CN113897394B - 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113897394B
CN113897394B CN202110763754.2A CN202110763754A CN113897394B CN 113897394 B CN113897394 B CN 113897394B CN 202110763754 A CN202110763754 A CN 202110763754A CN 113897394 B CN113897394 B CN 113897394B
Authority
CN
China
Prior art keywords
adenovirus
plasmid
vector
pad5lcl3
ires
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110763754.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113897394A (zh
Inventor
陈平
李娜
张婷婷
钟鑫涛
祝志刚
张利娟
李娅芳
李楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd filed Critical Jiaxing Anyu Biotechnology Co ltd
Publication of CN113897394A publication Critical patent/CN113897394A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113897394B publication Critical patent/CN113897394B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达P72和B602L、P30和P54基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。

Description

一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427453，申请日2020年7月6日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学领域，具体而言，涉及一种非洲猪瘟病毒的重组腺病毒疫苗及其构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASFVirus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制，具有20面体结构，直径为175～215nm,基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。构成ASFV病毒粒子的结构蛋白有P30、P72、P49、P54、P220、P62、pB602L、CD2v蛋白等，基于一个或两个亚单位疫苗迄今未能诱导免疫强大到足以对疫苗接种者具有显著保护作用。
我国已于2018年发现ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。因此，迫切需要开发针对ASFV的疫苗。有报道，ASFV疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒疫苗的生物安全是其使用的主要限制因素，减毒毒株在我国是不允许研究的。然而在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
因此需要开发新型的ASFV疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。有利的是，需要用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。
活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。腺病毒5型作为表达非洲猪瘟抗原蛋白的载体具有很多优势：①腺病毒表达载体是复制缺陷型的，只能在其独特的互补细胞系中生产制备，同时腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低，制备疫苗安全性好；②重组的腺病毒载体可获得较高的滴度，利于大规模生产，工厂化效率高，生产成本低；③目前对腺病毒5型的结构、特性、功能的研究较为深入，腺病毒载体容易复制，操作简单，利于研究；④普通的一代腺病毒载体基因组敲除了6K的基因，能插入外源基因7.5k，具有较大的容量；⑤腺病毒相对稳定，经得起纯化、浓缩、保存。
现有技术报道了一些活载体疫苗。例如将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫,获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R共7个ASFV抗原基因,重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答。但“鸡尾酒”式免疫，每个ASFV抗原基因都必须重组入一个复制缺陷型腺病毒载体，因此需要的载体数量非常多，有在免疫过程中受到针对腺病毒载体的免疫反应的风险。CN108504686A和CN108504687A分别提供了表达ASFV的EP153R和EP402R基因的重组腺病毒载体。CN109652449A公开了EP153R与EP402R两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，CN109735567A公开了EP153R与P54两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体。
但为了进一步增强对ASF的特异性免疫反应，还需进一步提高腺病毒载体的抗原基因容量，需用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质，以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
CN110269932A公开了将ASFV的A104R、A151R、B119L、B602L、CD2v、K205R、P49等5-7种抗原基因基于腺病毒载体融合在一起用于制备活载体疫苗。但多个抗原基因融合存在降低免疫原性和可能导致免疫失效的风险，因此要提高疫苗活性，还是必须要在每一个腺病毒载体上表达完全独立的抗原基因。
ASFV的P30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由CP204L基因编码。研究发现P30能够诱导宿主细胞产生抑制细胞内化的中和抗体，从而使得疾病发作延迟甚至保护细胞抵抗病毒感染，因此P30在阻断病毒与细胞相互作用中有着重要的作用。P30作为病毒的早期蛋白，感染细胞后主要分布于细胞质中，在感染后4小时即可在胞浆内检测到；P30也是最具有抗原性的ASFV蛋白之一，有很强的免疫原性，在感染动物体内能诱导机体产生病毒中和抗体，因此通常被用做诊断抗原。ASFV的P54蛋白，由E183L基因编码，其抗体具有一定的病毒中和能力，此外，P30蛋白和P54蛋白与易感细胞上的两个不同的受体或结合位点相互作用，能缓和病程。P72蛋白是ASFV的主要检测抗原之一，大小约75ku。稳定性好，变异小。以P72蛋白为抗原，已经研发出一系列检测产品。由B602L基因编码的pB602L蛋白，可刺激基体产生较高水平的抗体。但目前现有技术中还没有四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，也没有关于ASFV的P72、B602L、P30、P54四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体并运用于活载体疫苗的开发。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54。
非洲猪瘟病毒的抗原基因共计有160多种，发明人经过大量筛选实验，从中选出了20种免疫效果更强的抗原基因，分别为：P72、B602L、P30、P54、CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L、L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R、EP153R、I177L、K205R、F317L、A151R、P34、pp62；这20种抗原基因根据基因片段大小和蛋白结构，被分成五组，每组的4种抗原基因能在本发明提供的重组腺病毒载体pAd5LCL3中得以共表达，即能在同一载体中完全独立表达四种抗原基因。这五组抗原基因疫苗(包括了5个重组腺病毒载体pAd5LCL3)组成了完整的非洲猪瘟病毒疫苗，取得了非常好的免疫效果。本发明选取了P72、B602L、P30、P54四种抗原基因，可以很好地搭配组装在同一重组腺病毒载体中，从而得以完全独立表达这四种抗原基因。
一方面，本发明提供了一种可同时表达多种抗原基因的重组腺病毒载体pAd5LCL3，所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3缺失E1、E3、E4和E2a基因，具有可分别同时表达一个或多个外源的抗原基因的E1区和E4区；所述抗原基因可以是任意来源的大小合适的抗原基因。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E1区和E4区可表达四个不同或相同来源的抗原基因。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E4区域缺失了ORF1～ORF7的序列。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E2a区域(又称DNA Binding Protein，DBP)缺失。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E4区域的E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列放在了E2a位置。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E1区预置了SwaⅠ酶切位点。
进一步地，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3的E4区预置了I-sceI酶切位点。
研究发现腺病毒复制相关的基因为E1、E2、E3、E4，缺失这些基因，并不影响腺病毒结构蛋白的表达，但会使得腺病毒无法进行复制和包装；因此构建这些复制相关的细胞系，能使敲除复制基因的复制缺陷型的腺病毒载体能够在其特有的细胞系中进行复制包装。同时，研究发现，只要表达腺病毒的E4基因中ORF6或是ORF3均能够代替整个E4基因，使敲除了E4的腺病毒能够复制包装。通过进一步对E4、E2a基因进行序列的研究分析，E4基因能够在E2a处表达。因此，本发明对E4基因进行序列分析，找出了E4的promoter、ORF6/7、polyA这几个基本元素，将其整合成一个完整的表达框，将其构建在敲除了E2a基因的序列位置，使ORF6、ORF7基因正常表达，最终获得了敲除E1、E3、E4、E2a，并将E4表达框置于E2a位置的复制缺陷型腺病毒5型载体pAd5LCL3，能在含有DBP序列的293TD37细胞中进行复制包装。
研究发现，E4基因中含有ORF1,2,3,4,5,6,7共7个表达框，其中ORF6/7是不能缺失的，一旦缺失了，将会明显影响腺病毒的包装和抗原基因的表达，因此需要将ORF6/7补回，同时为了获得更大的载体空间，需要将ORF6/7在E2a处表达，从而制得容量更大、表达效果更好的腺病毒载体。
进一步地，所述可同时表达四种抗原基因的重组腺病毒载体pAd5LCL3必须通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞才能实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
普通的293细胞中含有腺病毒5型的E1基因，敲除E1、E3的腺病毒能在该细胞系中复制，但敲除了E4、E2a基因的腺病毒则不能在293细胞中复制。
293TD37细胞株由本发明小组发明，并已申请发明专利CN201911033247.2，于2019年5月8日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD-37，该细胞株包含腺病毒的E2a-DBP基因和E4-ORF6/7基因，能够用于包装E2a-DBP基因和E4基因缺乏的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒，该二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础，并且由于E2a-DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量，对增强腺病毒载体的应用水平具有重要意义。
所述可同时表达四种抗原基因的重组腺病毒载体pAd5LCL3的构建方法，包含以下步骤：
1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5。
2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
在已经敲除了E1、E3基因的基础上，敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，同时可以在E4区域插入外源基因，外源基因可以在E4位置大量表达，而不影响腺病载体的包装。在E1、E4基因处表达外源基因，能避免多个外源基因在同一区域表达的相互干扰，更利于表达，同时减少了不必要的E4相关基因，降低了腺病毒的免疫原性，使腺病毒能较为长期得存在于宿主细胞中，使外源基因更长期表达。
E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于是腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，因此在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
为了使E4基因能敲除完全，便于大载体质粒的连接，使用CRISPR/cas9方法将E4区域的上游Fiber基因、以及E4的基因，进行敲除，使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入I-sceI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，重新获得E4敲除引进了I-sceI单酶切位点的载体质粒。使用I-sceI将载体质粒线性化，构建E4区域的穿梭质粒，使外源基因重组到E4区域，并在E4区域大量表达。
3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5ΔE4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3。
E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。同时还敲除了E2a区的DBP序列。腺病毒E2a基因是一个DNA binding protein，与腺病毒的复制相关，敲除这个基因并不影响腺病毒的结构蛋白以及腺病毒的包装。DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。E2a和E4部分序列的敲除，增加了约3kb的载体容量。
现有的腺病毒载体构建普遍采用穿梭质粒，需要寻找单一的酶切位点。本发明创造性地采用CRISPR/cas9来构建重组腺病毒载体，通过比对，选择合适的E1、E3、E4、E2a敲除位点，根据E1、E3、E4、E2a序列的位置，敲除的基因碱基的数量，选择CRISPR位点，并设计了最佳的gRNA，从而完成重组腺病毒载体的构建。
再一方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54。
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54必须通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞才能实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
其中，P72、B602L、P30、P54和pAd5LCL3分别具有如序列表中Seq ID NO.1、Seq IDNO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5所示的核苷酸序列。
研究证明，表E3区对于外源蛋白的表达水平不高，而在E1和E4区进行抗原基因的表达，表达水平更高，因此可以将四个抗原分别表达在E1区和E4区。
E3基因由于跟复制相关，需要敲除，让其复制缺陷；E3的作用是与腺病毒的免疫逃逸相关；敲除E3区可以增加腺病毒载体的容量；并使腺病毒载体能够正常包装。
另一方面，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，包含以下步骤：
1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5。
2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5ΔE4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3。
4)构建腺病毒E1区域穿梭质粒，pS5E1通过DNA连接酶分别与P72、IRES、B602L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L。
穿梭质粒pS5E1先与核糖体进入位点IRES片段连接得到pS5E1-IRES载体，再经酶切，与P72片段连接，得到pS5E1-P72-IRES，pS5E1-P72-IRES与B602L片段进行酶切并连接，获得E1区域穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L，并进行菌落PCR验证。
5)构建腺病毒E4区域穿梭质粒，P30、2A、P54基因通过融合PCR技术得到P30-2A-P54基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与P30-2A-P54连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54。
通过对E4的穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP替换为pS5E4-P30-2A-P54。P30-2A-P54为P30、P54通过2A序列连接。2A序列的加入是为了蛋白的裂解，EF1α启动子串联表达，2A序列又进一步裂解获得的P30、P54抗原。
6)将穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L。
7)将穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54，pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54具有如序列表中Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤1)所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
进一步地，步骤3)所述的ORF6/7表达框基因具有如序列表中Seq ID NO.7所示的核苷酸序列；步骤4)所述的IRES具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列；步骤5)所述的2A具有如序列表中Seq ID NO.9所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤4)所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40 early polyA；步骤5)所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp等基本元素具有如序列表可见中Seq ID NO.10所示的核苷酸序列，EF1α-EGFP-HBVpolyA基因具有如序列表可见中Seq ID NO.11所示的核苷酸序列。
穿梭质粒pS5E1的骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成，合成采用pucorigin、amp等基本元素(2796bp)，Ad5左臂ITR部分序列(400bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(944bp)SV40 early polyA(160bp)。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1。
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP。
进一步地，步骤6)穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
进一步地，步骤7)穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep GelExtraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
另一方面，本发明提供一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液，实现重组腺病毒包装。其中的293TD37细胞株于2019年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD37，该细胞株包含腺病毒的E2a和E4-ORF6/7基因，是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，能用于包装缺失E2a和E4基因的二代重组腺病毒而形成具有感染性的二代腺病毒颗粒。
进一步地，所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，由以下步骤制得：
1)将pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2)转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3)TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4)重复3)，收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5)持续接毒直至细胞出现病变。
另一方面，本发明还提供了293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54；其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达P72和B602L、P30和P54基因，从而获得全新的腺病毒载体。本发明的有益效果主要体现在：
①提供了全新的腺病毒5型载体CRISPR/cas9的构建方法，自主设计最佳敲除位点和gRNA，避免了过去载体构建用穿梭质粒敲除，需要找单一的酶切位点。
②由于E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，本发明在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
②本发明将E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。
③本发明还进一步敲除了DBP(E2a)序列，DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。④E2a和E4部分序列的敲除，相对于一代载体，增加了约3kb的载体容量。
⑤腺病毒载体的E2a、E4敲除，并将E4promoter-ORF6/7-polyA放于E2a区域，由此可以用E2a(DBP序列)互补的细胞系进行拯救，同时，外源基因可以在E1、E4区域同时表达而不相互干扰，目前该腺病毒疫苗在我们公司构建的互补细胞系—293TD37细胞系中的拯救，该细胞系能够持久的表达DBP蛋白。
⑥本发明构建了E1、E4区域的穿梭质粒，用于E1、E4区域外源基因表达。
⑦本发明经293TD37细胞系包装制备得到的重组腺病毒病毒的滴度较高。
基于以上原则，本发明可以极大地提高腺病毒载体的疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应，可以使家猪获得更好的免疫保护。
附图说明
图1为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图2为实施例2的Ad5-E4-down-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图3为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，其中泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”，M为Marker
图4为实施例2含有部分敲除的fiber、ITR片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为fiber部分片段扩增结果，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为Marker
图5为实施例2的Fiber-ITR融合片段电泳检测结果，其中泳道1为Fiber-ITR融合片段，M为Marker
图6为实施例2的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为Marker
图7为实施例2对图6的阳性克隆菌落质粒进行BamHI、XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中1-5为BamHI酶切，6-10为XhoI酶切，1、10为pAd5对照(为确实E4基因)，M为Marker
图8为实施例3的100k-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图9为实施例3的protease-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图10为实施例3的100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，M为Marker
图11为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为Marker
图12为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合PCR电泳检测结果，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，M为Marker
图13为实施例3的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为Marker
图14为实施例3对图13的菌落挑取9、18、21、24号阳性克隆菌落进行XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切，M为Marker
图15为实施例4的CMV-MCS和SV40 earlypolyA片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40 earlypolyA片段，M为2000 Marker
图16为实施例4的CMV-MCS-SV40 earlypolyA、PUC、Ad5右臂、Ad5左臂扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂，M为2000 Marker
图17为实施例4的pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-6为菌落，M为Marker
图18为实施例4的选取图17中的1-6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中左1-6为质粒pS5E1NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker
图19为实施例4的IRES片段PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp Marker
图20为实施例4的片段IRES与pS5E1载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段IRES EcoRV、NotI酶切，泳道2为pS5E1 EcoRV、NotI酶切，M为15000bp Marker
图21为实施例4的pS5E1载体与IRES片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-9号为菌落，M为Marker
图22为实施例4的pS5E1-IRES质粒NotI、EcoRV酶切电泳检测验证，选取图21的2、6进行质粒提取，酶切验证，其中1号泳道为2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，2号泳道为6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定
图23为实施例4的P72与pS5E1-IRES载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段pS5E1-IRES、NotI酶切，泳道2为P72、NotI酶切，M为15000bp Marker
图24为实施例4的P72与pS5E1-IRES连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-10号为菌落，M为Marker
图25为实施例4的pS5E1-P72-IRES质粒酶切电泳检测验证，选取图24中的2、5号菌落进行质粒提取，酶切验证，其中2号泳道为2号质粒酶切验证，5号泳道为5号质粒酶切验证，M为Marker
图26为实施例4的片段B602L与pS5E1-P72-IRES载体酶切产物电泳检测结果，其中泳道1为pS5E1-P72-IRES，NotI、XhoI酶切，泳道2为B602L片段，NotI、XhoI酶切，M为15000bpMarker
图27为实施例4的B602L与pS5E1-P72-IRES连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-7号为菌落，M为Marker
图28为实施例4的pS5E1-P72-IRES-B602L质粒酶切电泳检测验证，其中1、2、4、6号泳道为选取图27中的1、2、4、6号菌落质粒NotI、XhoI酶切鉴定，M为15000bp Marker
图29为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1a-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架扩增电泳检测结果，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000 Marker
图30为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-20为菌落，M为Marker
图31为实施例5的选取图30中的3、4、5、6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3为15000bp Marker，M2为2000bp Marker
图32为实施例5的片段P30、P54、2A的PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为P30扩增片段，泳道2为P54扩增片段，泳道3为2A扩增片段，M1、M2为2000bp Marker。
图33为实施例5的片段P30-2A-P54融合PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为P30-2A-P54片段，M为Marker
图34为实施例5的片段P30-2A-P54与pS5E4-EGFP载体酶切电泳检测结果，其中泳道1、2为pS5E4-EGFP，BamHI、XhoI双酶切胶回收，泳道3、4：片段P30-2A-P54 BamHI、XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker
图35为实施例5的pS5E4与P30-2A-P54片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-20号为菌落，M为2000bp Marker
图36为实施例5挑取图35的2、19号阳性克隆提取质粒进行BamHI、XhoI双酶切验证的电泳检测结果，其中泳道2为2号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，泳道19为19号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bp Marker
图37为实施例6的pAd5LCL3与pS5E1-P72-IRES-B602L琼脂糖凝胶验证电泳检测结果，其中泳道1为pAd5LCL3，泳道2为pS5E1-P72-IRES-B602L
图38为实施例6的穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组获得pAd5LCL3-P72-IRES-B602L质粒的电泳检测结果，其中泳道1-7为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L克隆，M为15000bp Marker
图39为实施例6挑取图38的1号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中1号泳道为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L质粒PacI酶切，M为15000bp Marker
图40为实施例6对穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L琼脂糖凝胶验证电泳检测结果，其中泳道1为pS5E4-P30-2A-P54，泳道2为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L，M为15000bp Marker
图41为实施例6的穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组获得重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒的电泳检测结果，其中泳道1-8为菌落，M为15000bp Marker
图42为实施例6的挑取图41的4号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中1号泳道为pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒PacI酶切，M为15000bp Marker
图43为实施例7的293TD37转染pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒TP0后72小时的细胞照片
图44为实施例7的293TD37感染TP0后TP1的细胞照片
图45为实施例7的293TD37感染TP1后TP2细胞照片
图46为实施例7的293TD37感染TP2后TP3细胞照片
图47为实施例7的TP4引起的293TD37细胞病变照片
图48为实施例11用Western Blot检测非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54中P30蛋白结果示意图
图49为实施例12对比非洲猪瘟多抗原重组腺病毒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54、非相关抗原pAd5-FMDO腺病毒组和生理盐水组疫苗诱导的细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验结果图
图50为pAd5LCL3的载体图谱
图51为pS5E1的载体图谱
图52为pS5E1-P72-IRES-B602L的载体图谱
图53为pS5E4-EGFP的载体图谱
图54为pS5E4-P30-2A-P54的载体图谱
图55为pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的载体图谱
图56为实施例11用Western Blot检测非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54中P54、P72表达结果示意图，其中M，预染Marker；泳道1，P54抗体血清；泳道2，P72抗体血清；泳道3：293TD37细胞对照
图57为实施例12用间接ELISA法检测血清中针对非洲猪瘟目的蛋白P72和P30的IgG抗体滴度结果示意图(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)，其中左图为蛋白P72的IgG抗体滴度，右图为P30的IgG抗体滴度
图58为实施例12非洲猪瘟重组腺病毒疫苗Ad5LCL3-P72-B602L-P30-P54诱导的CD8+T细胞反应示意图
图59为实施例12非洲猪瘟重组腺病毒疫苗Ad5LCL3-P72-B602L-P30-P54诱导的CD4+T细胞反应示意图
图60为实施例12非洲猪瘟重组腺病毒疫苗Ad5LCL3-P72-B602L-P30-P54诱导的细胞免疫反应代表图
图61为实施例12空白对照免疫反应代表图
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5的构建
在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型(/>VR-1516，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：
hAd5-E1上游gRNA:
GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E1下游gRNA:
GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5 E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5△E1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5△E1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：
hAd5-E3上游gRNA:
GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E3下游gRNA:
GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5 E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，获得缺失E1和E3基因，并引入SwaI酶切位点的腺病毒载体质粒pAd5。
实施例2缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4的构建
采用实施例1获得的已经敲除了E1、E3基因的载体质粒pAd5，进一步敲除敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，并使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入NdeI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，获得缺失E1、E3和E4基因，并引入SwaI和I-sceI酶切位点的载体质粒pAd5ΔE4。
1、目的基因E4 CRISPR靶序列的选择
1)E4基因上游fiber基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入fiber基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E4基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择GCTACTAAACAATTCCTTCC作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-up-gRNA，裂解位点和PAM位点如图1所示。
2)E4下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择AGGTTCGCGTGCGGTTTTCT作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-down-gRNA，裂解位点和PAM位点如图2所示。
2、Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA扩增
1)Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
引物设计：
Ad5-E4-up-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCT
Ad5-E4-up-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACGGAAGGAATTGTTTAGTA
Ad5-E4-down-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTT
Ad5-E4-down-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACAGAAAACCGCACGCGAAC
4、扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板
1)准备0.3μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward引物3ul，10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Reverse引物3ul，补充水至100ul。
2)准备0.3μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward引物3ul，10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Reverse引物3ul，补充水至100ul。
3)PCR反应体系
Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5ul，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1ul，0.3μM Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1ul，补水至25ul。
Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-FidelityPCR Master Mix(2X)12.5ul，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1ul，0.3μM Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1ul，补水至25ul。
4)PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
5、体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA的反应体系为：NTP mix 8ul，E1A-gRNA DNA模板6ul，5X TranscriptAidTM Reaction Buffer 4ul，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2ul。于37℃孵育4小时后加入1ul的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-down-gRNA的反应体系为：NTP mix 8ul，E1B-gRNA DNA模板6ul，5X TranscriptAidTM Reaction Buffer 4ul，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2ul。于37℃孵育4小时后加入1ul的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA
6、体外转录产物的纯化
1)将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200ul；
2)加入100ul的Binding buffer，充分混匀；
3)加入300ul的乙醇(>96％)，充分混匀；
4)将混合液转移到the Gene JETTM RNA Purification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；
5)加入700ul的Wash Buffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；
6)加入700ul的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次；
7)14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中；
8)在柱子中心加入10ul的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTM Enzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的RNA序列如下所示：
Ad5-E4-up-gRNA:GUACUAAACAAUUCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
Ad5-E4-down-gRNA:GGUUCGCGUGCGGUUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
7、CRISPR/Cas9“酶切”
使用Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA和cas9双酶切实施例1获得载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg，Ad5-E4-up-gRNA 6μg，Ad5-E4-down-gRNA 6μg，pAd5-REBP载体质粒3μg，NEB buffer 3.1 5ul，补充水至50ul。
酶切反应于37℃孵育过夜。取3ul样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果电泳图如图3所示。泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”pAd5载体质粒结果，出现了目的大小在2500bp-5000bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
8、获得含有部分敲除的fiber、ITR片段并引入I-SceI酶切位点，敲除使用含有敲除部分fiber的引物，扩增fiber片段并引入I-SceI酶切位点
1)片段fiber的扩增
扩增引物：
Fiber-RH-F：GAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGG
Fiber-ISceI-ITR-R：TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTG
扩增序列为：
TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGAAACATAACACAAACGATTCTTTATTCTTGGGCAATGTATGAAAAAGTGTAAGAGGATGTGGCAAATATTTCATTAATGTAGTTGTGGCCAGACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTAATGGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTGTCTCCGTTTAAGTAAACTTGACTGACAATGTTACTTTTGGCAGTTTTACCGTGAGATTTTGGATAAGCTGATAGGTTAGGCATAAATCCAACAGCGTTTGTATAGGCTGTGCCTTCAGTAAGATCTCCATTTCTAAAGTTCCAATATTCTGGGTCCAGGAAGGAATTGTTTAGTAGCACTC
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1ul；10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1ul；模板pAd5(100ng/ul)0.5ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果电泳图如图4所示，泳道1为fiber部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
2)ITR片段的扩增
扩增引物：
ISceI-ITR-F：TAGGGATAACAGGGTAATAACACCACTCGACACGGCAC
ITR-RH-R：GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTT
扩增序列为：
GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTTTAACCGTTACGTCATTTTTTAGTCCTATATATACTCGCTCTGCACTTGGCCCTTTTTTACACTGTGACTGATTGAGCTGGTGCCGTGTCGAGTGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTA
扩增体系为：10μM ISceI-ITR-F引物1ul；10μM ITR-RH-R引物1ul；模板pAd5(100ng/ul)0.5ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图4所示，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
3)融合PCR获得Fiber-ITR的融合片段
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1ul，10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1ul，模板pAd5(100ng/ul)0.5ul，Q5高保真酶25ul，补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图5所示，泳道1为Fiber-ITR的融合片段，M为2000Marker，可见融合结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
9、载体连接
使用NEB的Gibson使Fiber-ITR片段与敲除E4后的载体质粒连接，连接体系如下所示：胶回收产物载体质粒片段100ng，胶回收产物fiber-ITR片段50ng，Gibson预混液10ul，补水至20ul。于50℃，孵育40分钟。
10、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10ul连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
11、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
E4-cexu-F：AGTGACGATTTGAGGAAGTTG
E4-cexu-R：TCAATTGCAGAAAATTTCAAGTC
反应体系为：10μM E4-cexu-F引物1ul，10μM E4-cexu-R引物1ul，Q5高保真酶10ul，补水至20ul，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图6所示，除了2、8、11、17号，大部分菌落出现了阳性条带。
12、质粒酶切验证
挑取4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行BamHI、XhoI酶切验证，酶切结果如图7所示，从图7可以看出，2-5号质粒BamHI、XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
实施例3缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3的构建
1、目的基因E2a CRISPR靶序列的选择
1)E2a基因上游100k基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入100k基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E2a基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择ATAGGTGGCGTTCGTAGGCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为100k-gRNA，裂解位点和PAM位点如图8所示。
2)E2a下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择TACCCCGGTAATAAGGTTCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为protease-gRNA，裂解位点和PAM位点图9所示。
2、100k-gRNA和protease-gRNA的DNA扩增
1)100k-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGAGGTGGCGTTCGTAGGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)protease-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGCCCCGGTAATAAGGTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增100k-gRNA的DNA模板和protease-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
1)引物设计
100k-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG AGGTGGCGTTCGTAG
100k-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGCCTACGAACGCCACCT
protease-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG CCCCGGTAATAAGGT
protease-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGAACCTTATTACCGGGG
2)扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板
①准备0.3μM的100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的100k-gRNA-Forward引物3ul，10μM的100k-gRNA-Reverse引物3ul，补充水至100ul。
②准备0.3μM的Aprotease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的protease-gRNA-Forward引物3ul，10μM的protease-gRNA-Reverse引物3ul，补充水至100ul。
③PCR反应体系
100k-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5ul，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1ul，0.3μM 100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1ul，补水至25ul。
protease-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5ul，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1ul，0.3μM protease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1ul，补水至25ul。
④PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
3、体外转录获得100k-gRNA和protease-gRNA
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得100k-gRNA和protease-gRNA。
1)体外转录获得100k-gRNA、protease-gRNA
体外转录获得100k-gRNA的反应体系为：NTP mix 8ul，100k-gRNA DNA模板6ul，5XTranscriptAidTM Reaction Buffer 4ul，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2ul。于37℃孵育4小时后加入1ul的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得protease-gRNA的反应体系为：NTP mix 8ul，protease-gRNA DNA模板6ul，5X TranscriptAidTM Reaction Buffer 4ul，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2ul。于37℃孵育4小时后加入1ul的DNase I，于37℃孵育15分钟。
2)体外转录产物的纯化
将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200ul，加入100ul的Binding buffer，充分混匀，加入300ul的乙醇(>96％)，充分混匀，将混合液转移到the Gene JETTM RNAPurification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700ul的WashBuffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700ul的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次。14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中，在柱子中心加入10ul的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTM Enzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的100k-gRNA和protease-gRNA的RNA序列如下所示：
100k-gRNA:GAGGUGGCGUUCGUAGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
protease-gRNA:GCCCCGGUAAUAAGGUUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
4、CRISPR/Cas9“酶切”
使用100k-gRNA、protease-gRNA和cas9双酶切实施例2获得的缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg；100k-gRNA 6μg；protease-gRNA 6μg；实施例2获得的载体质粒3μg；NEB buffer 3.1 5ul；补充水至50ul。
上述酶切反应分别于37℃孵育过夜。取3ul样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果如图10所示。泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，出现了目的大小在1000-2500bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
5、获得含有部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段
1)部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的扩增
①部分敲除的100k扩增引物：
100k-F：TGAGAATAGGTGGCGTTCGTAGGCAAGGCTGACATCCGCTATGG
100k-ORF6/7-R：TACAATTCCCAACACATACAAGTTTCCTTCTCCTATAGGCAGAA
扩增体系为：10μM 100k-F引物1ul；10μM 100k-ORF6/7-R引物1ul；模板pAd5ΔE4(100ng/ul)0.5ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
②E4 ORF6/7表达框扩增引物：
ORF6/7-F：ACTTGTATGTGTTGGGAATTGTA
ORF6/7-R：ATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
扩增体系为：ORF6/7-F引物1ul；10μM ORF6/7-R引物1ul；模板ORF6/7表达框基因(100ng/ul)0.5ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
③部分敲除的Protease片段的扩增
ORF6/7-Protease-F：CCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
Protease-R：ATGGATCACAACCCCACCATGAACCTTATTACCGGGGTACCCA
扩增体系为：10μM ORF6/7-Protease-F引物1ul；10μM Protease-R引物1ul；模板pAd5ΔE4(100ng/ul)0.5ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
④100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增结果如图11所示，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为15000bpMarker
可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段分别进行胶回收纯化。
6、融合PCR获得100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合片段
扩增体系为：10μM 100k-F引物1ul；10μM Protease-R引物1ul；模板100k胶回收产物(50ng/ul)1ul模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/ul)1ul模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/ul)1ul；Q5高保真酶25ul；补水至50ul。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，50sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图12所示，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，可见扩增结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
7、载体连接
使用NEB的Gibson使100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR胶回收产物与步骤4中敲除E2a后的载体连接，连接体系如下所示：胶回收产物敲除E2a后的载体片段100ng，胶回收产物100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR片段50ng，Gibson预混液10ul，补水至20ul。于50℃，孵育40分钟。
8、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10ul连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
9、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
DBP-upsteam-F：GTTGGGCTCGCATGTGCCG
DBP-downsteam-R：ACTCCCATGGATCACAACCC
反应体系为：10μM DBP-upsteam-F引物1ul，10μM DBP-downsteam-R引物1ul，Q5高保真酶10ul，补水至20ul，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图13所示，在9、18、21、24出现阳性条带。
10、质粒酶切验证
挑取9、18、21、24这4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行XhoI酶切验证，酶切结果如图14所示，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切。从图14可以看出，质粒XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3、E4和E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置的pAd5LCL3质粒，其载体图谱如图50所示。
实施例4非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L的构建
1、人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E1的骨架采用puc origin、amp等基本元素(2796bp)(pS5E1骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成)，Ad5左臂ITR部分序列(355bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(Seq ID NO.12)(944bp)SV40 early polyA(Seq ID NO.13)(160bp)。
1)引物设计
puc-Ad5-right arm-F：TAATGCAGCTGGCTTATCGAAACGTGGAATGCGAGACCGTCT
Ad5-right arm-CMV-R：ACACACAAGCAGGGAGCAGATACAAGGGTGGGAAAGAATATATAAG
CMV-F：GTATCTGCTCCCTGCTTGTG
CMV-SV40-R：TAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGTGATCAGCGGGTTTAAACGGG
SV40-F：CTTCGCCCACCCCAACTTGT
SV40-R：AGAGGTCGACGGTATACAGAC
SV40-Ad5-left arm-F：TGTCTGTATACCGTCGACCTCTCCGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCC
Ad5-left arm-puc-R：ACACTATAGAATACACGGAATTCTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
puc-F：GAATTCCGTGTATTCTATAGTGT
puc-R：TTTCGATAAGCCAGCTGCATTA
2)目的片段的扩增
①以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以CMV-F和CMV-SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV启动子MCS片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uM CMV-SV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃，5min。
②以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以SV40-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的SV40-earlypolyA片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM SV40-F引物1ul，10uM SV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图15所示，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40earlypolyA片段，M为2000 Marker。由图15可见，扩增结果正确。
③使用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
④以博迈德公司合成的pS5E1骨架质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E1穿梭质粒骨架，扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。
⑤以pAd5LCL3质粒为模板，以SV40-Ad5-left arm-F和Ad5-left arm-puc-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM SV40-Ad5-left arm-F引物1ul，10uM Ad5-left arm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。
⑥以pAd5LCL3质粒为模板，以puc-Ad5-right arm-F和Ad5-right arm-CMV-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的右臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5-right arm-F引物1ul，10uM Ad5-right arm-CMV-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、15s，35个循环；72℃，5min。
⑦以胶回收产物CMV-MCS为模板，以CMV-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV-MCS-SV40 earlypolyA片段，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uMSV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图16所示，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂。
3)片段的连接转化
使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化，然后使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix10ul、pS5E1骨架片段50ng、Ad5左臂50ng、Ad5右臂50ng、CMV-MCS-SV40 polyA 50ng、补水至20ul，50℃保温40分钟，获得连接产物质粒pS5E1。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
4)质粒的验证
①菌落PCR验证
挑选菌落进行琼脂糖凝胶验证，结果如图17所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图18所示，其中左1-6为质粒pS5E1 NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker，酶切结果正确，成功构建人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1，其载体图谱如图51所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L构建
1)pS5E1与IRES片段的连接
①引物合成
IRES-EcoRV-F：ccg GATATC TGTCGTCATCATCCTTATAGTCC
IRES-NotI-R：aaatat GCGGCCGC GGTTGTGGCCATTATCATCGTG
②扩增IRES片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，模板IRES模板2ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。扩增结果电泳检测如图19所示，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp ladder，可见扩增结果正确。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化IRES片段。
④目的片段IRES与pS5E1载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1、IRES片段～2ug，EcoRV和NotI各1ul；10×cutsmartbuffer 5ul；补水至50ul；反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活；胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图20所示，其中泳道1为片段IRES EcoRV，NotI酶切，泳道2为pS5E1 EcoRV，NotI酶切，M为15000bp ladder。
⑤pS5E1载体与IRES片段连接
连接体系：pS5E1(100ng)；IRES片段(载体：片段＝1：5,摩尔比)；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图21所示，其中1-9号为菌落，M为Marker，由图21可见，2和6号出现阳性条带。
⑦质粒NotI、EcoRV酶切验证，选取2、6进行质粒提取，酶切验证，结果如图22所示，其中2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，可见酶切结果正确。
2)pS5E1-IRES与P72片段的连接
①引物合成
P72-his-EcoRV-R：
cgGATATCTCAGTGGTGGTGGTGATGGTGGGTGCTGTATCTCAGCACGG
P72-BamHI-F：cgcGGATCCgccaccATGGCCAGCGGCGGAGCTTT
②PCR扩增P72片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物P72-BamHI-F 1ul，10uM引物P72-his-EcoRV-R1ul，模板P72 1ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化P72片段。
④目的片段P72与pS5E1-IRES载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-IRES、P72片段～2ug，EcoRV和BamHI各1ul；10×cutsmart buffer 5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图23所示，其中泳道1为片段pS5E1-IRES、NotI酶切，泳道2为P72、NotI酶切，M为15000bp Marker。
⑤目的片段P72与pS5E1-IRES连接
连接体系：pS5E1-IRES(100ng)；P72片段(载体：片段＝1：5,摩尔比)；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物P72-BamHI-F 1ul，10uM引物P72-his-EcoRV-R1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图24所示，其中1-10号为菌落，M为Marker，由图24可见，2和5号出现阳性条带。
⑦质粒酶切验证(BamHI&EcoRV)，选取2、5进行质粒提取，酶切验证。结果如图25所示，其中5号质粒为阳性质粒。
3)pS5E1-P72-IRES与片段B602L的连接
①引物合成
B602L-NotI-F：aaatat GCGGCCGC ATGGCCGAATTCAATATTGATGAA
B602L-XhoI-R：cggCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGATGGTG GGCGTAATCGGGCACGTCGT
②PCR扩增B602L片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物B602L-NotI-F 1ul，10uM引物B602L-XhoI-R 1ul，模板P72 1ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化B602L片段。
④目的片段B602L与pS5E1-P72-IRES载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-P72-IRES、B602L片段2ug，NotI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer 5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图26所示，其中泳道1为pS5E1-P72-IRES，NotI、XhoI酶切，泳道2为B602L片段，NotI、XhoI酶切，M为15000bp Marker。
⑤pS5E1-P72-IRES载体与B602L片段连接
连接体系：pS5E1-P72-IRES 100ng；B602L片段50ng；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物B602L-NotI-F 1ul，10uM引物B602L-XhoI-R 1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min；进行电泳验证，如图27所示，其中1-7号为菌落，M为Marker，由图27可见，出现阳性条带。
⑦质粒NotI、XhoI酶切验证，选取1、2、4、6进行质粒提取，酶切验证，结果如图28所示，其中1、2、4、6号泳道为1、2、4、6质粒NotI、XhoI酶切鉴定，M为15000bp Marker。由图28可见，酶切结果正确，成功构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L，其载体图谱如图52所示。
实施例5非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54的构建
1、人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。
1)基因合成
EF1α-EGFP-HBV polyA基因由博迈德公司合成。
2)引物设计
puc-Ad5E4-left arm-F：AGGTGACACTATAGAATACACGTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
Ad5E4-left arm-EF1a-R：caatccccccttttcttttaaaaAACACCACTCGACACGGCAC
EF1α-F：ttttaaaagaaaaggggggattg
EF1α-R：TAGAGCCCCAGCTGGTTCTTT
EF1α-Ad5E4-right arm-F：GGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGA
Ad5E4-right arm-puc-R：TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAAATGTAACCACTGTGAG
puc-F：TCTCCCTATAGTGAGTCGTATT
puc-R：CGTGTATTCTATAGTGTCACCT
ORF6/7-Protease-F：CGTTGAAACATAACACAAACGATACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGG
3)目的片段的扩增
①以EF1α-EGFP-HBV基因合成片段为模板，以EF1α-F和EF1α-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的EF1α-EGFP-HBV polyA片段；扩增体系：EF1α-EGFP-HBV基因合成片段50ng，10uM EF1α-F引物1ul，10uM EF1α-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
②以pAd5LCL3为模板，以puc-Ad5E4-left arm-F和Ad5E4-left arm-EF1α-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂片段。扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5E4-leftarm-F引物1ul，10uM Ad5E4-left arm-EF1a-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
③以pAd5LCL3为模板，以EF1α-Ad5E4-right arm-F和Ad5E4-right arm-puc-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的右臂片段；扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM EF1α-Ad5E4-right arm-F引物1ul，10uM Ad5E4-right arm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。
PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
④以pS5E1质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架；扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。扩增产物琼脂糖验证如图29所示，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000 Marker。由图29可见，扩增结果正确。
4)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
5)片段的连接转化
使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix 10ul、pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂片段50ng、EF1α-EGFP-HBV片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架片段50ng、补水至20ul，50℃保温40分钟；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
6)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物puc-Ad5E4-left arm-F/ER1α-R为引物菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图30所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取3、4、5、6号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图31所示，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3：15000bp Marker；M2：2000bp Marker；酶切结果正确，测序正确；成功构建人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，其载体图谱如图53所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54构建
1)引物设计
P30-BamHI-F：cgcGGATCCGCCACC ATGGACTTCATCCTGAACATCA
P30-2A-R：CTCCGCTTCC GGCGTAGTCGGGCACGTCGTA
P2A-F：ACGACGTGCCCGACTACGCC GGAAGCGGAGCTACTAACTTC
P2A-R：CTGGAAGAACTCGCTGTCCAT AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGT
2A-P54-F：CCCTGGACCT ATGGACAGCGAGTTCTTCCAG
P54-XhoI-R：ccg CTCGAG TTAGAGGGAGTTTTCCAGGTC
2)目的片段P30、P54、2A的扩增
①以P30基因合成片段为模板，以P30-BamHI-F和P30-2A-R为引物，扩增P30片段；扩增体系：P30基因合成片段50ng，10uM P30-BamHI-F引物1ul，10uM P30-2A-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
②以P54基因合成片段为模板，以2A-P54-F和P54-XhoI-R为引物，扩增P54片段；扩增体系：P54基因合成片段50ng，10uM 2A-P54-F引物1ul，10uM P54-XhoI-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
③以2A基因合成片段为模板，以P2A-F和P2A-R为引物，扩增2A片段；扩增体系：2A基因合成片段50ng，10uM P2A-F引物1ul，10uM P2A-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
扩增结果如图32所示，其中泳道1为P30扩增片段，泳道2为P54扩增片段，泳道3为2A扩增片段，M1、M2为2000bp Marker。
3)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
4)融合PCR扩增P30-2A-P54片段
扩增体系：P30胶回收片段50ng、P54胶回收片段50ng、P2A胶回收片段50ng，10uMP30-BamHI-F引物1ul，10uM P54-XhoI-R引物1ul，Q5高保真酶25ul；补水至50ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、50sec，35个循环；72℃，5min。融合结果如图33所示，其中泳道1为P30-2A-P54片段，M为Marker。
5)目的片段P30-2A-P54与pS5E4-EGFP载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E4-EGFP、P30-2A-P54片段2ug，BamHI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。Axygen试剂盒胶回收纯化。酶切结果如图34所示，其中泳道1、2为pS5E4-EGFP，BamHI、XhoI双酶切胶回收，3、4为片段P30-2A-P54，BamHI、XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker。
6)pS5E4载体与P30-2A-P54片段连接与转化
连接体系：pS5E4(100ng)，P30-2A-P54片段(50ng)，T4 DNA连接酶1ul，10×ligasebuffer 1ul，补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
7)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物P30-BamHI-F、P54-XhoI-R为引物，菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图35所示，其中1-20号为菌落，M为2000bp，由图35可见，2号、19号出现阳性条带。
②酶切验证
挑取2、19号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行BmHI、XhoI双酶切验证；酶切结果如图36所示，其中泳道2为2号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，泳道19为19号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bp Marker。酶切结果正确，测序正确，成功构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54，其载体图谱如图54所示。
实施例6穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L、pS5E4-P30-2A-P54与pAd5LCL3重组构建pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒
1、穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3的同源重组
1)PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L 3μg；PacI 2ul；buffer cutsmart 4ul；补水至40ul。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3 3ug；SwaI 2ul；Buffer 3.1 4ul；补水至40ul。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
取2ul琼脂糖凝胶验证，验证结果如图37所示，其中泳道1为pAd5LCL3，泳道2为pS5E1-P72-IRES-B602L。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5ul；去磷酸化酶1ul；去磷酸化buffer 5ul；补水至50ul。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证；结果如图38所示，其中泳道1-7为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L克隆，M15000 Marker，从图38可以看出，1号和7号克隆酶切正确。
6)将1号阳性质粒转化至DH5α感受态，挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证，酶切结果如图39所示，其中1号泳道为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-P72-IRES-B602L质粒PacI酶切，M为15000 Marker，由图39可知，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L。
2、穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组获得pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54
1)PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54 3μg；PacI 2ul；10×cutsmart buffer 4ul；补水至40ul。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L3ug；I-sceI 2ul；Buffer cutsmart4ul；补水至40ul。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
取2ul琼脂糖凝胶验证，验证结果如图40所示，其中泳道1为pAd5LCL3，泳道2为pS5E1-P72-IRES-B602L。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5ul；去磷酸化酶1ul；去磷酸化buffer 5ul；补水至50ul。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取8个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证，结果如图41所示，其中泳道1-8为菌落，M为15000 Marker，从图41可以看出，4号质粒正确。
6)将4号阳性质粒转化至DH5α感受态；挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证；酶切结果如图42所示，其中1号泳道为pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒PacI酶切，M为15000 Marker，由图42可知，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54，其载体图谱如图55所示。
实施例7重组腺病毒的包装
使用293TD37细胞包装pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54质粒，操作步骤如下所示：
准备293TD37细胞：转染前一天准备细胞，将待转染的293TD37细胞接种到6孔板中，0.5×106活细胞/孔，于37℃，5％CO2静置培养24小时，转染当天细胞有40-50％汇合率。
质粒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54线性化：将待转染的质粒用PacI酶切，于37℃孵育40min后，65℃灭活20min。
转染：用100ul无血清培养基将线性化的2μg质粒和PEI分别稀释；向PEI稀释液中加入质粒稀释液，反复吸取5次或涡旋10秒钟混匀，室温下孵育10分钟后形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出细胞培养液，加入新鲜的生长培养基2mL，10分钟后将转染复合物加到换了新鲜培养基的细胞中。
细胞培养：将转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72-96小时；病毒质粒转染72-96小时后收集6孔板细胞悬液于1.5ml离心管中即TP0。
持续接毒：将收集的细胞悬液在-80℃反复冻融3次，4℃、2000g离心10分钟，取上清500ul感染293TD37细胞(293TD37细胞需要提前一天准备)，37℃、5％CO2孵育60分钟，补充2mL的FBS的培养基，37℃、5％CO2培养培养72小时，收集细胞悬液即TP1；重复之前的步骤，收集细胞悬液即TP2。持续接毒直至TP4细胞出现病变。
细胞病变：当293TD37细胞培养从TP0至TP4后，细胞逐渐病变，直至TP4时293TD37细胞完全病变。TP0至TP4引起的细胞病变情况分别如图43-47所示，TP4已完全病变。
实施例8非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗滴度的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，接种6孔板中(5×105/mL，每孔2ml)，于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24小时后，待细胞贴壁生长成单层细胞，弃去培养基，用无血清DMEM维持液对重组的腺病毒作10-3～10-6倍连续稀释，每个稀释度接种2孔，每孔250uL，感染1小时后，弃上清，补充完全培养基，然后于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养。24h后，弃上清，用PBS洗细胞，每孔1mL，弃PBS后，每孔加1mL冷甲醛固定，室温10min，弃甲醛，再用PBS冲洗细胞，每孔1mL，加腺病毒抗体-FITC，每孔1ml，室温1h后，再次用PBS冲洗细胞，每孔1mL，两遍后每孔加1mL PBS，荧光显微镜下计数(200倍,10个连续视野)。计算：病毒滴度(FFU/mL)＝平均数×1013×4×10(-n)。pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒的FFU为2×108FFU/mL，滴度较高。
实施例9非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54稳定性的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，将293TD37细胞种入6孔板中(5×105cells/mL，2mL/孔)，室温孵育1小时使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。用pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒颗粒进行感染，感染的滴度为5MOI/孔。293TD37细胞48小时后发生病变后，收集细胞，反复冻融3次后2000g离心，收集上清，将收集的上清检测FFU，后重新感染新的293TD37细胞，直至30代。将收集的第5、10、15、20、25、30代次的病毒液进行检测，发现病毒的基因组仍然完整，说明复制缺陷型pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒能够在293TD37细胞中稳定包装。
实施例10非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54恢复突变(RCA)的检测
pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒RCA检测，检测方法如下：
1、准备pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒液，并测其病毒滴度，测定病毒颗粒浓度，病毒液加1％benzonase(Benzonase7.5～15units/mL病毒液)消化宿主细胞的DNA，37℃水浴40min。用300Kd的超滤离心管，经1000g，30min离心，1×PBS洗脱收集病毒颗粒，测A260，颗粒浓度＝A260×1.1×10^12VP/mL。
2、病毒感染，准备A549细胞的12孔板，每孔细胞为2.5×105/孔，弃培养基，PBS清洗一次，将腺病毒按照1×109VP/孔/0.5ml接种病毒，感染A549细胞，野生型腺病毒5型为阳性对照，37℃，5％CO2，1h后，弃去病毒液，补足5％完全培养基，37℃，5％CO2培养48h。
3、免疫染色，弃细胞上清，PBS表面冲洗细胞，用冰甲醛固定，放置-20℃，20min，1×PBS清洗三遍，每遍5min，每孔加入2ml 1％BSA-PBS溶液，放置摇床，孵育1h。弃去上清，加入腺病毒5型荧光抗体(1:500稀释)，孵育1h，1×PBS清洗三遍，每遍5min。
用10倍荧光显微镜观察，使用公式计算RCA
RCA＝(average positive cell field)×(374 field/well)×(dilutionfactor))/Total VPs in 0.5ml viral sample
判断标准为RCA的水平小于1RCA/3×1010vp。经过统计，pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的RCA的水平小于1RCA/3×1010vp，说明本发明所制备的复制缺陷型pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒在293TD37细胞中能够稳定包装，不会转化为野生型或转化为野生型的几率较低。
实施例11非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54蛋白表达检测
提前一天准备293TD37细胞，置于12孔细胞培养板中，使用非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54病毒感染293TD37细胞，48小时后细胞发生病变，收集全部的1ml细胞，使用PBS洗涤，制样，用于Western Blot检测；使用P30的抗体检测目的蛋白，P30的抗体是由原核表达的P30蛋白免疫的兔子血清。实验结果如图48所示，该疫苗可以清晰可见P30蛋白；同样使用P54、P72蛋白免疫的兔子血清，如图56所示：M，预染Makker；泳道1，P54抗体血清；泳道2，P72抗体血清；泳道3：293TD37细胞对照。由此可见非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的目的蛋白有明显得表达。
实施例12非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54实在小鼠模型上的免疫学评价
12.1疫苗体液免疫反应检测
20只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成4组，每组5只。根据表1所示分组情况对小鼠进行pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表1：疫苗免疫检测小鼠分组情况
小鼠于免疫后14天采血，分离血清，使用间接ELISA法检测血清中针对非洲猪瘟目的蛋白P72和P30的IgG抗体滴度。检测结果如图57所示(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)，其中左为P72的IgG抗体滴度，右图为P30的IgG抗体滴度。
由图57可见，小鼠肌肉注射pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54后，针对P72、P30蛋白，均能够产生较高浓度的IgG抗体。P72抗体中，高剂量组抗体滴度平均值达105以上，中剂量组滴度平均值也达70000，与对照组有显著差异；P30抗体中，高剂量组与中剂量组均能诱导高滴度的抗体。
12.2细胞免疫反应检测
10只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组5只。根据表2所示分组情况对小鼠进行pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表2：疫苗免疫检测小鼠分组情况
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和pS5E4-P30-2A-P54转染的PK15细胞刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD4、CD8，细胞内细胞因子包括IFNγ、IL2。使用流式细胞仪(CyExpert)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经目的蛋白刺激后表达IFNγ、IL2的水平。
pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图58、图59所示，代表性结果如图60、图61所示，其中图60为肌肉注射pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54后细胞免疫反应代表图，图61为空白对照免疫反应代表图。结果表示：小鼠免疫后14天，脾细胞经目的蛋白刺激后，CD8+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。CD4+T细胞经过刺激后，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。
12.3小鼠模型免疫原性评价小结
pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54重组腺病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高水平的血清IgG抗体。其中高剂量的1*10^8FFU和中剂量1*10^7FFU的免疫方式诱导的滴度都很高。由于P72和B602L抗原、P30和P54抗原分别由相同的表达元件调控表达同时，P72和P30血清IgG抗体可代表这四个抗原均能够较高的免疫原性。细胞免疫反应检测结果说明肌肉注射免疫1*10^7FFU的腺病毒载体疫苗，可诱导其免疫的小鼠产生特异性细胞免疫反应。
实施例13非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54在靶动物(三元猪)上的免疫学评价
13.1靶动物(三元猪)疫苗体液免疫反应检测
非洲猪瘟多抗原重组腺病毒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗动物免疫：使用1*10^9FFU的pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗，免疫三元猪。四周后，采集猪血样，分离血清，使用IDVET非洲猪瘟检测试剂盒，对免疫后的血清样本进行检测。具体免疫方式如表3所示：
表3：疫苗免疫三元猪分组情况
免疫实验组共有5组，空白对照组由2组，免疫实验结果如表4所示。
表4：实验检测结果
/>
其中，对于每个样品，计算其S/P百分比(S/P％)，S/P％＝(ODSAMPLE-ODNC)/(ODPC-ODNC)*100，每个样品算出S/P％，当S/P％≤30为阴性，30％＜S/P％＜40％为可疑，S/P％≥40％为阳性。
实验有效性判定：在下列情形下实验有效：
(1)阳性对照的平均净OD大于0.350；ODPC>0.350
(2)阳性对照与阴性对照平均净OD值比值大于3；ODPC/ODNC>3
实验结果说明：重组腺病毒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗，在三元猪免疫试验中，能够诱导足够的免疫反应。
13.2非洲猪瘟多抗原重组腺病毒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗诱导的细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验
非洲猪瘟多抗原重组腺病毒pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗动物免疫：使用1×108FFU的pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗，免疫三元猪，四周后，采集猪血样。猪外周血淋巴细胞分离：使用天津灏洋华科生物科技有限公司的猪外周血淋巴细胞分离试剂盒对采集的猪血样进行淋巴细胞分离，使用计数器对效应细胞计数。细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验：使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(购自碧云天)检测细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验。具体步骤：1、提前一晚准备PK15细胞(细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，并感染非洲猪瘟pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54疫苗和腺病毒载体对照疫苗(25MOI，提前18h)。
2、实验前将感染的PK15细胞用胰酶消化，用无血清培养基重悬稀释至1×105/ml作为靶细胞。在96孔底细胞培养板中加入靶细胞，每孔加100ul。3个效应细胞自然释放对照孔不加靶细胞，只加100ul培养液。
3、向各孔加100ul效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例为50：1。自然释放孔不加效应细胞只加100ul培养液。同时设置最大释放对照孔，加细胞释放试剂。
4、置37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4小时。
5、离心培养板250g 10分钟。每孔吸出140ul上清液，对应加入另一块96孔酶联检测板中，按乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒操作说明书配制并加入60μ0。检测OD490吸光值。
杀伤活性(％)＝[(OD实验组－OD总自然释放)/(OD最大释放组－OD总自然释放)]×100％
实验结果如图49所示，经过多次试验，统计分析显示，非洲猪瘟疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54组与非相关抗原(相当于空白)腺病毒pAd5LCL3组相比CTL杀伤水平更高，且差异显著P<0.05。生理盐水组基本没有展现出杀伤水平，少量数据可能来自于误差或自然杀伤。对细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤水平越高，则证明对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应越强，因此本实施例的非洲猪瘟疫苗pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54可显著增强对非洲猪瘟病毒较强的特异性免疫反应。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
<150> 2020106427453
<151> 2020-07-06
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1938
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccagcg gcggagcttt ttgcctgatc gccaatgatg gcaaggccga caagatcatc 60
ctggcccagg acctgctgaa ttccaggatc agcaatatca agaacgtgaa caagagctac 120
ggcaagcctg accccgagcc tacactgagc cagatcgagg agacacacct ggtgcacttt 180
aacgcccact tcaagcccta cgtgcccgtg ggcttcgagt acaataaggt gagaccccac 240
accggcacac ctaccctggg caataagctg acatttggca tccctcagta cggcgacttc 300
tttcacgaca tggtgggcca ccacatcctg ggcgcctgcc acagctcctg gcaggatgcc 360
cctatccagg gcacaagcca gatgggcgcc cacggccagc tgcagacctt cccaagaaac 420
ggctacgact gggacaatca gacccctctg gagggcgccg tgtacaccct ggtggaccct 480
ttcggcagac ctatcgtgcc tggcacaaag aacgcctaca gaaatctggt gtactactgc 540
gagtaccccg gcgagaggct gtacgagaat gtgaggtttg acgtgaacgg caactccctg 600
gatgagtact ccagcgatgt gaccacactg gtgaggaagt tttgtatccc tggcgataag 660
atgacaggct acaagcacct ggtgggccag gaggtgtccg tggagggcac ctccggccct 720
ctgctgtgta atatccacga tctgcacaag cctcaccaga gcaagcccat cctgaccgat 780
gagaatgaca cacagaggac ctgcagccac accaatccta agttcctgtc ccagcacttc 840
cctgagaaca gccacaatat ccagacagcc ggcaagcagg acatcacacc catcacagac 900
gccacatacc tggacatcag gagaaatgtg cactactcct gcaatggccc ccagacacct 960
aagtactacc agccccccct ggccctgtgg atcaagctga ggttctggtt caatgagaac 1020
gtgaatctgg ccatcccctc cgtgtccatc cctttcggcg agagattcat caccatcaag 1080
ctggcctccc agaaggacct ggtgaatgag tttcctggcc tgttcgtgag gcagagcagg 1140
ttcatcgccg gcagaccttc cagaaggaac atcagattca agccttggtt tatccctggc 1200
gtgatcaacg agatctccct gaccaacaac gagctgtaca tcaataacct gtttgtgacc 1260
cctgagatcc acaatctgtt cgtgaagagg gtgagattct ccctgatcag agtgcacaag 1320
acccaggtga cacacaccaa taacaatcac cacgacgaga agctgatgtc cgccctgaag 1380
tggcctatcg agtacatgtt catcggcctg aagcctacct ggaacatctc cgaccagaac 1440
ccccaccagc acagagactg gcacaagttc ggccacgtgg tgaatgccat catgcagcct 1500
acccaccacg ccgagatcag cttccaggat agggatacag ccctgcctga tgcctgctcc 1560
tccatcagcg atattagccc tgtgacctac cccatcaccc tgcctatcat caagaacatc 1620
agcgtgacag cccacggcat caacctgatc gacaagtttc ccagcaagtt ttgctcctcc 1680
tacatccctt ttcactacgg cggcaatgcc atcaagacac ccgacgaccc cggcgccatg 1740
atgatcacat tcgccctgaa gcctagagag gagtaccagc cctccggcca catcaacgtg 1800
agcagggcca gggagttcta catcagctgg gatacagact acgtgggcag catcaccacc 1860
gccgatctgg tggtgagcgc ctccgccatc aatttcctgc tgctgcagaa cggcagcgcc 1920
gtgctgagat acagcacc 1938
<210> 2
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccgaat tcaatattga tgaactgctg aaaaacgtgc tggaagatcc ctctaccgag 60
atctctgaag agaccctgaa acagctgtat cagcgcacca acccctataa acagttcaag 120
aatgactccc gggtggcctt ttgctccttc accaatctga gggagcagta catccgccgc 180
ctgatcatga cctccttcat cggctacgtc ttcaaggccc tccaggaatg gatgcccagc 240
tatagcaagc ctacccacac caccaagacc ctgctcagcg aactcatcac cctcgtggac 300
accctgaagc aggagaccaa cgacgtgccc agcgaatccg tcgtgaacac catcctgagc 360
atcgccgaca gctgcaaaac ccagacccag aaaagcaagg aagccaaaac caccatcgac 420
agcttcctga gagaacactt cgtgttcgac cccaacctgc atgcccagag cgcctacacc 480
tgcgccgaca ccaacgtcga cacctgcgcc agcatgtgcg ccgacacaaa cgtggacacc 540
tgcgctagca tgtgcgctga taccaacgtc gatacctgcg cctccacctg cacctccacc 600
gagtacaccg acctggccga ccccgagcgc atccctctgc acatcatgca gaaaaccctg 660
aacgtgccca acgaactgca ggccgatatt gacgccatca cccagacccc ccagggctac 720
cgcgccgctg ctcatatcct gcagaacatc gaactccacc agagcatcaa gcacatgctg 780
gagaaccccc gcgccttcaa gcccatcctg tttaacacca agatcacacg ctatctgtcc 840
cagcacatcc ccccccagga caccttctac aaatggaact actacatcga agacaactac 900
gaagaactgc gcgccgccac agagagcatc taccccgaaa agcccgacct ggagttcgcc 960
ttcatcatct acgacgtggt ggacagcagc aaccagcaga aggtcgacga gttctactat 1020
aagtacaagg accagatctt tagcgaggtg agcagcatcc agctgggcaa ctggaccctg 1080
ctgggcagct ttaaggccaa ccgcgagcgc tacaactact tcaaccagaa caacgaaatc 1140
atcaagcgga tcttggacag gcacgaggag gacctgaaga tcggcaaaga gatcctccgc 1200
aacaccatct accacaaaaa ggccaaaaac atccaggaga ccggacccga cgcccccgga 1260
ctgtctatct acaacagcac attccacacc gacagcggca tcaaaggact gctcagcttc 1320
aaagagctca aaaacctgga aaaagccagc ggcaacatca agaaagcccg cgaatacgat 1380
ttcatcgacg actgcgaaga gaaaatcaag cagctgctga gcaaagagaa cctgaccccc 1440
gacgaggaaa gcgagctgat caagaccaaa aagcagctgg acaacgccct ggagatgctg 1500
aacgtgcctg acgacaccat ccgcgtggac atgtgggtga acaacaacaa caaactcgaa 1560
aaggagatcc tgtacaccaa ggccgagctg tacccctacg acgtgcccga ttacgcc 1617
<210> 3
<211> 630
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggacttca tcctgaacat cagcatgaag atggaggtga tcttcaagac cgacctgcgg 60
agcagcagcc aggtggtgtt ccacgccggg agcctgtaca actggttcag cgtggagatc 120
attaacagcg gccggattgt gaccaccgcc attaagaccc tcctgtccac cgtgaagtac 180
gacatcgtca aaagcgccag gatttatgcc ggccagggct acaccgaaca ccaggcccag 240
gaggagtgga acatgatcct gcacgtgctg ttcgaggaag agaccgagag cagcgccagc 300
agcgagaaca tccacgagaa gaacgataat gagacaaacg aatgcaccag cagcttcgag 360
acactgttcg aacaggaacc ctctagcgag gtgccaaagg acagcaagct gtacatgctg 420
gcccagaaga ccgtgcagca cattgagcag tacggcaaag cccccgactt caacaaggtg 480
atccgcgccc acaacttcat ccagaccatc tacggcaccc ccctgaaaga ggaagaaaaa 540
gaagtggtga ggctcatggt gatcaaactg ctgaagaaga ttagctttta cctgacctac 600
atctacccct acgacgtgcc cgactacgcc 630
<210> 4
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggacagcg agttcttcca gcccgtgtac ccccgccact acggagagtg cctgagcccc 60
gtgaccaccc ccagcttctt cagcacacac atgtacacca tcctgatcgc catcgtggtg 120
ctggtgatta tcatcatcgt cctgatctac ctgttcagct ctcgcaagaa aaaggccgct 180
gccatcgaag aggaggacat ccagttcatc aacccctacc aggaccagca gtgggtggaa 240
gtgacccccc agcccggcac cagcaagcct gctggagcca ccaccgccag cgtgggaaaa 300
cccgtgaccg gccgccccgc taccaacaga cccgctacca ataagcccgt gaccgacaac 360
cccgtcaccg accgcctcgt gatggccacc ggcggaccag ctgccgctcc tgctgctgct 420
agcgcccctg ctcaccccgc tgagccatac accaccgtga ccacccagaa caccgccagc 480
cagaccatga gcgccattga gaatctccgc cagcgcaata catataccca caaagacctg 540
gaaaactccc tctaa 555
<210> 5
<211> 32619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 180
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 240
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 300
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 360
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 420
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 480
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 540
cagacctcag cgctcaaaga tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca 600
tccggcagtt caacagatcg ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt 660
gatgtcattc tggtgaagaa gctcgaccgt cttggccgcg acacgccgac atgatccaac 720
tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta 780
ccgacggtga tatggggcaa atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca caggctgaac 840
gccggaggat cctagagcgc acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg aaaggaatca 900
aatttggccg caggcgtacc gtggacagga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 960
gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 1020
gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 1080
cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 1140
gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 1200
tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1260
aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1320
tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 1380
tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgatcgatta attaacgacc catcatcaat 1440
aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg 1500
gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg taggttttag ggcggagtaa cttgtatgtg 1560
ttgggaattg tagttttctt aaaatgggaa gttacgtaac gtgggaaaac ggaagtgacg 1620
atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt 1680
tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc 1740
tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt 1800
tattaccctg ttatccctag caattgaaaa ataaacacgt tgaaacataa cacaaacgat 1860
tctttattct tgggcaatgt atgaaaaagt gtaagaggat gtggcaaata tttcattaat 1920
gtagttgtgg ccagaccagt cccatgaaaa tgacatagag tatgcacttg gagttgtgtc 1980
tcctgtttcc tgtgtaccgt ttagtgtaat ggttagtgtt acaggtttag ttttgtctcc 2040
gtttaagtaa acttgactga caatgttact tttggcagtt ttaccgtgag attttggata 2100
agctgatagg ttaggcataa atccaacagc gtttgtatag gctgtgcctt cagtaagatc 2160
tccatttcta aagttccaat attctgggtc caggaaggaa ttgtttagta gcactccatt 2220
ttcgtcaaat cttataataa gatgagcact ttgaactgtt ccagatattg gagccaaact 2280
gcctttaaca gccaaaactg aaactgtagc aagtatttga ctgccacatt ttgttaagac 2340
caaagtgagt ttagcatctt tctctgcatt tagtctacag ttaggagatg gagctggtgt 2400
ggtccacaaa gttagcttat cattattttt gtttcctact gtaatggcac ctgtgctgtc 2460
aaaactaagg ccagttccta gtttaggaac catagccttg tttgaatcaa attctaggcc 2520
atggccaatt tttgttttga ggggatttgt gtttggtgca ttaggtgaac caaattcaag 2580
cccatctcct gcattaatgg ctatggctgt agcgtcaaac atcaacccct tggcagtgct 2640
taggttaacc tcaagctttt tggaattgtt tgaagctgta aacaagtaaa ggcctttgtt 2700
gtagttaata tccaagttgt gggctgagtt tataaaaaga gggccctgtc ctagtcttag 2760
atttagttgg ttttgagcat caaacggata actaacatca agtataaggc gtctgttttg 2820
agaatcaatc cttagtcctc ctgctacatt aagttgcata ttgccttgtg aatcaaaacc 2880
caaggctcca gtaactttag tttgcaagga agtattatta atagtcacac ctggaccagt 2940
tgctacggtc aaagtgttta ggtcgtctgt tacatgcaaa ggagccccgt actttagtcc 3000
tagttttcca ttttgtgtat aaatgggctc tttcaagtca atgcccaagc taccagtggc 3060
agtagttaga gggggtgagg cagtgatagt aagggtactg ctatcggtgg tggtgagggg 3120
gcctgatgtt tgcagggcta gctttccttc tgacactgtg aggggtcctt gggtggcaat 3180
gctaagtttg gagtcgtgca cggttagcgg ggcctgtgat tgcatggtga gtgtgttgcc 3240
cgcgaccatt agaggtgcgg cggcagccac agttagggct tctgaggtaa ctgtgagggg 3300
tgcagatatt tccaggttta tgtttgactt ggtttttttg agaggtgggc tcacagtggt 3360
tacattttgg gaggtaaggt tgccggcctc gtccagagag aggccgttgc ccattttgag 3420
cgcaagcatg ccattggagg taactagagg ttcggatagg cgcaaagaga gtaccccagg 3480
gggactctct tgaaacccat tgggggatac aaagggagga gtaagaaaag gcacagttgg 3540
aggaccggtt tccgtgtcat atggatacac ggggttgaag gtatcttcag acggtcttgc 3600
gcgcttcatc tgcaacaaca tgaagatagt gggtgcggat ggacaggaac aggaggaaac 3660
tgacattcca tttagattgt ggagaaagtt tgcagccagg aggaagctgc aataccagag 3720
ctgggaggag ggcaaggagg tgctgctgaa taaactggac agaaatttgc taactgattt 3780
taagtaagtg atgctttatt attttttttt attagttaaa gggaataaga tctttgagac 3840
cgcacagggt cttaataagg gtgcagagat cctcaggtcc ttgacaaggt gagtgaatgc 3900
agccttcggt ttctaccgag tgctgagtta tggtaatggg cttttctccc accatgacca 3960
ccaatttctg acgcttggtt ggcaacttgt agctaaggcg gtgtccggtg gtattactgt 4020
cgtaggtgac tttggcctgc tttaccagac aaaagatacc ccttttgcac tggtgcaagt 4080
taaccatgtc ttggagctct tgattcatgc gctgttgctc ggccgctgcc ctgcgtcttt 4140
ctagcaggcg ctgctctgta ataattccgt ccatttctag ctagagaaac ctgaattaga 4200
atagcccgta gagttgcttg aattgttcat aaaccccaca gtagctgcgc ctttggccta 4260
ataccctaag ggttttctaa gctcacctcc tgttctggta aacagagtta ttgaggtctg 4320
tccggaaaaa gtctggttta cggtcaggcg gtaggtgtgg tgcagcggcc ggtgacgcac 4380
tcgtacgttc ccggcaggta aggagggtgg tgttttttct gatggagtag ctgagctcgg 4440
agaggttctc tcgtagactc actccgtctg ggttgaaact gttgtaaatc acagagggag 4500
agatgttaaa agtaccaggt aaggttcgcc ttggtttgct tgggcgggtg aagacggtgg 4560
cgtttacagg atggcgatag gagccccagt atattttaat ttctgtattt attatactca 4620
gcacagagat ggcaacaaag atcttgatgt aatccagggt taggacagtt gcaaatcaca 4680
gtgagaacac agggtcccct gtcccgctca actagcaggg ggcgctgggt aaactcccga 4740
atcaggctac gggcaagctc tccctgggcg gtaagccgga cgccgtgcgc cgggccctcg 4800
atatgatcct cgggcaattc aaagtagcaa aactcaccgg agtcgcgggc aaagcacttg 4860
tggcggcgac agtggaccag gtgtttcagg cgcagttgct ctgcctctcc acttaacatt 4920
cagtcgtagc cgtccgccga gtcctttacc gcgtcaaagt taggaataaa ttgatccgga 4980
tagtggccgg gaggtcccga gaaggggtta aagtagaccg atggcacaaa ctcctcaata 5040
aattgcagag ttccaatgcc tccagagcgc ggctcagagg acgaggtctg cagagttagg 5100
attgcctgac gaggcgtgaa tgaagagcgg ccggcgccgc cgatctgaaa tgtcccgtcc 5160
ggacggagac caagcgagga gctcaccgac tcgtcgttga gctgaatacc tcgccctctg 5220
attgtcaggt gagttatacc ctgcccgggc gaccgcaccc tgtgacgaaa gccgcccgca 5280
agctgcgccc ctgagttagt catctgaact tcggcctggg cgtctctggg aagtaccaca 5340
gtggtgggag cgggactttc ctggtacacc agggcagcgg gccaactacg gggattaagg 5400
ttattacgag gtgtggtggt aatagccgcc tgttccagga gaattcggtt tcggtgggcg 5460
cgtattccgt tgacccggga tatcatgtgg ggtcccgcgc tcatgtagtt tattcgggtt 5520
gagtagtctt gggcagctcc agccgcaagt cccatttgtg gctggtaact ccacatgtag 5580
ggcgtgggaa tttccttgct cataatggcg ctgacaacag gtgctggcgc cgggtgtggc 5640
cgctggagat gacgtagttt tcgcgcttaa atttgagaaa gggcgcgaaa ctagtcctta 5700
agagtcagcg cgcagtattt actgaagaga gcctccgcgt cttccagcgt gcgccgaagc 5760
tgatcttcgc ttttgtgata caggcagctg cgggtgaggg atcgcagaga cctgtttttt 5820
attttcagct cttgttcttg gcccctgctc tgttgaaata tagcatacag agtgggaaaa 5880
atcctgtttc taagctcgcg ggtcgatacg ggttcgttgg gcgccagacg cagcgctcct 5940
cctcctgctg ctgccgccgc tgtggatttc ttgggctttg tcagagtctt gctatccggt 6000
cgcctttgct tctgtgtggc cgctgctgtt gctgccgctg ccgccggtgc agtatgggct 6060
gtagagatga cggtagtaat gcaggatgtt acgggggaag gccacgccgt gatggtagag 6120
aagaaagcgg cgggcgaagg agatgttgcc cccacagtct tgcaagcaag caactatggc 6180
gttcttgtgc ccgcgccatg agcggtagcc ttggcgctgt tgttgctctt gggctaacgg 6240
cggcggctgc ttggacttac cggccctggt tccagtggtg tcccatctac ggttgggtcg 6300
gcgaacgggc agtgccggcg gcgcctgagg agcggaggtt gtagccatgc tggaaccggt 6360
tgccgatttc tggggcgccg gcgaggggaa tgcgaccgag ggtgacggtg tttcgtctga 6420
cacctcttcg acctcggaag cttcctcgtc taggctctcc cagtcttcca tcatgtcctc 6480
ctcctcctcg tccaaaacct cctctgcctg actgtcccag tattcctcct cgtccgtggg 6540
tggcggcggc agctgcagct tctttttggg tgccatcctg ggaagcaagg gcccgcggct 6600
gctgctgata gggctgcggc ggcgggggga ttgggttgag ctcctcgccg gactgggggt 6660
ccaagtaaac cccccgtccc tttcgtagca gaaactcttg gcgggctttg ttgatggctt 6720
gcaattggcc aagaatgtgg ccctgggtaa tgacgcaggc ggtaagctcc gcattaggcg 6780
ggcgggattg gtcttcgtag aacctaatct cgtgggcgtg gtagtcctca ggtacaaatt 6840
tgcgaaggta agccgacgtc cacagccccg gagtgagttt caaccccgga gccgcggact 6900
tttcgtcagg cgagggaccc tgcagctcaa aggtaccgat aatttgactt tcgttaagca 6960
gctgcgaatt gcaaaccagg gagcggtgcg gggtgcatag gttgcagcga cagtgacact 7020
ccagtagacc gtcaccgctc acgtcttcca ttatgtcaga gtggtaggca aggtagttgg 7080
ctagctgcag aaggtagcag tggccccaaa gcggcggagg gcattcgcgg tacttaatgg 7140
gcacaaagtc gctaggaagt gcacagcagg tggcgggcaa gattcctgag cgctctagga 7200
taaagttcct aaagttctgc aacatgcttt gactggtgaa gtctggcaga ccctgttgca 7260
gggttttaag caggcgttcg gggaaaatga tgtccgccag gtgcgcggcc acggagcgct 7320
cgttgaaggc cgtccatagg tccttcaagt tttgctttag cagtttctgc agctccttga 7380
ggttgcactc ctccaagcac tgctgccaaa cgcccatggc cgtctgccag gtgtagcata 7440
gaaataagta aacgcagtcg cggacgtagt cgcggcgcgc ctcgcccttg agcgtggaat 7500
gaagcacgtt ttgcccaagg cggttttcgt gcaaaattcc aaggtaggag accaggttgc 7560
agagctccac gttggagatc ttgcaggcct ggcgtacgta gccctgtcga aaggtgtagt 7620
gcaatgtttc ctctagcttg cgctgcatct ccgggtcagc aaagaaccgc tgcatgcact 7680
caagctccac ggtaacgagc actgcggcca tcattagttt gcgtcgctcc tccaagtcgg 7740
caggctcgcg cgtttgaagc cagcgcgcta gctgctcgtc gccaactgcg ggtaggccct 7800
cctctgtttg ttcttgcaaa tttgcatccc tctccagggg ctgcgcacgg cgcacgatca 7860
gctcactcat gactgtgctc atgaccttgg ggggtaggtt aagtgccggg taggcaaagt 7920
gggtgacctc gatgctgcgt tttagtacgg ctaggcgcgc gttgtcaccc tcgagttcca 7980
ccaacactcc agagtgactt tcattttcgc tgttttcctg ttgcagagcg tttgccgcgc 8040
gcttctcgtc gcgtccaaga ccctcaaaga tttttggcac ttcgttgagc gaggcgatat 8100
caggtatgac agcgccctgc cgcaaggcca gctgcttgtc cgctcggctg cggttggcac 8160
ggcaggatag gggtatcttg cagttttgga aaaagatgtg ataggtggca agcacctctg 8220
gcacggcaaa tacggggtag aagttgaggc gcgggttggg ctcgcatgtg ccgttttctt 8280
ggcgtttggg gggtacgcgc ggtgagaata ggtggcgttc gtaggcaagg ctgacatccg 8340
ctatggcgag gggcacatcg ctgcgctctt gcaacgcgtc gcagataatg gcgcactggc 8400
gctgcagatg cttcaacagc acgtcgtctc ccacatctag gtagtcgcca tgcctttcgt 8460
ccccccgccc gacttgttcc tcgtttgcct ctgcgttgtc ctggtcttgc tttttatcct 8520
ctgttggtac tgagcggtcc tcgtcgtctt cgcttacaaa acctgggtcc tgctcgataa 8580
tcacttcctc ctcctcaagc gggggtgcct cgacggggaa ggtggtaggc gcgttggcgg 8640
catcggtgga ggcggtggtg gcgaactcag agggggcggt taggctgtcc ttcttctcga 8700
ctgactccat gatctttttc tgcctatagg agaaggaaac ttgtatgtgt tgggaattgt 8760
agttttctta aaatgggaag ttacgtaacg tgggaaaacg gaagtgacga tttgaggaag 8820
ttgtgggttt tttggctttc gtttctgggc gtaggttcgc gtgcggtttt ctgggtgttt 8880
tttgtggact ttaaccgtta cgtcattttt tagtcctata tatactcgct ctgcacttgg 8940
ccctttttta cactgtgact gattgagctg gtgccgtgtc gagtggtgtt tttttaatag 9000
gttttctttt ttactggtaa ggctgactgt tatgactacg tccggcgttc catttggcat 9060
gacactacga ccaacacgat ctcggttgtc tcggcgcact ccgtacagta gggatcgtct 9120
acctcctttt gagacagaaa cccgcgctac catactggag gatcatccgc tgctgcccga 9180
atgtaacact ttgacaatgc acaacgtgag ttacgtgcga ggtcttccct gcagtgtggg 9240
atttacgctg attcaggaat gggttgttcc ctgggatatg gttctaacgc gggaggagct 9300
tgtaatcctg aggaagtgta tgcacgtgtg cctgtgttgt gccaacattg atatcatgac 9360
gagcatgatg atccatggtt acgagtcctg ggctctccac tgtcattgtt ccagtcccgg 9420
ttccctgcag tgtatagccg gcgggcaggt tttggccagc tggtttagga tggtggtgga 9480
tggcgccatg tttaatcaga ggtttatatg gtaccgggag gtggtgaatt acaacatgcc 9540
aaaagaggta atgtttatgt ccagcgtgtt tatgaggggt cgccacttaa tctacctgcg 9600
cttgtggtat gatggccacg tgggttctgt ggtccccgcc atgagctttg gatacagcgc 9660
cttgcactgt gggattttga acaatattgt ggtgctgtgc tgcagttact gtgctgattt 9720
aagtgagatc agggtgcgct gctgtgcccg gaggacaagg cgccttatgc tgcgggcggt 9780
gcgaatcatc gctgaggaga ccactgccat gttgtattcc tgcaggacgg agcggcggcg 9840
gcagcagttt attcgcgcgc tgctgcagca ccaccgccct atcctgatgc acgattatga 9900
ctctaccccc atgtagacta gggttctgtg agtttgatta aggtacggtg atctgtataa 9960
gctatgtggt ggtggggcta tactactgaa tgaaaaatga cttgaaattt tctgcaattg 10020
aaaaataaac acgttgaaac ataacacaaa cgatacggcg cagacggcaa gggtgggggt 10080
aaataatcac ccgagagtgt acaaataaaa gcatttgcct ttattgaaag tgtctctagt 10140
acattatttt tacatgtttt tcaagtgaca aaaagaagtg gcgctcctaa tctgcgcact 10200
gtggctgcgg aagtagggcg agtggcgctc caggaagctg tagagctgtt cctggttgcg 10260
acgcagggtg ggctgtacct ggggactgtt gagcatggag ttgggtaccc cggtaataag 10320
gttcatggtg gggttgtgat ccatgggagt ttggggccag ttggcaaagg cgtggagaaa 10380
catgcagcag aatagtccac aggcggccga gttgggcccc tgtacgcttt gggtggactt 10440
ttccagcgtt atacagcggt cgggggaaga agcaatggcg ctacggcgca ggagtgactc 10500
gtactcaaac tggtaaacct gcttgagtcg ctggtcagaa aagccaaagg gctcaaagag 10560
gtagcatgtt tttgagtgcg ggttccaggc aaaggccatc cagtgtacgc ccccagtctc 10620
gcgaccggcc gtattgacta tggcgcaggc gagcttgtgt ggagaaacaa agcctggaaa 10680
gcgcttgtca taggtgccca aaaaatatgg cccacaacca agatctttga caatggcttt 10740
cagttcctgc tcactggagc ccatggcggc agctgttgtt gatgttgctt gcttctttat 10800
gttgtggcgt tgccggccga gaagggcgtg cgcaggtaca cggtttcgat gacgccgcgg 10860
tgcggctggt gcacacggac cacgtcaaag acttcaaaca aaacataaag aagggtgggc 10920
tcgtccatgg gatccacctc aaaagtcatg tctagcgcgt gggcggagtt ggcgtagaga 10980
aggttttggc ccaggtctgt gagtgcgccc atggacataa agttactgga gaatgggatg 11040
cgccaaaggg tgcgatcgca aagaaacttt ttctgggtaa tgctgtcaac tgcggtcttg 11100
cctataagcg gataggggaa gttagcaggg taggcctgtc cttcgcgcat ggtgggggca 11160
aggtagccaa caaatccaga gttgttgtgt tggtgtagga tgcccacctg ttggtagtcc 11220
ttgtatttag tatcatccac cacctgacgg ctcatgggct ggaagtttct aaagaaggag 11280
tacatgcggt ccttgtagct ctctgggata tagaagccct ggtagccaat gttatagtta 11340
gctagcattt gtaccaggaa ccagtctttg gtcatgttac actgggcaac gttgtaaccc 11400
tccccgtcaa ctgagcgctt aatttcaaac tcgttggggg taagcaggcg gtcattgcca 11460
ggccagctga cagaagagtc aaaggtaatg gccaccttct taaaggtgtg gttgaggtaa 11520
aaggttccat ctaggtaggg tatagagcca gagtaggtgt aataagggtc gtagcccgag 11580
cccagtgatg gggtttcctt agtcttaagg cgcgtgaagg cccagccgcg gaaagccgcc 11640
cagttgcggg aggggatgga tatgggcacg ttggtagcgt tggcgggtat agggtagagc 11700
atgttggcgg cggagagata gtcgttaaag gactggtcgt tggtgtcgtt tctaagcatg 11760
gcctcaagcg tggaggcggt gttgtgggcc atggggaaga aggtggcgta aaggcaaatg 11820
ctatcaaact taatgctggc tccgtcaacc cttaggtcat ttcctaggga gctctgcaga 11880
accatgttaa catccttcct gaagttccac tcgtaggtgt atgagcccgg caggagaagg 11940
aggtttttaa tggcaaagaa cttctgaggc acctggatgt ggaagggcac atagcgacca 12000
ttgcccagca acattgagcg gtagcgcagg ccagcattgc ggtggtggtt aaatgggttg 12060
acgttgtcca tatagtcaag ggaccagcgt gctccaaggt taatgtagca gtccactagc 12120
ccgggagcca ccactcgctt gttcatgtag tcgtaggtgt ttgggttatc agaaattttt 12180
acgttggaag gactgtactt tagcttgtcg ggcaaataca gcgctatgtt ggagtacagg 12240
aaatttctcc acaggttggc atttagattg atttccatgg caaaattatt tccaactctt 12300
atttcatttt tatctgaaaa ttctgtagca tctttttccc atccattttc ctgacctgtt 12360
ttaggtttta ccttggtaag agtctctgta ttaatcacac ctcccagtgg aaagcagtaa 12420
tttggaagtt catcttcagt tccatgattt tcaataattc taacatctgg atcatagctg 12480
tcaacagcct gattccacat agaaaagtac ctggttctat caccaatgga atcaagcaaa 12540
agctggtatg aaagctctgt gtttctgtct tgcaaatcta caacagcatt caactgcgat 12600
gcttggcccg ccagaacacc catattaccc gtgctgttgt aatacattag accaataaaa 12660
ttgtccctaa aagcaatgta attaggcctg ttgggcatag attgttggcc cattagttct 12720
cgtgagttac cttccttaat agtgggcatg taagaaatat gagtgtctgg ggtttctata 12780
tctacatctt cactgtacaa taccacttta ggagtcaagt tatcaccatt gcctgcggct 12840
gcctcagtag ttgagaaaaa ttgcatttcc acttgacttt ctagctttcc attttgttgc 12900
tttacaagaa tgccttgccc tccattttca tttgtgggtt ttgcatatga accgtaacat 12960
ggtttcattg gggtagtctt ttttaggact ctcccagctg catgattaat ttctgtttcg 13020
taccactgag attctcctat ttgaggttca ggttgaaatg ttttatcggc atatttaggt 13080
gtttgacctt cgacacctat ttgaataccc tcctttgtaa tatttatacc agaataaggc 13140
gcctgcccaa atacgtgagt tttttgctgc tcagcttgct cgtctacttc gtcttcgttg 13200
tcatcgtcct cttcttctag gtttatttca agagcagtag cagcttcatc ccattcgcaa 13260
ggatttgggg cacccttggg agccagggcg ttgtaggcag tgccagagta gggcttaaaa 13320
gtagggcccc tgtccagcac gccgcggatg tcaaagtacg tggaagccat gtccagcaca 13380
cggttatcac ccacagctag ggtgaaccgc gccttgtacg agtacgcagt atcctcacgg 13440
tccacaggga tgaaccgcag cgtcaaacgc tgggaccggt ctgtggtcac gtcgtgcgta 13500
ggcgccaccg tggggtttct aaacttgtta ttcaggctga agtacgtctc ggtggcgcgg 13560
gcaaactgca ccagcccggg gctcaggtac tccgaggcgt cctggcccga gatgtgcatg 13620
taagaccact gcggcatcat cgaaggggta gccatcttgg aaagcgggcg cgcggcggct 13680
cagcagctcc tctggcggcg acatggacgc atacatgaca cacatacgac acgttagcta 13740
tcagaagcat cgtcggcgct tcagggattg cacccccaga cccacgatgc tgttcagtgt 13800
gctttgccag ttgccactgg ctacgggccg caacgatcgc ggaccgctgg cggcgcggcg 13860
cagggacgcg cggctaggac gggttacaac aacggcggtc gggcctggca gcacaggttt 13920
ctgctgggtg tcggcggggg gaggcaggtc cagcgttacg ggtgtgtgct ggcccagcac 13980
tccggtagcc atgggcgcga tgggacgggt ggtgggcagg ccttgcttta gtgcctcctc 14040
gtacgaggga ggctcgtcta tttgcgtcac cagagtttct tccctgtcgg ggcgcggacg 14100
cttttcgcca cgcccctctg gagacactgt ctccacggcc ggtggaggct cctctacggg 14160
agggcgggga tcaagcttac tgttaatctt attttgcact gcctggttgg ccaggtccac 14220
caccccgcta atgccagagg ccaggccatc taccaccttt tgttggaaat tttgctcttt 14280
caacttatcc ctcagcatct ggcctgtgct gctgttccag gccttgctgc catagttctt 14340
aacggtggaa ccgaaatttt taatgccgct ccacagcgag ccccagctga aggcgccacc 14400
gctcatattg ctggtgccga tatcttgcca gtttcccatg aacgggcgcg agccgtgtcg 14460
cggggccaga gacgcaaagt tgatgtcttc cattctacaa aatagttaca ggaccaagcg 14520
agcgtgagag tccagacttt ttattttgat ttttccacat gcaacttgtt tttaatcagt 14580
gtctctgcgc ctgcaaggcc acggatgcaa ttccgggcac ggcgccaatc gccgcggcga 14640
tcagtggaat aaggaggggc aggataccgc cgcgcatgcg acggtgcgac gcgcgccgcc 14700
gccggtggtg cgcacgacgc atgccgcccg tcaggccgtg gccggccatg cccctcctac 14760
ggtgcattct tcctcggaat cccggcaccg ggaaacggag gcggcaggtg agggccatat 14820
ctgcaagaac cacaaagacc ggcttttaaa cgatgctggg gtggtagcgc gctgttggca 14880
gcaccagggt cctgcctcct tcgcgagcca ccctgcgcac ggaaatcggg gccagcacgg 14940
gctggcgacg gcgacggcgg cggcgggttc cagtggtggt tcggcgtcgg gtagttgctc 15000
gtcttctggg gcggtaggtg tagccacgat agccgggggt aggcgcaatg gaaggatgta 15060
gggcatattc gggcagtagc gcgctggcgg cgccgtactt cctcgaacgg cgcgggcgcc 15120
ggggggctga aacgcgaaac atccacgggt ccgtttgcac ctccgtagag gtcttggacg 15180
cggccgcagc gaccgcctgc accgcggcat ccgccaccgc tgaggcaacc ggggacgttt 15240
gtgtctccat gccctctgtg gcggtggcaa tactggtgct actggtagtg ggtatctgaa 15300
cgtccacggt ctgcacgccc agtcccggcg ccacctgctt gattggccgc acgcggacct 15360
cgggctccag cccaggttcc acggtcattt tttccaagac atcttccagt cgctggcgct 15420
tgggtaccat cagctgcacg gtgggtgcca agtcaccaga ctcgcgcttt aggccgcgct 15480
tttcttcgga cggtgcaagc gcgggcagca cctgctgcag tgttacgggc tttaggctag 15540
gtgttgggtt gccctcgtcc agcggcaacg ccagcatgtc cttatgccgc tttccgtagg 15600
caaactcccc gaggcgctcg ttggcctgct caagcaggtc ctcgtcgccg tacacctcat 15660
catacacgcg cttgtaggtg cgggtggagc gctcaccggg cgtaaagact acggtggtgc 15720
cgggtcgcaa aacacgtttt acgcgtcgac ctttccactg tacccgtcgc ctgggcgcgg 15780
tagcgtgcag cagttccacc tcgtcgtcaa gttcatcatc atcatctttc tttttctttt 15840
tgacccgctt tagctttcgg ggcttgtaat cctgctcttc cttcttcggg gggccataga 15900
tctccggcgc gatgacctgg agcatctctt ctttgatttt gcgcttggac atagcttcgt 15960
tgcgcgccgc cgccgctgga tacatacaac agtacgagtc taagtagttt tttcttgcaa 16020
tctagttgcg cggggggcgg gtgcgcacgg gcacgcgcag gccgctaacc gagtcgcgca 16080
cccaatacac gttgcccctg cgaccctgag tcatagcact aatggccgcg gctgctgcgg 16140
cggccgctcg tcgcctggac ctggggggca cagtgacaat acccgcggcc agccttcgag 16200
cggcccgcat ggccgcccgt cggccggtgc gacgtgcgcg gttaagcagg gccgccgccg 16260
cgcgttgggc ggcagtgccg ggtcggcggc ggtggcgacg tgctacgcgc ctccgccgtc 16320
tcttcatttt agcatagcgc cgggctccgc gcaccacggt ctgaatggcc gcgtccactg 16380
tggacactgg tggcggcgtg ggcgtgtagt tgcgcgcctc ctccaccacc gcgtcgatgg 16440
cgtcatcgac ggtggtgcgc ccagtgcggc cgcgtttgtg cgcgccccag ggcgcgcggt 16500
agtgcccgcg cacgcgcact gggtgttggt cggagcgctt cttggccccg ccaaacatct 16560
tgcttgggaa gcgcaggccc cagcctgtgt tattgctggg cgatataagg atggacatgc 16620
ttgctcaaaa agtgcggctc gataggacgc gcggcgagac tatgcccagg gccttgtaaa 16680
cgtaggggca ggtgcggcgt ctggcgtcag taatggtcac tcgctggact cctccgatgc 16740
tgttgcgcag cggtagcgtc ccgtgatctg tgagagcagg aacgttttca ctgacggtgg 16800
tgatggtggg ggctggcggg cgcgccaaaa tctggttctc gggaaagcga ttgaacacgt 16860
gggtcagaga ggtaaactgg cggatgagtt gggagtagac ggcctggtcg ttgtagaagc 16920
tcttggagtg cacgggcaac agctcggcgc ccaccaccgg aaagttgctg atctggcgcg 16980
tggagcggaa ggtcacgggg tcttgcatca tgtctggcaa cgaccagtag acctgctccg 17040
agccgcaggt tacgtcagga gtgcaaagca gggtccatga gcggattccg gtctgagggt 17100
cgccgtagtt gtatgcaagg taccagctgc ggtactgggt gaaggtgctg tcattgctta 17160
ttaggttgta actgcgtttc ttgctgtcct ctgtcagggg tttgatcacc ggtttcttct 17220
gaggcttctc gacctcgggt tgcgcagcgg gggcggcagc ttcggccgct gcttcggcct 17280
cagcgcgctt ctcctcagcc cgtgtggcaa aggtgtcgcc gcgaatggca tgatcgttca 17340
tgtcctccac cggctgcatt gccgcggctg ccgcgttgga gttctcttcc gcgccgctgc 17400
cactgctgtt gctgccgcct gcgccacccc cgccctgttc ggtgtcatct ttcaagctcg 17460
cctggtaggc gtccacatcc aacagtgcgg gaatgttacc accctccaga tcatcgtagg 17520
tgatcctaaa gccctcctgg aagggttgcc gcttgcggat gcccaacaag ttgctcaggc 17580
ggctgtgggt gaagtccacc ccgcatcctg gcagcaaaat gatgtctgga tggaaggctt 17640
cgtttgtata taccccaggc atgacaagac cagtgacggg gtcaaacccc agtctgaagt 17700
tgcgggtgtc aaactttacc ccgatgtcgc tttccagaac cccgttctgt ctgcccactt 17760
tcaagtagtg ctccacgatc gcgttgttca taaggtctat ggtcatggtc tcggagtagt 17820
tgccctcggg cagcgtgaac tccacccact cgtatttcag ctccacctga ttgtccttag 17880
taggcaagcg cgacaccatc acccgcgcct taaacttatt ggtaaacatg aactcgttca 17940
catttggcat gttggtatgc aggatggttt tcaggtcgcc gccccagtgc gaccggtcgt 18000
caagattgat ggtctgtgtg cttgcctccc ccgggctgta gtcattgttt tgaatgaccg 18060
tggtcagaaa gttgctgtgg tcgttctggt agttcaggga tgccacatcc gttgacttgt 18120
tgtccaccag gtacacacgg gtggtgtcga ataggggtgc caactcagag taacggatgc 18180
tgtttctccc cccggtaggc cgcaggtacc gcggaggcac aaacggcggg tccaggggag 18240
catcgaaggg agaacccagc gccgccgcca ctggcgccgc gctcaccaca ctctcgtagg 18300
agggaggagg accttcctca tacatcgccg cgcgccgcat actaagggga atacaagaaa 18360
accaacgctc ggtgccatgg ccttggtgag ttttttattt tgcatcatgc tttttttttt 18420
tttaaaacat tctccccagc ctggggcgaa ggtgcgcaaa cgggttgcca ctccctccca 18480
aatccaggac gctgctgtcg tctgccgagt catcgtcctc ccacaccaga ccccgctgac 18540
ggtcgtgcct ttgacgacgg gtgggcgggc gcgggcctgg cacgtccctg tgctcctgcg 18600
cgtacgtctt ccatctactc atcttgtcca ctaggctctc tatcccgttg ttgggaaatg 18660
ccggaggcag gtttttttcg cgctgcggct gcagcagcga gttgtttagg tactcctcct 18720
cgcccagcag gcgcgggcgg gtggtgcgag tgctggtaag agaccctatc aagcttggaa 18780
atgggctact agcatctgac cgcggggccg cagcgcctag atcggacaag ctgcttggcc 18840
tgcggaagct ttcctttcgc agcgccgcct ctgcctgctc gcgctgttgc aactctagca 18900
gggtctgcgg ttgcggggaa aacacgctgt cgtctatgtc gtcccagagg aatccatcgt 18960
taccctcggg cacctcgaat cccccggtgt agaaaccagg gggcggtagc cagtgcgggt 19020
tcaagatggc attggtgaaa tactcggggt tcacggcggc cgcgcgatgc aagtagtcca 19080
ttaggcggtt gataaacggc cggtttgagg catacatgcc cggttccatg ttgcgcgcgg 19140
tcatgtccag cgccacgctg ggcgttaccc cgtcgcgcat caggttaagg ctcacgctct 19200
gctgcacgta gcgcaaaatg cgctcctcct cgctgtttaa actgtgcaac gaggggatct 19260
tctgccgccg gttggtcagc aggtagttta gggttgcctc caggctgccc gtgtcctcct 19320
gccccagcgc gcggctgaca cttgtaatct cctggaaagt atgctcgtcc acatgcgcct 19380
gacctatggc ctcgcggtac agtgtcagca agtgacctag gtatgtgtcc cgggacacgc 19440
tgccactgtc cgtgaagggc gctattagca gcagcaacag gcgcgagttg ggcgtcagca 19500
agctagacac ggtcgcgcgg tcgcctgtgg gagcccgcac cccccacagc ccctgcaagt 19560
ttttgaaagc ctggctcagg tttacggtct gcaggccttg tctactggtc tggaaaaaat 19620
agtctggccc agactggtac acctcacttt gcggtgtctc agtcaccatt agccgcagtg 19680
cgctcacaaa gttggtgtag tcctcctgtc cccgcggcac gttggcgggc tgtgtactca 19740
ggaaggcgtt tagtgcaacc atggagccca ggttgccctg ctgctgcgcg cgctcacgct 19800
gcgccacggc ctcgcgcaca tcccccacca gccggtccag gttggtctgc acgttgccgc 19860
tgttgtaacg agccacgcgc tgaagcagcg cgtcgtagac caggccggcc tcgtcgggcc 19920
ggatggccct gttttcggcc agcgcgttta cgatcgccag caccttctcg tgcgtggggt 19980
ttgcgcgcgc cgggaccacc gcttccagaa ttgcggagag ccggttggcc tgcggctgct 20040
gccggaacgc gtcaggattg cgcgcagtca gcgacatgat gcggtccatg acctggcgcc 20100
agtcgtccgt ggagttaagg ccggacggct ggctctgcag cgccgcccgc accgccgggt 20160
ccgttgcgtc ttgcatcatc tgatcagaaa catcaccgct tagtactcgc cgtcctctgg 20220
ctcgtactca tcgtcctcgt catattcctc cacgccgccg acgttgccag cgcgcgcggg 20280
tgccaccgcc agcccaggtc cggccccagc tgcctccagg gcgcgtcggc ttggggccca 20340
gcgcaggtca gcgcccgcgt caaagtagga ctcggcctct ctatcgccgc tgcccgtgcc 20400
agccagggcc ctttgcaggc tgtgcatcag ctcgcggtcg ctgagctcgc gccgccggct 20460
cacgctcacg gccttgtgga tgcgctcgtt gcgataaacg cccaggtcgt cgctcaaggt 20520
aagcaccttc agcgccatgc gcatgtagaa cccctcgatc tttacctcct tgtctatggg 20580
aacgtaaggg gtatggtata tcttgcgggc gtaaaacttg cccaggctaa gcatggaata 20640
gttgatggcg gccaccttgt cagccaggct caagctgcgc tcctgcacca ctatgctctg 20700
caggatgttt atcaaatcga gcagccagcg gccctcgggc tctactatgt ttagcagcgc 20760
atccctgaat gcctcgttgt ccctgctgtg ctgcactata aggaacagct gcgccatgag 20820
cggcttgcta tttgggtttt gctccagcgc gcttacaaag tcccacagat gcatcagtcc 20880
tatagccacc tcctcgcgcg ccacaagcgt acgcacgtgg ttgttaaagc ttttttgaaa 20940
gttaatctcc tggttcaccg tctgctcgta tgcggttacc aggtcggcgg ccgccacgtg 21000
tgcgcgcgcg ggactaatcc cggttcgcgc gtcgggctca aagtcctcct cgcgcagcaa 21060
ccgctcgcga ttcaggccat gccgcagctc gcgccctgcg tggaactttc gatcccgcat 21120
ctcctcgggc tcctctccct cgcggtcgcg aaacaggttc tgccgcggca cgtacgcctc 21180
acgcgtatca cgcttcagct gcacccttgg gtgccgctca ggagagggcg ctcctagccg 21240
cgccaggccc tcgccctcct ccaagtccag gtagtgccgg gcccggcgcc gcgggggttc 21300
gtaatcacca tctgctgccg cgtcaaccgc ggatgtcgcc cctcctgacg cggtaggagg 21360
aggggagggt gccctgcatg tctgccgctg ctcttgctct tgccgctgct gaggaggggg 21420
gcgcatctgc cgcagcaccg gatgcatctg ggaaaagcaa aaaaggggct cgtccctgtt 21480
tccggaggaa tttgcaagcg gggtcttgca tgacggggag gcaaaccccc gttcgccgca 21540
gtccggccgg tccgagactc gaaccggggg tcccgcgact caacccttgg aaaataaccc 21600
tccggctaca gggagcgagc cacttaatgc tttcgctttc cagcctaacc gcttacgctg 21660
cgcgcggcca gtggccaaaa aagctagcgc agcagccgcc gcgcctggaa ggaagccaaa 21720
aggagcactc ccccgttgtc tgacgtcgca cacctgggtt cgacacgcgg gcggtaaccg 21780
catggatcac ggcggacggc cggatacggg gctcgaaccc cggtcgtccg ccatgatacc 21840
cttgcgaatt tatccaccag accacggaag agtgcccgct tacaggctct ccttttgcac 21900
gctagagcgt caacgattgc gcgcgcctga ccggccagag cgtcccgacc atggagcact 21960
ttttgccgct gcgcaacatc tggaaccgcg tccgcgactt tccgcgcgcc tccaccaccg 22020
ccgccggcat cacctggatg tccaggtaca tctacggata tcatcgcctt atgttggaag 22080
atctcgcccc cggagccccg gccaccctac gctggcccct ctaccgccag ccgccgccgc 22140
actttttggt gggataccag tacctggtgc ggacttgcaa cgactacgta tttgactcga 22200
gggcttactc gcgtctcagg tacaccgagc tctcgcagcc gggtcaccag accgttaact 22260
ggtccgttat ggccaactgc acttacacca tcaacacggg cgcataccac cgctttgtgg 22320
acatggatga cttccagtct accctcacgc aggtgcagca ggccatatta gccgagcgcg 22380
ttgtcgccga cctagccctg cttcagccga tgaggggctt cggggtcaca cgcatgggag 22440
gaagagggcg ccacctacgg ccaaactccg ccgccgccgc agcgatagat gcaagagatg 22500
caggacaaga ggaaggagaa gaagaagtgc cggtagaaag gctcatgcaa gactactaca 22560
aagacctgcg ccgatgtcaa aacgaagcct ggggcatggc cgaccgcctg cgcattcagc 22620
aggccggacc caaggacatg gtgcttctgt cgaccatccg ccgtctcaag accgcctact 22680
ttaattacat catcagcagc acctccgcca gaaacaaccc cgaccgccgc ccgctgccgc 22740
ccgccacggt gctcagccta ccttgcgact gtgactggtt agacgccttt ctcgagaggt 22800
tttccgatcc ggtcgatgcg gactcgctca ggtccctcgg cggcggagta cctacacaac 22860
aattgttgag atgcatcgtt agcgccgtat ccctgccgca tggcagcccc ccgccaaccc 22920
ataaccggga catgacgggc ggcgtcttcc aactgcgccc ccgcgagaac ggccgcgccg 22980
tcaccgagac catgcgccgt cgccgcgggg agatgatcga gcgctttgtc gaccgcctcc 23040
cggtgcgccg tcgtcgccgc cgtgtccccc ctcccccacc gccgccagaa gaagaagaag 23100
gggaggccct tatggaagag gagattgaag aagaagaaga ggcccctgta gcctttgagc 23160
gcgaggtgcg cgacactgtc gccgagctca tccgtcttct ggaggaggag ttaaccgtgt 23220
cggcgcgcaa ctcccagttt ttcaacttcg ccgtggactt ctacgaggcc atggagcgcc 23280
ttgaggcctt gggggatatc aacgaatcca cgttgcgacg ctgggttatg tacttcttcg 23340
tggcagaaca caccgccacc accctcaact acctctttca gcgcctgcga aactacgccg 23400
tcttcgcccg gcacgtggag ctcaatctcg cgcaggtggt catgcgcgcc cgcgatgccg 23460
aagggggcgt ggtctacagc cgcgtctgga acgagggagg cctcaacgcc ttctcgcagc 23520
tcatggcccg catttccaac gacctcgccg ccaccgtgga gcgagccgga cgcggagatc 23580
tccaggagga agagatcgag cagttcatgg ccgagatcgc ctatcaagac aactcaggag 23640
acgtgcagga gattttgcgc caggccgccg tcaacgacac cgaaattgat tctgtcgaac 23700
tctctttcag gttcaagctc accgggcccg tcgtcttcac gcagaggcgc cagattcagg 23760
agatcaaccg ccgcgtcgtc gcgttcgcca gcaacctacg cgcgcagcac cagctcctgc 23820
ccgcgcgcgg cgccgacgtg cccctgcccc ctctcccggc gggtccggag ccccccctac 23880
ctccgggggc tcgcccgcgt caccgctttt agatgcatca tccaaggaca cccccgcggc 23940
ccaccgcccg ccgcgcggta ccgtagtcgc gccgcgggga tgcggcctct tgcaagccat 24000
cgacgccgcc accaaccagc ccctggaaat taggtatcac ctggatctag cccgcgccct 24060
gacccgtcta tgcgaggtaa acctgcagga gctcccgcct gacctgacgc cgcgggagct 24120
ccagaccatg gacagctccc atctgcgcga tgttgtcatc aagctccgac cgccgcgcgc 24180
ggacatctgg actttgggct cgcgcggcgt ggtggtccga tccaccgtaa ctcccctcga 24240
gcagccagac ggtcaaggac aagcagccga agtagaagac caccagccaa acccgccagg 24300
cgaggggctc aaattcccac tctgcttcct tgtgcgcggt cgtcaggtca acctcgtgca 24360
ggatgtacag cccgtgcacc gctgccagta ctgcgcacgt ttttacaaaa gccagcacga 24420
gtgttcggcc cgtcgcaggg acttctactt tcaccacatc aatagccact cctccaattg 24480
gtggcgggag atccagttct tcccgatcgg ctcgcatcct cgcaccgagc gtctctttgt 24540
cacctacgat gtagagacct atacttggat gggggccttt gggaagcagc tcgtgccctt 24600
catgctggtc atgaagttcg gcggagatga gcctctagtg actgccgcgc gagacctagc 24660
cgcgaacctt ggatgggacc gctgggaaca agacccgctt accttctact gcatcacccc 24720
agaaaaaatg gccataggtc gccagtttag gacctttcgc gaccacctgc aaatgctaat 24780
ggcccgtgac ctgtggagct cattcgtcgc ttccaaccct catcttgcag actgggccct 24840
ttcagagcac gggctcagct cccctgaaga gctcacctac gaggaactta aaaaattgcc 24900
ttccatcaag ggcatcccgc gcttcttgga actttacatt gtgggccaca acatcaacgg 24960
ctttgacgag atcgtgctcg ccgcccaggt aattaacaac cgttccgagg tgccgggacc 25020
cttccgcatc acacgcaact ttatgcctcg cgcgggaaag atactcttca acgatgtcac 25080
cttcgccctg ccaaatccgc gttccaaaaa gcgcacggac tttttgctct gggagcaggg 25140
cggatgcgac gacactgact tcaaatacca gtacctcaaa gtcatggtca gggacacctt 25200
tgcgctcacc cacacctcgc tccggaaggc cgcgcaggca tacgcgctac ccgtagaaaa 25260
gggatgctgc gcctaccagg ccgtcaacca gttctacatg ctaggctctt accgttcgga 25320
ggccgacggg tttccgatcc aagagtactg gaaagaccgc gaagagtttg tcctcaaccg 25380
cgagctgtgg aaaaaaaagg gacaggataa gtatgacatc atcaaggaaa ccctggacta 25440
ctgcgcccta gacgtgcagg tcaccgccga gctggtcaac aagctgcgcg actcctacgc 25500
ctccttcgtg cgtgacgcgg taggtctcac agacgccagc ttcaacgtct tccagcgtcc 25560
aaccatatca tccaactcac atgccatctt caggcagata gtcttccgag cagagcagcc 25620
cgcccgtagc aacctcggtc ccgacctcct cgctccctcg cacgaactat acgattacgt 25680
gcgcgccagc atccgcggtg gaagatgcta ccctacatat cttggaatac tcagagagcc 25740
cctctacgtt tacgacattt gcggcatgta cgcctccgcg ctcacccacc ccatgccatg 25800
gggtccccca ctcaacccat acgagcgcgc gcttgccgcc cgcgcatggc agcaggcgct 25860
agacttgcaa ggatgcaaga tagactactt cgacgcgcgc ctgctgcccg gggtctttac 25920
cgtggacgca gaccccccgg acgagacgca gctagacccc ctaccgccat tctgctcgcg 25980
caagggcggc cgcctctgct ggaccaacga gcgcctacgc ggagaggtag ccaccagcgt 26040
tgaccttgtc accctgcaca accgcggttg gcgcgtgcac ctggtgcccg acgagcgcac 26100
caccgtcttt cccgaatggc ggtgcgttgc gcgcgaatac gtgcagctaa acatcgcggc 26160
caaggagcgc gccgatcgcg acaaaaacca aaccctgcgc tccatcgcca agttgctgtc 26220
caacgccctc tacgggtcgt ttgccaccaa gcttgacaac aaaaagattg tcttttctga 26280
ccagatggat gcggccaccc tcaaaggcat caccgcgggc caggtgaata tcaaatcctc 26340
ctcgtttttg gaaactgaca atcttagcgc agaagtcatg cccgcttttc agagggagta 26400
ctcaccccaa cagctggccc tcgcagacag cgatgcggaa gagagtgagg acgaacgcgc 26460
ccccaccccc ttttatagcc ccccttcagg aacacccggt cacgtggcct acacctacaa 26520
accaatcacc ttccttgatg ccgaagaggg cgacatgtgt cttcacaccc tggagcgagt 26580
ggacccccta gtggacaacg accgctaccc ctcccactta gcctccttcg tgctggcctg 26640
gacgcgagcc tttgtctcag agtggtccga gtttctatac gaggaggacc gcggaacacc 26700
gctcgaggac aggcctctca agtctgtata cggggacacg gacagccttt tcgtcaccga 26760
gcgtggacac cggctcatgg aaaccagagg taagaaacgc atcaaaaagc atgggggaaa 26820
cctggttttt gaccccgaac ggccagagct cacctggctc gtggaatgcg agaccgtctg 26880
cggggcctgc ggcgcggatg cctactcccc ggaatcggta tttctcgcgc ccaagctcta 26940
cgccctcaaa agtctgcact gcccctcgtg cggcgcctcc tccaagggca agctgcgcgc 27000
caagggccac gccgcggagg ggctggacta tgacaccatg gtcaaatgct acctggccga 27060
cgcgcagggc gaagaccggc agcgcttcag caccagcagg accagcctca agcgcaccct 27120
ggccagcgcg cagcccggag cgcacccctt caccgtgacc cagactacgc tgacgaggac 27180
cctgcgcccg tggaaagaca tgaccctggc ccgtctggac gagcaccgac tactgccgta 27240
cagcgaaagc cgccccaacc cgcgaaacga ggagatatgc tggatcgaga tgccgtagag 27300
caggtgaccg agctgtggga ccgcctggaa ctgcttggtc aaacgctcaa aagcatgcct 27360
acggcggacg gtctcaaacc gttgaaaaac tttgcttcct tgcaagaact gctatcgctg 27420
ggcggcgagc gccttctggc ggatttggtc agggaaaaca tgcgagtcag ggacatgctt 27480
aacgaagtgg cccccctgct cagggatgac ggcagctgca gctctcttaa ctaccagttg 27540
cagccggtaa taggtgtgat ttacgggccc accggctgcg gtaagtcgca gctgctcagg 27600
aacctgcttt cttcccagct gatctcccct accccggaaa ccgttttctt catcgccccg 27660
caggtagaca tgatcccccc atctgaactc aaagcgtggg aaatgcaaat ctgtgagggt 27720
aactacgccc ctgggccgga tggaaccatt ataccgcagt ctggcaccct ccgcccgcgc 27780
tttgtaaaaa tggcctatga cgatctcatc ctggaacaca actatgacgt tagtgatccc 27840
agaaatatct tcgcccaggc cgccgcccgt gggcccattg ccatcattat ggacgaatgc 27900
atggaaaatc ttggaggtca caagggcgtc tccaagttct tccacgcatt tccttctaag 27960
ctacatgaca aatttcccaa gtgcaccgga tacactgtgc tggtggttct gcacaacatg 28020
aatccccgga gggatatggc tgggaacata gccaacctaa aaatacagtc caagatgcat 28080
ctcatatccc cacgtatgca cccatcccag cttaaccgct ttgtaaacac ttacaccaag 28140
ggcctgcccc tggcaatcag cttgctactg aaagacattt ttaggcacca cgcccagcgc 28200
tcctgctacg actggatcat ctacaacacc accccgcagc atgaagctct gcagtggtgc 28260
tacctccacc ccagagacgg gcttatgccc atgtatctga acatccagag tcacctttac 28320
cacgtcctgg aaaaaataca caggaccctc aacgaccgag accgctggtc ccgggcctac 28380
cgcgcgcgca aaacccctaa ataaagacag caagacactt gcttgatcca aatccaaaca 28440
gagtctggtt ttttatttat gttttaaacc gcattgggag gggaggaagc cttcagggca 28500
gaaacctgct ggcgcagatc caacagctgc tgagaaacga cattaagttc ccgggtcaaa 28560
gaatttaaat tctactcgct ggcactcaag agtggcctct tgaggaactc accgggtata 28620
aatacactac acgtcagctg actataataa taaaacgcca actttgaccc ggaacgcgga 28680
aaacacctga gaaaaacacc tgggcgagtc tccacgtaaa cggtcaaagt ccccgcggcc 28740
ctagacaaat attacgcgct atgagtaaca caaaattatt cagatttcac ttcctcttat 28800
tcagttttcc cgcgaaaatg gccaaatctt actcggttac gcccaaattt actacaacat 28860
ccgcctaaaa ccgcgcgaaa attgtcactt cctgtgtaca ccggcgcaca ccaaaaacgt 28920
cacttttgcc acatccgtcg cttacatgtg ttccgccaca cttgcaacat cacacttccg 28980
ccacactact acgtcacccg ccccgttccc acgccccgcg ccacgtcaca aactccaccc 29040
cctcattatc atattggctt caatccaaaa taaggtatat tattgatgat gataagctat 29100
caaacatgag aattcggcgc gccattatca tttgcgggtc ctttccggcg atccgccttg 29160
ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt 29220
ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg 29280
aaacgacagg tgctgaaagc gagctttttg gcctctgtcg tttcctttct ctgtttttgt 29340
ccgtggaatg aacaacgcgc ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 29400
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgccagggt 29460
ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg 29520
agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat 29580
ggtggttgac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga 29640
gatatccgca ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc ccagcgccat 29700
ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt 29760
ttgttgaaaa ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg gctgaatttg 29820
attgcgagtg agatatttat gccagccagc cagacgcaga cgcgccgaga cagaacttaa 29880
tgggcccgct aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct ccacgcccag 29940
tcgcgtaccg tcttcatggg agaaaataat actgttgatg ggtgtctggt cagagacatc 30000
aagaaataac gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca gcaatggcat cctggtcatc 30060
cagcggatag ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg agaagattgt gcaccgccgc 30120
tttacaggct tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc accacgctgg cacccagttg 30180
atcggcgcga gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg ccagactgga 30240
ggtggcaacg ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt tgttgtgcca cgcggttggg 30300
aatgtaattc agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg cagaaacgtg 30360
gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac 30420
atcgtataac gttactggtt tcacattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta 30480
tcatgccata ccgcgaaagg ttttgcacca ttcacctgca caccgcgcct taattaagaa 30540
ttccgtgtat tctatagtgt cacctaaatc gtatgtgtat gatacataag gttatgtatt 30600
aattgtagcc gcgttctaac gacaatatgt acaagcctaa ttgtgtagca tctggcttac 30660
tgaagcagac cctatcatct ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg gttggacgaa 30720
ccttctgagt ttctggtaac gccgttccgc accccggaaa tggtcagcga accaatcagc 30780
agggtcatcg ctagccagat cctctacgcc ggacgcatcg tggccaaaag gatctaggtg 30840
aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 30900
gcgtcagacc ccttaataag atgatcttct tgagatcgtt ttggtctgcg cgtaatctct 30960
tgctctgaaa acgaaaaaac cgccttgcag ggcggttttt cgaaggttct ctgagctacc 31020
aactctttga accgaggtaa ctggcttgga ggagcgcagt caccaaaact tgtcctttca 31080
gtttagcctt aaccggcgca tgacttcaag actaactcct ctaaatcaat taccagtggc 31140
tgctgccagt ggtgcttttg catgtctttc cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 31200
taaggcgcag cggtcggact gaacgggggg ttcgtgcata cagtccagct tggagcgaac 31260
tgcctacccg gaactgagtg tcaggcgtgg aatgagacaa acgcggccat aacagcggaa 31320
tgacaccggt aaaccgaaag gcaggaacag gagagcgcac gagggagccg ccagggggaa 31380
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacca ctgatttgag cgtcagattt 31440
cgtgatgctt gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgg ctttgccgcg gccctctcac 31500
ttccctgtta agtatcttcc tggcatcttc caggaaatct ccgccccgtt cgtaagccat 31560
ttccgctcgc cgcagtcgaa cgaccgagcg tagcgagtca gtgagcgagg aagcggaata 31620
tatcctgtat cacatattct gctgacgcac cggtgcagcc ttttttctcc tgccacatga 31680
agcacttcac tgacaccctc atcagtgcca acatagtaag ccagtataca ctccgctagc 31740
gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat 31800
catccagcca gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt 31860
tggtgatttt gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga 31920
tctgatcctt caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccacgtt gtgtctcaaa 31980
atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg 32040
cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 32100
cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg 32160
ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag 32220
agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca 32280
gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 32340
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag 32400
aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ctgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 32460
tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 32520
aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 32580
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcata 32619
<210> 6
<211> 40402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 180
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 240
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 300
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 360
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 420
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 480
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 540
cagacctcag cgctcaaaga tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca 600
tccggcagtt caacagatcg ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt 660
gatgtcattc tggtgaagaa gctcgaccgt cttggccgcg acacgccgac atgatccaac 720
tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta 780
ccgacggtga tatggggcaa atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca caggctgaac 840
gccggaggat cctagagcgc acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg aaaggaatca 900
aatttggccg caggcgtacc gtggacagga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 960
gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 1020
gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 1080
cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 1140
gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 1200
tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1260
aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1320
tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 1380
tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgatcgatta attaacgacc catcatcaat 1440
aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg 1500
gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg taggttttag ggcggagtaa cttgtatgtg 1560
ttgggaattg tagttttctt aaaatgggaa gttacgtaac gtgggaaaac ggaagtgacg 1620
atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt 1680
tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc 1740
tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt 1800
tttttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa 1860
tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaattc aaaattttat 1920
cgtactagtg gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 1980
cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc 2040
gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 2100
gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 2160
ccagaacaca gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta 2220
cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct 2280
cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc 2340
cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc 2400
ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt 2460
gaccggcgcc tacggatccg ccaccatgga cttcatcctg aacatcagca tgaagatgga 2520
ggtgatcttc aagaccgacc tgcggagcag cagccaggtg gtgttccacg ccgggagcct 2580
gtacaactgg ttcagcgtgg agatcattaa cagcggccgg attgtgacca ccgccattaa 2640
gaccctcctg tccaccgtga agtacgacat cgtcaaaagc gccaggattt atgccggcca 2700
gggctacacc gaacaccagg cccaggagga gtggaacatg atcctgcacg tgctgttcga 2760
ggaagagacc gagagcagcg ccagcagcga gaacatccac gagaagaacg ataatgagac 2820
aaacgaatgc accagcagct tcgagacact gttcgaacag gaaccctcta gcgaggtgcc 2880
aaaggacagc aagctgtaca tgctggccca gaagaccgtg cagcacattg agcagtacgg 2940
caaagccccc gacttcaaca aggtgatccg cgcccacaac ttcatccaga ccatctacgg 3000
cacccccctg aaagaggaag aaaaagaagt ggtgaggctc atggtgatca aactgctgaa 3060
gaagattagc ttttacctga cctacatcta cccctacgac gtgcccgact acgccggaag 3120
cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc 3180
tatggacagc gagttcttcc agcccgtgta cccccgccac tacggagagt gcctgagccc 3240
cgtgaccacc cccagcttct tcagcacaca catgtacacc atcctgatcg ccatcgtggt 3300
gctggtgatt atcatcatcg tcctgatcta cctgttcagc tctcgcaaga aaaaggccgc 3360
tgccatcgaa gaggaggaca tccagttcat caacccctac caggaccagc agtgggtgga 3420
agtgaccccc cagcccggca ccagcaagcc tgctggagcc accaccgcca gcgtgggaaa 3480
acccgtgacc ggccgccccg ctaccaacag acccgctacc aataagcccg tgaccgacaa 3540
ccccgtcacc gaccgcctcg tgatggccac cggcggacca gctgccgctc ctgctgctgc 3600
tagcgcccct gctcaccccg ctgagccata caccaccgtg accacccaga acaccgccag 3660
ccagaccatg agcgccattg agaatctccg ccagcgcaat acatataccc acaaagacct 3720
ggaaaactcc ctctaactcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgat 3780
aatcatctct tgtacatgtc ccactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg 3840
gggcatggac attgaccctt ataaagaatt tggagctact gtggagttac tctcgttttt 3900
gccttctgac ttctttcctt ccgtcagaga tctcctagac accgcctcag ctctgtatcg 3960
agaagcctta gagtctcctc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagcaattga 4020
aaaataaaca cgttgaaaca taacacaaac gattctttat tcttgggcaa tgtatgaaaa 4080
agtgtaagag gatgtggcaa atatttcatt aatgtagttg tggccagacc agtcccatga 4140
aaatgacata gagtatgcac ttggagttgt gtctcctgtt tcctgtgtac cgtttagtgt 4200
aatggttagt gttacaggtt tagttttgtc tccgtttaag taaacttgac tgacaatgtt 4260
acttttggca gttttaccgt gagattttgg ataagctgat aggttaggca taaatccaac 4320
agcgtttgta taggctgtgc cttcagtaag atctccattt ctaaagttcc aatattctgg 4380
gtccaggaag gaattgttta gtagcactcc attttcgtca aatcttataa taagatgagc 4440
actttgaact gttccagata ttggagccaa actgccttta acagccaaaa ctgaaactgt 4500
agcaagtatt tgactgccac attttgttaa gaccaaagtg agtttagcat ctttctctgc 4560
atttagtcta cagttaggag atggagctgg tgtggtccac aaagttagct tatcattatt 4620
tttgtttcct actgtaatgg cacctgtgct gtcaaaacta aggccagttc ctagtttagg 4680
aaccatagcc ttgtttgaat caaattctag gccatggcca atttttgttt tgaggggatt 4740
tgtgtttggt gcattaggtg aaccaaattc aagcccatct cctgcattaa tggctatggc 4800
tgtagcgtca aacatcaacc ccttggcagt gcttaggtta acctcaagct ttttggaatt 4860
gtttgaagct gtaaacaagt aaaggccttt gttgtagtta atatccaagt tgtgggctga 4920
gtttataaaa agagggccct gtcctagtct tagatttagt tggttttgag catcaaacgg 4980
ataactaaca tcaagtataa ggcgtctgtt ttgagaatca atccttagtc ctcctgctac 5040
attaagttgc atattgcctt gtgaatcaaa acccaaggct ccagtaactt tagtttgcaa 5100
ggaagtatta ttaatagtca cacctggacc agttgctacg gtcaaagtgt ttaggtcgtc 5160
tgttacatgc aaaggagccc cgtactttag tcctagtttt ccattttgtg tataaatggg 5220
ctctttcaag tcaatgccca agctaccagt ggcagtagtt agagggggtg aggcagtgat 5280
agtaagggta ctgctatcgg tggtggtgag ggggcctgat gtttgcaggg ctagctttcc 5340
ttctgacact gtgaggggtc cttgggtggc aatgctaagt ttggagtcgt gcacggttag 5400
cggggcctgt gattgcatgg tgagtgtgtt gcccgcgacc attagaggtg cggcggcagc 5460
cacagttagg gcttctgagg taactgtgag gggtgcagat atttccaggt ttatgtttga 5520
cttggttttt ttgagaggtg ggctcacagt ggttacattt tgggaggtaa ggttgccggc 5580
ctcgtccaga gagaggccgt tgcccatttt gagcgcaagc atgccattgg aggtaactag 5640
aggttcggat aggcgcaaag agagtacccc agggggactc tcttgaaacc cattggggga 5700
tacaaaggga ggagtaagaa aaggcacagt tggaggaccg gtttccgtgt catatggata 5760
cacggggttg aaggtatctt cagacggtct tgcgcgcttc atctgcaaca acatgaagat 5820
agtgggtgcg gatggacagg aacaggagga aactgacatt ccatttagat tgtggagaaa 5880
gtttgcagcc aggaggaagc tgcaatacca gagctgggag gagggcaagg aggtgctgct 5940
gaataaactg gacagaaatt tgctaactga ttttaagtaa gtgatgcttt attatttttt 6000
tttattagtt aaagggaata agatctttga gaccgcacag ggtcttaata agggtgcaga 6060
gatcctcagg tccttgacaa ggtgagtgaa tgcagccttc ggtttctacc gagtgctgag 6120
ttatggtaat gggcttttct cccaccatga ccaccaattt ctgacgcttg gttggcaact 6180
tgtagctaag gcggtgtccg gtggtattac tgtcgtaggt gactttggcc tgctttacca 6240
gacaaaagat accccttttg cactggtgca agttaaccat gtcttggagc tcttgattca 6300
tgcgctgttg ctcggccgct gccctgcgtc tttctagcag gcgctgctct gtaataattc 6360
cgtccatttc tagctagaga aacctgaatt agaatagccc gtagagttgc ttgaattgtt 6420
cataaacccc acagtagctg cgcctttggc ctaataccct aagggttttc taagctcacc 6480
tcctgttctg gtaaacagag ttattgaggt ctgtccggaa aaagtctggt ttacggtcag 6540
gcggtaggtg tggtgcagcg gccggtgacg cactcgtacg ttcccggcag gtaaggaggg 6600
tggtgttttt tctgatggag tagctgagct cggagaggtt ctctcgtaga ctcactccgt 6660
ctgggttgaa actgttgtaa atcacagagg gagagatgtt aaaagtacca ggtaaggttc 6720
gccttggttt gcttgggcgg gtgaagacgg tggcgtttac aggatggcga taggagcccc 6780
agtatatttt aatttctgta tttattatac tcagcacaga gatggcaaca aagatcttga 6840
tgtaatccag ggttaggaca gttgcaaatc acagtgagaa cacagggtcc cctgtcccgc 6900
tcaactagca gggggcgctg ggtaaactcc cgaatcaggc tacgggcaag ctctccctgg 6960
gcggtaagcc ggacgccgtg cgccgggccc tcgatatgat cctcgggcaa ttcaaagtag 7020
caaaactcac cggagtcgcg ggcaaagcac ttgtggcggc gacagtggac caggtgtttc 7080
aggcgcagtt gctctgcctc tccacttaac attcagtcgt agccgtccgc cgagtccttt 7140
accgcgtcaa agttaggaat aaattgatcc ggatagtggc cgggaggtcc cgagaagggg 7200
ttaaagtaga ccgatggcac aaactcctca ataaattgca gagttccaat gcctccagag 7260
cgcggctcag aggacgaggt ctgcagagtt aggattgcct gacgaggcgt gaatgaagag 7320
cggccggcgc cgccgatctg aaatgtcccg tccggacgga gaccaagcga ggagctcacc 7380
gactcgtcgt tgagctgaat acctcgccct ctgattgtca ggtgagttat accctgcccg 7440
ggcgaccgca ccctgtgacg aaagccgccc gcaagctgcg cccctgagtt agtcatctga 7500
acttcggcct gggcgtctct gggaagtacc acagtggtgg gagcgggact ttcctggtac 7560
accagggcag cgggccaact acggggatta aggttattac gaggtgtggt ggtaatagcc 7620
gcctgttcca ggagaattcg gtttcggtgg gcgcgtattc cgttgacccg ggatatcatg 7680
tggggtcccg cgctcatgta gtttattcgg gttgagtagt cttgggcagc tccagccgca 7740
agtcccattt gtggctggta actccacatg tagggcgtgg gaatttcctt gctcataatg 7800
gcgctgacaa caggtgctgg cgccgggtgt ggccgctgga gatgacgtag ttttcgcgct 7860
taaatttgag aaagggcgcg aaactagtcc ttaagagtca gcgcgcagta tttactgaag 7920
agagcctccg cgtcttccag cgtgcgccga agctgatctt cgcttttgtg atacaggcag 7980
ctgcgggtga gggatcgcag agacctgttt tttattttca gctcttgttc ttggcccctg 8040
ctctgttgaa atatagcata cagagtggga aaaatcctgt ttctaagctc gcgggtcgat 8100
acgggttcgt tgggcgccag acgcagcgct cctcctcctg ctgctgccgc cgctgtggat 8160
ttcttgggct ttgtcagagt cttgctatcc ggtcgccttt gcttctgtgt ggccgctgct 8220
gttgctgccg ctgccgccgg tgcagtatgg gctgtagaga tgacggtagt aatgcaggat 8280
gttacggggg aaggccacgc cgtgatggta gagaagaaag cggcgggcga aggagatgtt 8340
gcccccacag tcttgcaagc aagcaactat ggcgttcttg tgcccgcgcc atgagcggta 8400
gccttggcgc tgttgttgct cttgggctaa cggcggcggc tgcttggact taccggccct 8460
ggttccagtg gtgtcccatc tacggttggg tcggcgaacg ggcagtgccg gcggcgcctg 8520
aggagcggag gttgtagcca tgctggaacc ggttgccgat ttctggggcg ccggcgaggg 8580
gaatgcgacc gagggtgacg gtgtttcgtc tgacacctct tcgacctcgg aagcttcctc 8640
gtctaggctc tcccagtctt ccatcatgtc ctcctcctcc tcgtccaaaa cctcctctgc 8700
ctgactgtcc cagtattcct cctcgtccgt gggtggcggc ggcagctgca gcttcttttt 8760
gggtgccatc ctgggaagca agggcccgcg gctgctgctg atagggctgc ggcggcgggg 8820
ggattgggtt gagctcctcg ccggactggg ggtccaagta aaccccccgt ccctttcgta 8880
gcagaaactc ttggcgggct ttgttgatgg cttgcaattg gccaagaatg tggccctggg 8940
taatgacgca ggcggtaagc tccgcattag gcgggcggga ttggtcttcg tagaacctaa 9000
tctcgtgggc gtggtagtcc tcaggtacaa atttgcgaag gtaagccgac gtccacagcc 9060
ccggagtgag tttcaacccc ggagccgcgg acttttcgtc aggcgaggga ccctgcagct 9120
caaaggtacc gataatttga ctttcgttaa gcagctgcga attgcaaacc agggagcggt 9180
gcggggtgca taggttgcag cgacagtgac actccagtag accgtcaccg ctcacgtctt 9240
ccattatgtc agagtggtag gcaaggtagt tggctagctg cagaaggtag cagtggcccc 9300
aaagcggcgg agggcattcg cggtacttaa tgggcacaaa gtcgctagga agtgcacagc 9360
aggtggcggg caagattcct gagcgctcta ggataaagtt cctaaagttc tgcaacatgc 9420
tttgactggt gaagtctggc agaccctgtt gcagggtttt aagcaggcgt tcggggaaaa 9480
tgatgtccgc caggtgcgcg gccacggagc gctcgttgaa ggccgtccat aggtccttca 9540
agttttgctt tagcagtttc tgcagctcct tgaggttgca ctcctccaag cactgctgcc 9600
aaacgcccat ggccgtctgc caggtgtagc atagaaataa gtaaacgcag tcgcggacgt 9660
agtcgcggcg cgcctcgccc ttgagcgtgg aatgaagcac gttttgccca aggcggtttt 9720
cgtgcaaaat tccaaggtag gagaccaggt tgcagagctc cacgttggag atcttgcagg 9780
cctggcgtac gtagccctgt cgaaaggtgt agtgcaatgt ttcctctagc ttgcgctgca 9840
tctccgggtc agcaaagaac cgctgcatgc actcaagctc cacggtaacg agcactgcgg 9900
ccatcattag tttgcgtcgc tcctccaagt cggcaggctc gcgcgtttga agccagcgcg 9960
ctagctgctc gtcgccaact gcgggtaggc cctcctctgt ttgttcttgc aaatttgcat 10020
ccctctccag gggctgcgca cggcgcacga tcagctcact catgactgtg ctcatgacct 10080
tggggggtag gttaagtgcc gggtaggcaa agtgggtgac ctcgatgctg cgttttagta 10140
cggctaggcg cgcgttgtca ccctcgagtt ccaccaacac tccagagtga ctttcatttt 10200
cgctgttttc ctgttgcaga gcgtttgccg cgcgcttctc gtcgcgtcca agaccctcaa 10260
agatttttgg cacttcgttg agcgaggcga tatcaggtat gacagcgccc tgccgcaagg 10320
ccagctgctt gtccgctcgg ctgcggttgg cacggcagga taggggtatc ttgcagtttt 10380
ggaaaaagat gtgataggtg gcaagcacct ctggcacggc aaatacgggg tagaagttga 10440
ggcgcgggtt gggctcgcat gtgccgtttt cttggcgttt ggggggtacg cgcggtgaga 10500
ataggtggcg ttcgtaggca aggctgacat ccgctatggc gaggggcaca tcgctgcgct 10560
cttgcaacgc gtcgcagata atggcgcact ggcgctgcag atgcttcaac agcacgtcgt 10620
ctcccacatc taggtagtcg ccatgccttt cgtccccccg cccgacttgt tcctcgtttg 10680
cctctgcgtt gtcctggtct tgctttttat cctctgttgg tactgagcgg tcctcgtcgt 10740
cttcgcttac aaaacctggg tcctgctcga taatcacttc ctcctcctca agcgggggtg 10800
cctcgacggg gaaggtggta ggcgcgttgg cggcatcggt ggaggcggtg gtggcgaact 10860
cagagggggc ggttaggctg tccttcttct cgactgactc catgatcttt ttctgcctat 10920
aggagaagga aacttgtatg tgttgggaat tgtagttttc ttaaaatggg aagttacgta 10980
acgtgggaaa acggaagtga cgatttgagg aagttgtggg ttttttggct ttcgtttctg 11040
ggcgtaggtt cgcgtgcggt tttctgggtg ttttttgtgg actttaaccg ttacgtcatt 11100
ttttagtcct atatatactc gctctgcact tggccctttt ttacactgtg actgattgag 11160
ctggtgccgt gtcgagtggt gtttttttaa taggttttct tttttactgg taaggctgac 11220
tgttatgact acgtccggcg ttccatttgg catgacacta cgaccaacac gatctcggtt 11280
gtctcggcgc actccgtaca gtagggatcg tctacctcct tttgagacag aaacccgcgc 11340
taccatactg gaggatcatc cgctgctgcc cgaatgtaac actttgacaa tgcacaacgt 11400
gagttacgtg cgaggtcttc cctgcagtgt gggatttacg ctgattcagg aatgggttgt 11460
tccctgggat atggttctaa cgcgggagga gcttgtaatc ctgaggaagt gtatgcacgt 11520
gtgcctgtgt tgtgccaaca ttgatatcat gacgagcatg atgatccatg gttacgagtc 11580
ctgggctctc cactgtcatt gttccagtcc cggttccctg cagtgtatag ccggcgggca 11640
ggttttggcc agctggttta ggatggtggt ggatggcgcc atgtttaatc agaggtttat 11700
atggtaccgg gaggtggtga attacaacat gccaaaagag gtaatgttta tgtccagcgt 11760
gtttatgagg ggtcgccact taatctacct gcgcttgtgg tatgatggcc acgtgggttc 11820
tgtggtcccc gccatgagct ttggatacag cgccttgcac tgtgggattt tgaacaatat 11880
tgtggtgctg tgctgcagtt actgtgctga tttaagtgag atcagggtgc gctgctgtgc 11940
ccggaggaca aggcgcctta tgctgcgggc ggtgcgaatc atcgctgagg agaccactgc 12000
catgttgtat tcctgcagga cggagcggcg gcggcagcag tttattcgcg cgctgctgca 12060
gcaccaccgc cctatcctga tgcacgatta tgactctacc cccatgtaga ctagggttct 12120
gtgagtttga ttaaggtacg gtgatctgta taagctatgt ggtggtgggg ctatactact 12180
gaatgaaaaa tgacttgaaa ttttctgcaa ttgaaaaata aacacgttga aacataacac 12240
aaacgatacg gcgcagacgg caagggtggg ggtaaataat cacccgagag tgtacaaata 12300
aaagcatttg cctttattga aagtgtctct agtacattat ttttacatgt ttttcaagtg 12360
acaaaaagaa gtggcgctcc taatctgcgc actgtggctg cggaagtagg gcgagtggcg 12420
ctccaggaag ctgtagagct gttcctggtt gcgacgcagg gtgggctgta cctggggact 12480
gttgagcatg gagttgggta ccccggtaat aaggttcatg gtggggttgt gatccatggg 12540
agtttggggc cagttggcaa aggcgtggag aaacatgcag cagaatagtc cacaggcggc 12600
cgagttgggc ccctgtacgc tttgggtgga cttttccagc gttatacagc ggtcggggga 12660
agaagcaatg gcgctacggc gcaggagtga ctcgtactca aactggtaaa cctgcttgag 12720
tcgctggtca gaaaagccaa agggctcaaa gaggtagcat gtttttgagt gcgggttcca 12780
ggcaaaggcc atccagtgta cgcccccagt ctcgcgaccg gccgtattga ctatggcgca 12840
ggcgagcttg tgtggagaaa caaagcctgg aaagcgcttg tcataggtgc ccaaaaaata 12900
tggcccacaa ccaagatctt tgacaatggc tttcagttcc tgctcactgg agcccatggc 12960
ggcagctgtt gttgatgttg cttgcttctt tatgttgtgg cgttgccggc cgagaagggc 13020
gtgcgcaggt acacggtttc gatgacgccg cggtgcggct ggtgcacacg gaccacgtca 13080
aagacttcaa acaaaacata aagaagggtg ggctcgtcca tgggatccac ctcaaaagtc 13140
atgtctagcg cgtgggcgga gttggcgtag agaaggtttt ggcccaggtc tgtgagtgcg 13200
cccatggaca taaagttact ggagaatggg atgcgccaaa gggtgcgatc gcaaagaaac 13260
tttttctggg taatgctgtc aactgcggtc ttgcctataa gcggataggg gaagttagca 13320
gggtaggcct gtccttcgcg catggtgggg gcaaggtagc caacaaatcc agagttgttg 13380
tgttggtgta ggatgcccac ctgttggtag tccttgtatt tagtatcatc caccacctga 13440
cggctcatgg gctggaagtt tctaaagaag gagtacatgc ggtccttgta gctctctggg 13500
atatagaagc cctggtagcc aatgttatag ttagctagca tttgtaccag gaaccagtct 13560
ttggtcatgt tacactgggc aacgttgtaa ccctccccgt caactgagcg cttaatttca 13620
aactcgttgg gggtaagcag gcggtcattg ccaggccagc tgacagaaga gtcaaaggta 13680
atggccacct tcttaaaggt gtggttgagg taaaaggttc catctaggta gggtatagag 13740
ccagagtagg tgtaataagg gtcgtagccc gagcccagtg atggggtttc cttagtctta 13800
aggcgcgtga aggcccagcc gcggaaagcc gcccagttgc gggaggggat ggatatgggc 13860
acgttggtag cgttggcggg tatagggtag agcatgttgg cggcggagag atagtcgtta 13920
aaggactggt cgttggtgtc gtttctaagc atggcctcaa gcgtggaggc ggtgttgtgg 13980
gccatgggga agaaggtggc gtaaaggcaa atgctatcaa acttaatgct ggctccgtca 14040
acccttaggt catttcctag ggagctctgc agaaccatgt taacatcctt cctgaagttc 14100
cactcgtagg tgtatgagcc cggcaggaga aggaggtttt taatggcaaa gaacttctga 14160
ggcacctgga tgtggaaggg cacatagcga ccattgccca gcaacattga gcggtagcgc 14220
aggccagcat tgcggtggtg gttaaatggg ttgacgttgt ccatatagtc aagggaccag 14280
cgtgctccaa ggttaatgta gcagtccact agcccgggag ccaccactcg cttgttcatg 14340
tagtcgtagg tgtttgggtt atcagaaatt tttacgttgg aaggactgta ctttagcttg 14400
tcgggcaaat acagcgctat gttggagtac aggaaatttc tccacaggtt ggcatttaga 14460
ttgatttcca tggcaaaatt atttccaact cttatttcat ttttatctga aaattctgta 14520
gcatcttttt cccatccatt ttcctgacct gttttaggtt ttaccttggt aagagtctct 14580
gtattaatca cacctcccag tggaaagcag taatttggaa gttcatcttc agttccatga 14640
ttttcaataa ttctaacatc tggatcatag ctgtcaacag cctgattcca catagaaaag 14700
tacctggttc tatcaccaat ggaatcaagc aaaagctggt atgaaagctc tgtgtttctg 14760
tcttgcaaat ctacaacagc attcaactgc gatgcttggc ccgccagaac acccatatta 14820
cccgtgctgt tgtaatacat tagaccaata aaattgtccc taaaagcaat gtaattaggc 14880
ctgttgggca tagattgttg gcccattagt tctcgtgagt taccttcctt aatagtgggc 14940
atgtaagaaa tatgagtgtc tggggtttct atatctacat cttcactgta caataccact 15000
ttaggagtca agttatcacc attgcctgcg gctgcctcag tagttgagaa aaattgcatt 15060
tccacttgac tttctagctt tccattttgt tgctttacaa gaatgccttg ccctccattt 15120
tcatttgtgg gttttgcata tgaaccgtaa catggtttca ttggggtagt cttttttagg 15180
actctcccag ctgcatgatt aatttctgtt tcgtaccact gagattctcc tatttgaggt 15240
tcaggttgaa atgttttatc ggcatattta ggtgtttgac cttcgacacc tatttgaata 15300
ccctcctttg taatatttat accagaataa ggcgcctgcc caaatacgtg agttttttgc 15360
tgctcagctt gctcgtctac ttcgtcttcg ttgtcatcgt cctcttcttc taggtttatt 15420
tcaagagcag tagcagcttc atcccattcg caaggatttg gggcaccctt gggagccagg 15480
gcgttgtagg cagtgccaga gtagggctta aaagtagggc ccctgtccag cacgccgcgg 15540
atgtcaaagt acgtggaagc catgtccagc acacggttat cacccacagc tagggtgaac 15600
cgcgccttgt acgagtacgc agtatcctca cggtccacag ggatgaaccg cagcgtcaaa 15660
cgctgggacc ggtctgtggt cacgtcgtgc gtaggcgcca ccgtggggtt tctaaacttg 15720
ttattcaggc tgaagtacgt ctcggtggcg cgggcaaact gcaccagccc ggggctcagg 15780
tactccgagg cgtcctggcc cgagatgtgc atgtaagacc actgcggcat catcgaaggg 15840
gtagccatct tggaaagcgg gcgcgcggcg gctcagcagc tcctctggcg gcgacatgga 15900
cgcatacatg acacacatac gacacgttag ctatcagaag catcgtcggc gcttcaggga 15960
ttgcaccccc agacccacga tgctgttcag tgtgctttgc cagttgccac tggctacggg 16020
ccgcaacgat cgcggaccgc tggcggcgcg gcgcagggac gcgcggctag gacgggttac 16080
aacaacggcg gtcgggcctg gcagcacagg tttctgctgg gtgtcggcgg ggggaggcag 16140
gtccagcgtt acgggtgtgt gctggcccag cactccggta gccatgggcg cgatgggacg 16200
ggtggtgggc aggccttgct ttagtgcctc ctcgtacgag ggaggctcgt ctatttgcgt 16260
caccagagtt tcttccctgt cggggcgcgg acgcttttcg ccacgcccct ctggagacac 16320
tgtctccacg gccggtggag gctcctctac gggagggcgg ggatcaagct tactgttaat 16380
cttattttgc actgcctggt tggccaggtc caccaccccg ctaatgccag aggccaggcc 16440
atctaccacc ttttgttgga aattttgctc tttcaactta tccctcagca tctggcctgt 16500
gctgctgttc caggccttgc tgccatagtt cttaacggtg gaaccgaaat ttttaatgcc 16560
gctccacagc gagccccagc tgaaggcgcc accgctcata ttgctggtgc cgatatcttg 16620
ccagtttccc atgaacgggc gcgagccgtg tcgcggggcc agagacgcaa agttgatgtc 16680
ttccattcta caaaatagtt acaggaccaa gcgagcgtga gagtccagac tttttatttt 16740
gatttttcca catgcaactt gtttttaatc agtgtctctg cgcctgcaag gccacggatg 16800
caattccggg cacggcgcca atcgccgcgg cgatcagtgg aataaggagg ggcaggatac 16860
cgccgcgcat gcgacggtgc gacgcgcgcc gccgccggtg gtgcgcacga cgcatgccgc 16920
ccgtcaggcc gtggccggcc atgcccctcc tacggtgcat tcttcctcgg aatcccggca 16980
ccgggaaacg gaggcggcag gtgagggcca tatctgcaag aaccacaaag accggctttt 17040
aaacgatgct ggggtggtag cgcgctgttg gcagcaccag ggtcctgcct ccttcgcgag 17100
ccaccctgcg cacggaaatc ggggccagca cgggctggcg acggcgacgg cggcggcggg 17160
ttccagtggt ggttcggcgt cgggtagttg ctcgtcttct ggggcggtag gtgtagccac 17220
gatagccggg ggtaggcgca atggaaggat gtagggcata ttcgggcagt agcgcgctgg 17280
cggcgccgta cttcctcgaa cggcgcgggc gccggggggc tgaaacgcga aacatccacg 17340
ggtccgtttg cacctccgta gaggtcttgg acgcggccgc agcgaccgcc tgcaccgcgg 17400
catccgccac cgctgaggca accggggacg tttgtgtctc catgccctct gtggcggtgg 17460
caatactggt gctactggta gtgggtatct gaacgtccac ggtctgcacg cccagtcccg 17520
gcgccacctg cttgattggc cgcacgcgga cctcgggctc cagcccaggt tccacggtca 17580
ttttttccaa gacatcttcc agtcgctggc gcttgggtac catcagctgc acggtgggtg 17640
ccaagtcacc agactcgcgc tttaggccgc gcttttcttc ggacggtgca agcgcgggca 17700
gcacctgctg cagtgttacg ggctttaggc taggtgttgg gttgccctcg tccagcggca 17760
acgccagcat gtccttatgc cgctttccgt aggcaaactc cccgaggcgc tcgttggcct 17820
gctcaagcag gtcctcgtcg ccgtacacct catcatacac gcgcttgtag gtgcgggtgg 17880
agcgctcacc gggcgtaaag actacggtgg tgccgggtcg caaaacacgt tttacgcgtc 17940
gacctttcca ctgtacccgt cgcctgggcg cggtagcgtg cagcagttcc acctcgtcgt 18000
caagttcatc atcatcatct ttctttttct ttttgacccg ctttagcttt cggggcttgt 18060
aatcctgctc ttccttcttc ggggggccat agatctccgg cgcgatgacc tggagcatct 18120
cttctttgat tttgcgcttg gacatagctt cgttgcgcgc cgccgccgct ggatacatac 18180
aacagtacga gtctaagtag ttttttcttg caatctagtt gcgcgggggg cgggtgcgca 18240
cgggcacgcg caggccgcta accgagtcgc gcacccaata cacgttgccc ctgcgaccct 18300
gagtcatagc actaatggcc gcggctgctg cggcggccgc tcgtcgcctg gacctggggg 18360
gcacagtgac aatacccgcg gccagccttc gagcggcccg catggccgcc cgtcggccgg 18420
tgcgacgtgc gcggttaagc agggccgccg ccgcgcgttg ggcggcagtg ccgggtcggc 18480
ggcggtggcg acgtgctacg cgcctccgcc gtctcttcat tttagcatag cgccgggctc 18540
cgcgcaccac ggtctgaatg gccgcgtcca ctgtggacac tggtggcggc gtgggcgtgt 18600
agttgcgcgc ctcctccacc accgcgtcga tggcgtcatc gacggtggtg cgcccagtgc 18660
ggccgcgttt gtgcgcgccc cagggcgcgc ggtagtgccc gcgcacgcgc actgggtgtt 18720
ggtcggagcg cttcttggcc ccgccaaaca tcttgcttgg gaagcgcagg ccccagcctg 18780
tgttattgct gggcgatata aggatggaca tgcttgctca aaaagtgcgg ctcgatagga 18840
cgcgcggcga gactatgccc agggccttgt aaacgtaggg gcaggtgcgg cgtctggcgt 18900
cagtaatggt cactcgctgg actcctccga tgctgttgcg cagcggtagc gtcccgtgat 18960
ctgtgagagc aggaacgttt tcactgacgg tggtgatggt gggggctggc gggcgcgcca 19020
aaatctggtt ctcgggaaag cgattgaaca cgtgggtcag agaggtaaac tggcggatga 19080
gttgggagta gacggcctgg tcgttgtaga agctcttgga gtgcacgggc aacagctcgg 19140
cgcccaccac cggaaagttg ctgatctggc gcgtggagcg gaaggtcacg gggtcttgca 19200
tcatgtctgg caacgaccag tagacctgct ccgagccgca ggttacgtca ggagtgcaaa 19260
gcagggtcca tgagcggatt ccggtctgag ggtcgccgta gttgtatgca aggtaccagc 19320
tgcggtactg ggtgaaggtg ctgtcattgc ttattaggtt gtaactgcgt ttcttgctgt 19380
cctctgtcag gggtttgatc accggtttct tctgaggctt ctcgacctcg ggttgcgcag 19440
cgggggcggc agcttcggcc gctgcttcgg cctcagcgcg cttctcctca gcccgtgtgg 19500
caaaggtgtc gccgcgaatg gcatgatcgt tcatgtcctc caccggctgc attgccgcgg 19560
ctgccgcgtt ggagttctct tccgcgccgc tgccactgct gttgctgccg cctgcgccac 19620
ccccgccctg ttcggtgtca tctttcaagc tcgcctggta ggcgtccaca tccaacagtg 19680
cgggaatgtt accaccctcc agatcatcgt aggtgatcct aaagccctcc tggaagggtt 19740
gccgcttgcg gatgcccaac aagttgctca ggcggctgtg ggtgaagtcc accccgcatc 19800
ctggcagcaa aatgatgtct ggatggaagg cttcgtttgt atatacccca ggcatgacaa 19860
gaccagtgac ggggtcaaac cccagtctga agttgcgggt gtcaaacttt accccgatgt 19920
cgctttccag aaccccgttc tgtctgccca ctttcaagta gtgctccacg atcgcgttgt 19980
tcataaggtc tatggtcatg gtctcggagt agttgccctc gggcagcgtg aactccaccc 20040
actcgtattt cagctccacc tgattgtcct tagtaggcaa gcgcgacacc atcacccgcg 20100
ccttaaactt attggtaaac atgaactcgt tcacatttgg catgttggta tgcaggatgg 20160
ttttcaggtc gccgccccag tgcgaccggt cgtcaagatt gatggtctgt gtgcttgcct 20220
cccccgggct gtagtcattg ttttgaatga ccgtggtcag aaagttgctg tggtcgttct 20280
ggtagttcag ggatgccaca tccgttgact tgttgtccac caggtacaca cgggtggtgt 20340
cgaatagggg tgccaactca gagtaacgga tgctgtttct ccccccggta ggccgcaggt 20400
accgcggagg cacaaacggc gggtccaggg gagcatcgaa gggagaaccc agcgccgccg 20460
ccactggcgc cgcgctcacc acactctcgt aggagggagg aggaccttcc tcatacatcg 20520
ccgcgcgccg catactaagg ggaatacaag aaaaccaacg ctcggtgcca tggccttggt 20580
gagtttttta ttttgcatca tgcttttttt ttttttaaaa cattctcccc agcctggggc 20640
gaaggtgcgc aaacgggttg ccactccctc ccaaatccag gacgctgctg tcgtctgccg 20700
agtcatcgtc ctcccacacc agaccccgct gacggtcgtg cctttgacga cgggtgggcg 20760
ggcgcgggcc tggcacgtcc ctgtgctcct gcgcgtacgt cttccatcta ctcatcttgt 20820
ccactaggct ctctatcccg ttgttgggaa atgccggagg caggtttttt tcgcgctgcg 20880
gctgcagcag cgagttgttt aggtactcct cctcgcccag caggcgcggg cgggtggtgc 20940
gagtgctggt aagagaccct atcaagcttg gaaatgggct actagcatct gaccgcgggg 21000
ccgcagcgcc tagatcggac aagctgcttg gcctgcggaa gctttccttt cgcagcgccg 21060
cctctgcctg ctcgcgctgt tgcaactcta gcagggtctg cggttgcggg gaaaacacgc 21120
tgtcgtctat gtcgtcccag aggaatccat cgttaccctc gggcacctcg aatcccccgg 21180
tgtagaaacc agggggcggt agccagtgcg ggttcaagat ggcattggtg aaatactcgg 21240
ggttcacggc ggccgcgcga tgcaagtagt ccattaggcg gttgataaac ggccggtttg 21300
aggcatacat gcccggttcc atgttgcgcg cggtcatgtc cagcgccacg ctgggcgtta 21360
ccccgtcgcg catcaggtta aggctcacgc tctgctgcac gtagcgcaaa atgcgctcct 21420
cctcgctgtt taaactgtgc aacgagggga tcttctgccg ccggttggtc agcaggtagt 21480
ttagggttgc ctccaggctg cccgtgtcct cctgccccag cgcgcggctg acacttgtaa 21540
tctcctggaa agtatgctcg tccacatgcg cctgacctat ggcctcgcgg tacagtgtca 21600
gcaagtgacc taggtatgtg tcccgggaca cgctgccact gtccgtgaag ggcgctatta 21660
gcagcagcaa caggcgcgag ttgggcgtca gcaagctaga cacggtcgcg cggtcgcctg 21720
tgggagcccg caccccccac agcccctgca agtttttgaa agcctggctc aggtttacgg 21780
tctgcaggcc ttgtctactg gtctggaaaa aatagtctgg cccagactgg tacacctcac 21840
tttgcggtgt ctcagtcacc attagccgca gtgcgctcac aaagttggtg tagtcctcct 21900
gtccccgcgg cacgttggcg ggctgtgtac tcaggaaggc gtttagtgca accatggagc 21960
ccaggttgcc ctgctgctgc gcgcgctcac gctgcgccac ggcctcgcgc acatccccca 22020
ccagccggtc caggttggtc tgcacgttgc cgctgttgta acgagccacg cgctgaagca 22080
gcgcgtcgta gaccaggccg gcctcgtcgg gccggatggc cctgttttcg gccagcgcgt 22140
ttacgatcgc cagcaccttc tcgtgcgtgg ggtttgcgcg cgccgggacc accgcttcca 22200
gaattgcgga gagccggttg gcctgcggct gctgccggaa cgcgtcagga ttgcgcgcag 22260
tcagcgacat gatgcggtcc atgacctggc gccagtcgtc cgtggagtta aggccggacg 22320
gctggctctg cagcgccgcc cgcaccgccg ggtccgttgc gtcttgcatc atctgatcag 22380
aaacatcacc gcttagtact cgccgtcctc tggctcgtac tcatcgtcct cgtcatattc 22440
ctccacgccg ccgacgttgc cagcgcgcgc gggtgccacc gccagcccag gtccggcccc 22500
agctgcctcc agggcgcgtc ggcttggggc ccagcgcagg tcagcgcccg cgtcaaagta 22560
ggactcggcc tctctatcgc cgctgcccgt gccagccagg gccctttgca ggctgtgcat 22620
cagctcgcgg tcgctgagct cgcgccgccg gctcacgctc acggccttgt ggatgcgctc 22680
gttgcgataa acgcccaggt cgtcgctcaa ggtaagcacc ttcagcgcca tgcgcatgta 22740
gaacccctcg atctttacct ccttgtctat gggaacgtaa ggggtatggt atatcttgcg 22800
ggcgtaaaac ttgcccaggc taagcatgga atagttgatg gcggccacct tgtcagccag 22860
gctcaagctg cgctcctgca ccactatgct ctgcaggatg tttatcaaat cgagcagcca 22920
gcggccctcg ggctctacta tgtttagcag cgcatccctg aatgcctcgt tgtccctgct 22980
gtgctgcact ataaggaaca gctgcgccat gagcggcttg ctatttgggt tttgctccag 23040
cgcgcttaca aagtcccaca gatgcatcag tcctatagcc acctcctcgc gcgccacaag 23100
cgtacgcacg tggttgttaa agcttttttg aaagttaatc tcctggttca ccgtctgctc 23160
gtatgcggtt accaggtcgg cggccgccac gtgtgcgcgc gcgggactaa tcccggttcg 23220
cgcgtcgggc tcaaagtcct cctcgcgcag caaccgctcg cgattcaggc catgccgcag 23280
ctcgcgccct gcgtggaact ttcgatcccg catctcctcg ggctcctctc cctcgcggtc 23340
gcgaaacagg ttctgccgcg gcacgtacgc ctcacgcgta tcacgcttca gctgcaccct 23400
tgggtgccgc tcaggagagg gcgctcctag ccgcgccagg ccctcgccct cctccaagtc 23460
caggtagtgc cgggcccggc gccgcggggg ttcgtaatca ccatctgctg ccgcgtcaac 23520
cgcggatgtc gcccctcctg acgcggtagg aggaggggag ggtgccctgc atgtctgccg 23580
ctgctcttgc tcttgccgct gctgaggagg ggggcgcatc tgccgcagca ccggatgcat 23640
ctgggaaaag caaaaaaggg gctcgtccct gtttccggag gaatttgcaa gcggggtctt 23700
gcatgacggg gaggcaaacc cccgttcgcc gcagtccggc cggtccgaga ctcgaaccgg 23760
gggtcccgcg actcaaccct tggaaaataa ccctccggct acagggagcg agccacttaa 23820
tgctttcgct ttccagccta accgcttacg ctgcgcgcgg ccagtggcca aaaaagctag 23880
cgcagcagcc gccgcgcctg gaaggaagcc aaaaggagca ctcccccgtt gtctgacgtc 23940
gcacacctgg gttcgacacg cgggcggtaa ccgcatggat cacggcggac ggccggatac 24000
ggggctcgaa ccccggtcgt ccgccatgat acccttgcga atttatccac cagaccacgg 24060
aagagtgccc gcttacaggc tctccttttg cacgctagag cgtcaacgat tgcgcgcgcc 24120
tgaccggcca gagcgtcccg accatggagc actttttgcc gctgcgcaac atctggaacc 24180
gcgtccgcga ctttccgcgc gcctccacca ccgccgccgg catcacctgg atgtccaggt 24240
acatctacgg atatcatcgc cttatgttgg aagatctcgc ccccggagcc ccggccaccc 24300
tacgctggcc cctctaccgc cagccgccgc cgcacttttt ggtgggatac cagtacctgg 24360
tgcggacttg caacgactac gtatttgact cgagggctta ctcgcgtctc aggtacaccg 24420
agctctcgca gccgggtcac cagaccgtta actggtccgt tatggccaac tgcacttaca 24480
ccatcaacac gggcgcatac caccgctttg tggacatgga tgacttccag tctaccctca 24540
cgcaggtgca gcaggccata ttagccgagc gcgttgtcgc cgacctagcc ctgcttcagc 24600
cgatgagggg cttcggggtc acacgcatgg gaggaagagg gcgccaccta cggccaaact 24660
ccgccgccgc cgcagcgata gatgcaagag atgcaggaca agaggaagga gaagaagaag 24720
tgccggtaga aaggctcatg caagactact acaaagacct gcgccgatgt caaaacgaag 24780
cctggggcat ggccgaccgc ctgcgcattc agcaggccgg acccaaggac atggtgcttc 24840
tgtcgaccat ccgccgtctc aagaccgcct actttaatta catcatcagc agcacctccg 24900
ccagaaacaa ccccgaccgc cgcccgctgc cgcccgccac ggtgctcagc ctaccttgcg 24960
actgtgactg gttagacgcc tttctcgaga ggttttccga tccggtcgat gcggactcgc 25020
tcaggtccct cggcggcgga gtacctacac aacaattgtt gagatgcatc gttagcgccg 25080
tatccctgcc gcatggcagc cccccgccaa cccataaccg ggacatgacg ggcggcgtct 25140
tccaactgcg cccccgcgag aacggccgcg ccgtcaccga gaccatgcgc cgtcgccgcg 25200
gggagatgat cgagcgcttt gtcgaccgcc tcccggtgcg ccgtcgtcgc cgccgtgtcc 25260
cccctccccc accgccgcca gaagaagaag aaggggaggc ccttatggaa gaggagattg 25320
aagaagaaga agaggcccct gtagcctttg agcgcgaggt gcgcgacact gtcgccgagc 25380
tcatccgtct tctggaggag gagttaaccg tgtcggcgcg caactcccag tttttcaact 25440
tcgccgtgga cttctacgag gccatggagc gccttgaggc cttgggggat atcaacgaat 25500
ccacgttgcg acgctgggtt atgtacttct tcgtggcaga acacaccgcc accaccctca 25560
actacctctt tcagcgcctg cgaaactacg ccgtcttcgc ccggcacgtg gagctcaatc 25620
tcgcgcaggt ggtcatgcgc gcccgcgatg ccgaaggggg cgtggtctac agccgcgtct 25680
ggaacgaggg aggcctcaac gccttctcgc agctcatggc ccgcatttcc aacgacctcg 25740
ccgccaccgt ggagcgagcc ggacgcggag atctccagga ggaagagatc gagcagttca 25800
tggccgagat cgcctatcaa gacaactcag gagacgtgca ggagattttg cgccaggccg 25860
ccgtcaacga caccgaaatt gattctgtcg aactctcttt caggttcaag ctcaccgggc 25920
ccgtcgtctt cacgcagagg cgccagattc aggagatcaa ccgccgcgtc gtcgcgttcg 25980
ccagcaacct acgcgcgcag caccagctcc tgcccgcgcg cggcgccgac gtgcccctgc 26040
cccctctccc ggcgggtccg gagccccccc tacctccggg ggctcgcccg cgtcaccgct 26100
tttagatgca tcatccaagg acacccccgc ggcccaccgc ccgccgcgcg gtaccgtagt 26160
cgcgccgcgg ggatgcggcc tcttgcaagc catcgacgcc gccaccaacc agcccctgga 26220
aattaggtat cacctggatc tagcccgcgc cctgacccgt ctatgcgagg taaacctgca 26280
ggagctcccg cctgacctga cgccgcggga gctccagacc atggacagct cccatctgcg 26340
cgatgttgtc atcaagctcc gaccgccgcg cgcggacatc tggactttgg gctcgcgcgg 26400
cgtggtggtc cgatccaccg taactcccct cgagcagcca gacggtcaag gacaagcagc 26460
cgaagtagaa gaccaccagc caaacccgcc aggcgagggg ctcaaattcc cactctgctt 26520
ccttgtgcgc ggtcgtcagg tcaacctcgt gcaggatgta cagcccgtgc accgctgcca 26580
gtactgcgca cgtttttaca aaagccagca cgagtgttcg gcccgtcgca gggacttcta 26640
ctttcaccac atcaatagcc actcctccaa ttggtggcgg gagatccagt tcttcccgat 26700
cggctcgcat cctcgcaccg agcgtctctt tgtcacctac gatgtagaga cctatacttg 26760
gatgggggcc tttgggaagc agctcgtgcc cttcatgctg gtcatgaagt tcggcggaga 26820
tgagcctcta gtgactgccg cgcgagacct agccgcgaac cttggatggg accgctggga 26880
acaagacccg cttaccttct actgcatcac cccagaaaaa atggccatag gtcgccagtt 26940
taggaccttt cgcgaccacc tgcaaatgct aatggcccgt gacctgtgga gctcattcgt 27000
cgcttccaac cctcatcttg cagactgggc cctttcagag cacgggctca gctcccctga 27060
agagctcacc tacgaggaac ttaaaaaatt gccttccatc aagggcatcc cgcgcttctt 27120
ggaactttac attgtgggcc acaacatcaa cggctttgac gagatcgtgc tcgccgccca 27180
ggtaattaac aaccgttccg aggtgccggg acccttccgc atcacacgca actttatgcc 27240
tcgcgcggga aagatactct tcaacgatgt caccttcgcc ctgccaaatc cgcgttccaa 27300
aaagcgcacg gactttttgc tctgggagca gggcggatgc gacgacactg acttcaaata 27360
ccagtacctc aaagtcatgg tcagggacac ctttgcgctc acccacacct cgctccggaa 27420
ggccgcgcag gcatacgcgc tacccgtaga aaagggatgc tgcgcctacc aggccgtcaa 27480
ccagttctac atgctaggct cttaccgttc ggaggccgac gggtttccga tccaagagta 27540
ctggaaagac cgcgaagagt ttgtcctcaa ccgcgagctg tggaaaaaaa agggacagga 27600
taagtatgac atcatcaagg aaaccctgga ctactgcgcc ctagacgtgc aggtcaccgc 27660
cgagctggtc aacaagctgc gcgactccta cgcctccttc gtgcgtgacg cggtaggtct 27720
cacagacgcc agcttcaacg tcttccagcg tccaaccata tcatccaact cacatgccat 27780
cttcaggcag atagtcttcc gagcagagca gcccgcccgt agcaacctcg gtcccgacct 27840
cctcgctccc tcgcacgaac tatacgatta cgtgcgcgcc agcatccgcg gtggaagatg 27900
ctaccctaca tatcttggaa tactcagaga gcccctctac gtttacgaca tttgcggcat 27960
gtacgcctcc gcgctcaccc accccatgcc atggggtccc ccactcaacc catacgagcg 28020
cgcgcttgcc gcccgcgcat ggcagcaggc gctagacttg caaggatgca agatagacta 28080
cttcgacgcg cgcctgctgc ccggggtctt taccgtggac gcagaccccc cggacgagac 28140
gcagctagac cccctaccgc cattctgctc gcgcaagggc ggccgcctct gctggaccaa 28200
cgagcgccta cgcggagagg tagccaccag cgttgacctt gtcaccctgc acaaccgcgg 28260
ttggcgcgtg cacctggtgc ccgacgagcg caccaccgtc tttcccgaat ggcggtgcgt 28320
tgcgcgcgaa tacgtgcagc taaacatcgc ggccaaggag cgcgccgatc gcgacaaaaa 28380
ccaaaccctg cgctccatcg ccaagttgct gtccaacgcc ctctacgggt cgtttgccac 28440
caagcttgac aacaaaaaga ttgtcttttc tgaccagatg gatgcggcca ccctcaaagg 28500
catcaccgcg ggccaggtga atatcaaatc ctcctcgttt ttggaaactg acaatcttag 28560
cgcagaagtc atgcccgctt ttcagaggga gtactcaccc caacagctgg ccctcgcaga 28620
cagcgatgcg gaagagagtg aggacgaacg cgcccccacc cccttttata gccccccttc 28680
aggaacaccc ggtcacgtgg cctacaccta caaaccaatc accttccttg atgccgaaga 28740
gggcgacatg tgtcttcaca ccctggagcg agtggacccc ctagtggaca acgaccgcta 28800
cccctcccac ttagcctcct tcgtgctggc ctggacgcga gcctttgtct cagagtggtc 28860
cgagtttcta tacgaggagg accgcggaac accgctcgag gacaggcctc tcaagtctgt 28920
atacggggac acggacagcc ttttcgtcac cgagcgtgga caccggctca tggaaaccag 28980
aggtaagaaa cgcatcaaaa agcatggggg aaacctggtt tttgaccccg aacggccaga 29040
gctcacctgg ctcgtggaat gcgagaccgt ctgcggggcc tgcggcgcgg atgcctactc 29100
cccggaatcg gtatttctcg cgcccaagct ctacgccctc aaaagtctgc actgcccctc 29160
gtgcggcgcc tcctccaagg gcaagctgcg cgccaagggc cacgccgcgg aggggctgga 29220
ctatgacacc atggtcaaat gctacctggc cgacgcgcag ggcgaagacc ggcagcgctt 29280
cagcaccagc aggaccagcc tcaagcgcac cctggccagc gcgcagcccg gagcgcaccc 29340
cttcaccgtg acccagacta cgctgacgag gaccctgcgc ccgtggaaag acatgaccct 29400
ggcccgtctg gacgagcacc gactactgcc gtacagcgaa agccgcccca acccgcgaaa 29460
cgaggagata tgctggatcg agatgccgta gagcaggtga ccgagctgtg ggaccgcctg 29520
gaactgcttg gtcaaacgct caaaagcatg cctacggcgg acggtctcaa accgttgaaa 29580
aactttgctt ccttgcaaga actgctatcg ctgggcggcg agcgccttct ggcggatttg 29640
gtcagggaaa acatgcgagt cagggacatg cttaacgaag tggcccccct gctcagggat 29700
gacggcagct gcagctctct taactaccag ttgcagccgg taataggtgt gatttacggg 29760
cccaccggct gcggtaagtc gcagctgctc aggaacctgc tttcttccca gctgatctcc 29820
cctaccccgg aaaccgtttt cttcatcgcc ccgcaggtag acatgatccc cccatctgaa 29880
ctcaaagcgt gggaaatgca aatctgtgag ggtaactacg cccctgggcc ggatggaacc 29940
attataccgc agtctggcac cctccgcccg cgctttgtaa aaatggccta tgacgatctc 30000
atcctggaac acaactatga cgttagtgat cccagaaata tcttcgccca ggccgccgcc 30060
cgtgggccca ttgccatcat tatggacgaa tgcatggaaa atcttggagg tcacaagggc 30120
gtctccaagt tcttccacgc atttccttct aagctacatg acaaatttcc caagtgcacc 30180
ggatacactg tgctggtggt tctgcacaac atgaatcccc ggagggatat ggctgggaac 30240
atagccaacc taaaaataca gtccaagatg catctcatat ccccacgtat gcacccatcc 30300
cagcttaacc gctttgtaaa cacttacacc aagggcctgc ccctggcaat cagcttgcta 30360
ctgaaagaca tttttaggca ccacgcccag cgctcctgct acgactggat catctacaac 30420
accaccccgc agcatgaagc tctgcagtgg tgctacctcc accccagaga cgggcttatg 30480
cccatgtatc tgaacatcca gagtcacctt taccacgtcc tggaaaaaat acacaggacc 30540
ctcaacgacc gagaccgctg gtcccgggcc taccgcgcgc gcaaaacccc taaataaaga 30600
cagcaagaca cttgcttgat ccaaatccaa acagagtctg gttttttatt tatgttttaa 30660
accgcattgg gaggggagga agccttcagg gcagaaacct gctggcgcag atccaacagc 30720
tgctgagaaa cgacattaag ttcccgggtc aaagaatcca attgtgccaa aagagccgtc 30780
aacttgtcat cgcgggcgga tgaacgggaa gctgcactgc ttgcaagcgg gctcaggaaa 30840
gcaaagtcag tcacaatccc gcgggcggtg gctgcagcgg ctgaagcggc ggcggaggct 30900
gcagtctcca acggcgttcc agacacggtc tcgtaggtca aggtagtaga gtttgcgggc 30960
aggacggggc gaccatcaat gctggagccc atcacattct gacgcacccc ggcccatggg 31020
ggcatgcgcg ttgtcaaata tgagctcaca atgcttccat caaacgagtt ggtgctcatg 31080
gcggcggcgg ctgctgcaaa acagatacaa aactacataa gacccccacc ttatatattc 31140
tttcccaccc ttgtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt agtgcgcgag 31200
caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag 31260
ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt gacattgatt 31320
attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 31380
gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 31440
cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 31500
acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 31560
tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 31620
ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 31680
tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 31740
acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 31800
tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 31860
gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag aacccactgc 31920
ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg gctagcgttt 31980
aaacttaagc ttggtaccga gctcggatcc gccaccatgg ccagcggcgg agctttttgc 32040
ctgatcgcca atgatggcaa ggccgacaag atcatcctgg cccaggacct gctgaattcc 32100
aggatcagca atatcaagaa cgtgaacaag agctacggca agcctgaccc cgagcctaca 32160
ctgagccaga tcgaggagac acacctggtg cactttaacg cccacttcaa gccctacgtg 32220
cccgtgggct tcgagtacaa taaggtgaga ccccacaccg gcacacctac cctgggcaat 32280
aagctgacat ttggcatccc tcagtacggc gacttctttc acgacatggt gggccaccac 32340
atcctgggcg cctgccacag ctcctggcag gatgccccta tccagggcac aagccagatg 32400
ggcgcccacg gccagctgca gaccttccca agaaacggct acgactggga caatcagacc 32460
cctctggagg gcgccgtgta caccctggtg gaccctttcg gcagacctat cgtgcctggc 32520
acaaagaacg cctacagaaa tctggtgtac tactgcgagt accccggcga gaggctgtac 32580
gagaatgtga ggtttgacgt gaacggcaac tccctggatg agtactccag cgatgtgacc 32640
acactggtga ggaagttttg tatccctggc gataagatga caggctacaa gcacctggtg 32700
ggccaggagg tgtccgtgga gggcacctcc ggccctctgc tgtgtaatat ccacgatctg 32760
cacaagcctc accagagcaa gcccatcctg accgatgaga atgacacaca gaggacctgc 32820
agccacacca atcctaagtt cctgtcccag cacttccctg agaacagcca caatatccag 32880
acagccggca agcaggacat cacacccatc acagacgcca catacctgga catcaggaga 32940
aatgtgcact actcctgcaa tggcccccag acacctaagt actaccagcc ccccctggcc 33000
ctgtggatca agctgaggtt ctggttcaat gagaacgtga atctggccat cccctccgtg 33060
tccatccctt tcggcgagag attcatcacc atcaagctgg cctcccagaa ggacctggtg 33120
aatgagtttc ctggcctgtt cgtgaggcag agcaggttca tcgccggcag accttccaga 33180
aggaacatca gattcaagcc ttggtttatc cctggcgtga tcaacgagat ctccctgacc 33240
aacaacgagc tgtacatcaa taacctgttt gtgacccctg agatccacaa tctgttcgtg 33300
aagagggtga gattctccct gatcagagtg cacaagaccc aggtgacaca caccaataac 33360
aatcaccacg acgagaagct gatgtccgcc ctgaagtggc ctatcgagta catgttcatc 33420
ggcctgaagc ctacctggaa catctccgac cagaaccccc accagcacag agactggcac 33480
aagttcggcc acgtggtgaa tgccatcatg cagcctaccc accacgccga gatcagcttc 33540
caggataggg atacagccct gcctgatgcc tgctcctcca tcagcgatat tagccctgtg 33600
acctacccca tcaccctgcc tatcatcaag aacatcagcg tgacagccca cggcatcaac 33660
ctgatcgaca agtttcccag caagttttgc tcctcctaca tcccttttca ctacggcggc 33720
aatgccatca agacacccga cgaccccggc gccatgatga tcacattcgc cctgaagcct 33780
agagaggagt accagccctc cggccacatc aacgtgagca gggccaggga gttctacatc 33840
agctgggata cagactacgt gggcagcatc accaccgccg atctggtggt gagcgcctcc 33900
gccatcaatt tcctgctgct gcagaacggc agcgccgtgc tgagatacag cacccaccat 33960
caccaccacc actgagatat cggactataa ggatgatgac gacaaataat agcaattcct 34020
cgacgactgc atagggttac ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 34080
ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc 34140
ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 34200
tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 34260
tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 34320
cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 34380
ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 34440
ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 34500
atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt 34560
ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatggcca 34620
caaccgcggc cgcatggccg aattcaatat tgatgaactg ctgaaaaacg tgctggaaga 34680
tccctctacc gagatctctg aagagaccct gaaacagctg tatcagcgca ccaaccccta 34740
taaacagttc aagaatgact cccgggtggc cttttgctcc ttcaccaatc tgagggagca 34800
gtacatccgc cgcctgatca tgacctcctt catcggctac gtcttcaagg ccctccagga 34860
atggatgccc agctatagca agcctaccca caccaccaag accctgctca gcgaactcat 34920
caccctcgtg gacaccctga agcaggagac caacgacgtg cccagcgaat ccgtcgtgaa 34980
caccatcctg agcatcgccg acagctgcaa aacccagacc cagaaaagca aggaagccaa 35040
aaccaccatc gacagcttcc tgagagaaca cttcgtgttc gaccccaacc tgcatgccca 35100
gagcgcctac acctgcgccg acaccaacgt cgacacctgc gccagcatgt gcgccgacac 35160
aaacgtggac acctgcgcta gcatgtgcgc tgataccaac gtcgatacct gcgcctccac 35220
ctgcacctcc accgagtaca ccgacctggc cgaccccgag cgcatccctc tgcacatcat 35280
gcagaaaacc ctgaacgtgc ccaacgaact gcaggccgat attgacgcca tcacccagac 35340
cccccagggc taccgcgccg ctgctcatat cctgcagaac atcgaactcc accagagcat 35400
caagcacatg ctggagaacc cccgcgcctt caagcccatc ctgtttaaca ccaagatcac 35460
acgctatctg tcccagcaca tcccccccca ggacaccttc tacaaatgga actactacat 35520
cgaagacaac tacgaagaac tgcgcgccgc cacagagagc atctaccccg aaaagcccga 35580
cctggagttc gccttcatca tctacgacgt ggtggacagc agcaaccagc agaaggtcga 35640
cgagttctac tataagtaca aggaccagat ctttagcgag gtgagcagca tccagctggg 35700
caactggacc ctgctgggca gctttaaggc caaccgcgag cgctacaact acttcaacca 35760
gaacaacgaa atcatcaagc ggatcttgga caggcacgag gaggacctga agatcggcaa 35820
agagatcctc cgcaacacca tctaccacaa aaaggccaaa aacatccagg agaccggacc 35880
cgacgccccc ggactgtcta tctacaacag cacattccac accgacagcg gcatcaaagg 35940
actgctcagc ttcaaagagc tcaaaaacct ggaaaaagcc agcggcaaca tcaagaaagc 36000
ccgcgaatac gatttcatcg acgactgcga agagaaaatc aagcagctgc tgagcaaaga 36060
gaacctgacc cccgacgagg aaagcgagct gatcaagacc aaaaagcagc tggacaacgc 36120
cctggagatg ctgaacgtgc ctgacgacac catccgcgtg gacatgtggg tgaacaacaa 36180
caacaaactc gaaaaggaga tcctgtacac caaggccgag ctgtacccct acgacgtgcc 36240
cgattacgcc caccatcacc accaccactg actcgagtct agagggcccg tttaaacccg 36300
ctgatcactt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 36360
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 36420
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatcggtga tcaccgatcc cggaaaaaca 36480
cctgggcgag tctccacgta aacggtcaaa gtccccgcgg gccctagaca aatattacgc 36540
gctatgagta acacaaaatt attcagattt cacttcctct tattcagttt tcccgcgaaa 36600
atggccaaat cttactcggt tacgcccaaa tttactacaa catccgccta aaaccgcgcg 36660
aaaattgtca cttcctgtgt acaccggcgc acaccaaaaa cgtcactttt gccacatccg 36720
tcgcttacat gtgttccgcc acacttgcaa catcacactt ccgccacact actacgtcac 36780
ccgccccgtt cccacgcccc gcgccacgtc acaaactcca ccccctcatt atcatattgg 36840
cttcaatcca aaataaggta tattattgat gatgataagc tatcaaacat gagaattcgg 36900
cgcgccatta tcatttgcgg gtcctttccg gcgatccgcc ttgttacggg gcggcgacct 36960
cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc cggtttaagg cgtttccgtt cttcttcgtc 37020
ataacttaat gtttttattt aaaataccct ctgaaaagaa aggaaacgac aggtgctgaa 37080
agcgagcttt ttggcctctg tcgtttcctt tctctgtttt tgtccgtgga atgaacaacg 37140
cgcctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 37200
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca 37260
gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc 37320
ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt gacggcggga 37380
tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc 37440
gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca 37500
gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca 37560
tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt 37620
tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg 37680
cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat 37740
gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa 37800
cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga 37860
tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc 37920
cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa 37980
tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca 38040
gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg 38100
ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca 38160
cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg 38220
gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa 38280
aggttttgca ccattcacct gcacaccgcg ccttaattaa gaattccgtg tattctatag 38340
tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt attaattgta gccgcgttct 38400
aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct tactgaagca gaccctatca 38460
tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac gaaccttctg agtttctggt 38520
aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc agcagggtca tcgctagcca 38580
gatcctctac gccggacgca tcgtggccaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 38640
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccttaat 38700
aagatgatct tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa 38760
aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt tgaaccgagg 38820
taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc 38880
gcatgacttc aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt 38940
ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 39000
actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac ccggaactga 39060
gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga 39120
aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg gtatctttat 39180
agtcctgtcg ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg cttgtcaggg 39240
gggcggagcc tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg ttaagtatct 39300
tcctggcatc ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct cgccgcagtc 39360
gaacgaccga gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg tatcacatat 39420
tctgctgacg caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt cactgacacc 39480
ctcatcagtg ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgctgagg tctgcctcgt 39540
gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg 39600
agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat tttgaacttt 39660
tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca 39720
gcaaaagttc gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt 39780
gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat 39840
acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat 39900
tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 39960
ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 40020
ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 40080
gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 40140
ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 40200
ggtgaaaata ttgctgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 40260
tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 40320
aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 40380
caagtctgga aagaaatgca ta 40402
<210> 7
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt 60
ttcattcagt agtatagccc caccaccaca tagcttatac agatcaccgt accttaatca 120
aactcacaga accctagtct acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg 180
gtggtgctgc agcagcgcgc gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata 240
caacatggca gtggtctcct cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt 300
cctccgggca cagcagcgca ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag 360
caccacaata ttgttcaaaa tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg 420
gaccacagaa cccacgtggc catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct 480
cataaacacg ctggacataa acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg 540
gtaccatata aacctctgat taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc 600
caaaacctgc ccgccggcta tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag 660
agcccaggac tcgtaaccat ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca 720
caggcacacg tgcatacact tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc 780
ccagggaaca acccattcct gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac 840
gtaactcacg ttgtgcattg tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag 900
tatggtagcg cgggtttctg tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg 960
ccgagacaac cgagatcgtg ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt 1020
cat 1023
<210> 8
<211> 644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggactataag gatgatgacg acaaataata gcaattcctc gacgactgca tagggttacc 60
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 120
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 180
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 240
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 300
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 360
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 420
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 480
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 540
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 600
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatggccac aacc 644
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 10
<211> 2796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattccgtg tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt 60
attaattgta gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct 120
tactgaagca gaccctatca tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac 180
gaaccttctg agtttctggt aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc 240
agcagggtca tcgctagcca gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 300
gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 360
cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 420
gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 480
ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 540
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 600
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 660
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcattcacc gtcatcaccg 720
aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 780
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 840
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 900
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 960
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1020
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1080
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1140
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 1200
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1260
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1320
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1380
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1440
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1500
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1560
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1620
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1680
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1740
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1800
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1860
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1920
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1980
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2040
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2100
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2160
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2220
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2280
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2340
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2400
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2460
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2520
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2580
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2640
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2700
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 2760
gttggccgat tcattaatgc agctggctta tcgaaa 2796
<210> 11
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaattttatc 120
gtactagtgg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 180
agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg 240
cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 300
agaaccgtat ataagtgcag tagctcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata 360
gagattcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct 420
tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg 480
ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt 540
ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct 600
acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt 660
tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc ctacggatcc 720
gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 780
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 840
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 900
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 960
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 1020
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 1080
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 1140
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 1200
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1260
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 1320
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 1380
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 1440
aagtaactcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgat aatcatctct 1500
tgtacatgtc ccactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 1560
attgaccctt ataaagaatt tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac 1620
ttctttcctt ccgtcagaga tctcctagac accgcctcag ctctgtatcg agaagcctta 1680
gagtctcctc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc ta 1722
<210> 12
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 60
tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 120
tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta 180
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 240
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 300
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 360
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 420
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 480
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 540
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 600
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 660
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 720
ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 780
cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgtttaa acttaagctt 840
ggtaccgagc tcggatccac tagtccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 900
ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcacttcgc ccacccc 957
<210> 13
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gtataccgtc gacctct 147

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；
所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54；
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54需通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞进行重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；
其中，P72、B602L、P30、P54和pAd5LCL3的核苷酸序列分别如序列表中Seq ID NO.1、SeqID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5所示；
所述四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.6所示。
2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5；
2）再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5△E4；
3）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5△E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3；
4）构建腺病毒E1区域穿梭质粒，pS5E1通过DNA连接酶分别与P72、IRES、B602L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L；
5）构建腺病毒E4区域穿梭质粒，P30、2A、P54基因通过融合PCR技术得到P30-2A-P54基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与P30-2A-P54连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54；
6）将穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L；
7）将穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54，pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtViral DNAExtract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的ORF6/7表达框基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.7所示；步骤4）所述的IRES的核苷酸序列如序列表中Seq IDNO.8所示；步骤5）所述的2A的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.9所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用pucorigin、amp基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40early polyA；步骤5）所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp基本元素的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.10所示，EF1α-EGFP-HBV polyA基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.11所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6）穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep GelExtraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7）穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-P30-2A-P54和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-P72-IRES-B602L进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
8.一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液。
9.根据权利要求8所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，由以下步骤制得：
1）将pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2）转染后的293TD37细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3）TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4）重复3），收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5）持续接毒直至细胞发生病变。
10.293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为P72、B602L、P30和P54，其中P72和B602L表达在E1区，P30和P54表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54；所述pAd5LCL3-P72-B602L-P30-P54的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.6所示；
其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
CN202110763754.2A 2020-07-06 2021-07-06 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 Active CN113897394B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2020106427453 2020-07-06
CN202010642745 2020-07-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113897394A CN113897394A (zh) 2022-01-07
CN113897394B true CN113897394B (zh) 2023-09-12

Family

ID=79187547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110763754.2A Active CN113897394B (zh) 2020-07-06 2021-07-06 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113897394B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116396974B (zh) * 2022-02-21 2024-02-13 吉林农业大学 非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用
CN116656731B (zh) * 2023-05-25 2024-04-12 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154225A (zh) * 2010-12-30 2011-08-17 云南生物制药有限公司 一种重组腺病毒及其构建方法
CN107574175A (zh) * 2017-09-11 2018-01-12 南方医科大学 一种基于重组腺病毒的表达载体及其构建方法
CN108504686A (zh) * 2018-03-28 2018-09-07 扬州大学 一种表达非洲猪瘟病毒ep153r基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
CN109652449A (zh) * 2018-12-07 2019-04-19 扬州大学 一种ep153r与ep402r基因共表达重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法
CN110269932A (zh) * 2019-06-24 2019-09-24 北京生科基因科技有限公司 非洲猪瘟病毒疫苗及其用途
CN110656090A (zh) * 2019-10-28 2020-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9738907B2 (en) * 2002-02-01 2017-08-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Viral vector
US20190307879A1 (en) * 2015-12-04 2019-10-10 The Texas A&M University System Adenovirus-vectored multivalent vaccine

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154225A (zh) * 2010-12-30 2011-08-17 云南生物制药有限公司 一种重组腺病毒及其构建方法
CN107574175A (zh) * 2017-09-11 2018-01-12 南方医科大学 一种基于重组腺病毒的表达载体及其构建方法
CN108504686A (zh) * 2018-03-28 2018-09-07 扬州大学 一种表达非洲猪瘟病毒ep153r基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
CN109652449A (zh) * 2018-12-07 2019-04-19 扬州大学 一种ep153r与ep402r基因共表达重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法
CN110269932A (zh) * 2019-06-24 2019-09-24 北京生科基因科技有限公司 非洲猪瘟病毒疫苗及其用途
CN110656090A (zh) * 2019-10-28 2020-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡永新等.表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定.《畜牧兽医学报》.2019,第50卷(第08期),1635-1641. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113897394A (zh) 2022-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210149060A (ko) Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
JP3194751B2 (ja) シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスおよび該ウイルス由来の生菌ベクターワクチン
CN113897394B (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
CN112673092A (zh) 工程化的免疫刺激性细菌菌株及其用途
CN113897390B (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
KR101745029B1 (ko) 재조합 조류 파라믹소바이러스 백신 및 이의 제조 및 사용 방법
AU2016275601A1 (en) Adenovirus polynucleotides and polypeptides
KR20220004959A (ko) 종양, 종양-상주 면역 세포, 및 종양 미세환경을 콜로니화하기 위해 조작된 면역자극성 박테리아
CN116249779A (zh) 免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途
CN113897395B (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
JP2004000111A (ja) 組み換え鳥類ヘルペスウイルス
WO2022007800A1 (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
JPH11505128A (ja) キメラインテグラーゼタンパク質に媒介される真核生物ゲノム中へのベクター構築物の位置特異的組み込み
US6773709B2 (en) Chicken embryo lethal (CELO) virus
CN111166875A (zh) 一种腺病毒二价疫苗
KR20230014694A (ko) 항원-코딩 카세트
Joklik Recent progress in reovirus research
JP2002515222A (ja) ブタアデノウイルス３型ゲノム
CN112156181A (zh) 一种腺病毒四价疫苗
CN113897393B (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
CN113897391B (zh) 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
JP3375347B2 (ja) マレック病に対する組換えワクチン
JP2000512129A (ja) ブタレトロウィルス
Deckhut et al. Localization of common cytotoxic T lymphocyte recognition epitopes on simian papovavirus SV40 and human papovavirus JC virus T antigens
JP4344805B2 (ja) 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant