CN112156181A

CN112156181A - 一种腺病毒四价疫苗

Info

Publication number: CN112156181A
Application number: CN202011046532.0A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 杨臣臣; 冯立强
Original assignee: Guangzhou Enbao Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Enbao Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2021-01-01
Also published as: WO2022068247A1

Abstract

本发明公开了一种腺病毒四价疫苗，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。本发明的腺病毒四价疫苗能够有效刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，产生高效价的特异性中和抗体，用于预防病原体的感染。

Description

一种腺病毒四价疫苗

技术领域

本发明属于病毒免疫学技术领域，具体涉及一种腺病毒四价疫苗。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度约35-40kb。已知人腺病毒分为7个亚群(A～G)，包括50多个血清型及90多个基因型，感染患者后主要引起急性呼吸道疾病(腺病毒B和C亚群)、结膜炎(腺病毒B和D亚群)和胃肠炎(腺病毒F亚群41型和42型，G亚群52型)。腺病毒导致的呼吸道感染多由腺病毒3型、4型和7型引起，近年来腺病毒11型和14型导致的上呼吸道感染和肺炎逐渐增多，而且病毒常常发生变异，导致呼吸道疾病暴发流行。2006年保定市解放军252医院收治了一些呼吸道感染发热病人，确诊为腺病毒55型引起的呼吸道感染。腺病毒55型也是由腺病毒11型和 14型基因重组而来的变异病毒。Ad4和Ad7主要集中在部队、学校等青年和青少年聚集的地方爆发，甚至导致病人的死亡。但是，尚无治疗腺病毒感染的特效药物，临床上只能采取支持性治疗。

目前，抗腺病毒感染的疫苗仅在美国军队获得使用。该疫苗为野生型Ad4、Ad7在人胚肾二倍体成纤维细胞上传代，经冷冻脱水、混和纤维素乳糖等制成的肠溶型胶囊形式的口服活病毒疫苗。该疫苗的使用有效控制了美军腺病毒感染疫情的爆发。但是，美军使用的Ad4和Ad7苗存在极大的风险，该疫苗主要是低剂量野生型腺病毒，安全性较差，存在残余活病毒从肠道排出后污染生活环境的风险，极易造成病毒的二次污染，因而不能广泛应用于普通人群。所以，研制安全性高并能预防强病毒株的复制缺陷型腺病毒疫苗是十分必要的。

复制缺陷型腺病毒载体已经被广泛的应用于疫苗研发、基因治疗等领域，其不仅安全性好，并且在生物体内又发生较强的免疫反应。已有研究显示，腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因在抵抗宿主的免疫系统中起关键性作用。敲除E1、E3基因后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，在此方面具有减毒表型。同时，Ad3、Ad4、Ad7和Ad55 主要的表面抗原Hexon、Fiber等则不受影响，不会影响疫苗的免疫原性。因此，采用复制缺陷的腺病毒作为疫苗可有效增加疫苗的全性和使用范围。但是，研究发现很多腺病毒，尤其是非C亚群腺病毒，敲除E1、E3基因后在生产细胞株中产量较低，其主要原因是Ad5 E1B 55K不能与B亚型腺病毒E4 Orf6蛋白产生相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA 的出核，不能提高病毒晚期蛋白的表达。这些腺病毒需要表达相应E1基因的293细胞株或其他细胞株才能生产。因此，仅敲除E1、E3基因的复制缺陷型Ad3、Ad4和Ad7在疫苗生产细胞株293或PerC6种难以生产。因此，提升复制缺陷型腺病毒在这些细胞株中的生产能力是当前需要解决的瓶颈技术问题。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术缺陷，提供一种可在疫苗生产细胞株中大规模扩增的复制缺陷型重组Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的备方法和应用，及复制缺陷型重组Ad3、Ad4、Ad7和Ad55以一定的比例混合制备四价疫苗，该疫苗免疫机体可以有效刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫反应，产生特异性Ad3、Ad4、Ad7和Ad55中和抗体，用于预防Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的病原体的感染。

本发明所采取的技术方案是：

一种组合物，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒。

所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。

所述E4基因的编码框包括Orf2、Orf3、Orf 4Orf6编码框。

作为优选地，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒、55型腺病毒中至少有一种的E1基因区域整合外源基因表达框。

进一步优选地，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒颗粒数按比1：1：1：1的比例混合。

以上所述的组合物在制备疫苗或药物中的应用。

一种腺病毒四价疫苗制剂，其包括以上所述的组合物。

作为优选地，所述制剂还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的有益效果是：

(1)本发明在敲除E1和E3基因的基础上，将Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的E4基因部分编码框置换为Ad5 E4基因的相应编码框，大大提升复制缺陷型Ad3、Ad4、Ad7和Ad55 的安全性及其在生产细胞株中的复制能力。

(2)本发明制备得到的Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗经初免和加强免后，能够有效在实验动物体内诱导产生Ad3、Ad4、Ad7和Ad55特异性体液免疫和细胞免疫，产生特异性Ad3、Ad4、Ad7和Ad55中和抗体，用于预防Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的病原体的感染。与市面上Ad4和Ad7二价活疫苗(美国)相比较，本发明的四价疫苗在保留了Ad3、 Ad4、Ad7和Ad55的免疫原性的条件下大大提高了疫苗的安全性、保护范围和使用范围。

附图说明

图1为pAd3ΔE1ΔE3质粒构建流程图。

图2为pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒构建流程图。

图3为pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒构建流程图。

图4为pAd3ΔE1ΔE3质粒、pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒、pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP 的酶切鉴定结果图。

图5为复制缺陷型Ad3载体的生产及纯化结果图。

图6为复制缺陷型Ad3载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。

图7为pAd4质粒构建流程图。

图8为pAd4ΔE3质粒的构建流程图。

图9为pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建流程图。

图10为pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建流程图。

图11为pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建流程图。

图12为pAd4质粒、pAd4ΔE3质粒、pAd4ΔE1ΔE3质粒、pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6) 质粒、pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP的酶切鉴定结果图。

图13复制缺陷型Ad4载体的生产及纯化结果图。

图14为复制缺陷型Ad4载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。

图15为pAd7质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。

图16为pAd7ΔE3质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。

图17为pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。

图18为pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。

图19为pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建流程图(A)和酶切鉴定结果图(B)。

图20为复制缺陷型Ad7载体的生产及纯化结果图。

图21为复制缺陷型Ad7载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。

图22为pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建流程及酶切鉴定结果图。

图23为pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建流程及酶切鉴定结果图。

图24为pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建流程及酶切鉴定结果图。

图25为pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建流程及酶切鉴定结果图。

图26为复制缺陷型Ad55载体的生产及纯化结果图。

图27为复制缺陷型Ad55载体在HEK293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。

图28为猕猴血清中Ad3、Ad4、Ad7和Ad55中和抗体水平测定结果。

图29为猕猴血清中Ad2、Ad11和Ad14交叉中和抗体水平测定结果。

图30为猕猴PMBC ELISPOT实验结果。

具体实施方式

本发明术语“人3型腺病毒人、人4型腺病毒、人7型腺病毒、人55型腺病毒”指本领域普通技术人员已知的3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒，实施例中用到的腺病毒基因组也来源于这些已知的人腺病毒。本发明所述复制缺陷型人3型腺病毒载体、人4型腺病毒载体、人7型腺病毒载体和人55型腺病毒载体不局限于实施例所采用的特定临床分离株。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

实施例1Ad3疫苗的制备

一、E1基因的敲除及pAd3ΔE1ΔE3质粒的构建

1.E1基因敲除穿梭质粒pVax-delE1(L+R)的构建

以pAd3ΔE3为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE1及R-delE1。

L-delE1引物序列：

L-delE1 F：GATTATTGACTAGAGTATACAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAA(SEQ ID NO.1)；

L-delE1 R：GATATCGTTTAAACACTAGTCACACCTCATTTTACGTCACCTTT(SEQ ID NO.2)。

PCR程序：95℃，30秒；62℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delE1引物序列：

R-delE1 F，ACTAGTGTTTAAACGATATCAGCCGGTGTGCGTGGATGTG(SEQ ID NO.3)；

R-delE1 R，CCCAGTAGAAGCGCCGGTGCGAGACCGATGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.4)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。

L-delE1和L-delE1以同源重组酶(Exnase)接至同样酶切的pVax载体得到p3SE1LR。

2.pAd3ΔE1ΔE3质粒的构建。

pVax-delE1(L+R)以BstZ17+SgrAI线性化后，与PmeI单酶切线性化的pAd3ΔE3共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞；手工提取质粒，得到pAd3ΔE1ΔE3质粒。技术流程如图1所示，酶切鉴定结果如图4所示。所得到的pAd3ΔE1ΔE3质粒中的腺病毒基因组原E1区引入 PmeI酶切位点，以方便后续克隆。

二、Ad3 E4基因的改造及pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建

1.Ad3 E4基因的改造穿梭质粒p3△E4-(L+R)的构建

以Ad3基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂3E4L及3E4R。

3E4L引物序列：

3E4R F：GATTATTGACTAGAGTATACTGTCTAATGGTGGTGCGGCTGA(SEQ ID NO.5)；

3E4R R：CGCGTACAGACTAGAATTC AAGGAATTTCAATAAAAAATGTTGAACTTT(SEQ IDNO.6)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

3E4R引物序列：

3E4R F：GAATTCTAGTCTGTACGCG TCATATCATAGTAGCCTGTCGAACA(SEQ ID NO.7)；

3E4R R：CCCAGTAGAAGCGCCGGTG ATGGCTAATGAGGCTTTGTATGTGT(SEQ ID NO.8)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至pVax载体得到Ad3 E4基因的改造的穿梭质粒p3△E4-(L+R)。

2.Ad3 E4基因的改造穿梭质粒p3SE4-Orf2-6的构建

以Ad5基因组为模板进行PCR扩增得到Ad5腺病毒E4基因的Orf2-6。

Orf2-6引物序列：

Orf2-6 F：TTTTATTGAAATTCCTT CTACATGGGGGTAGAGTCATAATC(SEQ ID NO.9)；

Orf2-6 R：CAGGCTACTATGATATGA ATGCAGAAACCCGCAGACATGTTT(SEQ ID NO.10)。

PCR程序：95℃，30秒；65℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至MluI线性化的p3△E4-(L+R)载体，得到Ad3 E4基因的改造的穿梭质粒p3SE4-Orf2-6。

3.pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建

p3SE4-Orf2-6以BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与MluI酶切线性化的pAd3ΔE1Δ E3共转化BJ5183感受态细胞；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd3ΔE1Δ E3(Orf2-6)质粒，技术流程如图2所示，酶切鉴定结果如图4所示。。

三、携带外源基因的穿梭质粒及pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建。

1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK31-EGFP。

以pGK143-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。

引物序列：

CMV，ACGCGTTGACATTGATTATTGACTA(SEQ ID NO.11)；

BGH，CCTGCTATTGTCTTCCCAATCCT(SEQ ID NO.12)。

PCR程序：95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，30s；25个循环。

采用SoultionI将SpeI和EcoRV双酶切的CMV-EGFP-BGH表达框与SpeI+EcoRV双酶切的p3SE1LR载体进行连接，得到携带重组臂的穿梭质粒pGK31-EGFP。

2.构建基因组质粒pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP。

pGK31-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)以PmeI 线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd3ΔE1 ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒，技术流程如图3所示，酶切鉴定结果如图1-4所示。

四、复制缺陷型Ad3载体的拯救与生产

按照常规方法，pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)和pAd3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37 度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad3载体的生产及纯化结果如图5所示。

五、复制缺陷型Ad3病毒在A549及293细胞中的复制能力测定

按照常规实验方法，以噬斑形成实验鉴定复制缺陷型Ad3病毒在辅助细胞HEK293和非辅助细胞A549中的生长能力。六孔板中293或A549细胞长至九成满后，以Ad3ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP进行感染，感染滴度为1X10⁷Vp/孔。感染后4小时，吸走培养基，并铺上1％的琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖，1％BSA，1×MEM培养基)。37℃培养箱内放置9-12天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成,并拍照记录。结果如图6所示。复制缺陷型Ad3 ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP仅能在HEK293细胞中形成噬斑，在A549细胞中则不能形成噬斑。这表明，复制缺陷型Ad3载体可在E1基因互补的HEK293细胞中有效增殖，但在非辅助细胞如A549细胞中不具备复制能力，具有减毒表型。同时，该结果也显示复制缺陷型人3型腺病毒载体可携带报告基因进入靶细胞，因而可应用于报告示踪系统中。

实施例2 Ad4疫苗的制备

一、Ad4基因组环化穿梭载体的构建

1.Ad4基因组环化穿梭载体的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂Ad4-L及Ad4-R。

Ad4-L引物序列：

Ad4-L Fw，ATAGAATTCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.13)；

Ad4-L RwR，TTTACTAGTGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.14)。

PCR程序：95℃，30秒；62℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

Ad4-R引物序列：

Ad4-R Fw，ACTAGTAGCTGGATCCAAGCCTCGAGGCACTACAATG(SEQ ID NO.15)；

Ad4-R Rw，CCTGCCGTTCGACGATGCGATCGCCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG (SEQ IDNO.16)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至pSIMPLE 19(EcoRV)载体(TaKaRa)得到Ad4基因组环化穿梭质粒 pT-Ad4(L+R)。

2.pAd4质粒的构建。

pT-Ad4(L+R)以SpeI、BamHI线性化后，与Ad4基因组共转化BJ5183感受态细胞；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4，技术流程如附图7所示，酶切图如图12所示。

二、E3基因的敲除及pAd55ΔE3质粒的构建

1.E3基因敲除穿梭质粒pVax-delE3(L+R)的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE3及R-delE3。

L-delE3(或称为delE3-4L)引物序列：

L-delE3 F，GACATTGATTATTGACTAGTTTCAACACCTGGACCACTGCC(SEQ ID NO.17)；

L-delE3 R，ATTTAAATTGGAATTCAAGGTCAGAGACTGGTTGAAGGATG(SEQ ID NO.18)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delE3(delE3-4R)引物序列：

R-delE3 F，GAATTCCAATTTAAATAGCAGTCTGGCGATACCAAGG(SEQ ID NO.19)；

R-delE3 R，GTTTAAACGGGCCCTCTAGACATTCTTGGTGGTGACAGGGTC(SEQ ID NO.20)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至pVax载体得到到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)。

2.pAd4ΔE3质粒的构建。

pVax-delE3(L+R)以SpeI和XbaI双酶切线性化后，与EcoRI部分酶切线性化的pAd4共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4 ΔE3质粒，技术流程如附图8所示，酶切图如图2-6所示。所得到的pAd4ΔE3质粒中的腺病毒基因组原E3区引入1个SwaI酶切位点，以方便后续克隆。

三、E1基因的敲除及pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建

1.E1基因敲除穿梭质粒pVax-delE3(L+R)的构建

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE1及R-delE1。

L-delE1(或称为L-delK)引物序列：

L-delE1 F，CCAGATATACGCGTGTATACCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG(SEQ IDNO.21)；

L-delE1 R，GATATCAAGTTAATTAAAATCGAAACCTCCACGTAAAC(SEQ ID NO.22)。

PCR程序：95℃，30秒；50℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delE1(或称为R-delK)引物序列：

R-delE1 F，TTAATTAACTTGATATCGTGTGGATGTGACGGAGGAC(SEQ ID NO.23)；

R-delE1 R，GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGCGGGATTATTAGTGGAACTTGAG(SEQ ID NO.24)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至pVax载体(Invitrogen)得到敲除E1基因的穿梭质粒pVax-delE1(L+R)。

2.pAd4ΔE1ΔE3质粒的构建。

pVax-delE1(L+R)以BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与PsiI酶切线性化的pAd4ΔE3 共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4ΔE1ΔE3质粒，技术流程如附图9所示，酶切图如图12所示。所得到的pAd4ΔE1ΔE3 质粒中的腺病毒基因组原E1区引入1个PacI酶切位点，以方便后续克隆。

四、Ad4 E4基因的改造及pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建

1.Ad4 E4基因的改造穿梭质粒pGK143-(L+R)的构建。

以Ad4基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂4E4L及4E4R。

4E4L引物序列：

4E4R F，CATTGATTATTGACTAGAGTATACCATGCTGGCGCGGCTGACCTAGCT(SEQ IDNO.25)；

4E4R R，CGGATCCGCTGTGATTCCAACCACCGAGGACAGCCCTC(SEQ ID NO.26)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

4E4R引物序列：

4E4R F，CGGATCCGTCCAGCATGGTTAGTGTTTTTGGTGATCTGTAGAAC(SEQ ID NO.27)；

4E4R R，TAGAAGCGCCGGTGGGTAAGCTATGGACGCTGAG(SEQ ID NO.28)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至pVax载体(Invitrogen)得到到Ad4 E4基因的改造的穿梭质粒 pGK143-(L+R)。

2.Ad4 E4基因的改造穿梭质粒pGK143-Orf2-6的构建。

以Ad5基因组为模板进行PCR扩增得到Ad5腺病毒E4基因的Orf2-6。

Orf2-6引物序列：

Orf2-6 F，TCCTCGGTGGTTGGAATCACAGCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ IDNO.29)；

Orf2-6 R，CCAAAAACACTAACCATGCTGGAATGCAGAAACCCGCAGACATGTTTGAG (SEQ IDNO.30)。

PCR程序：95℃，30秒；65℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

采用同源重组酶连接至BamHI线性化的pGK143-(L+R)载体，得到Ad4 E4基因的改造的穿梭质粒pGK143-Orf2-6。

3.pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建。

pGK143-Orf2-6以BstZ17I+SgrAI双酶切线性化后，与SwaI酶切线性化的pAd4ΔE1ΔE3共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒，技术流程如图10所示，酶切图如图12所示。

五、携带外源基因的穿梭质粒及pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建。

1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK3-EGFP。

1.1以Ad4基因组为模板PCR扩增得到E1区同源重组臂4SE1L及4SE1R：

SE1L引物序列：

4SE1L Fw，CCAGATATACGCGTGTATACCATCATCAATAATATACCTTATAGATGG (SEQ IDNO.31)；

4SE1R Rw，GATATCAAGTTAATTAAAATCGAAACCTCCACGTAAAC(SEQ ID NO.32)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

4SE1R引物序列：

4SE1R Fw，TTAATTAACTTGATATCGTGTGGATGTGACGGAGGAC(SEQ ID NO.33)；

4SE1R Rw，GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGCGGGATTATTAGTGGAACTTGAG(SEQ ID NO.34)。

PCR程序：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟30秒；25个循环。

1.2构建携带重组臂的穿梭质粒pGK41-(L+R)。

采用同源重组酶(Vazyme)连接将E1区同源重组臂4SE1L和4SE1R连接至pVax载体，得到携带重组臂的穿梭质粒pGK41-(L+R)。

1.3构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK41-EGFP。

以pGA1-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。

引物序列：

CMV，GTCACATCCACACGATACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG(SEQ ID NO.35)；

BGH，TTTTAATTAACTTGATCCTGCTATTGTCTTCCCAATC(SEQ ID NO.36)。

PCR程序：95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，30s；25个循环。

采用同源重组酶(Vazyme)将CMV-EGFP-BGH表达框连接至pGK41-(L+R)载体，得到携带重组臂的穿梭质粒pGK41-EGFP。

2.构建基因组质粒pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP。

pGK41-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)以PacI 线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd4ΔE1 ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒，技术流程如图11所示。双酶切鉴定结果参见图12。

六、复制缺陷型Ad4载体的拯救与生产

按照常规方法，pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)和pAd4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在 37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；2-3 天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000 转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad4载体的生产及纯化结果如附图13所示。

七、复制缺陷型Ad4病毒在A549及293细胞中的复制能力测定

按照常规实验方法，以噬斑形成实验鉴定复制缺陷型Ad4病毒在辅助细胞HEK293和非辅助细胞A549中的生长能力。六孔板中293或A549细胞长至九成满后，以Ad4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP进行感染，感染滴度为1X107Vp/孔。感染后4小时，吸走培养基，并铺上1％的琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖，1％BSA，1×MEM培养基)。37℃培养箱内放置9-12 天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成,并拍照记录。结果如图14所示。复制缺陷型 Ad4ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP仅能在HEK293细胞中形成噬斑，在A549细胞中则不能形成噬斑。这表明，复制缺陷型Ad4载体可在E1基因互补的HEK293细胞中有效增殖，但在非辅助细胞如A549细胞中不具备复制能力，具有减毒表型。同时，该结果也显示复制缺陷型人4型腺病毒载体可携带报告基因进入靶细胞，因而可应用于报告示踪系统中。

实施例3复制缺陷型Ad7疫苗的制备

一、Ad7基因组的环化。

1.构建环化Ad7基因组的穿梭质粒pT-Ad7(L+R)。

以Ad7的基因组为模板，PCR获得Ad7基因组的左臂(L-Ad7)和右臂(R-Ad7)。

L-Ad7引物：

L-Ad7-F：ACTGCGATCGCCTCTCTATTTAATATACCTTATAGATGG(SEQ ID NO.37)；

L-Ad7-R：ACATGGATCCTCACTGAAGATAATCTCCTGTGG(SEQ ID NO.38)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；56℃30s；72℃，40s；cycles 30；72℃，5min； 12℃保存。

R-Ad7引物：

R-Ad7-F：AGCTGGATCCGAACCACCAGTAATATCATCAAAG(SEQ ID NO.39)；

R-Ad7-R：TGAGCGATCGCCTCTCTATATAATATACCTTATAGATGGAA(SEQ ID NO.40)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；cycles 30；72℃，5min； 12℃保存。

PCR产物和T载体使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pT-Ad7(L+R)。

2.构建pAd7。

pT-Ad7(L+R)使用BamHI进行酶切线性化，然后和Ad7的基因组共转化BJ5183感受态细胞进行重组，氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到的单克隆扩增后提取其质粒转化 XL-Blue化学感受态细胞，提取质粒得到pAd7，使用不同的酶切方式进行鉴定，pAd7在基因组的两侧引入了两个AsisI酶切位点，方便后续对改造后的Ad7基因组进行线性化进行病毒拯救。具体构建过程如图15所示。

二、E3基因的敲除及pAd7ΔE3质粒的构建。

1.构建E3基因敲除的穿梭质粒pVax-ΔE3(L+R)。

E3基因敲除穿梭质粒pVax-ΔE3(L+R)的构建。以Ad7的基因组为模板，PCR获得E3基因的左臂(L-ΔE3)和右臂(R-ΔE3)。

L-ΔE3引物：

L-ΔE3-F：CATACTAGTCTGTCTACTTCAACCCCTTCTCCG(SEQ ID NO.41)；

L-ΔE3-R:GCAGAATTCATTTAAATGGAGGAAGGGTCTGGGTCTTCTG(SEQ ID NO.42)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；63℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min； 12℃保存。

R-ΔE3引物：

R-ΔE3-F:GCAGATATCATTTAAATAGACCCTATGCGGCCTAAGAGAC(SEQ ID NO.43)；

R-ΔE3-R：ACATCTAGAGACAGTTGGCTCTGGTGGGGT(SEQ ID NO.44)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，40s；cycles 30；72℃，5min； 12℃保存。

L-ΔE3使用SpeI+EcoRI酶切后，连接至相同酶切的pVax载体上，得到pVax-L-ΔE3。 R-ΔE3使用EcoRV+XbaI进行酶切，连接至相同酶切的pVax-L-ΔE3骨架上得到pVax-ΔE3(L+R)。

2.pAd7ΔE3质粒的构建。

pVax-ΔE3(L+R)以SpeI+XbaI线性化，pAd7以EcoRI线性化，乙醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞，手提取质粒并进行酶切鉴定。得到敲除E3基因并在E3区引入唯一的单酶切位点SwaI的基因组质粒pAd7ΔE3。SwaI酶切位点的插入，方便在E3基因区进行线性化。穿梭质粒及pAd7ΔE3质粒的构建示意图及大质粒的酶切鉴定结果如图16所示。

三、E1基因的敲除及pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建。

1.构建E1基因敲除的穿梭质粒pT-Ad7ΔE1(L+R)。

E1基因敲除穿梭质粒pT-Ad7ΔE1(L+R)的构建。以Ad7的基因组为模板，PCR获得E1基因的左臂(L-ΔE1)和右臂(R-ΔE1)。

L-ΔE1引物：

L-ΔE1-F：ACTCACCGGCGGCGATCGCCTCTCTATTTAATATACCTTATAGATGG(SEQ IDNO.45)；

L-ΔE1-R：ATCACAATTGAATTCGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAA(SEQ ID NO.46)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；54℃30s；72℃，30s；cycles 30；72℃，5min； 12℃保存。

R-SE1引物：

R-SE1-F：ATAGAATTC ACTAGTGAGGCCCGATCATTTGGTGCT(SEQ ID NO.47)；

R-SE1-R：ACGTATAC CTATCATTATGGATGAGTGCATGG(SEQ ID NO.48)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min 10s；cycles 30；72℃，5min；12℃保存。

2.pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建。

pT-Ad7-ΔE1(L+R)以Bstz17I线性化，pAd7以AatII线性化，乙醇沉淀法回收后共转化 BJ5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞，手提取质粒并进行酶切鉴定。敲除E1基因并在E1区引入单酶切位点PmeI的基因组质粒pAd7ΔE1ΔE3。PmeI酶切位点的插入，方便在E1基因区进行线性化。穿梭质粒及 pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建示意图及大质粒的酶切鉴定结果如图17所示

四、构建整合Ad5 E4部分序列的质粒pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)

1.构建E4基因区的穿梭质粒p7SE4。以Ad7的基因组为模板PCR获得E4基因区的左臂(L-SE4)和右臂(R-SE4)。

扩增Ad7 L-SE4的引物序列：

L-SE4-F:CGCGGATCTTCCAGAGATGTTTAAACAACCAGTTACTCCTAGAACAGTCAGC (SEQ IDNO.49)；

L-SE4-R:ACGCGTATGGATTTAAAT CGATGCAGGCGAGAGTCTATTC(SEQ ID NO.50)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,45s；cycles 30；72℃,5min；

扩增Ad7 R-SE4的引物序列：

R-SE4-F:ATTTAAATCCATACGCG TGGAGTTCTTATTAAGTGCGGATGG(SEQ ID NO.51)

R-SE4-R:GCCTGCCGTTCGACGATGTTTAAAC CAGCTGGCACGACAGGTTTC(SEQ ID NO.52)

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,30s；cycles 30；72℃,5min；

PCR获得的L-SE4、R-SE4片段和平末端的T载体进行三片段连接得到p7SE4。

2.构建携带Ad5 E4部分序列的E4基因区的穿梭质粒p7SE4(Orf2-6)。以Ad5的基因组为模板PCR获得Ad5 E4Orf2-6。

Ad5 Orf2-6-F:TCACAGTCCAACTGCT CCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ IDNO.53)；

Ad5 Orf2-6-R:GCGCGGTAACCTATTG CATGCAGAAACCCGCAGACATG(SEQ ID NO.54)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；65℃30s；72℃,2min；cycles 30；72℃,5min；

以p7SE4为模板PCR获得其骨架序列

p7SE4-F:CAATAGGTTACCGCGCTGCG(SEQ ID NO.55)；

P7SE4-R:AGCAGTTGGACTGTGAAAGCGC(SEQ ID NO.56)。

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,6min；cycles 30；72℃,6min；

将上述PCR获得的片段利用Exnase酶进行双片段连接得到p7SE4(Orf2-6)；

3.构建质粒pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)。

p7SE4(Orf2-6)使用PmeI进行酶切线性化，pAd7ΔE1ΔE3使用SwaI进行酶切线性化，利用乙醇沉淀法回收上述两种酶切产物，共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL-Blue感受态细胞，提取质粒得到pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)，提取质粒进行酶切鉴定，pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)具体构建过程及大质粒的鉴定结果参见图18。

五、携带外源基因的E1基因区穿梭质粒及pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建。

1.构建携带外源基因表达框的E1基因区穿梭质粒pGK71-EGFP。

1)以Ad7的基因组为模板PCR获得E1基因区穿梭质粒的左臂SE1L和右臂SE1R。

SE1L的扩增：

SE1L-F:CCAGATATACGCGTGTATACTTAATTAACGGCATCAGAGCAGATTGTACTG (SEQ IDNO.57)；

SE1L-R:GTTTAAACAAGATTTAAATGTAATCGAAACCTCCACGTAAACG(SEQ ID NO.58)。

SE1R的扩增：

SE1R-F:ATTTAAATCTTGTTTAAACGAATTCACTAGTGAGGCCCGATC(SEQ ID NO.59)；

SE1R-R:GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGTTAATTAACAAGTAGCTTGTCCTCAGCCAG G(SEQ IDNO.60)。

2)构建携带E1基因区重组臂的穿梭质粒pSE1LR。

使用Bstz17I+SgraI双酶切质粒pVax回收质粒骨架，然后和上述PCR获得SE1L、SE1R 使用Exnase酶进行三片段连接得到pSE1LR。

3)构建携带EGFP表达框的穿梭质粒pGK71-EGFP。

以实验室保存的pGA1-EGFP质粒为模板，PCR扩增获得CMV-EGFP-BGH的表达框。

扩增CMV-EGFP-BGH的引物序列：

CMV-EGFP-BGH-F:ACTAGTGAATTCGTTTACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG G(SEQ IDNO.61)；

CMV-EGFP-BGH-R:CATTTAAATCTTGTTTCCTGCTATTGTCTTCCCAATC(SEQ ID NO.62)；

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃2min；cycles 30；72℃,5min；

pSE1LR使用PmeI酶切进行线性化，然后和PCR扩增获得的CMV-EGFP-BGH表达框使用Exnase酶进行连接得到pGK71-EGFP。

2.构建插入外源基因EGFP的腺病毒重组质粒pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP。

pGK71-EGFP使用PacI进行线性化，pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)使用PmeI酶切进行线性化，利用乙醇沉淀法回收上述两种酶切产物，共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL-Blue感受态细胞，提取质粒得到pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP，提取质粒进行酶切鉴定，pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP具体构建过程及大质粒的鉴定结果参见图19。

六、复制缺陷型Ad7载体的拯救与生产

按照常规方法，pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)和pAd7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4-6小时后，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10-15个15厘米皿； 2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清加至氯化铯密度梯度离心管； 4℃,35000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃ 冻存。复制缺陷型Ad7载体的生产及纯化结果如图20所示。

七、复制缺陷型Ad7在293和A549细胞中复制能力测定

采用噬斑实验测定复制缺陷型Ad7载体在辅助细胞293和非辅助细胞A549中的复制能力。在6孔细胞板中接种293或者A549细胞，待到细胞密度接近100％时，将收获的的P1代Ad7ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP病毒原液梯度稀释后分别感染293或者A549细胞，每个病毒浓度做两个重复。病毒感染细胞2h后，吸去培养基，每孔铺上2ml左右的琼脂糖凝胶 (含1ml 1.4％琼脂糖，1ml 1×MEM培养基，200ul BSA，1×青链霉素抗生素)。培养9-12 天左右，利用荧光显微镜观察病毒携带的绿色荧光表达，并寻找病毒克隆的形成，拍照记录。结果如图21所示，Ad14ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP同时删除了E1和E3基因，只能在辅助细胞293中形成病毒噬斑，却无法在人正常的A549细胞形成病毒噬斑。以上结果表明复制缺陷型Ad7载体可在辅助细胞293中复制，却无法在人的正常细胞如A549细胞中复制，具有减毒表型。此外，复制缺陷型Ad7载体可在感染的细胞中表达携带的报告基因，运用于生物示踪系统中。

实施例4 Ad55疫苗的制备

一、E1基因的敲除及pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建

1.E1基因敲除穿梭质粒pVax-delE1(L+R)的构建。

以Ad55基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE1及R-delE1。

L-delE1引物序列：

L-delE1 F：ATAGAATTCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.63)；

L-delE1 R：TTTACTAGTGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.64)。

PCR程序：95℃，30秒；62℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-arm引物序列：

R-delE1 F：ATTTCTAGAGTTTAAACGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO.65)；

R-delE1 R：AAAGAATTCGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO.66)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。

L-delE1以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delE1；R-delE1 以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE1得到敲除E1基因的穿梭质粒 pVax-delE1(L+R)。

2.pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建。

pVax-delE1(L+R)以EcoRI线性化后，与PacI单酶切线性化的pAd55ΔE3共转化BJ5183 感受态细胞；经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue 感受态细胞；手工提取质粒，得到pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如图22所示。所得到的pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒中的腺病毒基因组原E1区引入2 个PmeI酶切位点，以方便后续克隆。

二、Kana抗性基因的敲除及pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建

1.Kana抗性基因敲除穿梭质粒pVax-delK(L+R)的构建。

以Ad55基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delK及R-delK。

L-delK引物序列：

L-delK F：ATAACTAGTGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.67)；

L-delK R：TTTGAATTCGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.68)。

PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。

R-delK引物序列：

R-delK F：ATCGTTTAAACGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO.69)；

R-delK R：ATCTCTAGAGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO.70)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。

L-delK以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delK；R-delK以 EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE3得到敲除Kana基因的穿梭质粒 pVax-delK(L+R)。

2.pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建。

pVax-delK(L+R)以SpeI+XbaI线性化，pAd55ΔE1ΔE3-Kana以PmeI线性化，乙醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手工提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞，手工提取质粒并进行酶切鉴定。得到去除Kana抗性基因并在E1区引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3。穿梭质粒及pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建示意图及酶切鉴定结果如图23所示。

三、Ad55 E4基因的改造及pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建

1.Ad55 E4基因改造的穿梭质粒构建。

(1)以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到Ad55 E4基因。

R-delE3 Mlu：GATCACGCGTGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQ ID NO.71)；

L-delK R：TGTAGATCTGTTTAAACCTTTAGCCCCATTACGTCAGTTTAG(SEQ ID NO.72)。

PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，4分钟；25个循环。

PCR产物末端加磷酸化之后，与平末端T载体(TaKaRa)连接，得到p55E4。

(2)以p55E4质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到末端加入SapI酶切位点且去除Ad55 E4 Orf(2-6)基因的线性化p55E4。

Sap-p55E4 R：TTACGCTCTTCCTAGCCGTGATCCAGACTCCGG(SEQ ID NO.73)；

Sap-p55E4orf2 F：ATAGCTCTTCCCATTGTTAGTTTTGAATGAGTCTGCA(SEQ ID NO.74)；

PCR程序：95℃，30秒；61.5℃，30秒；72℃，4分钟；25个循环。

以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到末端加入SapI位点的Ad5 E4 Orf(2-6)。

Sap-5ORF2-6 F：AATAGCTCTTCCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ ID NO.75)Sap-5ORF2-6 R：ATATGCTCTTCCATGCAGAAACCCGCAGACATG(SEQ ID NO.76)

PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，2分钟；25个循环。

上述线性化p55E4及Ad5 E4 Orf(2-6)片段以SapI酶切后相连接，得到p55E4(Orf2-6)。

2.pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)质粒的构建。

p55E4(Orf2-6)以MluI+PmeI线性化，pAd55ΔE1ΔE3以PsiI线性化，共转化BJ5183感受态细胞，重组得到缺失E1、E3基因，且E4基因经过改造的基因组质粒pAd55ΔE1Δ E3(Orf2-6)。具体构建过程及鉴定结果参见图24。

四、携带外源基因的穿梭质粒和pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒的构建。

1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK551-EGFP。

1)以Ad55基因组为模板PCR扩增得到E1区同源重组臂SE1L及SE1R：

SE1L引物序列：

SE1L F，AATGGTACCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.77)；

SE1L R，ATCGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.78)。

PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，30秒；25个循环。

SE1R引物序列：

SE1R F，AACACTAGTGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO.79)；

SE1R R，TTAACGCGTGTATACGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO.80)。

PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟30秒；25个循环。

2)构建携带重组臂的穿梭质粒pSE1LR。

pSE3LR以KpnI+EcoRV切，SE1L同样酶切，连接得到pSE1L；pSE1L以SpeI+MluI 切，SE1R同样切，连接得到pSE1LR。

3)构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK551-EGFP等。

以pGA1-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。

CMV，AGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQ ID NO.81)；

BGH，GCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG(SEQ ID NO.82)。

PCR程序：95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，1分钟45秒；25个循环。

pSE1LR以SpeI+EcoRV切，CMV-EGFP-BGH以SpeI切，连接得到目标穿梭质粒pGK551-EGFP。

2.构建基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP等。

pGK551-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)以PmeI线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP质粒。具体构建过程及鉴定结果参见图25。

五、复制缺陷型Ad55载体的拯救与生产

按照常规方法，pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)和pAd55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP分别以AsiSI 线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3 天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染6-10个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃,35000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad55载体的生产及纯化结果如图26所示。

六、复制缺陷型Ad55病毒在A549及293细胞中的复制能力鉴定。

按照常规方法，以噬斑形成实验鉴定复制缺陷型Ad55载体在辅助细胞293以及非辅助细胞A549中的生长能力。六孔板中293或A549细胞长至九成满后，以Ad55ΔE1Δ E3(Orf2-6)-EGFP进行感染，感染滴度为1X10⁷Vp/孔。感染后4小时，吸走培养基，并铺上 1％的琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖，5％胎牛血清，1×MEM培养基)。37℃培养箱内放置10-12 天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成,并拍照记录。结果如图27所示。复制缺陷型 Ad55ΔE1ΔE3(Orf2-6)-EGFP仅能在293细胞中形成噬斑，在A549细胞中则不能形成噬斑。这表明，复制缺陷型Ad55载体可在293细胞中有效增殖，但在正常人体细胞如A549细胞中不具备复制能力，具有减毒表型。同时，该结果也显示复制缺陷型人55型腺病毒载体可携带报告基因进入靶细胞，因而可应用于报告示踪系统中。

实施例5四价疫苗制备

将经氯化铯密度梯度力离心纯化后的复制缺陷型Ad3、Ad4、Ad7和Ad55疫苗分别稀释至8×10¹¹vp/ml，以500ul/管的量进行独立分装，-80℃保存。Ad3、Ad4、Ad7和Ad55 四价疫苗(Ad3：2×10¹⁰vp/ml；Ad4：2×10¹⁰vp/ml，Ad7：2×10¹⁰vp/ml；Ad4：2×10¹⁰vp/ml)：取分装的Ad3、Ad4、Ad7和Ad55疫苗各250ul(1管)转移至15ml离心管中，进行10倍稀释，充分混匀，-80℃保存待用。

实施例6 Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗在猕猴中免疫原性评价

设计Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗在猕猴中免疫原性评价方案，如表1所示，按照设计的免疫方案对Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗的免疫原性进行评价。

表1

选取成年恒河猴，分为2组，每组4只。采取肌注(手臂)免疫的方式，第1组免疫Ad3、Ad4、Ad7和Ad55四价疫苗(实验组)，第2组为对照组。免疫后第28天，静脉采血分离血清，测定抗Ad3、Ad4、Ad7和Ad55的特异性中和抗体。同时按上述方案第35 天加强免疫；第49天(加强免疫2周)，静脉取血并分离血清，测定抗Ad3、Ad4、Ad7和 Ad55的特异性中和抗体。结果如图28所示，实验组初免后即可产生高效价抗Ad3、Ad4、 Ad7和Ad55的特异性中和抗体，而加强后抗体效价水平显著提升；对照组样品中Ad3、Ad4、 Ad7和Ad55的中和抗体呈阴性。此外，我们对该四价疫苗对其他血清型腺病毒的交叉保护进行了分析，结果显示，加强免疫后两周的血清中存在较高效价的Ad2、Ad11和Ad14的抗体，证明该疫苗存在交叉保护作用，结果图29所示。我们分离了加强免疫后猕猴外周血单个核细胞(PBMC)进行了ELISPOT分析，结果如图30所示，该四价疫苗免疫后能够有效刺激猕猴机体产生较强的特异性细胞免疫应答。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司

<120> 一种腺病毒四价疫苗

<130>

<160> 82

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gattattgac tagagtatac agtgccacct gacgtctaag aaa 43

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatatcgttt aaacactagt cacacctcat tttacgtcac cttt 44

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actagtgttt aaacgatatc agccggtgtg cgtggatgtg 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccagtagaa gcgccggtgc gagaccgatg gtccagggc 39

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gattattgac tagagtatac tgtctaatgg tggtgcggct ga 42

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcgtacaga ctagaattca aggaatttca ataaaaaatg ttgaacttt 49

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaattctagt ctgtacgcgt catatcatag tagcctgtcg aaca 44

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccagtagaa gcgccggtga tggctaatga ggctttgtat gtgt 44

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttttattgaa attccttcta catgggggta gagtcataat c 41

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggctacta tgatatgaat gcagaaaccc gcagacatgt tt 42

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acgcgttgac attgattatt gacta 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cctgctattg tcttcccaat cct 23

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atagaattcg gggtggagtg tttttgcaag 30

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttactagtg tttaaacgta atcgaaacct ccacgtaatg g 41

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

actagtagct ggatccaagc ctcgaggcac tacaatg 37

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctgccgttc gacgatgcga tcgccatcat caataatata ccttatagat gg 52

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gacattgatt attgactagt ttcaacacct ggaccactgc c 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atttaaattg gaattcaagg tcagagactg gttgaaggat g 41

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaattccaat ttaaatagca gtctggcgat accaagg 37

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtttaaacgg gccctctaga cattcttggt ggtgacaggg tc 42

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccagatatac gcgtgtatac catcatcaat aatatacctt atagatgg 48

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gatatcaagt taattaaaat cgaaacctcc acgtaaac 38

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ttaattaact tgatatcgtg tggatgtgac ggaggac 37

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcccagtaga agcgccggtg cgggattatt agtggaactt gag 43

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cattgattat tgactagagt ataccatgct ggcgcggctg acctagct 48

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cggatccgct gtgattccaa ccaccgagga cagccctc 38

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cggatccgtc cagcatggtt agtgtttttg gtgatctgta gaac 44

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tagaagcgcc ggtgggtaag ctatggacgc tgag 34

<210> 29

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcctcggtgg ttggaatcac agctacatgg gggtagagtc ataatcg 47

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ccaaaaacac taaccatgct ggaatgcaga aacccgcaga catgtttgag 50

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ccagatatac gcgtgtatac catcatcaat aatatacctt atagatgg 48

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gatatcaagt taattaaaat cgaaacctcc acgtaaac 38

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ttaattaact tgatatcgtg tggatgtgac ggaggac 37

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gcccagtaga agcgccggtg cgggattatt agtggaactt gag 43

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gtcacatcca cacgatacta gttattaata gtaatcaatt acggg 45

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttttaattaa cttgatcctg ctattgtctt cccaatc 37

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

actgcgatcg cctctctatt taatatacct tatagatgg 39

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acatggatcc tcactgaaga taatctcctg tgg 33

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

agctggatcc gaaccaccag taatatcatc aaag 34

<210> 40

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tgagcgatcg cctctctata taatatacct tatagatgga a 41

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

catactagtc tgtctacttc aaccccttct ccg 33

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gcagaattca tttaaatgga ggaagggtct gggtcttctg 40

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcagatatca tttaaataga ccctatgcgg cctaagagac 40

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

acatctagag acagttggct ctggtggggt 30

<210> 45

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

actcaccggc ggcgatcgcc tctctattta atatacctta tagatgg 47

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

atcacaattg aattcgttta aacgtaatcg aaacctccac gtaa 44

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

atagaattca ctagtgaggc ccgatcattt ggtgct 36

<210> 48

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

acgtatacct atcattatgg atgagtgcat gg 32

<210> 49

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

cgcggatctt ccagagatgt ttaaacaacc agttactcct agaacagtca gc 52

<210> 50

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

acgcgtatgg atttaaatcg atgcaggcga gagtctattc 40

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

atttaaatcc atacgcgtgg agttcttatt aagtgcggat gg 42

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gcctgccgtt cgacgatgtt taaaccagct ggcacgacag gtttc 45

<210> 53

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tcacagtcca actgctccta catgggggta gagtcataat cg 42

<210> 54

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gcgcggtaac ctattgcatg cagaaacccg cagacatg 38

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

caataggtta ccgcgctgcg 20

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

agcagttgga ctgtgaaagc gc 22

<210> 57

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ccagatatac gcgtgtatac ttaattaacg gcatcagagc agattgtact g 51

<210> 58

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gtttaaacaa gatttaaatg taatcgaaac ctccacgtaa acg 43

<210> 59

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

atttaaatct tgtttaaacg aattcactag tgaggcccga tc 42

<210> 60

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gcccagtaga agcgccggtg ttaattaaca agtagcttgt cctcagccag g 51

<210> 61

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

actagtgaat tcgtttacta gttattaata gtaatcaatt acggg 45

<210> 62

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

catttaaatc ttgtttcctg ctattgtctt cccaatc 37

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

atagaattcg gggtggagtg tttttgcaag 30

<210> 64

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tttactagtg tttaaacgta atcgaaacct ccacgtaatg g 41

<210> 65

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

atttctagag tttaaacgag accggatcat ttggttattg 40

<210> 66

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

aaagaattcg ggaaatgcaa atctgtgagg g 31

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

ataactagtg gggtggagtg tttttgcaag 30

<210> 68

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

tttgaattcg tttaaacgta atcgaaacct ccacgtaatg g 41

<210> 69

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

atcgtttaaa cgagaccgga tcatttggtt attg 34

<210> 70

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

atctctagag ggaaatgcaa atctgtgagg g 31

<210> 71

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

gatcacgcgt ggactaagag acctgctacc catg 34

<210> 72

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

tgtagatctg tttaaacctt tagccccatt acgtcagttt ag 42

<210> 73

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ttacgctctt cctagccgtg atccagactc cgg 33

<210> 74

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

atagctcttc ccattgttag ttttgaatga gtctgca 37

<210> 75

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

aatagctctt ccctacatgg gggtagagtc ataatcg 37

<210> 76

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

atatgctctt ccatgcagaa acccgcagac atg 33

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

aatggtaccg gggtggagtg tttttgcaag 30

<210> 78

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

atcgtaatcg aaacctccac gtaatgg 27

<210> 79

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

aacactagtg agaccggatc atttggttat tg 32

<210> 80

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

ttaacgcgtg tatacgggaa atgcaaatct gtgaggg 37

<210> 81

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

agatatacgc gttgacattg attattgact ag 32

<210> 82

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

gctggttctt tccgcctcag aag 23

Claims

1.一种组合物，其包括复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒和55型腺病毒。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人3型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人4型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人7型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人55型腺病毒的E1、E3基因缺失，E4基因的部分编码框置换为人5型腺病毒E4基因的相应编码框。

6.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部分编码框包括Orf2、Orf3、Orf 4和Orf6编码框。

7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部分编码框包括Orf2、Orf3、Orf 4和Orf6编码框。

8.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部分编码框包括Orf2、Orf3、Orf 4和Orf6编码框。

9.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述E4基因的部分编码框包括Orf2、Orf3、Orf 4和Orf6编码框。

10.根据权利要求1-9所述的组合物，其特征在于，所述复制缺陷型人3型腺病毒、4型腺病毒、7型腺病毒、55型腺病毒中至少有一种腺病毒的E1基因区域整合外源基因表达框。

11.根据1-10任一权利要求所述的组合物在制备疫苗，检测试剂，调节基因功能的制剂或药物中的应用。

12.一种腺病毒四价疫苗制剂，其包括1-10任一权利要求所述的组合物。

13.根据权利要求12所述的腺病毒四价疫苗制剂，其特征在于，所述制剂还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。

14.根据权利要求12所述的腺病毒四价疫苗制剂，其特征在于，所述制剂也对其它血清型腺病毒产生了交叉保护。