取试剂盒操作说明，加入组织裂解液200μL，蛋白酶K 20μL，RNA酶10μL，漩涡混匀，置于56℃水浴锅裂解2-3h，至无明显组织块。后续按试剂盒说明进行基因组DNA的提取与纯化。采用的试剂盒为TaKaRa MninBEST Universal Genomic DNA Extactcion Kit Ver5.0，货号：9765，供应商：宝生物工程(大连)有限公司。
2、PCR扩增：根据在NCBI上查询所得mt启动子序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，用Primer1引物设计软件进行引物设计。利用
Figure GDA0004097580020000052
HS DNA Polymerase进行巢式PCR，第一轮反应采用引物mt-nested-F(其序列如SEQ ID NO.2所示)和mt-nested-R(其序列如SEQ ID NO.3所示)，PCR反应体系为50μL，具体包括：5X PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、mt-nested-F+R Mix 1μL、
Figure GDA0004097580020000061
HSDNA Polymerase 0.5μL、海水青鳉基因组(marinemedaka genome)DNA 1μL、ddH2O 33.5μL；PCR反应程序为：98℃预热2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共30个循环，最后72℃延伸10min，待反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(该试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的条带，回收方法按试剂盒操作说明进行操作。
3、目的片段连平端载体并测序：胶回收PCR产物与pEASY-Blunt3 Cloning Kit(货号：CB301-01生产商：北京全式金生物技术有限公司)克隆连接，克隆反应体系为5μL，具体包括：PCR产物50ng、pEASY-Blunt3 Cloning Kit 1μL，总体积不足5μL时，用水补足至5μL，25℃反应18min，反应结束后将连接产物加入50μL Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入250μL平衡至室温的LB培养基，在200rpm(摇床转速)、37℃下培养1h。5000rpm离心1min，弃掉部分上清，剩余部分混匀，取全部菌液涂LA平板，37℃过夜培养。次日菌落PCR挑取阳性克隆，摇菌过夜，提质粒送生物有限公司测序，测序结果与NCBI序列进行比对，与预期结果一致，该载体命名为pEASY-mt promoter。
二、质粒构建1、质粒酶切回收目的条带：将pEASY-mt promoter和质粒pI-Sce1-SPG3000-LUC(pI-Sce1-SPG3000-LUC为实验室已有质粒，其序列如SEQ ID NO.4所示；为了观察荧光效果，验证之前，在该质粒后面加上eGFP(增强型绿色荧光蛋白，Enhanced GreenFluorescent Protein)，eGFP序列如SEQ ID NO.6所示。)用赛默飞快切酶SbfI和NcoI进行双酶切，37℃恒温水浴锅放置30min，琼脂糖凝胶电泳回收mt promoter片段和pI-SceI–eGFP骨架。mt promoter即mt启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示，pI-SceI–eGFP骨架序列如SEQ ID NO.5所示。快切酶SbfI和NcoI均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
2、采用T4DNA连接酶(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行连接反应：20μL反应体系包括10×buffer 2μL、mt promoter片段50ng、pI-Sce1–eGFP骨架100ng、T4DNA连接酶0.2μL、余量为水。PCR仪中22℃连接1h，取10μL加入100μL感受态中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2min，加入850μL平衡至室温(25℃)的LB培养基，180rpm、37℃培养1h。5000rpm离心1min，弃掉部分上清，剩余混匀，取全部菌液涂LA平板，37℃过夜培养。次日菌落PCR挑取阳性克隆，摇菌过夜，提质粒酶切鉴定，阳性质粒送江苏金维智生物科技有限公司测序，测序结果与预期一致，该载体命名为pI-Sce1-OmMT-eGFP，其结构如图1所示。
3、质粒改造
如图2所示，海水青鳉金属硫蛋白(mt)启动子(简称OmMT)总长1059bp，有两个金属调节元件(MRE)，一个位于TATA盒附近，一个在末端，还有三个连续的激活蛋白ap1。翻译从启动子后面的第一个氨基酸序列开始，通过对海水青鳉mt启动子序列的删除(序列D1、D2)和5个串联MRE元件的插入，构建另外7个大小不一的质粒：
(1)通过在pI-Sce1-OmMT-eGFP质粒上删除序列D1、D2、D1&2分别得到图2中所示的质粒OmMT(D1)、OmMT(D2)、OmMT(D1&2)。
其中，OmMT(D1&2)质粒的构建方法如下：将质粒pI-Sce1-OmMT-eGFP进行PCR扩增，敲除D2片段，得到OmMT(D2)启动子，敲除的D2片段序列如SEQ ID NO.21所示，引物D2-F的序列如SEQ ID NO.22所示，D2-R的序列如SEQ ID NO.23所示，使用Prime STAR Max Premix(2x)高保真酶，PCR程序98℃，10s；55℃，5s；72℃，30s；35个循环后，在敲除D2的基础上，敲除D1片段，敲除的D1片段序列如SEQ ID NO.18所示，引物D1-F的序列如SEQ ID NO.19所示，D1-R的序列如SEQ ID NO.20所示，使用Prime STAR Max Premix(2x)高保真酶，PCR程序98℃，10s；55℃，5s；72℃，30s；35个循环后，获得OmMT(D1&2)质粒。
(2)元件的插入是指添加5个串联的MRE元件，序列为
ctccTGCACTCacgtcgtgtTGCGCGCgcacTGCACCCaaaccttttaatcatTGCGCACctgcgcctttgcTGCACTCtgcg(SEQ ID NO.24)。
通过在pI-Sce1-OmMT-eGFP质粒上直接插入5个串联MRE元件得到图2中所示的质粒OmMT(INS)；通过在pI-Sce1-OmMT-eGFP质粒上删除序列D1的基础上插入5个串联MRE元件，删除D2的基础上5个串联MRE元件，以及删除序列D1&2的基础上插入5个串联MRE元件，分别得到图2中所示的质粒OmMT(D1-INS)、OmMT(D2-INS)、OmMT(D1&2-INS)。
上述8个质粒的启动子结构图如图2所示，接着通过实验筛选得到对重金属响应最明显的质粒。
三、质粒荧光诱导效果验证
1、细胞传代铺板：利用人肾上皮细胞细胞293T进行荧光诱导效果验证试验，将培养在25mL细胞培养瓶中的293T细胞消化传代至96孔细胞培养板中，接种细胞数量为1×104个/孔，培养基为有血清无抗生素高糖DMEM培养基，其中胎牛血清(FBS)含量为10％。DMEM，High Glucose(货号：11965175)；
Figure GDA0004097580020000071
胎牛血清(FBS)货号：10100147。DMEM与
Figure GDA0004097580020000072
胎牛血清均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
2、细胞转染：第二天，待上述96孔板中细胞长至80～85％融合，将步骤二中构建好的8个质粒利用ViaFectTM转染试剂(名称：ViaFectTM Transfection Reagent；货号：E4981；供应商：普洛麦格(北京)生物技术有限公司)进行细胞转染，转染液体系为：10μL DMEM、0.1μg质粒、0.3μL转染试剂，配制混合物时，先加质粒至DMEM培养基中混合均匀，然后将转染试剂直接加入到培养基中，不要沾到离心管壁上，立即吹打混匀，室温孵育10min。然后将混合物滴加至培养的细胞中，轻轻吹打混合均匀，继续培养6-8h。
3、双荧光素酶实验：PLB(Passive Lysis Buffer)：将5x的PLB按照1：4的比例用蒸馏水配置后，每个孔样加20μl，用完保存在-20℃。85％-90％融合度的293T细胞弃去培养液，并加入20μL PLB缓冲液冲洗杂质和死亡细胞。摇床上摇晃15min，使其充分混匀，将转速调到最小。先加100μLLARll(荧光素酶检测试剂II，Luciferase Assay Reagent II)，使用酶标仪定量荧光强度后，每一个样品中加入10μL stop&Glo试剂，酶标仪测量后读数。荧光值与海肾荧光值的比值作为计算结果。结果如图4A所示，从中筛选出荧光效果相对较好的3个质粒，如图4B所示，最后选出OmMT，OmMT(D1&2),OmMT(INS)这3个质粒进行细胞暴露实验，最后得出OmMT(D1&2)质粒效果最好，OmMT(D1&2)质粒序列如SEQ ID NO.7所示。
4、重金属梯度暴露：重金属Zn2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+的浓度梯度分别为0、0.2、2、20、200、2000μM，0、0.3、3、30、300、3000μM，0、0.4、4、40、400、4000μM和0、0.5、5、50、500、5000μM。每一个小组设3个重复，暴露48h后收样。利用荧光倒置显微镜观察荧光表达情况，结果如图5所示，其中图5A为细胞荧光图，5B为柱状定量图，柱状图表示的量化的荧光强度值。(注：由于组别及样品较多，图5中只展示了对诱导效果相对较好的重金属Zn2+暴露后的细胞荧光图及荧光强度值。)
由图5可知，对重金属响应最明显的质粒为OmMT(D1&2)，OmMT(D1&2)质粒图谱如图3所示，其序列如SEQ ID NO.7所示。
5、QPCR实验：提取的Zn2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+暴露后的细胞RNA后立刻进行反转录，使用实验对象293T细胞的β-actin基因为内参，引物稀释：h-mt、eGFP和h-actin正反引物稀释10倍，使浓度达到10μm，同时使用Takara的SYBY Premix Ex Tap II kit相关的试剂盒和对应型号的PCR仪，通过检测mt和eGFP的相对表达量，每个样品有三个平行样，同时每个反应有三个重复，荧光实时定量的总体系为10μL。
结果如图6所示，可以看到eGFP和OmMT的基因整体上呈显著上调趋势，但是在Cu-eGFP基因中，Cu显著下调了所有浓度的eGFP表达，细胞对重金属铜Cu十分敏感。重金属Cu对细胞具有严重损伤的功能，而绿色荧光蛋白eGFP又和细胞的活性具有正相关关系。因此当重金属Cu暴露浓度逐渐增大时，细胞慢慢进行分裂漂浮至死凋亡，同时随着设置的浓度越来越高，暴露的时间越来越长时，细胞死亡率增大，eGFP同时也逐渐减低及减少。对于OmMT的基因，随着重金属Zn、Cd、Cu和Hg浓度分别达到200、30、40和50μM的浓度时，OmMT基因始终显著上调且分别上调了25、40、18和3.5倍。当然，随着四个重金属的浓度再次增加，细胞呈现死亡状态，且金属对金属硫蛋白的诱导能力下降，OmMT明显降低，但是对整体OmMT基因表达没有影响。
四、显微注射
显微注射采用eppendorf FemtoJet 4i显微注射仪。显微注射前夜，挑取性成熟海水青鳉雌雄鱼进行配对，雌雄数量比例为1:1(雌雄海水青鳉各三条)，雌雄鱼用隔板分开，待第二天开灯后根据注射需要依次打开隔板，打开隔板后，雄鱼追尾雌鱼，数分钟后雌性斑马鱼即可排卵，收集受精卵用清水简单清洗，用吸管依次排放在注射凹槽中。取步骤三验证的重组质粒OmMT(D1&2)，将该重组质粒和I-SceI酶共注射到海水青鳉一细胞期胚胎中，注射液体系为10μL：OmMT(D1&2)质粒终浓度20～50ng/μL、10×buffer 1μL、I-SceI酶0.5μL、酚红0.5μL，加双蒸水补足至10μL。注射时，根据毛细玻璃管针尖大小，调试合适的注射压力和注射时间，注射针从植物极穿过到达动物极，轻踏注射踏板可以看到红色注射液进入胚胎动物极，轻轻抽出即可完成注射，单个胚胎质粒注射量控制在20-50pg。海水青鳉1细胞期的时间约为0.5h，超过1细胞期的胚胎不进行注射。注射完成后吸取孵化水将胚胎从注射盘上冲洗到一个干净的培养皿中，28℃恒温培养，获得转基因斑马鱼F0代。
五、纯合子筛选
4、F0代阳性转基因鱼后代验证：取前述步骤四获得的转基因海水青鳉F0代，将F0代转基因海水青鳉与未注射海水青鳉进行一对一配对，收集F1代受精卵，次日随机挑取5颗，加入终浓度为200uM的重金属Zn2+进行暴露，暴露2天，荧光显微镜观察荧光。将具有荧光的仔鱼挑出进行饲养，直至性成熟。
5、转绿色荧光蛋白基因海水青鳉纯合子筛选：筛选出有绿色荧光表达的F1代，继续培养至性成熟，再次与未注射的海水青鳉杂交，低浓度(20μM)重金属暴露获得有荧光表达的海水青鳉F2代，最后将筛选的F2代海水青鳉培育至性成熟后自交获得F3代，F3代与野生型杂交，若后代均有荧光表达，则表示该F3代个体为纯合子。
图7显示了未注射、注射重组质粒OmMT(D1&2)和I-SceI酶、注射重组质粒OmMT(D1&2)和I-SceI酶加重金属这三种海水青鳉的荧光比较图以及它们在白场、绿色激发光和合并下的图像。其中，Wild filed，野生型是指未注射海洋清鳉；Tg(OmMT：eGFP)是指不暴露于重金属的转基因海洋清鳉；Tg(OmMT：eGFP)+heavy metal是暴露于低浓度重金属的转基因海水青鳉荧光状态。
六、Cd2+、Zn2+、Hg2+和Cu2+暴露实验
1、转绿色荧光海水青鳉胚胎收集：试验前夜，将转基因绿色荧光海水青鳉品性成熟雌雄配对，次日收集胚胎于28℃恒温培养箱12h，剔除其中未受精的海水青鳉胚胎。
2、将重金属Zn2+(0、0.005、0.05、0.5、1μM)、Cd2+(0、0.001、0.005、0.05、0.2μM)、Cu2 +(0、0.002、0.02、0.2、1μM)和Hg2+(0、0.0002、0.002、0.02、0.1μM)分别设置浓度组进行急性暴露，每个暴露浓度设有三个平行，暴露总时间为72h。转基因海水青鳉鱼卵孵化出3天以后收集，放在六孔板里进行实验，暴露体积为5mL，分别随机放入20条海水青鳉幼鱼，每天更换一次含有相同重金属浓度的海水。实验期间，除了海水以外，其他实验条件和养殖条件相同。
3、暴露结束，MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉，利用Nikon体式荧光显微镜进行荧光观察记录。
4、样品处理：提取的暴露后的海水青鳉RNA浓度达到1ng立刻反转录为cDNA，使用实验对象293T细胞的human-β-actin基因为内参，m-mt、eGFP和h-actin正反引物稀释10倍，使浓度达到10μM，同时使用Takara的SYBY Premix Ex Tap II kit相关的试剂盒和对应型号的PCR仪，通过检测mt和eGFP的相对表达量，每个样品有三个平行样，同时每个反应有三个重复，荧光实时定量的总体系为10μL。
5、以上所有实验结果全部重复3次以上。统计数据则使用软件SPSS软件，且用P＜0.05来表示统计学差异。结果使用GraphPad Prism 5来进行分析和作图。
结果如图8所示，4种重金属暴露海水青鳉实验表明，Zn2+、Cd2+、Cu2+和Hg2+对eGFP基因均有显著上调作用，都能诱导幼鱼的eGFP基因表达，从图形中看，低浓度的重金属Zn2+(0.005μM)、Cd2+(0.001μM)、Cu2+(0.002μM)和Hg2+(0.0002μM)对eGFP有一定的诱导作用，随着重金属浓度的增加诱导效果也逐步增加，其中0.2μM的Zn2+、Cd2+和Cu2+相比于对照分别显著上调约7、8和7倍，而Hg2+浓度在0.02μM时，eGFP显著上调了约6倍之多。在OmMT基因中，四种重金属均能显著上调mt基因，尤其是Zn2+对mt蛋白具有很好的诱导作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆绵凯生物技术研究院有限公司
<120> 一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的制作与应用
<130> PYZMK2110387-HZ
<160> 24
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<400> 24
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ctgcgccttt gctgcactct gcg 83

Claims (7)

1.一种监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)获取响应启动子：提供能被重金属诱导表达的基因的启动子序列，设计引物，扩增得到对重金属有响应的启动子，即响应启动子；所述被重金属诱导表达的基因为海水青鳉金属硫蛋白基因，所述响应启动子为海水青鳉金属硫蛋白启动子，所述金属硫蛋白启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；
2)载体构建：将步骤1)获得的响应启动子连接到载体中，得到连接有响应启动子的载体，即响应载体，所述响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统，所述响应载体还包括荧光蛋白序列，所述荧光蛋白选自eGFP；采用转染试剂将响应载体瞬时转染至细胞中，重金属暴露，筛选得到对重金属有响应效果的响应载体，转入下一步进行注射，包括：
将步骤1)的响应启动子与pEASY-Blunt3 Cloning Kit克隆连接，获得pEASY-mtpromoter载体；再将pEASY-mt promoter载体与质粒pI-SceI-SPG3000-LUC双酶切后获得金属硫蛋白启动子和pI-SceI-eGFP骨架，将金属硫蛋白启动子和pI-SceI-eGFP骨架连接，PCR培养后获得响应载体pI-SceI-OmMT-eGFP质粒；所述质粒pI-SceI-SPG3000-LUC的序列如SEQ IDNO.4所示；
对pI-SceI-OmMT-eGFP质粒进行质粒改造，获得对重金属响应最显著的质粒OmMT-D1-D2，步骤如下：将pI-SceI-OmMT-eGFP质粒进行PCR扩增，敲除D2片段，得到OmMT-D2启动子，在敲除D2的基础上，敲除D1片段，得到OmMT-D1-D2质粒；所述D2片段序列如SEQ ID NO.21所示，所述D1片段序列如SEQ ID NO.18所示，所述OmMT-D1-D2质粒的序列如SEQ ID NO.7所示；
3)注射培养：将核酸酶I-SceI酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至海水青鳉的受精卵，培养获得能够监测海水重金属的转荧光蛋白基因海水青鳉。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述重金属选自Zn、Cd、Cu和Hg中的至少一种；
和/或，步骤3)中，将核酸酶与步骤2)获得的响应载体共同注射至海水青鳉的受精卵，培养获得F0代海水青鳉，筛选获得对重金属有响应的F0代海水青鳉，将有响应的F0代海水青鳉与未注射核酸酶和响应载体的野生型海水青鳉杂交，收集F1代受精卵，重金属暴露，筛选得到对重金属有响应的F1代海水青鳉，F1代海水青鳉再次与未注射核酸酶和响应载体的野生型海水青鳉杂交，收集F2代受精卵，重金属暴露，筛选得到对重金属有响应的F2代海水青鳉，将F2代海水青鳉自交，获得F3代海水青鳉，从F3代海水青鳉中筛选得到对重金属有响应的纯系转荧光蛋白基因海水青鳉。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：步骤1)中，提取并纯化海水青鳉的基因组DNA，通过巢式PCR获得响应启动子。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤1)中，巢式PCR第一轮反应的引物为mt-nested-F和mt-nested-R，mt-nested-F的序列如SEQ ID NO.2所示，mt-nested-R的序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法培养的转荧光蛋白基因海水青鳉在监测海洋水体重金属中的应用。
6.一种响应载体，其特征在于：所述响应载体为OmMT-D1-D2质粒，所述OmMT-D1-D2质粒的序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求6所述的响应载体在培养用于对海水重金属进行生物监测的转荧光蛋白基因海水青鳉上的用途。
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