CN114921424B - 一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用 - Google Patents

一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用，涉及生物技术领域。本发明公开了一种重组猫传染性腹膜炎病毒，其特征在于，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC‑FIPV‑791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒。通过体外生长曲线，遗传稳定性检测，证明了本发明的重组病毒能稳定表达纳米荧光素酶；利用重组病毒检测猫FIPV阳性血清，并利用重组病毒对天然化合物药库进行筛选，结果表明，本发明构建的重组病毒可以实现快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体，并且可以实现高通量筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物。

Description

一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用。
背景技术
猫冠状病毒(FCoV)广泛存在于猫体内，根据基因型的不同，分为猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。其中FECV只引起轻微的肠道症状，而FIPV可引起猫慢性、致死性的猫传染性腹膜炎。感染FIPV的猫只常出现体温升高、胸腹部积水、淋巴结增大、黄疸等症状，幼年猫比成年猫更易感，死亡率高达100％。
目前市面上没有针对猫传染性腹膜炎的疫苗，无法进行有效预防，同时用于治疗的药物极少，大多治疗手段为对症治疗配合使用广谱抗病毒药物或免疫调节剂，以减缓症状延长生命周期，但不能有效抑制FIPV降低死亡率。因此，需要建立快速检测中和抗体水平的方法，评估正在开发的各种疫苗，并确定猫只个体的免疫状态；同时急需建立一种快速筛选抗病毒药物的方法，以高效筛选用于潜在治疗猫传染性腹膜炎的药物。目前猫冠状病毒中和抗体检测及病毒滴度测定主要通过计算CRFK细胞病变孔数，实验者逐一观察，所需时间长。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建的重组病毒可以实现快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体，并且可以实现高通量筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种重组猫传染性腹膜炎病毒，构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒。
本发明还提供上述的重组猫传染性腹膜炎病毒在快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体中的应用。
本发明还提供了一种利用上述的重组猫传染性腹膜炎病毒快速检测猫传染性腹膜炎病毒的中和抗体的方法，包括：将猫血液离心取上清，之后灭活；灭活后的血清稀释后，加入含100TCID50的权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒共孵育1h，之后再加入CRFK细胞悬液，继续共培养24h，之后取孔中上清检测荧光值，降低50％荧光素酶信号的血清浓度NT50≥25即为阳性。。
本发明还提供上述的重组猫传染性腹膜炎病毒在快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用。
本发明还提供一种上述的重组猫传染性腹膜炎病毒快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物的方法，包括：CRFK细胞进行消化传代后，用细胞生长液稀释，之后接种于96孔板，培养12h；之后弃去所述96孔板的孔中的培养基，清洗之后在接种CRFK细胞的每孔中，按照体积比9:1，分别加入MOI＝0.01的权利要求1所述的重组猫传染性腹膜炎病毒的稀释液和500μΜ的药物稀释液，继续培养48h后，取孔中上清检测荧光值；荧光值>1×106即为阳性，表示该浓度下的药物对病毒没有抑制作用。
本发明公开了以下技术效果：
纳米荧光素酶(NanoLuc)大小约为19.1kDa，具有良好的发光报告性能，比萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶要强150倍左右。目前尚未有利用纳米荧光素酶构建重组FIPV用于中和抗体检测和高通量药物筛选的相关报道。本发明利用反向遗传操作平台，将NanoLuc序列替换到标准株FIPV-791146的ORF3区域，成功拯救出来的重组FIPV-791146-Nluc病毒，中和抗原表位不受影响，同时能稳定表达纳米荧光素酶蛋白，与新型的呋喃嗪(Furimazine)底物反应能产生高强度的信号。反应过程不依赖ATP，能有效抑制背景发光，检测灵敏；通过酶标仪检测荧光信号的强弱来表示样品中病毒量的多少，以达到高效筛选的目的。
通过体外生长曲线，遗传稳定性检测，证明了本发明的重组病毒能稳定表达纳米荧光素酶；利用重组病毒检测猫FIPV阳性血清，24小时能检测出结果，提高检测效率；利用重组病毒对天然化合物药库进行筛选，48小时后能通过荧光值高通量筛选出有效抑制病毒的药物，并使用已知的FCoV抑制剂GS-441524进行验证，证明了此重组病毒能用于快速检测中和抗体以及筛选抗病毒药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组pBAC-FIPV-791146-Nluc质粒的构建策略；
图2为重组病毒FIPV-791146-Nluc的拯救结果；
图3是重组病毒FIPV-791146-Nluc与FIPV-791146的体外生长特性检测；
图4是重组病毒FIPV-791146-Nluc体外遗传稳定性检测；
图5是重组病毒FIPV-791146-Nluc用于快速药物筛选的检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中质粒pBAC-FIPV-791146(将791146基因构建到BAC载体上；全长基因组序列GenBank：MW030109.1)来源于华中农业大学彭贵青教授，293细胞和CRFK细胞购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
实施例1重组质粒pBAC-FIPV-791146-Nluc的构建
如图1所示，重组质粒pBAC-FIPV-791146-Nluc的构建策略：在ORF3两端设计sgRNA，利用CRISPR-Cas9酶将质粒pBAC-FIPV-791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，得到重组质粒。
1)通过在线网站http://crispor.tefor.net/，设计ORF3两端的sgRNA，F：GGTAACATTACACAGGCTTT(SEQ ID NO.1)；R：TTTGAAAGTTTAGTTACACC(SEQ ID NO.2)，将融合后的sgRNA进行转录；
2)利用CRISPR-Cas9酶与转录后的sgRNA将pBAC-FIPV-791146质粒进行酶切(Buffer 5μL；质粒2μg；sgRNA各1μL；酶2μL；补水至50μL；37℃酶切5h)，酶切产物进行CP回收；
3)将回收的线性化载体和PCR扩增的NanoLuc片段进行同源重组(Buffer 2μL；载体200ng；片段；酶1μL；补水至10μL；37℃30min)，将重组产物加入到DH10B感受态中，42℃热激90s，冰浴3min；将感受态涂布到氯霉素抗性的LB固体培养平板中，平板在37℃培养箱中倒置培养16小时，挑取单个菌落加入5mL氯霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，12h后提取重组质粒。(详见诺维赞同源重组试剂盒说明书和Omega质粒提取试剂盒说明书)
4)重组后的pBAC-FIPV-791146-Nluc质粒进行测序鉴定，将重组后的质粒作为模板，PCR扩增其中的NanoLuc片段，将PCR产物送擎科生物科技公司进行测序，对比检测序列结果与原序列一致,构建成功。
NanoLuc核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下：
ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA。
实施例2重组病毒FIPV-791146-Nluc的拯救
1)取生长状态良好的293细胞进行消化，接种于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h；
2)当6孔板中细胞生长到密度约为80％时，弃上清，PBS清洗1遍，每孔加入800μL细胞维持培养基；
3)将鉴定正确的2μg重组质粒pBAC-FIPV-791146-Nluc与2μg对照质粒pBAC-FIPV-791146分别与转染试剂(jetPRIME)充分混合后，加入6孔板中，轻轻晃匀，置于37℃、5％CO2培养箱培养4-6h后换液；
4)转染48小时后，将6孔板中的上清分别接种到密度约为80％的单层CRFK细胞中，24小时后观察病变，结果见图2。结果表明，重组质粒和作为对照的原始质粒分别转染293细胞48h后，将上清接种到CRFK细胞中，两者都出现明显膜融合病变，表明成功拯救出重组病毒。
5)将出现细胞病变孔的上清收集，标记为第一代病毒，重组质粒组得到的第一代病毒记为FIPV-791146-Nluc，对照质粒组得到的第一代病毒记为FIPV-791146。
实施例3FIPV-791146与FIPV-791146-Nluc在CRFK上的生长曲线检测
1)取生长状态良好的CRFK细胞进行消化，接种于48孔板，每孔300μL，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h；
2)分别将病毒FIPV-791146和FIPV-791146-Nluc以MOI＝0.01感染48孔板中密度约为80％的单层CRFK细胞；
3)在37℃、5％CO2细胞培养箱中感作1h后，PBS洗2次，加入含2％FBS的DMEM细胞维持液，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每8h收取细胞上清保存到-80℃。
4)将上述不同时间段收获的病毒液冻融1次后做10倍连续稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种于过夜生长至密度约为80％单层CRFK细胞中，每个稀释度做4个重复，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
5)感染后第3天在显微镜下观察细胞病变，计算病毒滴度并绘制病毒生长动力学曲线，结果见图3。
为鉴定重组病毒FIPV-791146-Nluc的体外生长特性(图3)，将重组病毒FIPV-791146-Nluc与亲本株FIPV-791146以MOI＝0.01感染CRFK细胞，在不同时间点测定病毒滴度，绘制重组病毒的多步生长曲线。通过数据分析显示，重组病毒FIPV-791146-Nluc在CRFK细胞上48h内的病毒滴度与亲本株FIPV-791146没有显著性差异，在32h滴度达到最高值，分别为10-7.7TCID50/mL和10-7.74TCID50/mL，表明外源基因NanoLuc的插入不影响重组病毒的生长特性。
实施例4FIPV-791146-Nluc在CRFK上的遗传稳定性检测
1)将第一代FIPV-791146-Nluc按MOI＝0.01接种于贴壁的CRFK细胞中，置于37℃、5％CO2培养；
2)约24h后，观察细胞出现80％病变，将细胞板在-80℃冻融一次，8500rmp离心5min，取上清标记为第二代，再次接种于贴壁的CRFK细胞中。重复以上方法连续传代至第十代；
3)病毒液中的荧光值测定：
Figure BDA0003688525660000061
Luciferase检测试剂盒购买于Promega公司。根据样品数按照工作浓度为1:50稀释底物(呋喃嗪)，取第一代和第十代重组病毒FIPV-791146-Nluc 25μL分别加入25μL底物稀释液中，放入酶标仪中检测荧光值，结果见图4。
为了检测重组病毒在传代过程中的稳定性(图4)，我们将重组病毒FIPV-791146-Nluc在CRFK细胞上连续传代10次，检测第十代重组病毒FIPV-791146-Nluc的荧光值(P10)，与第一代重组病毒FIPV-791146-Nluc(P1)相比没有显著性差异，结果表明重组病毒FIPV-791146-Nluc能在CRFK细胞上稳定表达NanoLuc蛋白，遗传稳定性较好。
实施例5重组FIPV-791146-Nluc在CRFK上检测猫血清的中和抗体滴度
1)将猫FIPV阳性血液和阴性血液收集在离心管中，4℃5000r/min离心5min，取上层血清4℃5000r/min再次离心5min，留上层血并置于56℃水浴锅灭活30min；
2)血清样品分别用DMEM(达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)培养基连续2倍稀释：在96孔板中每孔加入50μL DMEM培养基，然后在第一列每孔加入50μL血清混匀后，取第一列混合物50μL加入第二列，连续倍比稀释至12列，弃去12列混合物中的50μL，使每稀释度体积为50μL，每孔再加入50μL含100TCID50的FIPV-791146-Nluc病毒液，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中共孵育1h；
3)将生长良好的CRFK细胞用胰酶消化，加入培养基吹打，往96孔板每孔加入100μL约含3×104个CRFK细胞的悬液，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
4)培养24h后，将96孔板上清取出，吸取25μL检测荧光值，方法见实施例4的步骤3)，将阴性组的荧光值为基准，来计算阳性组相对荧光素酶信号。降低50％荧光素酶信号的血清浓度(NT50)用来计算血清的中和效价，结果见表1。
利用重组病毒FIPV-791146-Nluc检测猫FIPV阳性和阴性血清中和抗体(表1)，10份FIPV阳性猫血清(样品1-10)显示NT50为407-3258，10份FIPV阴性猫血清(样品11-20)显示NT50为11-22，将NT50<25作为检测基准值。因此，利用重组病毒FIPV-791146-Nluc检测猫FIPV血清中和抗体，当NT50≥25时，血清判断为FIPV阳性。
表1重组病毒FIPV-791146-Nluc用于快速中和抗体检测
Figure BDA0003688525660000071
实施例6利用重组病毒FIPV-791146-Nluc筛选抗病毒的天然化合物
1)取生长状态良好的CRFK细胞进行消化传代，用细胞生长液调整细胞密度为1×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h；
2)取出96孔板，弃去孔中培养基，PBS清洗三次弃上清，每组第1列加入100μL细胞维持液，作为阴性对照，第2-12列加90μL重组病毒稀释液(病毒按照MOI＝0.01稀释)；
3)将药库浓度提前稀释到500μΜ，往第2-10列每孔对应加入10μL，使药物浓度为50μΜ/孔；
4)将FCoV抑制剂GS-441524(合成于武汉药明康德新药开发有限公司)稀释成100μΜ、50μΜ、25μΜ、12.5μΜ、6.25μΜ、3.125μΜ，1.5625μΜ，0.78125μΜ，往第11列从上到下依次加入10μL；
5)第12列每孔加入10μL维持液作为病毒阳性对照；
6)置于37℃、5％CO2培养箱培养48h，用排枪取25μL/孔上清检测荧光值，方法见实施例4的步骤3)，结果见图5。
利用重组病毒FIPV-791146-Nluc筛选抗病毒药物(图5)，图中阴性对照的荧光值<1.5×102；阳性对照的荧光值>1×106(表示该浓度下的药物对病毒没有抑制作用)；对照药物GS-441524呈浓度依赖性方式抑制Nluc的活性(添加高浓度药物比低浓度药物检测出的荧光值低，荧光值从984到786797整体呈现渐进的趋势)；天然化合物药库中所对应的药物呈现不同的荧光强度，能批量筛选出抗病毒的药物进行下一步验证。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种重组猫传染性腹膜炎病毒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtaacatta cacaggcttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttgaaagtt tagttacacc 20
<210> 3
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516

Claims (2)

1.一种重组猫传染性腹膜炎病毒在快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物中的应用；其特征在于，所述重组猫传染性腹膜炎病毒的构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒；
所述质粒pBAC-FIPV-791146的全长基因组序列在GenBank的登录号为MW030109.1；
所述NanoLuc序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种利用重组猫传染性腹膜炎病毒快速筛选抗猫传染性腹膜炎病毒的药物的方法，其特征在于，包括：CRFK细胞进行消化传代后，用细胞生长液稀释，之后接种于96孔板，培养12 h；之后弃去所述96孔板的孔中的培养基，清洗之后在接种CRFK细胞的每孔中，按照体积比9:1，分别加入MOI=0.01的重组猫传染性腹膜炎病毒的稀释液和500μΜ的药物稀释液，继续培养48 h后，取孔中上清检测荧光值；荧光值>1×106即为阳性，表示该浓度下的药物对所述重组猫传染性腹膜炎病毒没有抑制作用；
所述重组猫传染性腹膜炎病毒的构建方法包括：利用反向遗传操作平台，将质粒pBAC-FIPV-791146的ORF3区域替换成NanoLuc序列，之后病毒拯救出所述重组猫传染性腹膜炎病毒；
所述质粒pBAC-FIPV-791146的全长基因组序列在GenBank的登录号为MW030109.1；
所述NanoLuc序列如SEQ ID NO.3所示。
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