CN115094045A - 耐热的嵌合型基因vii型新城疫弱毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株及其应用，所述耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株的分类命名是新城疫病毒NDV/rHR09‑VII‑C I，所述新城疫病毒NDV/rHR09‑VII‑C I已于2020年10月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：V202065。该毒株天然耐热，遗传稳定，对流行的基因VII型NDV强毒株免疫保护效果好，可作为预防新城疫的疫苗候选毒株。

Description

耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，涉及一种新城疫弱毒株，尤其涉及一种耐热的嵌合 型基因VII型新城疫弱毒株及其应用。
背景技术
新城疫(Newcastle disease，ND)是危害养禽业的一种急性、高度接触性传染病，每年 给世界养禽业带来巨大经济损失。目前生产上有效预防和控制ND主要依赖于接种疫苗，使 用最多的商品化疫苗是新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)弱毒疫苗，但是大多数 弱毒疫苗都对热敏感，在室温(约25℃)条件下放置1-2小时后病毒滴度迅速下降，因此为 保证疫苗质量在运输和储藏过程都需要冷链维持。低温储藏疫苗的方式非常昂贵，往往由于 保藏方式不当、冷链不完善或人为操作不当等，每年都造成大量的疫苗产品被废弃。而耐热 疫苗具有减少疫苗浪费，提高疫苗效力的有效性，减少对冷藏的依赖，减少设备的维修成本， 易于使用和材料的运输等优点。目前，由耐热株V4和I-2发展和研制成的商品化ND耐热疫 苗被广泛应用在热带和亚热带许多发展中国家的乡村鸡群中，产生了很大的经济和社会效益。 但随着NDV的不断进化，新的NDV基因型不断出现，V4和I2等毒株作为疫苗株已经与新 出现的流行NDV株存在基因型不匹配、免疫保护效果不理想等问题，对当前世界流行的NDV 基因VII型强毒株不能提供完全的临床保护，因此有必要创制耐热的、与当前流行NDV强毒 基因型相匹配的新型NDV疫苗株。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种耐热性以及遗传稳定的耐 热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱 毒株，所述耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株的分类命名是新城疫病毒NDV/rHR09-VII-C I，所述新城疫病毒NDV/rHR09-VII-C I已于2020年10月2日保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏编号是CCTCC NO：V202065，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
一种基于如所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株的构建方法，所述方法包括以 下步骤：
1)扩增属于NDV基因VII型的DT2014株F基因，对F基因进行突变，获取突变质粒DT-F-Class I；
2)基于突变质粒DT-F-Class I构建得到嵌合病毒全基因组cDNA转录体；
3)将步骤2)制备得到的嵌合病毒全基因组cDNA转录体进行转染，获取嵌合病毒阳性 尿囊液；
4)对步骤3)制备得到的嵌合病毒阳性尿囊液进行PCR鉴定，最终得到耐热的嵌合型基 因VII型新城疫弱毒株NDV/rHR09-VII-CI。
其中，步骤1)中所述F基因的突变基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明内容包括如所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株在制备新城疫药物中的 应用。
本发明内容包括如所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株在制备耐热型新城疫疫 苗中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
本发明提供了一种耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株及其应用，是针对目前传统新 城疫(Newcastle Disease，ND)疫苗弱毒株不耐热、基因型与流行毒株不匹配的问题，利用 本实验室分离鉴定的基因VIII型新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)耐热毒株HR09， 利用本室已经建立的该毒株反向遗传操作平台，将HR09毒株的F基因替换为我国流行毒株 (基因VII型)的F基因，其中该F蛋白裂解位点序列已利用定点突变技术突变为NDV Class I弱毒株特征序列，然后经过病毒拯救获得一种热稳定的新型嵌合新城疫病毒 NDV/rHR09-VII-C I。对该新型病毒株的生物学特性和免疫保护试验证明，该毒株具有较好的 耐热性，遗传稳定，对NDV流行强毒株的免疫保护效果好。本发明新型嵌合新城疫病毒 NDV/rHR09-VII-C I毒株由新分离的耐热新城疫HR09毒株经过F基因替换及裂解位点突变 获得，致病力弱，免疫原性较强，用该毒株制备的活疫苗可对鸡提供针对新城疫病毒流行毒 株的有效免疫保护作用。本发明利用本研究室分离获得的耐热新城疫病毒株及其建立的反向 遗传学技术平台，基于近年来新城疫防控研究方面的最新成果，在耐热毒株中引入与近年来 世界上流行的新城疫病毒基因型相一致的NDV F基因，并进行致弱突变改造，构建获得一株 耐热的、F基因与流行毒株相匹配的新型NDV弱毒株。该毒株天然耐热，遗传稳定，对流行 的基因VII型NDV强毒株免疫保护效果好，可作为预防新城疫的疫苗候选毒株。
附图说明
图1是DT2014株F基因的扩增结果，其中，泳道1和泳道2分别为F基因扩增结果；
图2是Class I的F蛋白裂解位点突变示意图；
图3是突变后的F蛋白酶切位点序列鉴定结果；
图4是重组嵌合病毒全基因组质粒示意图；
图5是嵌合病毒全长基因组分段扩增电泳图；
图6是嵌合病毒在SPF鸡胚上的生长曲线图；
图7是标准品质粒的标准曲线图；
图8是嵌合病毒免疫攻毒后咽喉拭子排毒监测结果；
图9是嵌合病毒免疫攻毒后泄殖腔拭子排毒监测结果；
图10是嵌合病毒免疫攻毒后各组鸡存活曲线结果。
具体实施方式
实施例1：耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株(NDV/rHR09-VII-C I)全基因组cDNA 转录载体的构建
1.嵌合型耐热基因VII型NDV全基因组cDNA转录载体的构建
(1)F基因扩增和定点突变
设计引物(DT-F-F，DT-F-R)扩增本室分离鉴定的、属于NDV基因VII型的DT2014 株(详见申请号是201910648492.8的专利申请文件)F基因ORF序列(SEQ ID NO.1)。同 时参照分类上属于Class I的NDV F蛋白裂解位点序列，设计1对突变引物(Class I-R，Class I-F)，将DT2014株的F蛋白裂解位点112RRQRRF117突变为112ERQERL117(突变后全长 序列见SEQ ID NO.2)。引物序列见表1。
表1设计的引物序列
Figure BDA0003707206230000031
提取DT2014毒株RNA，并反转录成cDNA，然后以此为模板，利用
Figure BDA0003707206230000032
High-FidelityDNA Polymerase(NEB(北京)有限公司，目录号：#M0491S)通过PCR扩增出F基因，反应 体系如下：
Figure BDA0003707206230000033
轻轻混匀，PCR反应条件为98℃反应30s；98℃反应8s，55-70℃(根据引物的Tm值计算退火温度)30s；72℃延伸时间1kb/25-30s；进行35个循环反应；72℃延伸2min。
将扩增后的PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳，回收大小正确的PCR产物(图1)，按照胶回收试剂盒说明书步骤纯化PCR产物。参照The TA
Figure BDA0003707206230000043
Kit with
Figure BDA0003707206230000044
2.1说明书步骤将纯化后的PCR产物连接pCR2.1克隆载体上。次日，挑取单个菌落放入含氨苄青霉素LB培养基中培养4h，取菌液样品做PCR鉴定，选取部分菌液样品送去测序作进一步验 证。参照质粒小量提取试剂盒说明书步骤提取鉴定正确的菌液质粒，质粒被命名为DT2014-F，置于-20℃保存备用。
以DT2014-F质粒为模板通过Overlap PCR的方式将A片段和B片段进行连接，共进行 两轮PCR反应，第一轮DT2014-F质粒为模板，以DT-F-F和Class I-R为引物扩增片段A，大小为369bp；同样以DT2014-F质粒为模板，以Class I-F和DT-F-R为引物扩增片段B，大 小为1662bp；最后，等比例混合A和B片段并以此为模板，然后以DT-F-F和DT-F-R为引 物，扩增出包含Class I NDV的F蛋白裂解位点的F基因片段。构建示意图如图2所示，PCR 反应条件如下：
Figure BDA0003707206230000041
轻轻混匀，PCR反应条件为98℃反应30s；98℃反应8s，55-70℃(根据引物的Tm值计算退火温度)30s；72℃延伸时间1kb/25-30s；进行30个循环；72℃延伸2min。
将PCR产物添加到1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，然后参照胶回收试剂盒说明书步骤回 收扩增出的A片段和B片段条带。通过Overlap PCR方式连接A和B片段，扩增出完整的F基因，具体反应如下所示：
Figure BDA0003707206230000042
Figure BDA0003707206230000051
轻轻混匀，PCR反应条件为98℃反应30s；98℃反应8s，55-70℃(根据引物的Tm值计算退火温度)30s；72℃延伸时间1kb/25-30s；进行30个循环；72℃延伸2min。将扩增后的PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶进行电泳，通过紫外凝胶成像仪分离大小正确F基因条带，按照胶回收试剂盒说明书步骤回收PCR产物。参照The TA
Figure BDA0003707206230000052
Kit with
Figure BDA0003707206230000053
2.1说明书步骤将突变后的F基因连接到pCR2.1克隆载体上，然后取10μL连接后的产物转化Trans-T1 感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD501-02)，将转化后的感受态细胞 涂布含氨苄青霉素的LB平板上，置于37℃培养过夜。
次日挑取单克隆菌落通过菌液PCR进行鉴定，将阳性的菌液样品送测序做进一步验证， 结果如图3，表明F基因已被成功突变。参照质粒小提试剂盒说明书步骤提取阳性菌液的质 粒，质粒命名为DT-F-C I。通过分光光度计测定提取质粒的浓度和纯度，置于-20℃保存备用。
(2)嵌合病毒全基因组cDNA转录载体的连接
参照
Figure BDA0003707206230000054
MultiS One Step Cloning Kit说明书步骤将突变质粒DT-F-CI与HR09 株基因组中间片段克隆的质粒TM(包含R1、R2、R3和L2，详见硕士论文：刘倩，新城疫 病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建)进行连接，构建嵌合病毒中间片段克 隆的质粒。将嵌合病毒基因组中间片段克隆的质粒与包含HR09首尾片段克隆的质粒TVT-V (包含V1和V2)通过Apa I和Mlu I进行双酶切，将酶切后的产物置于1％的琼脂糖凝胶上 电泳，回收并纯化酶切后产物，通过T4 DNA Ligase进行连接，并将连接产物转化至DH5α 感受态细胞(宝日医生物技术(北京)有限公司，Code No.9057)，第二天挑取单克隆菌落 置于含氨苄青霉素的LB培养基中，放入恒温培养箱中37℃培养6h，通过菌液PCR对菌液样品进行鉴定，将阳性的菌液样品送测序验证最终构建嵌合病毒全基因组cDNA转录载体，全长为18295bp，其中包含的NDV全长基因组(GenBank：MF285077.1)如图4所示。参照 无内毒素质粒中提试剂盒说明书步骤提取阳性菌液的质粒，同时利用PCR方法鉴定构建的全 基因组转录载体，将构建正确的嵌合病毒全基因组cDNA转录载体命名为pcHR-DT-C I。通 过分光光度计检测质粒的浓度和纯度，置于-20℃保存备用。
实施例2：耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株(NDV/rHR09-VII-C I)的病毒拯救及 鉴定
(1)嵌合病毒全基因组cDNA转录载体转染
参照
Figure BDA0003707206230000055
3000 Transfection试剂盒说明书步骤将嵌合病毒全基因组cDNA转 录载体pcHR-DT-C I与本实验室构建的3个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L，详见硕士论 文刘倩，新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建)共转染BSR细胞，转 染12h和36h后分别添加200μL无菌尿囊液，转染72h后反复冻融3次BSR细胞并将细胞及上清混合液接种10日龄SPF鸡胚尿囊液中，0.4mL/枚，置于37℃培养箱培养，弃去24h 内死亡的鸡胚，收集接种4d后的鸡胚尿囊液，通过HA试验进行验证。实验结果表明，收 获的尿囊液HA实验结果为阳性。
(2)嵌合病毒的PCR鉴定
参照超纯RNA提取试剂盒说明书步骤提取嵌合病毒阳性尿囊液RNA，反转录为cDNA。 通过PCR方法扩增嵌合病毒全长基因组各个片段(图5)，并将各扩增片段送往测序，测序 结果表明各片段均正确。以上结果表明，已成功拯救嵌合病毒，并将其命名为 NDV/rHR09-VII-C I，已于2020年10月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是 CCTCCNO：V202065，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例3：耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株(NDV/rHR09-VII-C I)的生物学特性 鉴定：
(1)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I的耐热性评价
将嵌合病毒置于56℃，分别处理30min及50min后取样，测定处理后病毒的滴度，结果如下表2所示，表明嵌合病毒在56℃热处理50min后仍具有鸡胚感染能力。
表2嵌合病毒在56℃热处理后的滴度
Figure BDA0003707206230000061
为进一步评价不同NDV毒株在室温(大约25℃)保存条件下滴度的损失情况，分别将 嵌合病毒和La Sota置于室温保存10d、20d和30d，然后按照标准检测方法分别检测其EID50值，结果如下表3所示。嵌合病毒在室温放置30d后滴度大于或等于3.4log10 EID50/0.1mL， 而La Sota在相同条件下滴度仅为1.2log10EID50/0.1mL，表明嵌合病毒与La Sota相比在室温 条件病毒滴度损失更低。
表3不同NDV置于室温(大约25℃)保存后的滴度
Figure BDA0003707206230000062
(2)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I生长性能测定
为评价嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I在SPF鸡胚上的生长特性，用无菌的PBS溶液将病 毒稀释103倍，取0.2mL病毒溶液接种10日龄的SPF鸡胚尿囊液中，将接种后的鸡胚置于37℃恒温培养箱中，分别培养24h、48h、72h和96h，收集病毒尿囊液并进行EID50测定， 结果如图6，表明构建的嵌合病毒可在鸡胚中正常生长。
(3)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I的MDT、ICPI测定
将获救的NDV在10日龄SPF鸡胚上连续传5代，然后对病毒进行鸡胚平均时间(Meandeath time，MDT)和1日龄雏鸡脑内致病指数(Intracerebral pathogenicity index，ICPI)检测。
病毒MDT的测定，具体步骤如下：
①用无菌的PBS溶液连续10倍稀释病毒感染液，稀释浓度为10-6-10-9；
②每个稀释度经尿囊腔接种5枚10日龄的SPF鸡胚，每枚接种0.1mL；
③每日观察鸡胚死亡情况，连续观察7d，记录各组鸡胚的死亡时间；
④根据公式计算出MDT值，MDT＝(Nx*X+NY*Y+……)/T
注：Nx为X小时死亡的胚数；NY为Y小时死亡的胚数；T为死亡的总胚数。
ICPI值的测定：用无菌的PBS做10倍稀释病毒，然后脑内接种10只1日龄的SPF雏鸡， 接种剂量为50μL/只。同时设立脑内接种PBS作对照组。接种后每日观察每组鸡的发病和死 亡情况，连续观察8d。正常记为0分，发病记为1分，死亡记为2分，然后根据如下计算公式计算出ICPI值。
Figure BDA0003707206230000071
结果表明，构建的嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I的MDT大于120h，且ICPI值为0，这些数据均表明所构建嵌合病毒符合弱毒株特征。
(4)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I遗传稳定性评价
将嵌合病毒在SPF鸡胚中连续传代15次，然后收集第15代的鸡胚尿囊液，参照超纯RNA 提取试剂盒说明书步骤提取病毒RNA，反转录成cDNA，然后通过PCR分别扩增出F基因，测序结果显示F基因序列未发生变化。另外，参照标准检测方法检测嵌合病毒的MDT值， 结果如下表4所示，嵌合病毒的MDT值仍大于120h，表明嵌合病毒的毒力没有发生明显变 化。
表4嵌合病毒(15代)的MDT值
Figure BDA0003707206230000072
实施例4：耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株(NDV/rHR09-VII-C I)的免疫保护效 力试验
(1)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I免疫实验分组
为评价cHR-DT-CI在SPF鸡上的免疫保护效力，将48只10日龄的SPF鸡随机分成四组 (每组12只)，其中第一组免疫La Sota病毒；第二组免疫NDV/rHR09-VII-C I；第三组免疫PBS缓冲液；第四组为正常对照组。免疫方式为点眼滴鼻，免疫剂量为106EID50/只。免疫 3周后，除对照组外，其他免疫组鸡都接种NDV强毒株ZJ1，攻毒的剂量为105EID50/只，免 疫和攻毒相关内容如下表5所示。
表5免疫和攻毒试验方案
Figure BDA0003707206230000081
(2)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I免疫后抗体效价测定
分别采集免疫后第1、2和3周不同组鸡的血清，通过血凝抑制(HI)试验和交叉HI试验(ZJ1作为反应抗原)分别检测检测免疫3周内不同组鸡血清中的抗体水平。
(3)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I免疫后攻毒后排毒量测定
①标准曲线的建立
将本实验室保存的包含ZJ1病毒F基因标准品质粒通过超纯水以10-2至10-8稀释后按照 说明书步骤进行qPCR检测，绘制标准曲线，结果如下图7所示。从获得的标准曲线可以看 出，模板拷贝数与Ct值呈线性反比关系，其中R2＞0.99，扩增效率为90.96，因此建立的标 准曲线具有良好的线性关系，符合预期效果，可用于临床样品的检测。
②排毒量的测定
在攻毒后第3、5天分别采集不同攻毒株的SPF鸡口咽拭子和泄殖腔拭子，通过实时荧 光定量PCR(Fluorescent Quantitative PCR，qPCR)方法检测攻毒后不同组鸡的排毒情况，并 以从拭子中提取RNA并反转录成cDNA，然后以cDNA为模板通过绝对定量的方式计算出攻 毒后不同免疫组病毒cDNA模板拷贝数，引物序列和探针序列如表6。
表6探针及引物序列
Figure BDA0003707206230000082
a：ZJ1株病毒全基因组；b：探针序列5端为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)报告染料；3端为非荧光MGB淬灭基 团。
根据测得标准品的数值建立标准曲线，计算出曲线的相关性系数，再通过测得样品的Ct 值，计算出样品中病毒cDNA模板拷贝数。结果表明在攻毒后第3d，疫苗免疫组鸡的口咽拭 子(图8)和泄殖腔拭子(图9)检测出的排毒量显著低于对照组(p＜0.001)，且免疫嵌合 病毒NDV/rHR09-VII-C I疫苗组的排毒量明显低于免疫La Sota疫苗组。
(4)嵌合病毒NDV/rHR09-VII-C I免疫后攻毒后临床症状和死亡率
在攻毒后14d内观察所有试验组鸡的临床症状和死亡情况，结果显示所有免疫疫苗组的 鸡都未出现任何临床症状，存活率为100％(图10)，但是对照组的鸡在攻毒后第4d出现精 神委顿，羽毛松乱，呈昏睡状，排出绿色稀粪等临床症状，攻毒后第5天喉头和嗉囊内充满 液体并出现死亡情况，而在攻毒后第6天存活率为0％，表明构建的嵌合病毒 NDV/rHR09-VII-C I可以对NDV VII强毒株提供完全保护。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1662
<212> DNA
<213> DT-2014 F基因(DT-2014 F)
<400> 1
atgggctcca aactttctac caggatccca gtacctctaa tgctaatcac tcggattatg 60
ctgacattga gctgcatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacgggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aagagcccca 240
ctggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggtga ctccatccgc 300
aagatccaag ggtctgtatc cacgtccgga ggaaggagac aaagacgttt tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctgatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgcata 600
aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt aactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ctacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780
agctcgttaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840
caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc actagtcccg 960
aaagtagtga cacaagttgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacatttc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcctgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccatata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacgtgcaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcgt gtaatgtctt atcgttagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aggtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440
ttggcagaaa gcaacagcaa actagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatccgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtctggct 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620
aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga 1662
<210> 2
<211> 1662
<212> DNA
<213> 突变后F基因(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggctcca aactttctac caggatccca gtacctctaa tgctaatcac tcggattatg 60
ctgacattga gctgcatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacgggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aagagcccca 240
ctggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggtga ctccatccgc 300
aagatccaag ggtctgtatc cacgtccgga ggagaacgtc aagagcgttt gataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctgatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480
accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgcata 600
aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt aactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ctacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780
agctcgttaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840
caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc actagtcccg 960
aaagtagtga cacaagttgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacatttc ccatgtcccc aggtatttat 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcctgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccatata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacgtgcaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcgt gtaatgtctt atcgttagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aggtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440
ttggcagaaa gcaacagcaa actagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatccgct 1500
ctcattacct atattgttct aactgtcatt tccctaattt tcggtgcact tagtctggct 1560
ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620
aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga 1662

Claims (5)

1.一种耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株，其特征在于：所述耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株的分类命名是新城疫病毒NDV/rHR09-VII-C I，所述新城疫病毒NDV/rHR09-VII-C I已于2020年10月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCNO：V202065。
2.一种基于如权利要求1所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）扩增属于NDV基因VII型的 DT2014株F基因，对F基因进行突变，然后将突变基因导入质粒中获取突变质粒DT-F-C I；
2）基于突变质粒DT-F-C I构建得到嵌合病毒全基因组cDNA转录载体；
3）将步骤2）制备得到的嵌合病毒全基因组cDNA转录载体进行转染，获取嵌合病毒阳性尿囊液；
4）对步骤3）制备得到的嵌合病毒阳性尿囊液进行PCR鉴定，最终得到耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株NDV/rHR09-VII-C I。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述F基因的突变基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株在制备新城疫药物中的应用。
5.如权利要求1所述的耐热的嵌合型基因VII型新城疫弱毒株在制备耐热型新城疫疫苗中的应用。
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