CN117089577B - 重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例公开了重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法。该重组的猴腺病毒是以携带重组的猴腺病毒基因组的病毒载体经转染细胞包装得到。该重组的猴腺病毒基因组具有被替代的E4基因orf6区；部分或全部缺失的E1基因；部分或全部缺失E3基因；或插入了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的E3基因。该猴腺病毒能够很好地避免预存免疫干扰，能够作为一种安全的复制缺陷型的病毒载体。
Description
技术领域
本申请涉及腺病毒技术领域，具体涉及重组的猴腺病毒、病毒载体及构建方法。
背景技术
腺病毒在自然界中拥有广泛的宿主，截至目前，根据腺病毒感染的宿主的差异，ICTV将腺病毒分为6个属共87个种(https://ictv.global/taxonomy)，这些病毒分别感染哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和两栖动物。灵长类动物腺病毒归为哺乳动物腺病毒属，其中人腺病毒(HμMan adenovirus，HAdV)被划分为7个种(HAdVA-G)，含有至少100个型。而非人灵长类动物腺病毒统称为猴腺病毒(Simian adenovirus，SAdV)，共划分为9个种(SAdVA-I)，截至目前已经鉴定了至少50个型别。
腺病毒可感染的细胞种类多，一般不与宿主基因组整合。腺病毒能够高效表达外源基因，其基因组稳定，并且于液态和固态颗粒状态下能稳定存在。腺病毒是一种常见病毒载体，也被广泛应用于构建病毒疫苗和基因治疗。
然而，腺病毒的基因组可以容纳的基因片段加上自身基因组不能超过原始基因组的105％。并且，各种人群中，人腺病毒的血清中和抗体阳性率较高。人腺病毒预存免疫高，导致其表达外源基因的效率低，使得其作为病毒载体的应用受到干扰。
发明内容
本申请发明人利用猴腺病毒在人群中和抗体阳性率低于人腺病毒的现象，对猴腺病毒一野生毒株的基因组进行重组，得到一类新型的猴腺病毒。该猴腺病毒能够很好地避免预存免疫干扰，能够作为一种安全的复制缺陷型的病毒载体。
为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述重组的猴腺病毒基因组是对如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组进行重组得到的基因组，所述重组的猴腺病毒基因组具有如下至少一项特性：
E4基因的orf6区被替代；
E1基因部分或全部缺失；
E3基因部分或全部缺失；
E3基因插入了EGFP基因。
第二方面，实施例公开了一种第一方面所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
构建第一载体，所述第一载体携带至少一个所述猴腺病毒基因组；
构建第二载体，所述第二载体携带用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列；
将所述第一载体和所述第二载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第三载体。
第三方面，实施例公开了一种重组复制缺陷型猴腺病毒，其为第一方面所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
附图说明
图1为本申请实施例提供的第一载体(pBRSAdV GZ3-12)的构建流程示意图。
图2为本申请实施例提供的第三载体(pSAdV-Ad5E4orf6)的构建流程示意图
图3为本申请实施例提供的第五载体(pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP)的构建流程示意图.
图4为本申请实施例提供的第七载体(pSAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP)的构建流程示意图。
图5为本申请实施例提供的第八载体(pSAdV-ΔE3-EGFP)的构建流程示意图。
图6为本申请实施例提供的第一病毒(AdVGZ3-12)转染Ad2933细胞为微观图。
图7为本申请实施例提供的第五病毒(SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP)转染Ad293细胞为白光图(左图)和荧光图(右图)。
图8为本申请实施例提供的第七病毒(SAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP)转染Ad293细胞为白光图(左图)和荧光图(右图)。
图9为本申请实施例提供的多种病毒生长繁殖时不同时间点病毒的DNA含量变化曲线(a)和活病毒滴度变化曲线(b)。图中，“SAdV-E4orf6 INA549”表明第三病毒SAdV-AdE4orf6于A549细胞中的生长情况，
“SAdV-ΔE1B55KΔE3-E4orf6-EGFP INA549”表明第七病毒SAdV-ΔE1B55KΔE3-E4orf6-EGFP于A549细胞中的生长情况，“SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP INA549”表明第五病毒SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP于A549细胞中的生长情况，“SAdV-WT INA549”表明野生型病毒SAdV-WT于A549细胞中的生长情况，“SAdV-E4orf6 INAd293”表明第三病毒SAdV-E4orf6于Ad293细胞中的生长情况，“SAdV-ΔE1B55KΔE3-E4orf6-EGFP INAd293”表明第七病毒SAdV-ΔE1B55KΔE3-E4orf6-EGFP于Ad293细胞中的生长情况，“SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP INAd293”表明第五病毒SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP于Ad293细胞中的生长情况，“SAdV-WT INAd293”表明野生型病毒SAdV-WT于Ad293细胞中的生长情况。
图10为本申请实施例提供的第八病毒SAdV-ΔE3-EGFP感染Ad293-E3细胞的白光和荧光图。图a中红色箭头指示视野下聚集表达绿色荧光的细胞团，图b中蓝色箭头指示白光下细胞的CPE现象。
图11为本申请实施例提供的第八病毒SAdV-ΔE3-EGFP的FFU活病毒滴度生长曲线(a)和DNA含量变化曲线(b)。红色线条代表病毒感染Ad293-E3细胞后病毒的复制水平，绿色线条代表病毒感染Ad293细胞后病毒的复制水平。
图12为本申请实施例提供的第八病毒SAdV-ΔE3-EGFP和第五病毒SAdV-12-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP的DNA含量变化曲线(a)和FFU病毒滴度变化生长曲线(b)。红色线条代表第八病毒感染Ad293-E3细胞后病毒DNA的复制水平，蓝色线条代表第五病毒感染Ad293-E3细胞后病毒DNA的复制水平。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在中国，人腺病毒5型(HAdV-5)的血清中和抗体阳性率高达50％～80％，而在非洲的一些地区，阳性率高达90％甚至100％。广东省和山东省的一份调查中，1184份血清中人腺病毒26型(HAdV-26)中和抗体阳性率高达47％，中和抗体滴度在200-1000之间；而人腺病毒35型(HAdV-35)中和抗体阳性率为15％，抗体滴度相对较低(72-200)。在另一份研究中，发现人血清中针对人腺病毒3型(HAdV-3)的中和抗体阳性率高达63％。在韩国的一项研究中也发现，人腺病毒55型(HAdV-55)在普通人群和军队人员中抗体阳性率分别是18.8％和56.0％。
相比之下，在健康人群中有较低的猴腺病毒中和抗体阳性率。在泰国的一项研究中，经过检测猴子血清(n＝113)针对猴腺病毒(SAdV RBR-7-10)病毒的中和抗体阳性率为6.8％，而在正常人血清中(n＝125)，该阳性率为0。此外在巴西的一项研究中，对200份人血清的检测表明针对猿猴腺病毒AdC6和AdC68的中和抗体阳性率分别为21％和23％。而在国内，相似的血清流行病学调查发现，在广州、宜昌、西安、成都等地的血清样本中猴腺病毒23型(SAdV-23)的抗体阳性率在6％-20％之间。而在重庆的另一项研究中，发现健康志愿者血清中猿猴腺病毒6型和7型中和抗体的阳性率在12.22％和13.13％。因此，在人群中，猴腺病毒中和抗体阳性率远低于人腺病毒中和抗体的阳性率，猴腺病毒在人群中的预存免疫较低。
基于此，本申请发明人利用猴腺病毒在人群中和抗体阳性率低于人腺病毒的现象，对猴腺病毒基因组进行重组，得到一类新型的猴腺病毒。该猴腺病毒能够很好地避免预存免疫干扰，还能高效表达外源绿色荧光蛋白EGFP，能够作为一种安全的复制缺陷型的病毒载体。鉴于此，新型猴腺病毒载体成为替代人腺病毒载体的优先选择目标，开发新型的预存免疫低的猴腺病毒载体作为疫苗载体和治疗载体具有重要的现实意义和应用前景。
第一方面，实施例公开了一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述重组的猴腺病毒基因组是对如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组进行重组得到的基因组，所述重组的猴腺病毒基因组具有如下至少一项特性：
E4基因的orf6区被替代；
E1基因部分或全部缺失；
E3基因部分或全部缺失；
E3基因插入了EGFP基因。
在实施例中，如SEQ ID NO.35所示的基因组的猴腺病毒株为一野生毒株，为本申请发明人从猴粪便样本中筛选得到，于2023年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为猴腺病毒(SimanAdenovirus)SAdV GZ3-12，保藏编号为CCTCC NO:V202385。
SEQ ID NO.35：
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在一些实施例中，所述猴腺病毒载体还具有一基础载体区。所述基础载体选自pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript或pcDNA3.1。
在一些实施例中，所述重组的猴腺病毒基因组是将所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区替换为人5型腺病毒株的E4基因orf6区所得的基因组。
在一些实施例中，所述重组的猴腺病毒基因是将所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区替换为人5型腺病毒株的E4基因orf6区，并将其E3区敲除，以及将其E3区插入EGFP基因所得的基因组。
在一些实施例中，所述重组的猴腺病毒基因组是将所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区替换为人5型腺病毒株的E4基因orf6区，并将其E3区敲除和E1B 55K区敲除，以及将其E3区插入EGFP基因所得的基因组。
在一些实施例中，所述重组的猴腺病毒基因组是将所述猴腺病毒株基因组E3区敲除并插入EGFP基因所得的基因组。
第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
构建第一载体，所述第一载体携带至少一个所述猴腺病毒基因组；
构建第二载体，所述第二载体携带用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列；
将所述第一载体和所述第二载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第三载体。
在一些实施例中，所述构建方法还包括：
构建第四载体，所述第四载体携带用于敲除所述SAdV GZ3-12猴腺病毒基因组E3区的核酸序列；
将所述第三载体和所述第四载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第五载体；
构建第六载体，所述第六载体用于敲除猴腺病毒E1B55K区的序列；
将所述第五载体和所述第六载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第七载体。
在一些实施例中，用于替换所述SAdV GZ3-12猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列的序列为HAdV-C5病毒株基因组的E4orf6序列。
在一些实施例中，用于敲除所述SAdV GZ3-12猴腺病毒基因组E3区的核酸序列由猴腺病毒E3区上下游核酸序列、EGFP基因完整序列、CMV启动子和CMV增强子组成。
在一些实施例中，用于敲除猴腺病毒E1B55K区的序列是由携带猴腺病毒E1B55K区上下游核酸序列组成。
在一些实施例中，所述构建方法还包括：将所述第一载体和所述第四载体分别进行酶切后转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第八载体。
第三方面，本申请实施例还公开了一种重组复制缺陷型猴腺病毒，其为第一方面所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
在一些实施例中，将所述第一载体经转染细胞包装获得一种猴腺病毒，称之为第一病毒，命名为SAdV GZ3-12，此即为野生型猴腺病毒。
在一些实施例中，将所述第三载体经转染细胞包装获得一种重组的猴腺病毒(称之为第三病毒，命名为SAdV-Ad5E4orf6。
在一些实施例中，将所述第五载体经转染细胞包装获得一种重组的猴腺病毒(称之为第五病毒，命名为SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP。
在一些实施例中，将所述第七载体经转染细胞包装获得一种重组的猴腺病毒(称之为第七病毒，命名为SAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP。
在一些实施例中，将所述第八载体经转染细胞包装获得一种重组的猴腺病毒(称之为第八病毒，命名为SAdV-ΔE3-EGFP。
在一些实施例中，所述转染及包装的细胞选自HEK293细胞、Ad293细胞、Ad293-E3细胞、A549细胞。
在一些实施例中，所述可表达重组酶的大肠杆菌为大肠杆菌BJ5183。
第四方面，本申请实施例公开的第一方面所述的猴腺病毒载体、或第二方面所述的制备方法制得的猴腺病毒载体在制备猴腺病毒疫苗、人腺病毒疫苗、猴腺病毒基因治疗药物或人腺病毒基因治疗药物中的应用。
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合更加具体的对本申请进行进一步详细说明。
本申请中涉及的蛋白或编码蛋白的核酸分子可以是重组的、天然的、合成的蛋白或编码该蛋白的核酸分子；本申请中涉及的蛋白或编码该蛋白的核酸分子可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本申请实施例中，根据猴腺病毒SAdV GZ3-12基因组(SEQ ID NO.24)其相关功能区域的引物(如表1所示)。其中，该基因组的E1区位于SAdV GZ3-12基因组的491nt～3347nt，E1B55K位于SAdV GZ3-12基因组的1821nt～3347nt，E3区位于SAdV GZ3-12基因组的26084nt～29316nt，E4区位于SAdV GZ3-12基因组的31100nt～33741nt，E4orf6区位于SAdV GZ3-12基因组的31414nt～32268nt，两个ITR区分别位于SAdV GZ3-12基因组的1nt～150nt和33943nt～34092nt，E3区的CR1-α位于SAdV GZ3-12基因组的26358nt～27467nt，E3区的CR1-β位于SAdV GZ3-12基因组的27564nt～28340nt，E3区的RID-α位于SAdV GZ3-12基因组的28353nt～28628nt，E3区的RID-β位于SAdV GZ3-12基因组的28625nt～28939nt，E3的14.7K位于SAdV GZ3-12基因组的28939nt～29316nt。
根据HAdV-5病毒基因组(GenBank编号AC_000008.1)设计及合成其Ad5E4orf6区(33193nt～34077nt)的特异性扩增引物(如表1所示)，所有引物由擎科生物科技有限公司合成，引物用ddH2O溶解为10μM的工作浓度，保存于4℃或-20℃。
表1猴腺病毒载体构建使用的引物列表
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实施例1：制备第一载体和第一病毒
如图1所示，本实施例中，采用Gibson重组方法构建第一载体(pBRSAdV GZ3-12)。将该第一载体转染细胞进行病毒组装即可得到第一病毒(SAdV GZ3-12)。具体步骤包括：
(1)按照表2所示配制5×恒温反应缓冲液，分装并保存于-20℃备用。
表25×等温反应缓冲液成分表
| 试剂名称 | 使用量 |
| 1MTris-HCl，pH＝7.5 | 1mL |
| 2MMgCl2 | 50μL |
| 10mMdNTP | 200μL |
| 1MDTT | 100μL |
| PEG-8000 | 0.5g |
| 100mMNAD | 100μL |
| ddH2O | 补充至2mL |
(2)按照表3所示配制Gibson assembly酶混合物，分装并保存于-20℃备用。
表3Gibson assembly酶混合物成分表
| 试剂名称 | 使用量 |
| 5×恒温反应缓冲液 | 40μL |
| 10U/μLT5核酸外切酶 | 0.1μL |
| 40U/μLTaqDNAligase | 20μL |
| 2U/μLphusionDNApolymerase | 2.5μL |
| ddH2O | 87.4μL |
(3)按照表4所示试剂配制Gibson assembly连接反应体系，其中，基因组DNA与线性pBR322片段的反应摩尔比为4:1。线性pBR322片段由PBR-SWAI-ITR-F/PBR-SWAI-ITR-R为引物对从pBR322质粒上扩增。
表4Gibson assembly连接反应体系
| 试剂名称 | 使用量 |
| 基因组DNA | 4当量 |
| 线性pBR322片段 | 1当量 |
| Gibsonassembly酶混合液 | 补充至20μL |
混合体系置于4℃冰箱静置3小时后，50℃连接1小时。最后取出保存于-20℃。如图6所示，将第一载体转染Ad293细胞，能够产生CPE效应，能够拯救得到第一病毒，证明其不仅具有猴腺病毒全基因组还具有感染性，可以在细胞中包装出活病毒。
实施例2：制备第三载体和第三病毒
本实施例中，如图2所示，第三病毒制备过程包括：构建携带猴腺病毒基因组的第一载体(pBRSAdV GZ3-12)；构建第二载体(pUC-Ad5E4orf6)，所述第二载体携带用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列；将所述第一载体和所述第二载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第三载体(pSAdV-Ad5E4orf6)。将所述第三载体转染HEK293细胞包装获得第三病毒(SAdV-Ad5E4orf6)。
在本实施例中，第三病毒为具有一个E4基因orf6区被人E4orf6基因序列替代的复制缺陷型猴腺病毒。在本实施例中，用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列由人5型腺病毒E4orf6完整基因片段以及猴腺病毒E4orf6基因上游各2500bp的核酸序列和下游800bp的核苷酸序列组成。
第三病毒的具体制备过程如下。
本步骤中，第二载体的构建过程包括：
(1)以pUC19-F/pUC19-R为引物，大量扩增pUC19质粒(B610005-0050，生工生物工程(上海)股份有限公司)，提取质粒后，用EcoRI限制性内切酶酶切pUC19质粒，得到线性化pUC19；
(2)以SAdV GZ3-12基因组为模板，以E4L-F和E4L-R为引物对扩增SAdV GZ3-12基因组第28912nt至31413nt的核苷酸序列(E4orf6基因上游2500nt)，得到如SEQ ID NO.27的E4区上游的同源序列；
(3)以SAdV GZ3-12基因组为模板，以E4R-F和E4R-R为引物对扩增以SAdV GZ3-12基因组第32269nt至33068nt的核苷酸序列(E4orf6基因下游800nt)，得到如SEQ ID NO.28的E4区下游的同源序列；
(4)以Ad5E4orf6-F和Ad5E4orf6-R为引物对从HAdV-5病毒株基因组Ad5E4orf6序列，得到如SEQ ID NO.29的Ad5E4orf6的同源序列；
(5)按照无缝克隆技术，将线性化pUC19、E4区上游的同源序列、E4区下游的同源序列和Ad5E4orf6的同源序列同时加入连接体系中，37℃反应30min；
(6)产物化转DH5α感受态细胞后，在氨苄抗性的琼脂平板中筛选单菌落，经过PCR扩增和测序，即可得到第二载体，命名为pUC-Ad5E4orf6。
本实施例中，第三载体的构建过程包括：
(1)用SpeI限制性内切酶酶切pBRSAdV GZ3-12质粒使之线性化，暴露同源臂。同时使用PacⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切pUC-E4orf6质粒，并回收E4区上游的同源序列、Ad5E4orf6的同源序列、E4区下游的同源序列的连接片段；
(2)取200ng的pBRSAdV GZ3-12线性化载，200ng的E4区上游的同源序列、Ad5E4orf6的同源序列、E4区下游的同源序列的连接片段，同时化转入至BJ5183感受态细胞，进行同源重组；
(3)从氨苄抗性的琼脂平板上筛选单菌落，使用Hexon-F/Hexon-R为引物和Ad5E4orf6-F/Ad5E4orf6-R引物进行筛选，双阳性的质粒化转DH5α感受态进行质粒纯化和扩增；
(4)选取4种限制性内切酶酶切PCR扩增双阳性的质粒，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳后，条带与SnapGene模拟图一致的质粒，判定为重组正确的质粒，验证正确的质粒即为第三载体，命名为pSAdV-Ad5E4orf6。
本实施例中，第三病毒的制备步骤包括：扩增第三载体后，使用SwaⅠ限制性内切酶将质粒酶切为猴腺病毒基因组和pBR322质粒骨架；切胶回收重组的猴腺病毒基因组，并通过脂质体转染到Ad293细胞，包装病毒；每日观察细胞生长状态，若细胞产生变圆、融合和葡萄串状等典型CPE现象，则收获病毒，反复冻融三次后取病毒上清液继续Ad293细胞扩大培养。通过PCR扩增、酶切等方法验证病毒，验证正确的病毒即为第三病毒，命名为SAdV-Ad5E4orf6。
实施例3：制备第五载体和第五病毒
本实施例中，如图3所示，采用与实施例2相同的步骤制备第三载体(pSAdV-Ad5E4orf6)；再构建携带用于敲除猴腺病毒E3区的序列的第四载体(pUC-ΔE3-EGFP)；将所述第三载体和所述第四载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第五载体(pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP)；将所述第五载体转染HEK293细胞包装获得第五病毒(SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP)。第五病毒为具有一个E4基因orf6区被人E4orf6基因序列替代，缺失E3区，并插入了EGFP基因的复制缺陷型猴腺病毒。
在本实施例中，用于敲除猴腺病毒E3区的序列由E3区上游的同源序列、EGFP表达框(CMV启动子、CMV增强子、EGFP基因)、E3区下游的同源序列组成(SEQ ID NO.30)。
本实施例中，第四载体的构建过程具体包括：
(1)以SAdV GZ3-12基因组为模板，用E3L-F和E3L-R为引物对扩增第25756nt至26416nt的核苷酸序列，得到E3上游的同源序列，以E3R-F和E3R-R为引物对扩增第29332nt至30352nt的核苷酸序列作为E3区下游的同源序列。
(2)以pEGFP-C1质粒(VT1118，优宝生物)为模板，用EGFP-F和EGFP-R为引物对扩增携带CMV启动子的EGFP蛋白表达框，作为病毒包装和观察的指示物。同时在引物设计时加入酶切位点，方便替换EGFP蛋白。
(3)将线性化的pUC载体、E3上游的同源序列、E3下游的同源序列和EGFP蛋白表达框序列同时加入无缝克隆反应体系中，37℃反应30min，经过筛选和验证，得到第四载体，命名为pUC-ΔE3-EGFP。
本实施例中，第五载体的构建过程具体包括：
(1)用PacⅠ限制性内切酶酶切第三载体(pSAdV-Ad5E4orf6质粒)使之线性化，暴露同源臂。同时使用EcoRⅤ限制性内切酶酶切第四载体(pUC-ΔE3-EGFP质粒)，并回收得到E3区上游的同源序列、EGFP表达框(CMV启动子、CMV增强子、EGFP基因)、E3区下游的同源序列依次连接的片段。
(2)pSAdV-Ad5E4orf6线性化载体与E3区上游的同源序列、EGFP表达框、E3区下游的同源序列依次连接的片段各取200ng同时化转到BJ5183感受态细菌，进行同源重组，涂布平板，以Hexon-F/Hexon-R和EGFP-F/EGFP-R进行PCR筛选阳性克隆，提取质粒，即为第五载体，命名为pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP。
本实施例中，将第五载体扩增后，使用SwaⅠ限制性内切酶，切胶回收重组的猴腺病毒基因组，并通过脂质体转染到Ad293细胞，包装病毒。每日观察细胞生长状态，同时在荧光显微镜下观察细胞产生荧光的强度。如图7所示，若荧光视野下出现聚集成团的细胞，收获病毒并继续扩大培养。通过PCR扩增、酶切等方法验证，即为第五病毒，命名为SAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP。
实施例4：制备第七载体和第七病毒
本实施例中，如图4所示，采用与实施例3相同的步骤制备第五载体(pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP)；再构建携带用于敲除猴腺病毒E1B55K区的序列的第六载体；将所述第五载体和所述第六载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第七载体(pSAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP)。将所述第七载体转染HEK293细胞包装获得第七病毒(SAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP)。第七病毒为具有一个E4基因orf6区被人E4orf6基因序列替代，缺失E3区和E1B55K区，并插入了EGFP基因的复制缺陷型猴腺病毒。
在本实施例中，用于敲除猴腺病毒E1B55K区的序列由猴腺病毒E1B55K区上游约800bp和E1B55K区下游约1300bp的核酸序列组成。
在本实施例中，第六载体的构建过程具体包括：
(1)以pBRSAdV GZ3-12质粒为模板，用E1B55K-UP-F/E1B55K-UP-R为引物对扩增SAdV GZ3-12基因组第1358nt至第2072nt的核苷酸序列，得到E1B55K区上游的同源序列(SEQ ID NO.31)。用
E1B55K-DOWN-F/E1B55K-DOWN-R为引物对扩增SAdV GZ3-12基因第3422nt至第4509nt的核苷酸序列，得到E1B55K区下游的同源序列(SEQ ID NO.32)。在引物设计时加入酶切位点，方便在E1区插入感兴趣的目的蛋白序列，同时，设计上游的同源序列正向序列的3’端添加15nt下游的同源序列正向序列5’端的序列，实现两片段连接后造成E1B 55K蛋白基因缺失。
(2)将线性化的pUC载体、E1区上游的同源序列和E1区下游的同源序列同时加入无缝克隆反应体系中，37℃反应30min，经过筛选和验证，连接正确且无突变的质粒命名为pUC-ΔE1B55K。
在本实施例中，第七载体的构建过程具体包括：
(1)用PmeⅠ限制性内切酶酶切pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP质粒使之线性化，暴露同源臂。同时使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切pUC-ΔE1B55K质粒，并回收E1区上游的同源序列和E1区下游的同源序列依次连接的片段。
(2)pSAdV-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP线性化载体和E1区上游的同源序列和E1区下游的同源序列依次连接的片段各200ng同时化转到BJ5183感受态细菌，进行同源重组，涂布平板，以Hexon-F/Hexon-R和E1com-F/E1com-R，进行PCR筛选阳性克隆，提取质粒，即为第七载体，命名为pSAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP。
本实施例中，将第五载体扩增后，使用SwaⅠ限制性内切酶，切胶回收重组的猴腺病毒基因组，并通过脂质体转染到Ad293细胞，包装病毒。每日观察细胞生长状态，同时在荧光显微镜下观察细胞产生荧光的强度。如图8所示，若荧光视野下出现聚集成团的细胞，收获病毒并继续扩大培养。通过PCR扩增、酶切等方法验证，即为第七病毒，命名为SAdV-ΔE3-ΔE1B55K-Ad5E4orf6-EGFP。
实施例5：制备第八载体和第八病毒
本实施例中，如图8所示，采用与实施例1相同的方法构建第一载体(pBRSAdV GZ3-12)；采用与实施例3相同的方法构建第四载体；将所述第一载体和所述第四载体分别进行酶切后转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第八载体(pSAdV GZ3-12-E3-EGFP)；将第八载体转染HEK293细胞包装获得第八病毒(SAdV-ΔE3-EGFP)。
本实施例中，各取pBRSAdV GZ3-12的线性化条带与pUC-ΔE3-EGFP的线性化条带200ng化转到BJ5183感受态细菌，涂布平板，以Hexon-F/Hexon-R为引物和EGFP-F/EGFP-R进行PCR筛选阳性克隆，提取质粒，即为第八载体，命名为pSAdV GZ3-12-E3-EGFP。
本实施例中，将第八载体扩增后，使用SwaⅠ限制性内切酶，切胶回收重组的猴腺病毒基因组，并通过脂质体转染到Ad293细胞和Ad293-E3细胞，包装病毒。每日观察细胞生长状态，同时在荧光显微镜下观察细胞产生荧光的强度。其中，Ad293-E3细胞为表达猴腺病毒SAdV GZ3-12病毒株E3区的细胞系。
在一些实施例中，Ad293-E3细胞系的构建过程包括：
(1)以SAdV GZ3-12基因组为模板，plenti-E3F/plenti-E3R为引物对PCR扩增猴腺病毒GZ3-12病毒株E3区碱基序列，得到E3区PCR扩增产物，共包含E3区CR1-α、CR1-β、RID-α、RID-β和E314.7K五个编码基因，在上游引物5’端依次加入EcoRⅠ酶切位点和Kozak序列，在下游引物5’端加入HindⅢ酶切位点。
(2)用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切plenti-Flag质粒(Addgene公司)和E3区PCR扩增产物，回收大片段的质粒骨架和E3区碱基片段。
(3)plenti-flag质粒骨架和E3区酶切产物按照1:3的摩尔质量比加入T4连接酶的反应体系中，16℃连接12小时，连接产物化转DH5α感受态，经过筛选，连接成功的质粒命名为plenti-E3。
(4)在六孔板的每个孔中接种5×105个Ad293细胞，细胞完全贴壁后，psPAX2载体(Invitrogen公司)、pMD2.G载体(Addgene公司)和plenti-E3载体按照4:3:1的质量比同时转染Ad293细胞，每孔细胞转染总量为8μg。转染后细胞置于细胞培养箱培养。
(5)72h后，收获细胞培养上清，上清经过0.45μm滤膜过滤后，分装保存于-80℃。
(6)在六孔板每孔加入5×105个Ad293细胞，待细胞完全贴壁后，每孔加入上一步收获的病毒液1mL，2小时后将病毒液替换为完全培养基。
(7)假病毒感染Ad293细胞72小时后，将培养基去除，每孔加入含2μg/mL嘌呤霉素的完全培养基，每隔两天更换新鲜的含嘌呤霉素的培养基。
(8)加入含嘌呤霉素培养5天后，按照正常的细胞传代流程将细胞传代，当表达嘌呤霉素抗性的细胞生长起来后，使用96孔板筛选纯化细胞，即得到表达E3的Ad293细胞，Ad293-E3。
在一个检测实施例中，检测了上述构建的Ad293-E3细胞能否转录E3。具体包括：利用Trizol试剂提取Ad293-E3细胞的RNA，利用TAKARA公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)酶试剂盒以随机引物进行逆转录。将逆转录反应体系，37℃保温10min，42℃反应1小时。70℃反应15min终止反应，迅速取出PCR管置于冰上冷却15min，得到的cDNA溶液用于PCR扩增，PCR反应体系如表5所示。结果如图10所示，构建的表达猴腺病毒E3区的稳转细胞系，通过逆转录PCR跑电泳验证细胞中E3区的5个基因均可以在Ad293细胞内转录，表明稳转细胞系Ad293-E3构建成功。
表5
| 试剂名称 | 体积(μL) |
| 上述模板RNA-引物变性溶液 | 6 |
| 5XM-MLVBuffer | 2 |
| dNTPMixture(各10mM) | 0.5 |
| RNaseInhibitor(40U/μL) | 0.25 |
| RTaseM-MLV(RNaseH-)(200U/μL) | 0.25 |
| RNasefreeH2O | 1 |
| 总体积 | 10 |
实施例6：大量制备病毒样本
在本实施例中，收获上述实施例1～5的细胞液，使用PBS洗涤细胞，将其置于的-80℃(冰冻)和37℃(解冻)的步骤3次，促使病毒充分从细胞中释放。将释放病毒的液体于12000×g离心2min，取上清液，即分别为大量收获的第一病毒样本、第三病毒样本、第五病毒样本和第七病毒样本。
测试例1：qPCR检测病毒DNA含量
待测样本：第一病毒样本、第三病毒样本、第五病毒样本和第七病毒样本。
检测方法：
(1)将Hexon-F/Hexon-R溶解并稀释成10μM的工作浓度。
(2)从冰箱中取出分装的标准质粒(pUC-hexon，如SEQ ID NO.33所示)，冰上解冻，并用灭菌的去离子水稀释成102-108copies/μL的工作浓度，作为标准样本，同时使用2uL待测样本液作为模板。其中，标准质粒pUC-hexon的构建方法包括：利用Hexon-F/Hexon-R将人5型腺病毒六邻体基因中的300bp(如SEQ ID NO.34所示)扩增出来，将扩增产物连接到pUC19载体上，得到重组质粒，验证正确后，命名为标准质粒pUC-hexon。测定该标准质粒的浓度，按照公式：质粒浓度ng/μL×10-9×6.02×1023/双链DNA的分子量＝质粒的拷贝数copies/μL，换算并记录质粒的拷贝数，分装后置于-20℃冰箱保存备用。使用时将标准质粒稀释成101-107copies/μL的浓度，作为标准质粒。
(3)配制20μL qPCR反应体系，在2mL灭菌EP管中依次加入1mLTB GreenTM PremixEx TaqMTⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)、40uL ROX Reference DyeⅡ(50×)、10μM的上游引物HexF和下游引物HexR各80μL、600μL的灭菌水，混匀后，短暂离心，并将混合液分装至专用的八联管中，每管分装18μL，分装完成后，在每管中加入2μL模板DNA。此步骤全程在冰上操作，完成后短暂离心使液体聚集到管底。
(4)在QuantStudioTM Real-Time PCR Software系统上设置扩增和检测程序：95℃预变性5min，40个扩增循环(95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s)，熔解曲线扩增(95℃反应15s，60℃反应1min，95℃反应15s)。
(5)结合扩增曲线、熔解曲线调整背景值、标准样本的DNA拷贝数和CT值制作标准曲线，然后根据标准曲线计算待测样本(第一病毒样本、第三病毒样本、第五病毒样本和第七病毒样本)的CT值。根据CT值计算待测样本的DNA拷贝数。以待测样本的DNA拷贝数作为纵坐标(Log10 genomic DNAcopies/mL)，病毒感染细胞的不同时间点作为横坐标，绘制其病毒的生长曲线。
结果如图9a所示，第三病毒、第五病毒和第七病毒在A549细胞中的病毒DNA含量较低，而在Ad293细胞系中病毒DNA含量较高。而第一病毒(野生型病毒)在A549细胞和Ad293细胞中均具有较高的病毒DNA含量。结合图9a/7b可知，第三病毒、第五病毒和第七病毒在Ad293细胞系内正常复制，而在A549细胞系中仅感染不复制(其他细胞系Caco2、Hela、Huh7、HepG2、Vero表现出相同的趋势)，说明第三病毒、第五病毒和第七病毒具有复制缺陷特点，仅在特定细胞Ad293细胞内可以复制，安全性较高。
测试例2：直接免疫荧光法检测活病毒数
待测样本：第一病毒样本、第三病毒样本、第五病毒样本和第七病毒样本。
检测方法：用DMEM培养基分别将第一病毒样本、第三病毒样本、第五病毒样本和第七病毒样本按10倍倍比稀释，滴加至去除培养基的105cells/mL的Ad293细胞悬液中以感染细胞，每个稀释度做4个副孔，同时做阴性对照和阳性对照孔，放入细胞培养箱入37℃、含5％CO2培养2小时后，每孔加入100μL维持培养基，继续37℃、含5％CO2培养40小时，去除细胞培养基，在生物安全柜中干燥10min。每孔加入100μL 4℃预冷的无水甲醇，并将孔板置于-20℃保持10min固定细胞。去除甲醇，每孔加入100μLPBST，置于摇床上缓慢摇晃10min，重复洗板3次。每孔加入100μL含1％BSA的PBS，37℃缓慢摇晃30min。再次用PBST洗板3次。弃去洗液，每孔加入50μL 1:500稀释的FITC标记的腺病毒通用抗体(广州锐达生物科技有限公司)，用铝箔纸将孔板完全包裹，避光，置于摇床上缓慢摇晃1小时。去除抗体，用PBST重复洗板3次后，去除洗液，并将孔板倒扣到干净的吸水纸上，吸干洗液。在荧光显微镜下观察细胞荧光状况，若阴性孔细胞无绿色荧光，阳性孔细胞大部分发荧光，则可继续观察待测样品孔情况，并计数待测样品孔中发荧光的细胞数量。待测样本活病毒含量的计算公式为：荧光形成单位(FFU)/mL＝10×样品稀释倍数×四个副孔平均GFP阳性细胞数。
结果如图9b所示，第三病毒、第五病毒和第七病毒在A549细胞中病毒滴度较低，而在Ad293细胞系中病毒滴度较高。而第一病毒(野生型病毒)在A549细胞和Ad293细胞中均具有较高的病毒滴度。
测试例3：第八病毒的复制动力学检测
测试样本的制备：将第八载体分别在12孔板接种5×104细胞/孔的Ad293细胞和Ad293-E3细胞，每种细胞各接种三孔。十二孔板细胞生长成单层细胞后，以MOI＝0.1的第八病毒(SAdV-ΔE3-EGFP)病毒量分别感染Ad293细胞和Ad293-E3细胞两种细胞。37℃孵育2小时，期间每隔半小时轻轻摇晃一次。病毒感染细胞2小时后，将孔板中的病毒液去除，并用PBS缓冲液洗一遍后，每孔加入1mL维持培养基，继续置于37℃，5％CO2的培养箱培养。分别收集Ad293细胞液和Ad293-E3细胞液使用PBS洗涤细胞，将其置于的-80℃(冰冻)和37℃(解冻)的步骤3次，于12000×g离心2min，分别从取上清液，即为第八病毒样本。
免疫荧光测试：测试方法同测试例2。
如图10所示，第八病毒能够感染Ad293和Ad293-E3细胞。如图11所示，第八病毒能够在Ad293和Ad293-E3细胞中均能够感染和复制。
测试例4：第八病毒与第五病毒的复制能力差异检测
在12孔板的六个孔中每个孔接种104个Ad293-E3细胞，将12孔板置于细胞培养箱中培养12小时。十二孔板细胞生长成单层细胞后，在每个十二孔板的三孔细胞中接种MOI＝0.1的第五病毒SAdV-ΔE3-EGFP，另外三孔细胞中接种相同MOI的第八病毒SAdVGZ3-ΔE3-Ad5E4orf6-EGFP。37℃孵育2小时，期间每隔半小时轻轻摇晃一次。
采用与测试例1和测试例2分别提供的方法检测第五病毒(SAdV GZ3-12-ΔE3-Ad5E4orf6)和第八病毒(SAdV GZ3-12-ΔE3)的病毒DNA含量和活病毒数。结果如图12所示，第八病毒与第五病毒的复制能力无明显差异。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述猴腺病毒基因组如SEQ ID NO.35所示，所述重组的猴腺病毒基因组是所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区被替换为人5型腺病毒的E4基因orf6区所得的基因组；其中，所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的31414nt～32268nt所示，所述人5型腺病毒的E4基因orf6区如GenBank编号AC_000008.1所示的人5型腺病毒基因组的33193nt～34077nt所示。
2.一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述猴腺病毒基因组如SEQ ID NO.35所示，所述重组的猴腺病毒基因组是所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区被替换为人5型腺病毒株的E4基因orf6区，其E3基因被敲除，以及于其E3基因区插入了EGFP基因所得的基因组；
其中，所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的31414nt～32268nt所示，所述人5型腺病毒的E4基因orf6区如GenBank编号AC_000008.1所示的人5型腺病毒基因组的33193nt～34077nt所示；
所述猴腺病毒株基因组的E3基因位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的26084nt～29316nt。
3.一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述猴腺病毒基因组如SEQ ID NO.35所示，所述重组的猴腺病毒基因组是所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区被替换为人5型腺病毒株的E4基因orf6区，其E3区被敲除，E1B基因55K蛋白的编码区被敲除，以及于其E3基因区插入了EGFP基因所得的基因组；
其中，所述猴腺病毒株基因组的E4基因orf6区位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的31414nt～32268nt所示，所述人5型腺病毒的E4基因orf6区如GenBank编号AC_000008.1所示的人5型腺病毒基因组的33193nt～34077nt所示；
所述猴腺病毒株基因组的E3基因位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的26084nt～29316nt所示；
所述猴腺病毒株基因组的E1B基因55K蛋白的编码区位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的1821nt～3347nt所示。
4.一种猴腺病毒载体，所述猴腺病毒载体携带至少一个重组的猴腺病毒基因组，所述猴腺病毒基因组如SEQ ID NO.35所示，所述重组的猴腺病毒基因组是所述猴腺病毒株基因组E3基因被敲除并插入了EGFP基因所得的基因组；
其中，所述猴腺病毒株基因组的E3基因位于如SEQ ID NO.35所示的猴腺病毒株基因组的26084nt～29316nt所示。
5.一种重组的猴腺病毒，其为如权利要求1所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
6.一种重组的猴腺病毒，其为如权利要求2所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
7.一种重组的猴腺病毒，其为如权利要求3所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
8.一种重组的猴腺病毒，其为如权利要求4所述的猴腺病毒载体经转染细胞包装获得。
9.一种如权利要求1所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
构建第一载体，所述第一载体携带至少一个所述猴腺病毒基因组；
构建第二载体，所述第二载体携带用于替换所述猴腺病毒基因组E4orf6的核酸序列；
将所述第一载体和所述第二载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第三载体。
10.一种如权利要求2所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
如权利要求9所述的构建方法；
构建第四载体，所述第四载体携带用于敲除所述猴腺病毒基因组E3基因的核酸序列；
将所述第三载体和所述第四载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第五载体。
11.一种如权利要求3所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
如权利要求10所述的构建方法；
构建第六载体，所述第六载体携带用于敲除所述猴腺病毒基因组E1B基因55K蛋白的编码区的核酸序列；
将所述第五载体和所述第六载体同时转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第七载体。
12.一种如权利要求4所述的猴腺病毒载体的构建方法，其包括：
构建第一载体，所述第一载体携带至少一个所述猴腺病毒基因组；
构建第四载体，所述第四载体携带用于敲除所述猴腺病毒基因组E3基因的核酸序列；
将所述第一载体和所述第四载体分别进行酶切后转入可表达重组酶的大肠杆菌，得到第八载体。
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