JP3194751B2 - シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスおよび該ウイルス由来の生菌ベクターワクチン - Google Patents

シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスおよび該ウイルス由来の生菌ベクターワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、シチメンチョウのヘルペスウイ
ルス（ＨＶＴ）ゲノムの挿入領域に導入されたヘテロな
核酸配列を含む組換えＨＶＴ，ＨＶＴゲノムの該挿入領
域から誘導されるＤＮＡ配列によって、フランクされる
ヘテロな遺伝子を有する核酸配列、該核酸配列を含むプ
ラスミド、組換えＨＶＴの調製のための方法、組換えＨ
ＶＴに感染させた細胞培養物、組換えＨＶＴを含有する
ヘクチン、ならびに組換えＨＶＴに対する抗体を含む抗
血清と該ワクチンの調製方法に関する。マレク病（Ｍ
Ｄ）は、Ｔ細胞リンパ腫および末梢神経脱髄を生じる、
ニワトリの腫瘍形成性リンパ球増殖疾患であり、家禽産
業に対する経済的損失の主要原因である。マレク病ウイ
ルス（ＭＤＶ）はＭＤの病因として同定されている。基
本型ＭＤワクチンは、シチメンチョウから最初に単離さ
れた血清型３ＭＤウイルスである、シチメンチョウのヘ
ルペスウイルス（ＨＶＴ）から成る。病原性、腫瘍形成
性がないこと、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ
での良好な複製、細胞不含および細胞結合の両形態の製
剤が得られること、ならびに高い保護効果によって、Ｈ
ＶＴは家禽におけるマレク病の効果的な抑制のための非
常に好適で広く使用される安全なワクチンとして確立さ
れている。現在、一般に、動物を生菌または不活化ワク
チン、もしくは関連病原体のサブユニット由来のワクチ
ンによって病原微生物の感染から保護することができ
る。しかしながら、これらのタイプのワクチンは多くの
欠点を有すると考えられる。弱毒化した生菌ワクチンを
使用することは、常に、十分に弱毒化されていない病原
微生物を動物に接種する危険性を伴う。さらに、弱毒化
ウイルスは、接種された動物の疾病をひき起こし、他の
動物の病原体を伝播する可能性のあるビルレント状態に
復帰することがありうる。不活化ワクチンは一般的に低
レベルの免疫性しか誘発せず、追加免疫処置を必要とす
る。その上、中和を誘発するウイルスの抗原決定基が不
活化処理によって変性する可能性があり、ワクチンの保
護効力を低下させる。さらに、混合生菌ワクチンに関す
る問題として、１またはそれ以上の構成成分の効力の低
下をもたらす抗原成分相互の影響がある。組換えあるい
は天然由来のサブユニットワクチンも数多くの不利な点
を示す。まず第一に、非複製構造として免疫系に供され
るポリペプチド・サブユニットは持続的な免疫を誘発し
ない場合が多く、またアジュバントの存在を必要とす
る。第二に、複製構造としての提示は、サブユニット構
造として提示した場合よりも有効に免疫を誘発すること
ができる。本発明の目的は、ＭＤに対するワクチンの調
製のためだけでなく、家禽の他の感染症に対するワクチ
ン調製にも使用することができる組換えＨＶＴを提供す
ることにあり、該組換えＨＶＴは、生菌弱毒化病原体を
ワクチンとして用いることに関連する潜在的な危険性を
取り除き、特に明らかにアジュバントを必要としない強
力な方法で体液性および細胞性免疫の両方を刺激し、さ
らに、異なる抗原成分同士の好ましくない相互干渉の危
険性を伴わない多価ワクチンの可能性を提供する。本発
明に従えば、かかる組換えＨＶＴは、ＨＶＴとは異なる
ポリペプチドをコードするヘテロな核酸配列を含むこと
を特徴とし、該核酸配列は、図１に示すようにＯＲＥ−
１の末端からＯＲＦ−５まで（ＯＲＦ−５を含む）のゲ
ノム領域に対応するＨＶＴゲノムの挿入領域に導入され
ており、図１により基本的に定義される制限酵素切断地
図を持つＨＶＴゲノムのＤＮＡ断片内に位置している。
本発明に従った組換えＨＶＴは、いかなるＨＶＴ株から
も誘導することができ、たとえば、ＰＢ−ＴＨＶ１（Ｉ
ｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより市販
品が入手可能）あるいはＦＣ１２６株から誘導できる。
本文中で使用する「組換えＨＶＴ」の語は、ヘテロの核
酸配列、すなわち、ＨＶＴ中に天然に存在する遺伝子の
核酸配列と同一ではない遺伝子もしくはその一部をコー
ドするＤＮＡの、ウイルスゲノム内への取り込みによっ
て遺伝的に修飾された感染ウイルスを表わす。組換えＨ
ＶＴによって細胞が感染すると、組換えＨＶＴはヘテロ
ポリペプチドの形態でヘテロな遺伝子を発現する。「ポ
リペプチド」の語は、生物学的活性を有するアミノ酸の
分子鎖を指し、特定の長さの物質を意味しないので、必
要に応じてｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎｖｉｔｒｏで、
たとえばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化もし
くはリン酸化によって修飾することができる；従ってペ
プチドの中でも特にオリゴペプチドおよびタンパクがポ
リペプチドの定義の範囲内に含まれる。有用な組換えＨ
ＶＴにとっての必要条件は、ヘテロの核酸配列が、ＨＶ
Ｔゲノム配列の許容される位置もしくは領域、すなわ
ち、感染あるいは複製に必要とされるようなＨＶＴの本
質的機能を分断せずにヘテロ配列の取り込みに使用する
ことができる位置もしくは領域内に取り込まれることで
ある。そのような領域は挿入領域と称される。本発明に
おいて用いられる挿入領域は、ＨＶＴの本質的機能の分
断を伴わないＤＮＡの取り込みに関しては、これまでに
記述されたことがなかった。さらに、本文中で述べるよ
うに、ヘテロのＤＮＡ配列を取り込むのに使用されるＨ
ＶＴのゲノム領域の制限酵素切断地図に関しては情報が
存在しなかった。本発明に従って組換えＨＶＴを作製す
るためにヘテロなＤＮＡ配列を取り込むのに使用される
挿入領域は、酵素Ｓａｕ３ＡでゲノミックＨＮＴ ＤＮ
Ａを部分消化することによって得られる１７．５kbの制
限断片内に位置する。該断片は制限酵素マッピング（図
１）によって詳細に分析され、おそらくＩＲs およびＴ
Ｒs 構造の近接部分を含めて、本質的にＨＶＴゲノムの
Ｕs 領域に対応する。ＨＶＴゲノム内のＵs 領域ならび
にＩＲs とＩＲs 構造の相対的な位置はイガラシ（Ｉｇ
ａｒａｓｈｉ）ら（１９８７）によって示されている。
本文中に開示される挿入領域は、各々約１．２kb，３．
５kbおよび２．８kbの３つの近接するＸｈｏＩ断片内に
位置し、１．２kbのＸｈｏＩ断片の左側のＨＶＴゲノム
内の位置から始まるオープンリーディングフレームの端
（ＯＲＦ−１）を先頭とする（図１）。約５kbの該挿入
領域は、途中の非コード配列を含めてＯＲＦ２，３，４
および５を通して続く。上に該略した挿入領域に対応す
るＤＮＡ配列は、ウイルスの本質的機能を分断せずにＨ
ＶＴゲノム内に遺伝子を挿入するのに適用することがで
きる。特に、ＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３は外来遺伝子
の組込みに適用しうる。ＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３内
において外来遺伝子にとって好ましい挿入部位は、図１
に示す非反復のＢｇｌII制限部位である。β−ガラクト
シダーゼ遺伝子をＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３内の非反
復のＢｇｌII制限部位のどちらかに挿入すると組換えウ
イルスを生じ、該組換えウイルスは生育可能で安定であ
り、組織培養で複製するのみならず、由来のＨＶＴウイ
ルスに匹敵する程度にニワトリに感染する。図１に示す
ように各々ＸｈｏＩ断片を有するｐＭＤ０７およびｐＭ
Ｄ１２の非反復のＢｇｌII部位にβ−ｇａｌ遺伝子を挿
入することによって誘導される、ｐＭＤ０７ｇａｌある
いはｐＭＤ１２ｇａｌと称されるプラスミド（図２）で
形質転換したエシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、
受入番号Ｉ−９１４およびＩ−９１５の下にパリのパス
ツール研究所のＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託されている。も
う１つの例では、ＯＲＦ−４およびＯＲＦ−５の重要な
部分がＨＶＴゲノムから欠失し、β−ガラクトシダーゼ
のマーカー遺伝子に置換されて、ＯＲＦ−２あるいはＯ
ＲＦ−３内にマーカー遺伝子の挿入を含む組換えＨＶＴ
ウイルスと同等な組換えウイルスを生じる。ＨＶＴゲノ
ムのＤＮＡ配列に関しては、個々のＨＶＴウイルス間で
自然変異が存在しうることは自明であろう。これらの変
異は、１またはそれ以上の制限部位の位置に影響を及ぼ
す可能性のある、従って図１に示す制限酵素切断地図を
変化させ得る、１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠
失、置換、挿入、逆位、あるいは付加を生じることがあ
りうる。さらに、遺伝子工学テクノロジーを使用して、
図１に示す地図に関連する制限酵素切断地図を持ったＤ
ＮＡ配列を生じる、上述の変異をひき起こす潜在的可能
性が存在する。そのような関連する制限酵素切断地図を
特徴とする、ＨＶＴゲノム領域内に位置する挿入領域に
取り込まれたヘテロ遺伝子を含む組換えＨＶＴも、本発
明の範囲内に含まれることは明白である。さらに、本発
明に従って同定される挿入領域は本質的機能を示さない
ので、該領域を部分的にあるいは完全に欠失させること
ができ、そのあと該欠失部分にヘテロ遺伝子を取り込む
ことができる。本発明の挿入領域に対応するＨＶＴゲノ
ムの領域に取り込まれたヘテロ遺伝子を含み、本文中で
特性決定された組換えＨＶＴも、本発明の一部を成すこ
とは自明であろう。要するに、上記に基本的に定義され
る挿入領域は、ヘテロな核酸配列を取り込むのに使用す
ることができるＨＶＴゲノム内の領域の位置決定を特性
づけるものである。４つのＯＲＦを有し、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１に示すようなＨＶＴ ＤＮＡ配列によって本
質的に特性づけられる挿入領域内に取り込まれたヘテロ
な核酸配列を含む組換えＨＶＴを提供することは、本発
明の好ましい目的である。２０９アミノ酸の小さなオー
ブンリーディングフレーム、ＯＲＦ−２（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２）は、３１６と９４５ヌクレオチド位の間に位
置し、ＨＶＴゲノムへの遺伝子の挿入に使用されるｐＭ
Ｄ０７からのＢｇｌII制限部位（図１、ＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：１）を含む。そのことから、ＯＲＦ−２によってコ
ードされると仮定されるポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ
あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスの維持のための本
質的機能を持たないことが示唆される。これはまた、３
４６アミノ酸を有するＯＲＦ−３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３）にもあてはまる。ＯＲＦ−３は１０８４と２１
２４ヌクレオチド位の間に逆方向に翻訳され（相補
的）、ＨＶＴゲノムへの遺伝子の挿入のためにｐＭＤ１
２において使用されるＢｇｌII制限部位（図１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）を含む。ＯＲＦ−４は２３２２と３
１７０ヌクレオチド位の間でＩＲs 方向に転写され（相
補的、図１ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）、２８２アミノ酸
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をコードし、一方ＯＲＦ−
５は３３２０ヌクレオチド位から始まって４５０４ヌク
レオチド位まで続き（図１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）、３９４アミノ酸のポリペプチド（ＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：５）をコードする。本発明に従って、４つのオープ
ンリーディングフレームとその間の非コード配列を含
み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列によって
本質的に特性づけられる８２ヌクレオチド位でＯＲＦ−
１未満のあとから始まる約５kbのＨＶＴゲノムの連続的
ＤＮＡ伸張は、ウイルスの本質的機能を分断せずにＨＶ
Ｔゲノム内にヘテロな遺伝子を挿入するのに適用するこ
とができる。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すヌク
レオチド位３１６−９４５，１０８４−２１２４，２３
２２−３１７０および３３２０−４５０４の間のＤＮＡ
伸張は、外来遺伝子の組込みのために定義されたもので
あり、個々のＢｇｌII制限部位は挿入のための最適部位
である。本発明に従った挿入領域を特性づける、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１に示すＤＮＡ配列に関して、１個また
はそれ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位等
を生じる自然変異が個々のＨＶＴウイルス間に存在する
ことは明白である。これらの変異は遺伝子操作によって
もひき起こされうる。上記に特性づけられた挿入領域に
関連するが同一ではないＨＶＴゲノムの領域内に取り込
まれたヘテロな遺伝子を含む組換えＨＶＴも、本発明の
範囲内に包含される。たとえば、ヘテロ遺伝子は、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１に示すＨＶＴゲノムの核酸配列内に
生じた欠失に取り込まれうる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
に示すＤＮＡ配列によって本文中に定義されたＨＶＴ挿
入領域は、ヘテロの核酸配列を取り込むのに使用するこ
とができるＨＶＴゲノム内の領域の位置決定を特性づけ
る。本発明に従ってＨＶＴゲノムに取り込まれるヘテロ
な核酸配列は、いかなるソースからも誘導することがで
き、たとえば、ウイルス、原核生物、真核生物あるいは
合成に由来しうるる。該核酸配列は、病原体、好ましく
は鳥類病原体から誘導することができ、ＨＶＴゲノムへ
の挿入後、疾病に対する免疫を誘発するのに使用しう
る。ＨＶＴゲノムの挿入領域への取込みについては、好
ましくは、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マレク
病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎ
ＤＶ）、伝染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニワトリの
貧血因子（ＣＡＡ）、レオウイルス、鳥類レトロウイル
ス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイ
ルス、アイメリア種、サルモネラ種、エシェリヒア・コ
リ、およびマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）が考え
られる。さらに、医薬あるいは診断適用のためのポリペ
プチド、特にリンフォカイン、インターフェロンもしく
はサイトカインのような免疫調節因子をコードする核酸
配列を該挿入領域に取り込んでもよい。組換えＨＶＴに
おけるヘテロな核酸配列の発現のための必須条件は、ヘ
テロな核酸配列に作動可能に（機能し得るように）連結
された適切なプロモーターである。プロモーターの選択
は、組換えＨＶＴによって感染した細胞において遺伝子
の転写を指令することができる真核生物、原核生物ある
いはウイルスプロモーター、たとえば、レトロウイルス
のＬＴＲ，ＳＶ４０由来のプロモーターあるいはＨＶＴ
中に存在するプロモーターに及ぶことは、当業者には自
明である。ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えの手法を用い
て、ＨＶＴゲノム内にヘテロな核酸配列を導入すること
ができる。これは、まず最初にＨＶＴとの組換えのため
の組換えＤＮＡ分子を構築することによって達成され
る。そのような分子は適当なプラスミド、コスミドある
いはファージ由来のものでよいが、プラスミドが最も好
ましく、所望に応じてプロモーターに作動可能に連結さ
れた、ヘテロな核酸配列を含む。該核酸配列およびプロ
モーターを、組換えＤＮＡ分子中にサブクローン化され
た、本文中に定義されるような挿入領域の配列を含むゲ
ノミックＨＶＴＤＮＡ断片に導入する。ヘテロ核酸配列
に近接する挿入領域配列は、ウイルスＨＶＴゲノムとの
ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えを生じさせ得るような適
切な長さのものでなければならない。所望する場合に
は、たとえば、同じまたは異なる病原体由来の２または
それ以上の異なるヘテロな核酸配列を含み、該配列が本
文中に定義された挿入領域配列に近接するような構築物
を作製することができる。そのような組換えＤＮＡ分子
を用いて、多価ワクチンを提供する２またはそれ以上の
異なる抗原ポリペプチドを発現する組換えＨＶＴを生成
することができる。次に、細胞、たとえばニワトリの胚
線維芽細胞（ＣＥＦ）を、適切なＨＶＴ配列によってフ
ランクされるヘテロな核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子
の存在下に、ＨＶＴ ＤＮＡでトランスフェクトするこ
とができ、それにより、組換えＤＮＡ分子中の挿入領域
配列とＨＶＴの挿入領域配列との間に組換えが起こる。
組換えは、組換えＤＮＡ分子配列なしに、適当な近接挿
入領域配列によってフランクされるヘテロな核酸配列を
含む核酸配列で感染細胞をトランスフェクトすることに
よっても生じさせ得る。そのあと細胞培養において組換
えウイルス後代を産生し、たとえば遺伝子型あるいは表
現型によって、たとえばハイブリダイゼーションを用い
て選択して、ヘテロ核酸配列と共に同時取り込みされた
遺伝子によってコードされる酵素活性を検出したり、あ
るいは組換えＨＶＴによって発現される抗原性ヘテロポ
リペプチドを免疫学的に検出することにより選択するこ
とができる。選択された組換えＨＶＴを組織培養で大規
模に培養し、そのあと該ＨＶＴによって発現される物質
あるいはヘテロポリペプチドを含む組換えＨＶＴをそれ
らから回収することができる。本発明に従い、特定病原
体の１またはそれ以上の異なるヘテロポリペプチドを発
現する生菌組換えＨＶＴを使用して、これらの病原体に
対して感受性のある動物、特にニワトリ、シチメンチョ
ウ、ウズラ、ハトおよびホロホロ鳥のような鳥類種にワ
クチン接種することができる。そのような生菌ベクター
ワクチンによる予防接種は、好ましくは接種された宿主
内で組換えＨＶＴの複製を生じ、ｉｎｖｉｖｏでＨＶＴ
ポリペプチドと共にヘテロポリペプチドを発現する。ヘ
テロな免疫原性ポリペプチドは、ＨＶＴ自体に対すると
同様に該ポリペプチドに対しても免疫反応を誘発する。
特定病原体由来のヘテロなポリペプチドが防御免疫反応
を刺激することができれば、本発明に従った組換えＨＶ
Ｔを接種された動物は、その病原体によるその後の感染
ならびにＭＤＶによる感染に対して免疫性となる。従っ
て、本発明に従ってＨＶＴゲノムの挿入領域内に取り込
まれたヘテロな核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで継続的に
発現されると考えられ、病原体に対する確実で安全且つ
永続的な免疫を提供する。１またはそれ以上の異なるヘ
テロなポリペプチドを含み且つ発現する、本発明に従っ
た組換えＨＶＴは、単価あるいは多価ワクチンとして使
用することができる。本発明に従った組換えＨＶＴは、
不活化ワクチンを調製するためにも使用することができ
る。動物への投与にあたっては、本発明の記述に従った
組換えＨＶＴは、特にエアロゾル、飲料水、経口的、卵
接種、皮内的、皮下的あるいは筋内的方法によって与え
ることができる。本発明に従った組換えＨＶＴによって
発現されるヘテロなポリペプチドを含有するサブユニッ
トワクチン、薬学的および診断製剤を生産することは、
本発明のもう１つの目的である。これは、ヘテロなポリ
ペプチドの発現を促進する条件下で、該組換えＨＶＴに
感染させた細胞を培養することによって達成できる。次
にヘテロポリペプチドを、従来の手法により、意図する
用途に応じてある程度まで精製し、免疫、治療あるいは
診断活性を有する製剤へとさらに処理してもよい。上に
述べた特定病原体に対する能動免疫法は、健常動物にお
ける保護処置として適用される。既に特定病原体に感染
した動物を、抗原ポリペプチドをコードする特定病原体
由来のヘテロな遺伝子を含む、本発明に従った組換えＨ
ＶＴによって誘発される抗体を含有する抗血清で処置し
うることは言うまでもない。本発明に従った組換えＨＶ
Ｔに対する抗血清は、適切な免疫反応を誘発するため
に、動物、たとえば家禽を、有効量の該組換えＨＶＴで
免疫することによって調製することができる。そのあと
動物を放血させ、抗血清を調製することができる。
【実施例】実施例１ １．ＨＶＴゲノムのＵ s 領域からのサブフラグメント単
離 ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にＨＶＴワクチン株Ｐ
Ｂ−ＴＨＶ１（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ，Ｈｏｌｌａｎｄから市販されている）から採
取したウイルスを感染させ、この培養が９０％の細胞変
性作用（ＣＰＥ）を示すまで、ローラービンの中で４８
時間インキュベートした。細胞を採収し、リン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離した後、２０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１０mM ＥＤＴＡ中に１〜
５×１０8 細胞／mlの密度となるよう再度懸濁した。Ｓ
ＤＳは最終濃度０．５％となるよう、プロテインナーゼ
Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）は２００μg ／mlとなるよ
うに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、さ
らに１００μg ／mlのプロテインナーゼＫを加え、イン
キュベーションを１時間継続した。この溶液をフェノー
ル／クロロホルム（１：１）の混合液で２回抽出したと
ころ、核酸は、エタノールで沈降した。感染した細胞か
ら得られたすべてのＤＮＡは、ＴＥ（１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，pH７．５，１mM ＥＤＴＡ）中に０．５mg／
mlの濃度になるよう溶解した。このＤＮＡの１０μg
を、Ｓａｕ３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の０．５単位と共
に、１００μl 反応容量中で、酵素提供者の指示した条
件に従って、３７℃１０分間インキュベートした。反応
産物を、０．８％アガロースゲル上で分離し、１６〜２
０kbの大きさの分画を単離した。これらのＤＮＡの１０
０ngは、３０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１０mM
ＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，０．１mM ＡＴＰにＴ
4 ＤＮＡ−リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）１単位を
加えた中で、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断されたλＥ
ＭＢＬ3 ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、＋４℃一晩結合
させた。結合の後、反応混合液の１／１０を１０μl 容
量中、ＢａｍＨＩで分解（消化）し、ＤＮＡを市販の抽
出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎｖｉｔｒｏパッケ
ージングした。組み換えファージは、ＬＥ３９２、Ｋ８
０２等の適当な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株上に、密
度が約１００pfu ／プレートとなるような平板培養し
た。この皿のレプリカは、Ｂｅｎｔｏｎ ＆ Ｄａｖｉ
ｓ（１９７８）に従って、ニトロセルロースフィルター
を用いて、２検体ずつ調製した。最初のものは、感染し
ていないＣＥＦから得た32Ｐ−標識ＤＮＡとハイブリダ
イズし（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）、２番目のも
のは、ＨＶＴに感染したＣＥＦから得た32Ｐ−標識ＤＮ
Ａとハイブリダイズした。洗浄後、Ｘ線フィルムに撮
り、２つのフィルターの像を正確に重ねて二重焼き付け
し、感染した細胞から作られたプローブに特異性のある
信号を出す部分のいくつかを単離し、それによるファー
ジを増幅した。これらの候補物質のうちの１つをλＨＶ
Ｔ０４とし、１７．５kb挿入部分の制限酵素地図により
詳細を分析した（図１）。このフラグメントに存在する
配列は、ＨＶＴゲノムのＵs 領域に本質的に対応し、反
復構造の近接部分を含んでいた（Ｉｇａｒａｓｈｉら、
１９８７）。２．Ｕ s 領域のサブフラグメントを用いたβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子のＨＴＶゲノムへの挿入 λＨＶＴ０４の挿入部分の中に存在する２つのＸｈｏＩ
フラグメントは、ｉｎｖｉｖｏにおいてそのままのウイ
ルスのゲノムＤＮＡと組み換え現象を起こすことができ
るように、適当な位置に唯一のＢｇｌII制御部位を含ん
でいた。これら２つのフラグメントは、ＸｈｏＩによる
切断と、ＳａｌＩで切断されたプラスミドベクターｐＧ
ＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との結合により、λＨＶＴ
０４からサブクローンされた。得られたプラスミド構築
物ｐＭＤ０７とｐＭＤ１２は、図１に示すようなＸｈｏ
Ｉフラグメントを担持しており、唯一のＢｇｌII制限部
位によって線状にし、ＳＶ４０からの初期プロモーター
により制御される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得たβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含み、ＢａｍＨＩにより近接
する、４．０kbの発現カセットと結合させた。この発現
カセットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されているプ
ラスミドｐＣＨ１１０について、７２bpＳｐｈＩフラグ
メントを、以下の構造の合成２本鎖オリゴヌクレオチド
により、ｐＣＨ１１０に存在する複製の開始点ＳＶ４０
の近くに置換することにより得られた。 ５′−ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ−３′ ３′−ＧＴＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧ−５′ ｐＣＨ１１０の２つのＳｐｈＩ制限部位の間にリンカー
を挿入すると、いずれの部位においてもＳｐｈＩを認識
する配列が保存されず、ＳＶ４０初期プロモーターの上
流にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位の両方が創製され
る。この構築物を次にＢａｍＨＩで切断すると、上記
の、ｐＭＤ０７とｐＭＤ１２からのＢｇｌII部位に挿入
するために用いた４．０kbの発現カセットができ、これ
によってｐＭＤ０７gal とｐＭＤ１２gal のプラスミド
が得られ、その制限地図を図２に示す。ｐＭＤ０７gal
とｐＭＤ１２gal プラスミドの線状ＤＮＡは、Ｇｒａｈ
ａｍａｎｄ Ｖ．ｄ．Ｅｂ（１９７３）に従った、リン
酸カルシウムＤＮＡ沈降に基づいた方法により、ＨＶＴ
に感染した細胞から調整した総ＤＮＡと共にＣＥＦ内が
導入した。ＨＶＴ相同配列に近接したβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を含むこの構築物から得られたプラスミドＤ
ＮＡ２μg は、ＨＶＴ感染細胞のＤＮＡ１５μg と混合
し、最終容量を５６０μl Ｈ2 Ｏとし、ＨＢＳＰ７５０
μl （２０mMＫＣｌ，５６０mM ＮａＣｌ，２４mM ｇ
ｌｕｃｏｓｅ，３mM Ｎａ2 ＨＰＯ4，１００mM ＨＥ
ＰＥＳ，pH７．０）に加えた。１Ｍ ＣａＣｌ2 溶液１
９０μl を徐々に加えることにより沈殿物が形成され、
その混合物を室温で３０分間インキュベートした。その
間、Ｅａｇｌｅの最少必須培地のＧｌａｓｇｏｗの変法
に基づいた組成でありウシ胎児血清２％添加の培地６／
Ｂ８中の１０日令胚から得た２番目のＣＥＦの懸濁液
を、直径１０cmの皿に５×１０5 細胞／mlの密度となる
よう接種した。この細胞懸濁液にリン酸カルシウムで沈
降したＤＮＡを静かに加え、皿を、ＣＯ2 ５％含有の湿
った空気の入ったインキュベーターの中で、３７℃でイ
ンキュベートした。５時間後、培地を取り除き、ＨＢＳ
Ｐと３０％グリセロールを等量含んだ溶液１０mlで細胞
上に層とした。１〜２分間のインキュベーション後、こ
の溶液を取り除き、細胞を培地６／Ｂ８で洗浄し、皿に
新しい培地を入れ、ウイルスのＣＰＥが示されるまで３
〜５日間インキュベートした。組み換えＨＶＴウイルス
を含みβ−ガラクトシダーゼ活性を発現するプラーク
は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシドの化学的誘導体であるＢｌｕｏｇａｌ
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）という基質を、青色の反応産物
に変換する能力によって同定した。プレートは、ジメチ
ルスルフォキシドに用時溶解したＢｌｕｏｇａｌ ０．
２mg／mlで染色し、青色のプラークが検出されるまでイ
ンキュベートした。ｐＭＤ０７とｐＭＤ１２からのβ−
ガラクトシダーゼ誘導体によるトランスフェクション
は、すべて有意な％（＞５）の青色プラークを示した。
ｐＭＤ０７とｐＭＤ１２のトランスフェクション系か
ら、肉眼的に陽性なプラークを取り出し、ウイルスを増
幅するために、新鮮なＣＥＦと混合した。細胞は、ＣＰ
Ｅが見られる時点で採収し、溶解産物は、１％ウシ血清
アルブミン含有カルスタブ緩衝液（７４．３５ｇ ショ
糖，０．５２ｇ ＫＨ2 ＰＯ4，２．５８ｇ Ｎａ3 Ｈ
ＰＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ，０．９２ｇ グルタミン酸ナトリウ
ム／ｌＨ2 Ｏ）中に加え、この抽出物の入ったプラスチ
ックチューブを、Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ ３００ Ｃｕｐ
ｈｏｒｎ装置内で１５℃３分間超音波処理することで
調整した。細胞非含有ウイルスは、定量のため、新鮮な
ＣＥＦ上にプレートし、青色に染まった組み換えＨＶＴ
ウイルスを含むプラークを検出し、上記のごとく増幅し
た。このサイクルは、培養内容物をＢｌｕｏｇａｌで染
色した時、ウイルスプラークの９５％以上が陽性となる
まで繰り返した。特に、ｐＭＤ０７由来のＡ４−１／Ａ
１０−４およびｐＭＤ１２由来のＥ１／Ｅ２の４つのク
ローンは、ウイルスストックの調製物として選択され、
ニワトリのウイルス接種実験に供給された。さらにスト
ックの一部は、感染ＣＥＦから得た全ＤＮＡの調製のた
めとしても用いられた。ＸｈｏＩで切断されたＣＮＡ
は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に従って、アガロ
ースゲル上に分離し、ニトロセルロース紙に移した。Ａ
４−１／Ａ１０−４およびＥ１／Ｅ２から得られた試料
を、プローブとして非崩壊ＸｈｏＩフラグメントを用い
て、非組み換えＨＶＴウイルスのＸｈｏＩ切断ＣＮＡと
比較すると、β−ガラクトシダーゼカセットの挿入によ
り、元のｐＭＤ０７とｐＭＤ１２のフラグメントより大
きくなったと考えられるサイズの増加が示された。β−
ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、ＯＲＦ−４とＯＲ
Ｆ−５も潜在的挿入領域を表わすことを示すために用い
られた。このため、ＯＲＦ−４の２３１１番とＯＲＦ−
５の３４２８番のヌクレオチドの間のｐＭＤ１２中の１
１１７bpＳｐｅＩフラグメントを、合成された１６塩基
２重鎖オリゴマーと置換して、ｐＭＤ１２中に新たに唯
一のＳａｌＩ部位を創製し、これにより、ＯＲＦ−１２
中に新たに唯一のＳａｌＩ部位を創製し、これにより、
ＯＲＦ−４とＯＲＥ−５の両方に有意な部分が削除され
た。このプラスミドをｐＭＤ４０とし、その制限酵素地
図を図３Ａに示す。挿入に用いられたβ−ガラクトシダ
ーゼマーカー遺伝子は、上記のごとく、ｐＣＨ１１０
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、まず唯一のＢａｍＨＩ部位
とＳａｌＩ部位を交換し、次にＢａｍＨＩとＳａｌＩ制
限部位の両方を含む合成２本鎖リンカーにより７２bp
ＳｐｈＩフラグメントを置換することにより得られた。
このβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、現在、Ｓ
ａｌＩ部位に隣接した４．０kb ＤＮＡフラグメント上
に位置しており、ｐＭＤ４０の新たに創られたＳａｌＩ
部位等へ移すことができ、それによりプラスミドｐＭＤ
４４が得られる（図３Ｂ図を参照）。ｐＭＤ４４の線状
ＤＮＡは、上記のごとく、ＨＶＴ感染細胞からのＤＮＡ
とともに第二のＣＥＦへ、トランスフェクションされ
る。プレートは、ＣＰＥがみられるまでインキュベート
する。培養皿をＢｌｕｏｇａｌで染色により、β−ガラ
クトシダーゼ活性を発現する有為な％のＨＶＴプラーク
を識別した。これらの結果は、ＯＲＦ−２とＯＲＦ−３
にマーカー遺伝子を挿入した後にみられた最初の知見と
同等であった。実施例２ β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組み換えＨＶＴに
よるニワトリのワクチン接種 白色レグホンの日令のニワトリに、Ａ４−１およびＥ１
ウイルスストックの５０または１００pfu を筋肉内接種
した。対照動物には、ＨＶＴワクチン株ＰＢＴＨＩの同
じ用量を非経口的に接種した。第８および１５日目に採
血を行ない、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上にて
白血球を分離した。白血球を、第二のＣＥＦに接種し、
接種した細胞数に対するプラーク数を測定した。これら
の定量結果は、表１に示し、これにより、ｐＭＤ０７お
よびｐＭＤ１２のそれぞれに存在する各ＸｈｏＩサブフ
ラグメントのうちの唯一のＢｇｌII制限部位のいずれか
に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組み換
えＨＶＴウイルスが、非組み換えＰＢ−ＴＨＶＩワクチ
ン株と比べ同等の時間と程度のウイルス血症をニワトリ
に引き起こすことができることが示された。ＣＥＦに対
する白血球定量の一部のＢｌｕｏｇａｌ染色では、感染
したトリから回収された＞９０％のウイルスがまだβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子を発現することを示した。さら
に、接種３５日後の各動物の血清試料からは、β−ガラ
クトシダーゼの有意なＥＬＩＳＡ抗体価が認められた。
従って、ｐＭＤ０７をｐＭＤ１２中に存在する隣接する
配列により定義された、ＨＶＴゲノムから得られたＵs
の特別な領域は、感染や複製に必要な機能等ＨＶＴウイ
ルスに不可欠な機能に影響を与えずに、外来遺伝子を安
定に組み込む場合に使用できることが結論づけられた。
さらに、この領域に挿入された外来遺伝子は、感染動物
の血清中に高度な抗体価を誘導できる機能タンパクを発
現することが示されたと考えられる。
【表１】 実施例３ ＨＶＴのＵ s 領域の一部の配列分析 ｐＭＤ０７とｐＭＤ１２のプラスミドの挿入部分に対
し、図１に示すように、ＨＶＴゲノムから得たＸｈｏＩ
制限フラグメントにそれぞれ対応しており、Ｓａｎｇｅ
ｒら（１９７７）に従って、ジデオキシ鎖終末反応の二
本鎖ＤＮＡ標本を用いた詳細なヌクレオチド配列分析を
行なった。反応の開始は、各ＨＶＴゲノムフラグメント
に隣接するｐＧＥＭ３Ｚプラスミドベクター中のＳＰ６
およびＴ７プロモーター部位の中から行なった。この分
析は、各フラグメントの１方向のみに進む進行性欠失部
分を導入することにより終了した。これらの進行性欠失
部分は、二本鎖ＤＮＡのみを認識し、二本鎖のうちの１
本を３′から５′の方向に加水分解する、１本鎖エクソ
ヌクレアーゼであるＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−III を用
いて導入した。分析するフラグメントの末端付近に、
５′−オーバーハンギング部分または平滑末端を作りた
だす制限部位を選択すると、プラスミドベクターのプラ
イマー開始部位であるＳＰ６またはＴ７を、エクソヌク
レアーゼ−III の分解から保護する１本鎖の３′末端を
作成する２番目の制限酵素と共に、この酵素が、ｐＭＤ
０７またはｐＭＤ１２に存在するような挿入ＤＮＡフラ
グメントの１本鎖を取り除くように作用する。反応混合
物から３０秒間隙で試料を採取し、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
（１９８４）に示された手順に従って処理し、適当な大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株の中へ形質転換された再環
状ＤＮＡ分子を産生した。各コロニーのプラスミドＤＮ
Ａ小標本は、ｐＭＤ０７およびｐＭＤ１２のそれぞれ元
の１．２kbおよび３．５kbフラグメントの中へ導入され
た欠失部分の大きさによる制限酵素地図により分析し
た。フラグメントを１方向に進む進行性欠失部分を含む
一連の候補物質は、鎖終末反応における小標本から得ら
れた２本鎖ＤＮＡを用いて、ヌクレオチド配列を分析し
た。反応産物は、変性アクリルアミドゲル上で分離し、
オートラジオグラフィーによりＸ線フィルム上に視覚化
した。バンドパターンは、ディジタイザーで読みとり、
データは、Ｇｅｎｅ−Ｍａｓｔｅｒワークステーション
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のショットガンハンドラーおよひび
他のソフトウェアを用いて、集計し、分析した。ｐＭＤ
１２に存在するＸｈｏＩフラグメントの近くのＸｈｏＩ
制限フラグメントは、λＨＶＴ０４（図１）からｐＭＤ
３６の中へサブクローンし、上記と同じ手順に従って部
分的な配列分析を行った。実施例４ 遺伝子挿入されたＨＶＴゲノム内の領域の同定および詳
細な分析が可能となれば、β−ガラクトシダーゼをコー
ドする遺伝子以外のいかなる遺伝子によっても、み換え
ＨＶＴウイルスを構築することができる。しかし、トリ
の病原体と関連する又は関係ない抗原をコードする遺伝
子が特に興味深い。このような適用例は、以下の項で示
す。興味のあるこの遺伝子は、ニワトリの伝染性の高い
コロナウイルスである伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）のペプロマー（ｐｅｐｌｐｍｅｒ）タンパクの１５
７kdプレカーサー分子をコードする。その典型的表面構
造の主成分であるグリコシル化タンパクは、ＩＢＶを含
むすべてのコロナウイルスにみられるスパイクとしても
知られている。この遺伝子のｃＤＮＡコピーを、マサチ
ューセッツ血清型に属するＩＢＶ株Ｍ４１から単離し、
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ由来のプロモー
ターエレメントの後に置いた。次に、このプロモーター
を含む遺伝子を、以前にβ−ガラクトシダーゼ発現カセ
ットの挿入に用いた通り、ｐＭＤ０７の唯一のＢａｌII
制限部位に伝達し、ＨＶＴウイルスゲノムの中へ組み換
えた。組み換えられた多数の子ウイルスは、スパイク遺
伝子の発現についてスクリーニングし、陽性候補物質を
単離し、限界希釈での１つ以上の平板培養によりクロー
ニングした。組み換えＩＢ／ＨＶＴウイルスの均質スト
ックを確立し、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおける特性決定に用いられた。１．ＩＢＶ株Ｍ４１からのスパテイク遺伝子単離 ＩＢＶ株Ｍ４１由来ウイルスは、孵化鶏卵の１０日卵の
尿膜腔に、５０％（ｍｅｄｉａｎ）卵感染価１０4 ／卵
を接種することにより増殖させた。卵を３７℃で２４時
間インキュベーションした後、４℃で一晩冷蔵した。尿
膜腔液は、氷冷下、注意して採取した。赤血球とその破
片は、４℃で、６０００×ｇ３０分間遠心分離すること
により除いた。ウイルスは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｙｐｅ
１９ローターを用いて、４℃，５４，０００×ｇ４時間
により上清から沈殿した。この沈渣を、冷ＴＮＥ（１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００mM ＮａＣｌ，１mM Ｅ
ＤＴＡ，pH７．５）の入った注射針に繰り返し通すこと
により再度懸濁させ、ＴＮＥ中２０〜６０％のショ糖直
線勾配３２mlの上にのせた。ＳＷ２８ローターを用いて
４℃，２４，０００rpm で終夜遠心分離後、注射筒でチ
ューブの側面を刺して、ウイルス層を採収した。ウイル
スを、ＴＮＥで２倍量に希釈した後、ＳＷ２８ローター
を用いて、４℃，１８，０００rpm ９０分間で沈殿させ
た。その物質を少量のＴＮＥで再度懸濁し、硫酸ドデシ
ルを最終濃度０．５％となるように加えた。この標本に
プロテインナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）２００μ
g ／mlを３７℃２時間作用させ、フェノール／クロロホ
ルムの１：１混合液で２回抽出した。水層のウイルスＲ
ＮＡは、０．１Ｍ酢酸ナトリウムpH６．０存在下−２０
℃で２倍量のエタノールで沈降した。遠心分離の後、チ
ューブをエタノールで洗浄し、沈渣を陰圧乾燥し、ＲＮ
Ａ濃度が０．５mg／mlとなるよう滅菌水で溶解した。標
本は、アガロースゲル電気泳動で調べたところ、ＩＢＶ
ゲノムＲＮＡを＞９０％含んでおり、−２０℃で保存し
た。第一の鎖状ｃＤＮＡ生合成は、オリゴ（ｄＴ）１２
−１８により、ＡＭＶ逆転写酵素存在下、７５μl の反
応溶液中５μg のウイルスＲＮＡを用いて開始した。４
４℃で３０分間インキュベーションの後、ＣＮＡ／ＲＮ
Ａハイブリッドを１００℃３分間の加熱により変性さ
せ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩ
由来の大フラグメント存在下、２０℃で２時間インキュ
ベートすることにより第二の鎖状ｃＤＮＡを生合成し
た。ｃＤＮＡは、エタノールで沈降し、２００μl の反
応溶液中、３７℃３０分間、Ｓ1 −ヌクレアーゼ１０単
位で切断した。反応産物は、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，５mM ＥＤＴＡ，５００mM ＮａＣｌ，pH７．５中
の５〜２０％ショ糖勾配３．２mlの上にのせ、ＳＷ６５
ローターを用いて、１５℃，３０，０００rpm１６時間
遠心分離した。５００〜５０００塩基対の大きさの沈殿
物質を採収し、エタノールで沈降させた後、２０μl の
０．１ssc （１５mM ＮａＣｌ，１．５mMクエン酸ナト
リウム）に溶解した。２本鎖ｃＤＮＡの末端は、末端ト
ランスフェラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１５単位と共
に、３０μl の反応溶液中、酵素提供者の指示した条件
に従って、３７℃２分間インキュベートすることによ
り、１０〜１５ｄＧ残基伸長した。反応は、５mM ＥＤ
ＴＡにより停止させた。余剰ｃＤＮＡの１０ngは、リン
酸化合成オリゴマー５′−ｄＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣ−３′の２．５モル過剰と共に、最終容量１０μ
l ＴＥＮ中で６５℃２分間加熱した後、５０℃で一晩イ
ンキュベーションすることにより共にアニーリングし
た。ＥｃｏＲＩ切断λｇｔ１０ ＤＮＡ（Ｈｕｙｎｈ
ら，１９８５）との結合は、３０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，pH７．５，１０mM ＭｇＣｌ2 ，１０mMＤＴＴ，
０．１mM ＡＴＰ溶液２０μl 中に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ１単位を加え、４℃で一晩インキュベートすることに
より行なった。ＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ
ング反応混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のhfl Ａ株上に平板培養した後、組み
換えファージを選択することにより、ＩＢＶ株Ｍ４１由
来のｃＤＮＡライブラリーを確立した。このライブラリ
ーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のローン上に、１００〜
２００pfu ／ペトリ皿を平板培養することにより、スパ
イクタンパクのフラグメントをコードするｃＤＮＡクロ
ーンをスクリーニングした。ニトロセルロースフィルタ
ーを２枚ずつ調整し（Ｂｅｕｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉ
ｓ，１９７８）、32Ｐ−標識合成オリゴマーと共に、１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１Ｍ ＮａＣｌ，
０．１％ＳＤＳとデンハート溶液４倍量を含むハイブリ
ダイゼーション溶液中で、４２℃一晩インキュベーショ
ンした（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）。これらのハ
イブリダーゼーションのプローブとして使用した、３種
の合成オリゴマーは、以下のヌクレオチド配列構造であ
った： Ｉ．５′−ｄＴＴＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣ
ＴＴＴＧＧＴＡＧＴＡＧＴＡ−３′ II．５′−ｄＴＡＣＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＣ
ＡＧＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧ−３′ III.５′−ｄＴＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴ
ＴＴＴＡＧＧＴＣＴＧＴＡＴＴＧＴＴ−３′ これらのプローブのうちの１つまたは選ばれた２つに対
し信号を示す組み換えファージが選択され、プラークは
標準的手法（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）により精
製された。λファージ組み換え体からのｃＤＮＡフラグ
メントは、ＥｃｏＲＩ制限部位と隣接し、クローニング
ベクターｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であるプラス
ミドのＥｃｏＲＩ部位の中へ接合伝達された。２つの候
補物質についての制限酵素分析と部分的配列決定では、
１つがスパイク遺伝子の完全なＳ1 をコードし、他方が
そのＳ2 の一部をコードすることを示した。これら２つ
のＤＮＡフラグメントの配列は、一部互いに重複してお
り、特に、Ｓ1 ／Ｓ2 結合部近くの唯一のＭｌｕＩ一制
限部位に関して重複していた。次に、この部位は、上記
２つのフラグメントを合せるために使用し、その結果、
ＩＢＶ株Ｍ４１由来ペプロマータンパンのプレカーサー
をコードする完全な遺伝子を有する、３．７kb Ｂａｍ
ＨＩ挿入部分を持つプラスミド構築物であることがわか
った。２．ＬＴＲプロモーターで制御される、Ｍ４１由来スパ
イク遺伝子をコードするＨＶＴ組み換えプラスミドｐＩ
Ｂ１８の構築 ＲＳＶのＬＴＲ配列から、ＨＴＶウイルスのゲノムに挿
入された後、外来遺伝子の発現を指示できる強力なプロ
モーターを選択した。このプロモーターは、ｐＲＳＶｃ
ａｔの５８０bp ＮｄｅＩ／Ｈｉｎｄ III制限フラグメ
ント上に位置し（Ｇｏｒｍａｎら，１９８２）、フラグ
メントの両側から２本鎖合成リンカーにより、ｐＧＥ３
Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄ III部位とＰｓｔＩ部
位の間に挿入した。ベクターｐＧＥ３ＺのＨｉｎｄ III
部位とＬＴＲプロモーターを運ぶＲＳＶフラグメントの
ＮｄｅＩ部位の間の結合は、片方の末端がＨｉｎｄ III
と他方末端がＮｄｅＩと結合可能な粘着末端を含む３０
bpリンカーにより形成された。しかし、結合後、６塩基
対認識配列のヌクレオチドの外側に、変性が起こること
が考えられるため、両制限部位共保存されない。これら
の２つの部位が消失するだけでなく、リンカーそのもの
に存在した新しい制限部位（ＢａｍＨＩ）が対応する位
置に創製された。２番目の２０bpリンカーは、ＬＴＲフ
ラグメント由来のＨｉｎｄ III部位と、ｐＧＥＭ３Ｚ由
来のＰｓｔＩ部位を結合させて合成したが、この場合、
両末端の認識配列は破壊されず、ｐＧＥＭ′３Ｚのポリ
リンカーにすでに存在するＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，Ｘｈｏ
Ｉ，ＢａｍＨＩ等の制限部位に３種の便利な唯一の制限
部位ＢｇｌII，ＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＶが加わっている。
得られたｐＧＥＭ３Ｚの誘導体は、ｐＶＥＣ０１とし、
従って、ＬＴＲプロモーター配列を運ぶ６５０bp制限フ
ラグメントのすぐ後に、外来遺伝子の挿入が可能な７つ
の制限部位を含んでいる。この６５０bpフラグメント
は、両末端をＢａｍＨＩ制限部位と隣接し、ｐＭＤ０７
の１．２kb ＨＶＴ挿入部分に存在する唯一のＢｇｌII
部位等に接合伝達される。これら２つの制限酵素により
できる粘着末端は、互いに結合可能であるが、結合する
と、ＢｇｌIIとＢａｍＨＩの元の認識配列のいずれも保
存しない。得られた構築物の１つは、ＴＲs に向う方向
にＬＴＲを担持するが、ｐＶＥＣ０４と名付け、制限酵
素地図で分析した（図４）。この普偏的なＨＶＴ組み換
えベクターの構造は、ＬＴＲプロモーターのすぐ下流に
外来遺伝子の挿入を可能にし、ｉｎ ｖｉｖｏの組み換
えにより、ＨＶＴゲノムに完全な発現カセットの組み込
みを可能にする。ＬＴＲの下流の異なる制限部位の位置
は、特に酵素ＢｇｌII，ＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＶの位置
は、多数の遺伝子挿入が可能なように設計される。この
ベクターの適用は、ＩＢＶ株Ｍ４１のスパイク遺伝子を
発現する組み換えＨＶＴウイルスの構築であり、その単
離は、前項で示されている。Ｍ４１のスパイク遺伝子を
運ぶ３．７kb ＢａｍＨＩ制限フラグメントは、ｐＶＥ
０４のＬＴＲプロモーター下流のユニックなＢａｌII部
位に挿入された。この操作でも、結合後制限部位のいず
れも保存されない。ＬＴＲプロモーターに対して正しい
方向に挿入された遺伝子を有する候補物質の１つは、図
５に示す予測される構造を確認する制限酵素地図により
分析した。このプラスミドは、ｐＩＢ１８とし、次に、
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の同時（コ）トランス
フェクションに用いた。３．ＩＢＶのスパイク遺伝子のＨＶＴゲノム挿入および
ベプロマータンパクの発現 ｐＩＢ１８由来の線状ＤＮＡは、ＨＶＴ感染ニワトリ細
胞由来の総ＤＮＡと共に、β−ガラクトシダーゼ組み換
え体の構築における実施例Ｉに示した方法に従って、ト
ランスフェクションした。スパイクタンパクを発現する
ＨＶＴ組み換え体の検出は、ＩＢＶに対する一価または
多価血清を用いた免疫螢光染色法により行なった。トラ
ンスフェクション後の一次培養は、新鮮なＣＥＦ上に一
度継代して取り出し、実施例１に前述のとおり超音波処
理を行なった。細胞を含まない溶解産物を定量した後、
ＣＥＦのマイクロタイタープレートに１ptu ／ウェル未
満の限界希釈において感染させ、ＣＰＥが検出されるま
でインキュベートした。各ウェルの細胞懸濁液を、新鮮
なＣＥＦと共に、２つのマイクロタイタープレートに別
々に分け、再度２日間インキュベートした。次に、プレ
ートの１つを固定し、ＩＢＶ特異血清で染色し、顕微鏡
下で免疫螢光を検査し、ＩＢＶ陽性染色ＨＶＴプラーク
の大部分を含むウェルをスコア化した。感染した生菌
を、２つのマイクロタイタープレートの対応するウェル
から回収し、新鮮ＣＥＦ上で１つまたは２つの継代によ
り増幅した。限界稀釈法に基づくこのクローニング手順
を数回繰り返し、感染した細胞培養に対するＩＢＶ特異
的免疫螢光アッセイにおいて陽性染色を示したすべての
組み換えＨＶＴウイルスのいくつかの独立した単離物が
得られた。実施例５ １．ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の融合
（Ｆ）およびヘマグルチニン（ＨＮ）タンパクとコード
する遺伝子の単離 ＮＤＶワクチン株クローン３０（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｏｌｌａｎｄ）由来のウ
イルスは、孵化鶏卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄｅｇｇ
ｓ）で３０時間増殖させ、＋４℃で一晩インキュベーシ
ョンした後、尿膜腔液を採収した。ウイルスは、一次シ
ョ糖勾配により精製し、ゲノムＲＮＡは、ＳＤＳ存在下
でプロテインナーゼＫ切断により抽出した。第一の鎖状
ｃＤＮＡ生合成は、反応を開始するために無作為１０塩
基オリゴマー２０μg ／mlを用いて、逆転写酵素と共に
行なった。第二の鎖状ｃＤＮＡ生合成、Ｓ1 −処理、そ
れからλｇｔ１０ベクターへの挿入を含む次の手順は、
実施例４の第１項に前述したとおりに行なった。このラ
イブラリーのＦ−遺伝子特異配列は、32Ｐ−標識オリゴ
ヌクレオチドとのプラークハイブリダイゼーションによ
りスクリーニングした。 Ｉ．５′ＧＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＣＧＧＣＴＧＣＡ
ＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧ３′ II．５′ＧＣＡＡＡＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＣ
ＣＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＴＧＧＣ３′ それぞれコードする領域の５′および３′末を認識す
る。ＨＮ遺伝子配列の識別には、以下のオリゴヌクレオ
チドを用いた。 III.５′ＧＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡ
ＴＧＧＣＧＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＣＧＧ３′ IV．５′ＧＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣ
ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＴ３′ これらのプローブの配列は、ＮＤＶ株のＡｕｓｔｒａｌ
ｉａ−Ｖｉｃｔｏｒｉａ（ＭｃＧｉｎｎｅｓら；１９８
６）、Ｉｔａｌｉｅｎ（Ｅｓｐｉｏｎら，１９８７およ
びＷｅｍｅｒｓら，１９８７）、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ
（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８６およびＭｉｌｌｅｒ
ら，１９８６）、Ｄ２６（Ｓａｔｏら，１９８７）にお
ける公表データと比較して設計された。これらのプロー
ブの少なくとも２つに対して信号を示す陽性候補物質を
単離し、制限酵素地図により特性決定をした。この一連
の物質から、それぞれＮＤＶ株クローン３０由来のＦお
よびＨＮを示す２物質を選択した。このＤＮＡ挿入部分
は、プラスミドベクターｐＧＥＭ４Ｚに接合伝達され、
Ｆ−およびＨＮ−遺伝子をコードする真の領域の上流ま
たは下流の余剰または重複配列を除くためにエクソヌク
レアーゼＢａｌ３１を作用させた。これにより、Ｂａｍ
ＨＩ制限部位に隣接するＦおよびＨＮをコードする完全
な遺伝子を含む、それぞれプラスミドｐＮＤＶ０１およ
びｐＮＤＶ０３を得た。２．ＨＤＶ由来のＦ−およびＨＮ−遺伝子のＨＶＴゲノ
ムへの挿入 それぞれＦおよびＨＮをコードする遺伝子を含むプラス
ミドｐＮＤＶ０１およびｐＮＤＶ０３のＢａｍＨＩフラ
グメントを、ＨＶＴ組み換えベクターｐＶＥＣ０４のＢ
ｇｌII部位の中へ挿入し、ｐＮＤＶ０４およびｐＮＤＶ
０５とした。挿入された遺伝子のＬＴＲプロモータに対
する正しい方向は、図６に示したこれらの構築物の物理
的地図に基づいた制限分析により証明した。これらのプ
ラスミドのＤＮＡは、実施例１の第２項で示したよう
に、ＨＶＴ感染細胞のＤＮＡと共に、ＣＥＦ中にコトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションされた細
胞培養を増幅した後、細胞を含まない溶解産物を作成
し、マイクロタイマー皿の上で平板培養した。Ｆまたは
ＨＮタンパクを発現するＨＶＴ組み換え体の検出は、多
価ＮＤＶ血清またはＮＤＶ抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体を用いた免疫螢光染色により行なった。ＨＶＴ組
み換えウイルスの集積は、実施例４の第３項に示された
ように限界希釈により行なった。均一な組み換えウイル
ス標本の確立は、単一プラーク分離により行ない、感染
したＣＥＦにおけるそれぞれＦおよびＨＮの発現を免疫
螢光染色により検査した。参考文献 １．Benton, W.D. and Davis, R.W. (1978), Science, 196 , 180. ２．Chambers et al. (1986), J.Gen 67, 2685. ３．Espion et al. (1987), Arch. Virol. 95 ,79. ４．Gorman, C. et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777. ５．Graham, f. and v.d. Eb, A. (1973), Virology, 52 , 456. ６．Henikoff, S. (1984), Gene, 28 , 351. ７．Huynh, T.V., et al. (1985) in “DNA cloning, Vol.I”, ed. D. Glover, Pag. 49. ８．Igarashi, T., et al. (1987), Virology, 157, 351. ９．Maniatis, T., et al. (1982) in “Molecular cloning ”, Cold Spring Harbor laboratory. 10．McGinnes et al. (1986), Virus Res. 5, 343. 11．Millar et al. (1986), J. Gen. Virol. 67 , 1917. 12．Sanger, I., et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 , 5463. 13．Sato et al. (1987), Virus Res. 7, 241. 14．Wemers et al. (1987), Arch. Virol. 97 , 101.
【０００２】
【配列表】 (2) 配列番号１： (i) 配列特徴： (A) 長さ：４５２７塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：２本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類 ：ＤＮＡ（ゲノム） (vi)起源： (A) 生物名：シチメンチョウヘルペスウイルス (B) 株名：ＰＢ−ＴＨＶ１ (ix)特徴 (A) 名前／キー：ＣＤＳ (B) 位置：１..８１ (D) 他の情報：／ラベル＝ＯＲＦ１末端 (ix)特徴 (A) 名前／キー：ＣＤＳ (B) 位置：３１６..９４５ (D) 他の情報：／ラベル＝ＯＲＦ２ (ix)特徴 (A) 名前／キー：ＣＤＳ (B) 位置：相補（１０８４..２１２４） (D) 他の情報：／ラベル＝ＯＲＦ３ (ix)特徴 (A) 名前／キー：ＣＤＳ (B) 位置：相補（２３２２..３１７０） (D) 他の情報：／ラベル＝ＯＲＦ４ (ix)特徴 (A) 名前／キー：ＣＤＳ (B) 位置：３３２０..４５０４ (D) 他の情報：／ラベル＝ＯＲＦ５
【０００３】
【表２】
【表３】
【表４】
【０００４】
【表５】
【０００５】
【表６】
【表７】
【０００６】
【表８】
【表９】
【０００７】
【表１０】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
図１はＨＶＴゲノムのＵｓ領域と本質的に対応したＤＮ
Ａフラグメントの制限酵素地図である。４つの開放型読
み枠からなる挿入領域の相対的位置と、その間のコード
しない配列を示す。 図２はプラスミドの制限酵素地図を示す。 Ａ）ｐＭＤ０７ｇａｌの制限酵素地図。このプラスミド
は、ＨＶＴゲノムの１．２ｋｂＸｈｏＩフラグメント中
に存在する独特のＢｇｌＩＩ制限部位に、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を挿入することにより、ｐＭＤ０７から
得られた。 Ｂ）ｐＭＤ１２ｇａｌの制限酵素地図。このプラスミド
は、ＨＶＴゲノムの３．５ｋｂＸｈｏＩフラグメント中
に存在する独特のＢｇｌＩＩ制限部位に、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を挿入することにより、ｐＭＤ１２から
得られた。 図３はプラスミドの制限酵素地図を示す。 Ａ）ｐＭＤ４０の制限酵素地図。ｐＭＤ１２中に存在す
る１１１７ｂｐＳｐｅＩフラグメントは、ＳａｌＩ部位
を含む合成オリゴヌクレオチドにより置換された。 Ｂ）ｐＭＤ４４の制限酵素地図。これは、ｐＭＤ４０の
ＳａｌＩ部位に、ＳａｌＩ部位に隣接した４．０ｋｓβ
−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の挿入することによ
り、ｐＭＤ４０から得られた。 図４はｐＶＥＣ０４の制限酵素地図を示す。ｐＭＤ０７
由来の１．２ｋｂＸｈｏＩＨＶＴフラグメントの独特の
ＢｇｌＩＩ部位の中へ、ＬＴＲプロモーターが挿入され
ているのを示す。 図５はｐＩＢ１８の制限酵素地図を示す。ＩＢＶ株Ｍ４
１由来のスパイク遺伝子を運ぶ３．７ｋｂＢａｍＨＩフ
ラグメントが、ＬＴＲプロモーターの下流のｐＶＥＣ０
４のＢｇｌＩＩ部位の中へ挿入されているのを示す。 図６はプラスミドの制限酵素地図を示す。 Ａ）ｐＮＤＶ０４の制限酵素地図。ＢａｍＨＩ部位に隣
接するＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含むプラスミドは、ｐＶＥＣ
０４のＢｇｌＩＩ部位の中へ挿入された（第４図参
照）。 Ｂ）ｐＮＤＶ０５の制限酵素地図。ＢａｍＨＩ部位に隣
接するＮＤＶ−ＨＮ遺伝子を含むプラスミドは、ｐＶＥ
Ｃ０４のＢｇｌＩＩ部位の中へ挿入された（第４図参
照）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｊ 15/09 ＺＮＡ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/569 (Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｇ０１Ｎ 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ヨハンネス・アントニウス・ヨセフ・ク ラエツセンス オランダ国、5831・エム・エル・ボツク スメール、メース・25 (72)発明者 アルバート・フイリツプ・エイドリア ン・モケツト イギリス国、ペリー、ハンテイングト ン・ゲームズ、ピー・イー・18．オー・ デイー・５、チヤイチエスター・ウエ イ・15 (56)参考文献 特表 平２−500640（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500409（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．84（２），ｐ. 399−405（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 7/00 A61K 38/00 A61K 39/245 A61K 39/395 C07K 19/00 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 15/00 C12P 21/08 G01N 33/569 G01N 33/577 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 組換えHVTであって、ヘテロな核酸配列
    を含むことを特徴とし、該核酸配列は、図１に定義され
    る制限酵素地図を持つHVTゲノムのDNAフラグメント内に
    位置する、ORF-1の末端からORF-5まで（ORF-5を含む）
    のゲノム領域に対応するHVTゲノムの挿入領域に導入さ
    れている前記組換えHVT。
  2. 【請求項２】 組換えHVTであって、ヘテロな核酸配列
    を含むことを特徴とし、該核酸配列は、SEQID No:1に
    於いて示されるDNA配列により定義されており、ヌクレ
    オチド82位からヌクレオチド4504位までの間のDNA配列
    に対応するHVTゲノムの挿入領域に導入されている前記
    組換えHVT。
  3. 【請求項３】 挿入領域が、ORF-2、ORF-３、ORF-４又
    はORF-５に対応することを特徴とする請求項１、又は２
    記載の組換えHVT。
  4. 【請求項４】 ヘテロな核酸配列がORF-2又はORF-3内に
    存在するBgl II 制限酵素部位に取り込まれることを特
    徴とする、請求項３記載の組換えHVT。
  5. 【請求項５】 挿入領域内のHVT核酸配列の少なくとも
    一部が欠失していることを特徴とする請求項１乃至４記
    載のHVT。
  6. 【請求項６】 ヘテロな核酸配列がポリペプチドをコー
    ドしており、組換えHVTで感染した細胞内で該核酸配列
    の発現を調節するプロモーターのコントロール下にある
    ことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記
    載の組換えHVT。
  7. 【請求項７】 ヘテロな核酸配列が鳥類病原体の抗原を
    コードすることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれ
    か一項に記載の組換えHVT。
  8. 【請求項８】 抗原が、マレク病、感染性気管支炎ウイ
    ルス、ニューカッスル病ウイルス及び感染性嚢病ウイル
    スを含む群から誘導されることを特徴とする、請求項７
    に記載の組換えHVT。
  9. 【請求項９】 HVTに対してヘテロな遺伝子又はその一
    部を少なくとも含み、プロモーターのコントロール下に
    あり、ORF-1末端からORF-5まで（ORF-5を含む）のHVTゲ
    ノム領域に対応するHVTゲノムの挿入領域から誘導され
    たDNA配列にフランクされている核酸。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の核酸を含む組換えDN
    A分子。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載の核酸、又は請求項１
    ０に記載の組換えDNA分子によって形質転換されている
    宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 適当な細胞培養物をHVT DNA及び請求
    項１０に記載の組換えDNA分子でコトランスフェクショ
    ンすることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一
    項に記載の組換えHVTの製造方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載
    の組換えHVTに感染している細胞培養物。
  14. 【請求項１４】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載
    の組換えHVTを含むワクチン。
  15. 【請求項１５】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載
    の組換えHVTにより発現されたポリペプチドを含有する
    ワクチン組成物。
  16. 【請求項１６】 HVT含有材料が、請求項１３記載の細
    胞培養物から回収され、ワクチンとして処理されること
    を特徴とする、ワクチンの製造方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載
    されている組換えHVTにより発現されたポリペプチドを
    免疫、治療又は診断用活性を有する調製物に処理するこ
    とを特徴とする、ワクチン、医薬又は診断用組成物の製
    造方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１乃至８のいずれか一項に記載
    の組換えHVTに対する抗体を含有する抗血清。
  19. 【請求項１９】 請求項１４記載のワクチンを非ヒト動
    物に投与することを含んで成る、感染症に対する非ヒト
    動物の免疫法。
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