CN114231562A - 一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用，涉及生物学技术领域，本发明在LCMV病毒基因组的5’UTR与NP蛋白序列的N端之间插入荧光素酶基因，构建荧光素酶报告基因标记的病毒基因组，该结果不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，产生的荧光素酶蛋白也不影响子代病毒颗粒的组装，将含有重组病毒基因组的序列插入载体并转染宿主细胞，能够拯救出高效稳定表达荧光素酶的重组病毒，该荧光素酶重组病毒株可用于借助小鼠生物发光活体成像系统建立快速高通量的抗病毒药物筛选技术或平台，为活体动物成像、药物筛选、药物作用机制及疫苗评价等提供广泛的应用价值。

Description

一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体而言，涉及一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用。
背景技术
淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)属于沙粒病毒科哺乳类沙粒病毒属，是一类有囊膜包裹的负 链分节RNA病毒。Armstrong等1933年在路易斯城爆发的流行性脑膜炎样本时发现并分离该病毒。基因组由大片段L(7.2kb)和小片段S (3.4kb)组成，其中，L片段编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶L(～200kDa)和基质蛋白Z(～11kDa)，S片段编码病毒的核蛋白NP (～63kDa)和包膜糖蛋白和包膜糖蛋白GPC(～75kDa)。每一条基因组的5’和3’两端各有一段UTR(Untranslated region)序列，并且两 端的UTR可以发生互补配对形成柄状结构。
淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒以家鼠、野鼠等啮齿类动物为宿主。LCMV可通过乳汁、唾液、尿液、粪便或气溶胶传染其他动物和人， 人类感染LCMV轻者隐性或无症状，重者临床症状多以流感样型、脑膜炎型发病。
沙粒病毒科多个成员如瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus，GTOV)、(胡宁病毒(Junin virus，JUNV)、拉沙病毒(Lassa virus，LASV)、 Lujo病毒(Lujo virus，LUJV)、马秋波病毒(Machupo virus，MACV)、萨比亚病毒(Sabia virus，SABV)、和白水河病毒和(Whitewater Arroyo virus，WWAV)在西非和南美等地区流行，可以导致感染者出现出血热等症状，严重威胁人类健康。目前临床上除了广谱的抗病毒 药物利巴韦林，没有FDA批准的特异性针对沙粒病毒的疫苗及药物，然而利巴韦林的治疗效果有限并且较大的副作用。因此，迫切病需要 通过各种研究手段来寻找新的抗沙粒病毒药物。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有：淋巴脉络丛脑膜炎重组病毒S片段的cDNA；所述重组病毒的S片段的cDNA 中插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的重组载体的构建方法，其包括：获取含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒S片段的cDNA 的重组载体，在病毒S片段的cDNA中插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间。
第三方面，本发明实施例提供了一种重组载体组合物，其包括：载体1和载体2。其中，载体1为如前述实施例所述的重组载体或如前 述实施例所述的构建方法构建获得的载体。载体2为含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒L片段的cDNA的重组载体。
第四方面，本发明实施例提供了一种重组细胞或重组菌，其含有如前述实施例所述的重组载体或如前述实施例所述的重组载体组合物。
第五方面，本发明实施例提供了一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒的构建方法，其包括：将前述实施例所述的重组载体 组合物转染宿主细胞，培养后，筛选获得表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒。
第六方面，本发明实施例提供了一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒，其由如前述实施例所述的构建方法构建获得。
第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒在制备抗病毒药物或活体成像中的应 用。
本发明具有以下有益效果：
本发明在LCMV病毒基因组S片段的5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间插入荧光素酶基因，构建荧光素酶报告基因标记的病毒基 因组，该结果不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，产生的荧光素酶蛋白也不影响子代病毒颗粒的组装，将含有重组病毒基因组的序列插入 载体并转染宿主细胞，能够拯救出高效稳定表达荧光素酶的重组病毒，病毒生长曲线与野生病毒株相似，插入的荧光素酶基因在连续传代 的过程中较为稳定，该荧光素酶重组病毒株可用于借助小鼠生物发光活体成像系统建立快速高通量的抗病毒药物筛选技术或平台，为活体 动物成像、药物筛选、药物作用机制及疫苗评价等提供广泛的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发 明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他相关的附图。
图1为质粒构建示意图；
图2为WT和不同代数的重组病毒病毒的形态和结构上的变化；
图3为WT和不同代数的重组病毒基因的检测PCR鉴定结果；
图4为WT和重组病毒生长曲线；
图5为重组病毒基因生长动力学、免疫噬斑和荧光素酶活存在正比关系；
图6为荧光素酶活测定药物的IC50；
图7为重组病毒感染后，小鼠活体成像结果；
图8为小鼠活体成像评价药物的作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明 具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
病毒的结构蛋白或者非结构蛋白被标记后，组装成的重组病毒将带上标记或者在浸染细胞中释放标记如荧光素酶，从而能够被示踪。 这种技术在反向遗传病毒学的研究中被广泛应用，近年来，荧光素酶已成功用于标记冠状病毒、JEV、HSV、流感病毒等多种病毒。
首先，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有：淋巴脉络丛脑膜炎重组病毒S片段的cDNA；所述重组病毒的S片段的cDNA中 插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间。
在优选的实施方式中，所述重组病毒S片段的cDNA的序列如SEQ ID No.1所示:5’-cgcacagtggatcctaggcatttgattgcgcatttgtcttgagaaaccattga gcaacaagatgtccttgtctaaggaagttaagagcttccaatggacgcaagcattgagaagagaattgcagagcttcacatcagatgtgaaggctgctgtcattaaggatgcaaccaaccttctgaatgggttggacttctctga ggtcagcaatgttcagaggatcatgaggaaggaaaagagagatgacaaagacctacagagactcagaagtctcaaccagactgtacattctcttgtggatttaaagtcaacatcaaagaagaatgttttgaaagtggggagg ctcagtgcagaagaactgatgtctcttgcggctgaccttgagaagctgaaggccaagatcatgaggtctgaaaggccccaggcttcaggggtatatatggggaacttaacaacacagcaactagaccaaagatctcagatcc tacagatagttgggatgagaaagcctcagcagggtgcaagtggtgtggtaagagtttgggatgtgaaagactcatcacttttgaacaatcaatttggcacaatgccaagtctaactatggcttgtatggccaaacagtcacaga ctccgctcaatgacgttgtacaagcgctcacagaccttggcttgctttacacagtcaagtatccaaatcttaatgatcttgaaaggctgaaagacaagcacccagttctgggggtcatcactgaacagcagtccagcatcaacat ttctggctataactttagtcttggtgctgccgtgaaggcaggggcagccctgttggatgggggtaacatgttagagtcaattttgatcaagccaagcaacagcgaggacctcttgaaggcagttctcggggccaagagaaaac tcaacatgtttgtttcagaccaagttggggacaggaacccttatgaaaacatcctctataaagtttgcctttcaggtgaaggatggccatacatagcttgtagaacatcgattgtggggagagcatgggaaaacacaacaattgat ctcacaagcgagaaacctgcagtcaactcacccaggccagcgcctggagcagcaggtccacctcaggtgggcttaagctacagccagacaatgcttttaaaagacctcatgggaggaattgaccccaacgctcctacatg gattgacattgagggtagatttaatgatccagtggaaatagcaattttccaaccacagaacgggcagttcatacacttttacagggaacccgttgatcaaaaacaattcaagcaagattccaagtactcacacggcatggatctt gccgacctcttcaatgcgcaacccgggttgacctcgtcagttataggtgctcttccgcaggggatggttctaagctgtcaaggctccgatgacatcagaaagcttctggactcacagaataggaaggacattaagcttatcgat gttgaaatgaccagggaagcttcgagggagtatgaagacaaagtgtgggacaaatatggctggttgtgtaagatgcatactggaatagtaagggacaaaaagaagaaagagatcaccccgcactgtgcactcatggactg catcatttttgaaagcgcctccaaagcaaggctcccagatctgaaaactgttcacaacattctgccacatgacctaatttttagaggcccaaatgttgtgacactctaagaccctctgggcctccctgactctccacctctttcgag gtggagagtcagggaggcgctgttcttcagcgtcttttccagacggtttttacaccaggcaccttaaatgcaccacaactacaaattcctttgttggttaatcggtgtggctttggacatgagccaccttttatgtgcctgtgtgttgg tattttgacaaggtgcaggaagatgctgactagatatgcagatgtggaaaacatcagaaggtccatcaatgctaggggggtactcccctgcctctttatgtaatccttcctcaacatctctgtaatcatgttatcggcttcctgttcg atttgatcactgaagtgggtctcatttaagtaagaaccattggtgacaagccagcacttggggacactagtttcgccggtctttgcatgttctaggtaccaaaactttgagtaattgcaatatggcacccccatcagatctctcaagt ggttcctcatcagtagttgatctgaaatcaaagaattcactgttgttttgaataagtgcaaggcagattctacgtcctctttgaacttactcaaagcagccttgttgtagtcaattagtcgcagcatgtcacagaattcttcatcatgattt acattgcatttcgcaactgctgtgttcccgaaacacttaagctctgcagcaagaatcatccatttggtcaggcaataaccacctggattctccacccctgaagagtctgacaaagtccaggtgaatgtgcccgctagtctcctagt gaagaacttagtcttctcttgggaaaggagaatcctggacatcccaaaaggacctgcatatgtgcagtggttttcccaggttctattttgtataatcaggtattggtaactcgtctggctacaccaggtggtcttgccatctgagcct gtccagccccagccactcctcatgtatttccccccgaaggcagttctaaacatatctaggactctacctctgaaggttctacactggctctgagcactttgtgcatttgagaatgtcaagttgtattggatggttatgccattgttgaa gtcgcaggatactgccttatagttggagttccctctgatactgaggtgtaggctcgaaactatactcatgagtgtgtggtcaaaggtctttttattgaaggcagaggtcagattgcaaaagttgtgactgatgatggaatcattggt gaaggtcaattctagtccagaagtccccatactgatgtaatggtgggagttgttggctgaacatgcgttgggcatggtcaggttcagatgtgacatatcaaactccactgacttaaattggtaaactcctttgtaaatgtcgggtcc cttaagaccgtacatgccacaggacctgccagccagaagtaggaaactgatcaatgcgaatatcccacaggtggcaaaattgtagacagccttgatacccgtgatcacgataagcacaataatgacaatgttgatcacctcat cgatgatgtgaggcagagcctcaaacattgtcacaatctgacccatccttctgtaggatagggcctgacacccagttgatctagaggaaagcgcaatccaaaaagcctaggatccccggtgcg-3’。
在优选的实施方式中，所述插入位点为：S片段cDNA的第61位碱基和第62位碱基之间。
在优选的实施方式中，所述荧光素酶基因为Nluc基因。Nluc是一个经过基因工程改造的小分子酶，大小19.1kDa。该酶比萤火虫或海 肾萤光素酶的发光亮100倍，它使用一种新型底物，可产生高强度、辉光型发光。生物发光反应不依赖ATP，在体内可以较好的成像。
在优选的实施方式中，所述S片段的cDNA的5’末端上游还包括有T7启动子。
在优选的实施方式中，所述T7启动子的序列如SEQ ID No.2所示：5’-taatacgactcactatag-3’。使用该启动子序列能够保证合成出基因组 RNA具有精准的5’末端，能够正确的启动复制，成功包装出重组病毒。
在优选的实施方式中，所述S片段的cDNA的3’末端下游还包括有碱基C和/或HDV病毒的核酶自剪切序列HDR，HDR能够抑制或 减少3’末端后出现其他不必要的序列，如果省略HDR，则可能导致包装不出正确的病毒。末端的碱基C能够用于提高HDR的剪切效率， 且不会对病毒的转录复制过程造成影响。
在优选的实施方式中，所述HDR的核酸序列如SEQ ID No.3所示，5’-gggtcggcatggcatctccacctcc-3’。
在优选的实施方式中，所述重组载体还包括连接序列，所述荧光素酶基因通过所述连接序列与NP蛋白序列相连。荧光素酶基因的核苷 酸序列如下：5’-atggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccg atccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcacttt aaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaac aaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcg-3’(SEQ ID No.4)。
在优选的实施方式中，所述连接序列包括P2A。
在优选的实施方式中，P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示：5’-ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct-3’。
在优选的实施方式中，所述重组载体(pT7-LCMV-Nluc-P2A-S)的核苷酸序列如SEQID No.6所示： 5’-cacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagttt ggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcgga accctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccacca cacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgatta agttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactatagcgcacagtggatcctaggcatttgattgcgcatttgtcttgagaaaccattgagcaacaagatggtc ttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggt 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ctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgc-3’。
本发明还提供了如前述任意实施例所述的重组载体的构建方法，其包括：获取含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒S片段的cDNA的重组载体， 在病毒S片段的cDNA中插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间。
优选地，所述荧光素酶基因的插入方法包括同源同组法。
优选地，含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒S片段的cDNA的重组载体pT7-LCMV-S的核苷酸序列(SEQ ID No.8)如下：5’-cacctaaattgtaag cgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccacta ttaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccc cgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaat gcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccag ggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactatagcgcacagtggatcctaggcatttgattgcgcatttgtcttgagaaaccattgagcaacaagatgtccttgtctaaggaagttaagagcttccaatggacgcaagcattgagaagagaattgcagagcttcacatcagatgtgaaggctgctgtcattaaggatgcaaccaaccttctgaatgggttggacttctctgaggtcagcaatgttcagaggatcatgagga 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本发明实施例还提供了一种重组载体组合物，其包括载体1和载体2。载体1为如前述任意实施例所述的重组载体或如前述任意实施例 所述的构建方法构建获得的载体；载体2为含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒L片段的cDNA的重组载体。
优选地，所述载体2(pT7-LCMV-L)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示：5’-cacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctca ttttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtct atcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgaga aaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgca actgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgta atacgactcactatagcgcaccgaggatcctaggctttttgatgcgcaatggatgaaatcatctcagaattgagagagttatgtttaaactatatagaacaggatgagaggttgtcaaggcagaaactcaactttctgggacaaa gggaacccagaatggttctgattgagggactcaagttgctgtcacgctgcattgaaatagacagtgcagacaagagtggctgcacacacaaccacgacgataagtctgtggaaacaattttggtggagtctggaattgtatgc 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本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其含有如前述任意实施例所述的重组载体或如前述任意实施例所述的重组载体组合物。
在可选的实施方式中，所述宿主细胞为含有重组载体组合物的原核细胞或真核细胞。真核细胞可以为大肠杆菌的细胞，或酵母细胞。
本发明实施例还提供了一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒的构建方法，其包括：将前述任意实施例所述的重组载体组合 物转染宿主细胞，培养后，筛选获得表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒。
本发明实施例还提供了一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒，其由如前述任意实施例所述的构建方法构建获得。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒在制备抗病毒药物或活体成像中的 应用。
在可选的实施方式中，“制备抗病毒药物”包括对于抗病毒药物的筛选。
所述应用的直接目的并非疾病的诊断与治疗。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒的构建。
1.1携带荧光素酶基因的感染性克隆的构建。
淋巴脉络丛脑膜炎病毒由大片段L(GenBank No.AY847350.1)和小片S(GenBankNo.AY847351.1)组成，L片段全长7228nt，包括 两端的UTR区及中间的IGR区，L片段编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶L和基质蛋白Z。S片段全长3376nt，编码病毒的核蛋白NP和 包膜糖蛋白和包膜糖蛋白GPC。通过商业化公司提供的DNA化学合成服务化学合成LCMV Armstrong株的全长L片段与S片段对应的cDNA 序列，包括5’端与3’端的UTR区与中间的IGR序列。
人工合成两个片段后，本实施例在L片段和S片段的cDNA的5’末端均添加了T7启动子，所述T7启动子的序列如SEQ ID No.2所示， L片段和S片段的cDNA的3’末端均添加了碱基C和HDV病毒的核酶自剪切序列HDR，所述HDR的核酸序列如SEQ ID No.3所示。并将 两个片段分别连接到pT7的载体上，获得pT7-LCMV-L(SEQ ID No.7)和pT7-LCMV-S(SEQ IDNo.8)质粒。
1.2pT7-LCMV-Nluc-P2A-S的构建
选择在S片段cDNA的第61位碱基和62位碱基之间插入Nluc-P2A序列(其中，Nluc基因序列的长度为513nt，序列如SEQ ID NO.3 所示；link(连接)序列P2A来源于porcineteschovirus-1(PTV1)病毒的2A自剪切多肽序列长66nt，序列如SEQ ID NO.4所示)，包括以下步骤：
参照图1，采用PCR技术分别扩增Nluc-P2A片段和pT7-LCMV-S质粒序列，引物序列(表1)分别为SEQ ID NO.9～12，扩增后通过 In-Fusion HD Cloning Kits(Takara公司)同源重组方法处理后获得pT7-LCMV-Nluc-P2A-S，将其转化大肠杆菌TOP10，经PCR和测序鉴定正确后，即可获得pT7-LCMV-S-P2A-Nluc的全长S片段。
表1引物序列
SEQ ID NO. 序列(5’-3’)
9 ccattgagcaacaagatggtcttcacactcgaagatttcg
10 agtagctccgcttcccgccagaatgcgttcgcac
11 ggaagcggagctactaacttcagc
12 cttgttgctcaatggtttctcaagacaaatg
1.3重组病毒的拯救
用大提试剂盒分别提取pT7-LCMV-Nluc-P2A-S，pT7-LCMV-S，pT7-LCMV-L三个质粒，按照lipofectamine2000转染试剂说明书，将大 提质粒pT7-LCMV-Nluc-P2A-S：pT7-LCMV-L＝2：1的比例转染至生长至80-90％的BSR-T7细胞培养板中，转染量共计3μg，4h后换为2％ 胎牛血清的DMEM维持液，并将转染的6孔板至于37℃、5％CO2培养箱中培养72h，收集细胞和上清，经液氮和水浴锅冻融三次，收集 离心后的上清为第一代P1代病毒。为了获得更高滴度的病毒，提前一天铺BHK21-10 cm培养皿，2×106cell/皿，接毒2h后换液，换成2％胎牛血清的DMEM维持液，3天后收毒，此为第二代P2代病毒，以此类推，即可获得滴度较高的重组病毒，该病毒命名为LCMV-Nluc， 野生型的病毒拯救同上，使用质粒pT7-LCMV-S，pT7-LCMV-L包装，命名为LCMV-WT。
实施例2：LCMV-Nluc重组病毒的鉴定。
将实施例1中的LCMV-Nluc的P1代病毒至P5代病毒分别拍照，与LCMV-WT病毒进行比较，发现二者在形态结构上没有区别如图2 所示。
对P1-P5的重组病毒进行PCR鉴定，发现Nluc基因是稳定存在的，没有因为传代的影响发生基因丢失的现象，如图3所示。
LCMV-Nluc和LCMV-WT在相同的MOI扩增情况下，收取两种病毒不同时时间点收样6h、12h、24h、36h、48h、72h，检测NP基因 的表达量，以NP基因6h的表达量作为对照，经检测发现二者的基因表达量基本一致，见图4，表明重组病毒与野生型病毒的生长动力学 是一致的。
将病毒经10倍比例系列稀释（10的-1， -2，-3， -4， -5，-6），以传统免疫噬斑测定病毒滴度的病毒原液，并以100μl/孔感染24孔板中的BHK细胞，感染后24h测定荧光素酶活性，证明通过检测荧光素酶活性可替代传统的免疫噬斑检测上清病毒滴度，如图5所示，LCMV-WT和LCMV- Nluc重组病毒，检测Nluc的表达，LCMV-WT没有携带报告基因，没有表达，LCMV-Nluc在72h表达量最高如图5所示。
综上所述，表明重组病毒与野生型病毒相比具体稳定的遗传性，并能稳定表达Nluc基因，可根据荧光素酶活来示踪病毒的表达情况。
实施例3：LCMV-Nluc重组病毒在体外细胞层面药物筛选中的应用。
利巴韦林Ribavirin对LCMV-Nluc抑制作用：96孔细胞培养板每孔中接种2万/孔的Vero-E6细胞，37℃、5％CO2培养条件下，待汇 合度达到80-90％时，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养辈系列稀释的Ribavirin(浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625μM)，孵育1h后，分别向每孔加入LCMV-Nluc病毒液，感染复数MOI为0.1，37℃、5％CO2培养箱中吸附2h 后，将各个孔的液体用枪头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养辈系列稀释的Ribavirin(浓度分别为1000、500、250、125、 62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625μM)，37℃、5％CO2的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入0.5ml PBS清洗 后，吸弃孔中PBS,分别加入100μ1细胞裂解buffer处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，孔中裂解液稀释100倍后，取20μ1裂解液于新的 1.5mlEP管中，并加入20μ1的底物，按照试剂盒的说明检测Nluc的活性(GloMax Multi Jr单管型多功能检测仪)，结果见图6，通过对 Nluc的活性检测发现，随着Ribavirin浓度的增加，Nluc信号值逐渐减弱，表明Ribavirin抑制LCMV-Nluc病毒生长呈现浓度依赖性，并根 据公式计算出Ribavirin的IC50。
T705对LCMV-Nluc抑制作用：96孔细胞培养板每孔中接种2万/孔的Vero-E6细胞，37℃、5％CO2培养条件下，待汇合度达到80-90％ 时，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养辈系列稀释的T705(浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625 μM)，孵育1h后，分别向每孔加入LCMV-Nluc病毒液，感染复数MOI为0.1,37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，将各个孔的液体用枪 头吸弃，分别加入用含2％胎牛血清的DMEM培养辈系列稀释的T705(浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625μM)，37℃、5％CO2的培养箱中培养48h后分别丢弃孔中的上清，并向孔中加入0.5mlPBS清洗后，吸弃孔中PBS,分别加入 100μ1细胞裂解buffer处理细胞并混匀孔中的细胞裂解物，孔中裂解液稀释100倍后，取20μ1裂解液于新的1.5mlEP管中，并加入20μ1 的底物，按照试剂盒的说明检测Nluc的活性(GloMax Multi Jr单管型多功能检测仪)，检测结果见图6，对Nluc的活性检测发现，随着T705 浓度的增加，Rluc信号值逐渐减弱，表明T705抑制LCMV-Nluc病毒生长呈现浓度依赖性，并根据公式计算出T705的IC50。
实施例4：带有荧光素酶基因LCMV-Nluc重组病毒在小鼠C57BL/6Jprf1-/-mice活体成像中的应用。
取6-10周龄C57BL/6Jprf1-/-mice小鼠，每只均经腹腔注射2×106PFU LCMV-NLuc，分别接种病毒，检测荧光素酶活前，小鼠分别注射 戊巴比妥麻醉剂、麻醉后小鼠腹腔注射荧光素酶活底物100μ1的nanoluciferase(1:20)(萤光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司)， 注射底物5-10min后放入成像暗箱，使用
Figure BDA0003411732070000071
Spectrum小动物活体光学成像系统(购自perkinelmer公司)进行检测成像并摄取影像(图 7)。
从成像图像中显示，病毒感染后第一天，即可在小鼠的腹部检测到Nluc阳性信号，说明病毒在小鼠体内正常扩增；到病毒感染后第三 天，小鼠体内呈现较强阳性Nluc信号，说明病毒在小鼠体内大量扩增并持续感染周围组织和细胞；到病毒感染后第五天，小鼠体内的阳性 Nluc信号最强，与第三天相比，信号强度及范围都有所上升。因此，根据实验结果可以看出，本发明所构建的LCMV-Nluc感染性克隆所 拯救出的LCMV-Nluc病毒可实现病毒在小鼠活体内进行动态观察，可观测到病毒在动物体内病毒的发展进程，具有广泛的应用价值。
实施例5：LCMV-Nluc重组病毒在小鼠体内药物筛选中的应用。
取6-10周龄C57BL/6Jprf1-/-mice小鼠，分为三组，分别为A-0.4％CMC、B-T705、C-RBV(Ribavirin)，每组小鼠均经腹腔注射2×106PFU LCMV-Nluc重组病毒后，每天灌胃给药2次，间隔12h，给药5天，T705、RBV给药量分别为：300mg/kg、100mg/kg其中1day、3day 和5day分别测定小鼠活体成像，测定小鼠体内的荧光素酶活性，结果如图8所示，与对照组A-0.4％CMC相比，1、3、5day的B-T705、 C-RBV(Ribavirin)的酶活都有明性下降，说明与对照组相比，药物对病毒的载量有明显的抑制作用，5day药物组的酶活成像有明显地降 低。LCMV-Nluc重组病毒模型通过活体成像，可以作为小鼠体内药物筛选和评价的有效模型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3376
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcacagtgg atcctaggca tttgattgcg catttgtctt gagaaaccat tgagcaacaa 60
gatgtccttg tctaaggaag ttaagagctt ccaatggacg caagcattga gaagagaatt 120
gcagagcttc acatcagatg tgaaggctgc tgtcattaag gatgcaacca accttctgaa 180
tgggttggac ttctctgagg tcagcaatgt tcagaggatc atgaggaagg aaaagagaga 240
tgacaaagac ctacagagac tcagaagtct caaccagact gtacattctc ttgtggattt 300
aaagtcaaca tcaaagaaga atgttttgaa agtggggagg ctcagtgcag aagaactgat 360
gtctcttgcg gctgaccttg agaagctgaa ggccaagatc atgaggtctg aaaggcccca 420
ggcttcaggg gtatatatgg ggaacttaac aacacagcaa ctagaccaaa gatctcagat 480
cctacagata gttgggatga gaaagcctca gcagggtgca agtggtgtgg taagagtttg 540
ggatgtgaaa gactcatcac ttttgaacaa tcaatttggc acaatgccaa gtctaactat 600
ggcttgtatg gccaaacagt cacagactcc gctcaatgac gttgtacaag cgctcacaga 660
ccttggcttg ctttacacag tcaagtatcc aaatcttaat gatcttgaaa ggctgaaaga 720
caagcaccca gttctggggg tcatcactga acagcagtcc agcatcaaca tttctggcta 780
taactttagt cttggtgctg ccgtgaaggc aggggcagcc ctgttggatg ggggtaacat 840
gttagagtca attttgatca agccaagcaa cagcgaggac ctcttgaagg cagttctcgg 900
ggccaagaga aaactcaaca tgtttgtttc agaccaagtt ggggacagga acccttatga 960
aaacatcctc tataaagttt gcctttcagg tgaaggatgg ccatacatag cttgtagaac 1020
atcgattgtg gggagagcat gggaaaacac aacaattgat ctcacaagcg agaaacctgc 1080
agtcaactca cccaggccag cgcctggagc agcaggtcca cctcaggtgg gcttaagcta 1140
cagccagaca atgcttttaa aagacctcat gggaggaatt gaccccaacg ctcctacatg 1200
gattgacatt gagggtagat ttaatgatcc agtggaaata gcaattttcc aaccacagaa 1260
cgggcagttc atacactttt acagggaacc cgttgatcaa aaacaattca agcaagattc 1320
caagtactca cacggcatgg atcttgccga cctcttcaat gcgcaacccg ggttgacctc 1380
gtcagttata ggtgctcttc cgcaggggat ggttctaagc tgtcaaggct ccgatgacat 1440
cagaaagctt ctggactcac agaataggaa ggacattaag cttatcgatg ttgaaatgac 1500
cagggaagct tcgagggagt atgaagacaa agtgtgggac aaatatggct ggttgtgtaa 1560
gatgcatact ggaatagtaa gggacaaaaa gaagaaagag atcaccccgc actgtgcact 1620
catggactgc atcatttttg aaagcgcctc caaagcaagg ctcccagatc tgaaaactgt 1680
tcacaacatt ctgccacatg acctaatttt tagaggccca aatgttgtga cactctaaga 1740
ccctctgggc ctccctgact ctccacctct ttcgaggtgg agagtcaggg aggcgctgtt 1800
cttcagcgtc ttttccagac ggtttttaca ccaggcacct taaatgcacc acaactacaa 1860
attcctttgt tggttaatcg gtgtggcttt ggacatgagc caccttttat gtgcctgtgt 1920
gttggtattt tgacaaggtg caggaagatg ctgactagat atgcagatgt ggaaaacatc 1980
agaaggtcca tcaatgctag gggggtactc ccctgcctct ttatgtaatc cttcctcaac 2040
atctctgtaa tcatgttatc ggcttcctgt tcgatttgat cactgaagtg ggtctcattt 2100
aagtaagaac cattggtgac aagccagcac ttggggacac tagtttcgcc ggtctttgca 2160
tgttctaggt accaaaactt tgagtaattg caatatggca cccccatcag atctctcaag 2220
tggttcctca tcagtagttg atctgaaatc aaagaattca ctgttgtttt gaataagtgc 2280
aaggcagatt ctacgtcctc tttgaactta ctcaaagcag ccttgttgta gtcaattagt 2340
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agattctatg tatgggggga ggaagtccct cttctcacaa agtttgtatc tgcagcgcta 4860
cacaatgtca agtgtaaaga gccacatcaa ctttgtgaaa caatagatac aattgcagat 4920
caagccatcg caaatggcgt cccagtctcc ctagttaata gtatccaaag gagaacactg 4980
gacctcctaa agtatgccaa tttccctttg gatccatttc tactgaatac caacactgat 5040
gtgaaagatt ggctggatgg ttctagaggt tacagaatac aaagactcat tgaggaactg 5100
tgtcctaatg aaacaaaggt tgtaagaaag cttgtaagga aactgcatca taagctcaaa 5160
aatggtgaat ttaatgaaga atttttctta gacctattta acagagataa aaaggaggcc 5220
attcttcaat tgggagacct cctcggtctt gaagaagatc tgaatcagtt agcagatgtt 5280
aactggttga atttgaatga aatgttccca ttaaggatgg ttttaagaca aaaggtggtt 5340
tatccatcag tgatgacttt ccaagaggaa agaatcccat cattgatcaa gacactccag 5400
aacaaacttt gtagtaaatt cacaaggggt gcacagaagc tgctgtcaga agcaatcaac 5460
aagtcagctt tccagagttg tatctcatct ggctttatag gcctttgcaa aactctagga 5520
agcaggtgtg tgagaaacaa aaatagggaa aatctgtata tcaaaaagct gcttgaggat 5580
ctaaccacag atgatcatgt gacaagagtt tgcaatcggg atggtataac gctgtacatt 5640
tgtgacaaac agtctcatcc agaagcccac cgtgatcata tatgcctttt aaggcctctt 5700
ctttgggact acatttgtat ttcattgagc aactcttttg agttgggtgt ttgggtccta 5760
gcagaaccga ccaaagggaa gaataacagt gagaacctaa ctcttaagca cttaaaccca 5820
tgtgattatg tagcaagaaa gcctgagagc tcaaggctac tggaggacaa agtgaatttg 5880
aaccaagtga ttcaatctgt gaggcggtta tatcccaaga tctttgagga tcagcttctt 5940
ccatttatgt ctgacatgag ctcaaaaaac atgaggtgga gtcccagaat taaattcctt 6000
gacctctgtg ttttaattga tattaactca gaatccttgt cactcatttc tcatgttgtt 6060
aagtggaaaa gggatgaaca ttacactgtt ctgttttctg accttgccaa ttctcatcag 6120
cgatctgact ccagtctggt tgatgaattt gttgttagca cgagggatgt ctgcaagaac 6180
ttcttaaaac aggtgtattt tgaatcattt gttcgagaat ttgttgcaac aaccaggaca 6240
ttaggcaatt tttcatggtt ccctcataaa gaaatgatgc catctgaaga tggtgctgag 6300
gcactgggcc cctttcaatc atttgtctca aaggtggtga acaaaaatgt ggagaggcct 6360
atgtttagga atgatttgca gtttggtttt gggtggttct cttaccgaat gggagatgtt 6420
gtgtgtaatg ctgccatgtt gattaggcag ggcctgacaa acccaaaggc atttaaatcc 6480
ttaaaggatc tgtgggacta catgctcaac tacacaaaag gggtattgga gttttcaatt 6540
tcagtggact ttacgcacaa tcagaataat actgactgtt taaggaaatt ttcattgata 6600
ttcttggtta ggtgccaatt acagaatcca ggtgtggctg aacttttatc atgctctcac 6660
ctctttaagg gtgagataga tagaagaatg ttggatgaat gcctccactt actgaggaca 6720
gactctgtct tcaaggtgaa cgatggtgtc tttgatatca gatctgaaga gtttgaggat 6780
tacatggaag atcccttgat acttggtgat tctcttgagc ttgagttgtt gggctccaaa 6840
agaatactgg atgggattag atctattgac tttgagagag ttggacctga gtgggagcct 6900
gtgccactga ctgtaaagat gggtgccctt tttgaaggaa gaaaccttgt ccaaaatatc 6960
attgtgaagc tggagaccaa ggacatgaaa gtctttctag caggacttga gggctatgaa 7020
aagattagtg atgtccttgg gaacctcttc ctgcatcgat tcagaactgg tgaacatttg 7080
ttgggttcag agataagtgt aatcctccag gaactatgta tagacagatc tattctgctg 7140
attccactgt cgcttttgcc agactggttc gcctttaagg attgcagact ttgttttagc 7200
aaatctagga gcactttgat gtatgaaaca gtggggggca ggtttagact caaggggagg 7260
tcctgcgacg attggctggg cgggtcggtg gccgaggaca tcgactgatg ggcatctccg 7320
tggggctccg cccgggctcc cggggggccg ccccccgggg gggggcgccc cccggtggtg 7380
ggggcgcgtg cgtgtgggtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgcg tgttctgtgt tgggtgctgt 7440
gtctgtgtgc gttgggcgac gtgcggttcc cttgtgctgg gctgtttgtc ggggccgggg 7500
ccggacggtg ttactcttcg tagggaggtg gagagcttgg ggctgttgat atcttcaatc 7560
tggttggtaa tggatattta caaagaggac acctgtcgga tactgacagc agaaggttta 7620
aacagtgcct gcaaaggtag tggtcatggc atcttaccaa gctgtcaaat ttctgccagc 7680
aagatttgca gcttaaaggg ccaagatagg tggtatctgg taggatttcg gccctgtttg 7740
tactattggt gcctttctcc tctctggact tgccttgacc catcgctatc agccaggtcc 7800
acttctgaca gcctcacgaa gaaagttgtg caaccaaaca gcgcaactaa acgcctagga 7860
tccccggtgc gcgggtcggc atggcatctc cacctcctcg cggtccgacc tgggcatccg 7920
aaggaggacg tcgtccactc ggatggctaa gggaggggcc cccgcggggc tgctaacaaa 7980
gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 8040
ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggatcg 8100
agacctcgat actagtgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattt 8160
cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 8220
ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 8280
gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 8340
gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 8400
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 8460
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 8520
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 8580
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 8640
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 8700
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 8760
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 8820
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 8880
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 8940
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 9000
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 9060
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 9120
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 9180
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 9240
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 9300
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 9360
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 9420
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 9480
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 9540
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 9600
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 9660
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 9720
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 9780
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 9840
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 9900
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 9960
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 10020
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 10080
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 10140
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 10200
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 10260
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 10320
aagtgc 10326
<210> 8
<211> 6474
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180
ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240
accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300
gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 360
gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 420
caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc cattcaggct 480
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600
ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagcgcacag tggatcctag 660
gcatttgatt gcgcatttgt cttgagaaac cattgagcaa caagatgtcc ttgtctaagg 720
aagttaagag cttccaatgg acgcaagcat tgagaagaga attgcagagc ttcacatcag 780
atgtgaaggc tgctgtcatt aaggatgcaa ccaaccttct gaatgggttg gacttctctg 840
aggtcagcaa tgttcagagg atcatgagga aggaaaagag agatgacaaa gacctacaga 900
gactcagaag tctcaaccag actgtacatt ctcttgtgga tttaaagtca acatcaaaga 960
agaatgtttt gaaagtgggg aggctcagtg cagaagaact gatgtctctt gcggctgacc 1020
ttgagaagct gaaggccaag atcatgaggt ctgaaaggcc ccaggcttca ggggtatata 1080
tggggaactt aacaacacag caactagacc aaagatctca gatcctacag atagttggga 1140
tgagaaagcc tcagcagggt gcaagtggtg tggtaagagt ttgggatgtg aaagactcat 1200
cacttttgaa caatcaattt ggcacaatgc caagtctaac tatggcttgt atggccaaac 1260
agtcacagac tccgctcaat gacgttgtac aagcgctcac agaccttggc ttgctttaca 1320
cagtcaagta tccaaatctt aatgatcttg aaaggctgaa agacaagcac ccagttctgg 1380
gggtcatcac tgaacagcag tccagcatca acatttctgg ctataacttt agtcttggtg 1440
ctgccgtgaa ggcaggggca gccctgttgg atgggggtaa catgttagag tcaattttga 1500
tcaagccaag caacagcgag gacctcttga aggcagttct cggggccaag agaaaactca 1560
acatgtttgt ttcagaccaa gttggggaca ggaaccctta tgaaaacatc ctctataaag 1620
tttgcctttc aggtgaagga tggccataca tagcttgtag aacatcgatt gtggggagag 1680
catgggaaaa cacaacaatt gatctcacaa gcgagaaacc tgcagtcaac tcacccaggc 1740
cagcgcctgg agcagcaggt ccacctcagg tgggcttaag ctacagccag acaatgcttt 1800
taaaagacct catgggagga attgacccca acgctcctac atggattgac attgagggta 1860
gatttaatga tccagtggaa atagcaattt tccaaccaca gaacgggcag ttcatacact 1920
tttacaggga acccgttgat caaaaacaat tcaagcaaga ttccaagtac tcacacggca 1980
tggatcttgc cgacctcttc aatgcgcaac ccgggttgac ctcgtcagtt ataggtgctc 2040
ttccgcaggg gatggttcta agctgtcaag gctccgatga catcagaaag cttctggact 2100
cacagaatag gaaggacatt aagcttatcg atgttgaaat gaccagggaa gcttcgaggg 2160
agtatgaaga caaagtgtgg gacaaatatg gctggttgtg taagatgcat actggaatag 2220
taagggacaa aaagaagaaa gagatcaccc cgcactgtgc actcatggac tgcatcattt 2280
ttgaaagcgc ctccaaagca aggctcccag atctgaaaac tgttcacaac attctgccac 2340
atgacctaat ttttagaggc ccaaatgttg tgacactcta agaccctctg ggcctccctg 2400
actctccacc tctttcgagg tggagagtca gggaggcgct gttcttcagc gtcttttcca 2460
gacggttttt acaccaggca ccttaaatgc accacaacta caaattcctt tgttggttaa 2520
tcggtgtggc tttggacatg agccaccttt tatgtgcctg tgtgttggta ttttgacaag 2580
gtgcaggaag atgctgacta gatatgcaga tgtggaaaac atcagaaggt ccatcaatgc 2640
taggggggta ctcccctgcc tctttatgta atccttcctc aacatctctg taatcatgtt 2700
atcggcttcc tgttcgattt gatcactgaa gtgggtctca tttaagtaag aaccattggt 2760
gacaagccag cacttgggga cactagtttc gccggtcttt gcatgttcta ggtaccaaaa 2820
ctttgagtaa ttgcaatatg gcacccccat cagatctctc aagtggttcc tcatcagtag 2880
ttgatctgaa atcaaagaat tcactgttgt tttgaataag tgcaaggcag attctacgtc 2940
ctctttgaac ttactcaaag cagccttgtt gtagtcaatt agtcgcagca tgtcacagaa 3000
ttcttcatca tgatttacat tgcatttcgc aactgctgtg ttcccgaaac acttaagctc 3060
tgcagcaaga atcatccatt tggtcaggca ataaccacct ggattctcca cccctgaaga 3120
gtctgacaaa gtccaggtga atgtgcccgc tagtctccta gtgaagaact tagtcttctc 3180
ttgggaaagg agaatcctgg acatcccaaa aggacctgca tatgtgcagt ggttttccca 3240
ggttctattt tgtataatca ggtattggta actcgtctgg ctacaccagg tggtcttgcc 3300
atctgagcct gtccagcccc agccactcct catgtatttc cccccgaagg cagttctaaa 3360
catatctagg actctacctc tgaaggttct acactggctc tgagcacttt gtgcatttga 3420
gaatgtcaag ttgtattgga tggttatgcc attgttgaag tcgcaggata ctgccttata 3480
gttggagttc cctctgatac tgaggtgtag gctcgaaact atactcatga gtgtgtggtc 3540
aaaggtcttt ttattgaagg cagaggtcag attgcaaaag ttgtgactga tgatggaatc 3600
attggtgaag gtcaattcta gtccagaagt ccccatactg atgtaatggt gggagttgtt 3660
ggctgaacat gcgttgggca tggtcaggtt cagatgtgac atatcaaact ccactgactt 3720
aaattggtaa actcctttgt aaatgtcggg tcccttaaga ccgtacatgc cacaggacct 3780
gccagccaga agtaggaaac tgatcaatgc gaatatccca caggtggcaa aattgtagac 3840
agccttgata cccgtgatca cgataagcac aataatgaca atgttgatca cctcatcgat 3900
gatgtgaggc agagcctcaa acattgtcac aatctgaccc atccttctgt aggatagggc 3960
ctgacaccca gttgatctag aggaaagcgc aatccaaaaa gcctaggatc cccggtgcgc 4020
gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgtc 4080
gtccactcgg atggctaagg gaggggcccc cgcggggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa 4140
gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa 4200
cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggatcgag acctcgatac 4260
tagtgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt 4320
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 4380
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 4440
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 4500
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4560
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4620
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4680
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4740
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4800
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4860
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4920
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4980
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 5040
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 5100
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 5160
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5220
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5280
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5340
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5400
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5460
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5520
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5580
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5640
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5700
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5760
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5820
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5880
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5940
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 6000
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 6060
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 6120
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6180
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6240
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6300
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6360
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6420
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgc 6474
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccattgagca acaagatggt cttcacactc gaagatttcg 40
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtagctccg cttcccgcca gaatgcgttc gcac 34
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggaagcggag ctactaactt cagc 24
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttgttgctc aatggtttct caagacaaat g 31

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于，其含有：淋巴脉络丛脑膜炎重组病毒S片段的cDNA；所述重组病毒的S片段的cDNA中插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组病毒S片段的cDNA的序列如SEQ ID No.1所示；
优选地，所述插入位点为：S片段cDNA的第61位碱基和第62位碱基之间；
优选地，所述荧光素酶基因为Nluc基因。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述S片段的cDNA的5’末端上游还包括有T7启动子；
优选地，所述T7启动子的序列如SEQ ID No.2所示；
优选地，所述S片段的cDNA的3’末端下游还包括有碱基C和/或HDV病毒的核酶自剪切序列HDR；
优选地，所述HDR的核酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括连接序列，所述荧光素酶基因通过所述连接序列与NP蛋白序列相连；
优选地，所述连接序列包括P2A；
优选地，P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
优选地，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.如权利要求1～4任一项所述的重组载体的构建方法，其特征在于，其包括：获取含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒S片段的cDNA的重组载体，在病毒S片段的cDNA中插入有荧光素酶基因，插入位点为：S片段cDNA中5’UTR末端和NP蛋白序列的N端之间；
优选地，所述荧光素酶基因的插入方法包括同源重组法；
优选地，所述荧光素酶基因为Nluc基因。
6.一种重组载体组合物，其特征在于，其包括：
载体1，为如权利要求1～4任一项所述的重组载体；
载体2，为含有淋巴脉络丛脑膜炎病毒L片段的cDNA的重组载体；
优选地，所述载体2的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求1～4任一项所述的重组载体或如权利要求6所述的重组载体组合物。
8.一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒的构建方法，其特征在于，其包括：将权利要求6所述的重组载体组合物转染宿主细胞，培养后，筛选获得表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒。
9.一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒，其特征在于，其由如权利要求8所述的构建方法构建获得。
10.如权利要求9所述的表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒在制备抗病毒药物或活体成像中的应用，所述应用的直接目的并非疾病的诊断与治疗。
CN202111538577.4A 2021-12-15 2021-12-15 一种表达荧光素酶基因的淋巴脉络丛脑膜炎病毒及其构建方法和应用 Pending CN114231562A (zh)

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