BR112020019268A2 - Novo ehv com ul18 e/ou ul8 inativados - Google Patents

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Ramesh KOUKUNTLA
Jana M. Larsen
Robert Barry MANDELL
Luka N. Pelz
Eric Martin VAUGHN
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Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
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Abstract

a presente invenção refere-se ao campo de vacinas (vetor) e, especialmente, a novos ehvs tendo uma inativação de ul18 e/ou ul8. a presente invenção refere-se adicionalmente aos cassetes de expressão e vetores relacionados, que são apropriados para expressar genes de interesse, especialmente sequências de codificação de antígeno. os vetores virais da presente invenção são utilizáveis para produzir uma composição imunogênica ou uma vacina.

Description

NOVO EHV COM UL18 E/OU UL8 INATIVADOS
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001]Este pedido contém uma Listagem de Sequências de acordo 37 C.F.R. 1.821 – 1.825. A Listagem de Sequências que acompanha este pedido é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A. Campo da Invenção
[002]A presente invenção refere-se ao campo de vacinas (vetor) e, especialmente, à inativação de UL18 e/ou UL8 em EHV. A presente invenção refere-se adicionalmente a EHVs deficientes em replicação tendo uma inativação de UL18 e/ou UL8. A presente invenção refere-se adicionalmente a cassetes de expressão e vetores relacionados, que são apropriados para expressar genes de interesse, especialmente sequências de codificação de antígeno. Os vetores virais da presente invenção são utilizáveis para produzir uma composição imunogênica ou vacina. B. Fundamento e Descrição da Técnica Relacionada
[003]O patógeno de cavalos Alfaherpesvírus equídeo 1 (vírus do aborto equino, EHV-1) pertence ao gênero Varicellovírus na subfamília Alfaherpesvirinae na família Herpesviridae na ordem Herpesvirales. Ele é um vírus grande, envelopado com um DNA fita-dupla genoma de aproximadamente 150.000 pares de base. Outros membros importantes do subgênero Varicellovírus são o Alfaherpesvírus Humano 3 (Vírus de Varicella Zoster), Alfaherpesvírus Suídeo 1 (vírus de Pseudoraiva), Alfaherpesvírus Bovino 1 (Vírus da Bronquite Infecciosa), e Alfaherpesvírus equídeo 4 (Vírus da Rinopneumonite equina,
EHV-4) (Taxonomia do vírus: 2015 Release EC 47, Londres, UK, Julho 2015; ratificação por Email 2016 (MSL #30)). EHV-1 e EHV-4 são endêmicos e afetam os cavalos em todo o mundo. Enquanto EHV-4 causa uma infecção geralmente leve do trato respiratório superior, EHV-1 pode causar infecção sistêmica com uma variedade de doenças, desde sintomas respiratórios até aborto e mieloencefalopatia letal, dependendo da cepa e do estado imunológico do hospedeiro. Duas vacinas vivas modificadas licenciadas (MLV) contra EHV-1 estão atualmente disponíveis nos Estados Unidos e na Europa, respectivamente, Rhinomune® (Boehringer Ingelheim) e Prevaccinol® (MSD). Ambas contêm a cepa RacH de EHV-1 classicamente atenuada, que foi passada 256 vezes em células epiteliais de porcino para atenuação (Ma et al. 2013). O mecanismo de atenuação foi investigado em nível molecular. Osterrieder et al. (1996) mostraram que RacH é desprovida de duas cópias genômicas de orf67 (IR6) e que restauração de uma cópia foi suficiente para restaurar a virulência. Além disso, RacH carrega uma deleção de 1283 bp removendo mais de 90% da sequência de codificação de orf1 (UL56) que codifica uma proteína viral imunossupressora. Outras mutações também podem influenciar atenuação, mas não foram investigadas em detalhes, até agora. Tudo isso torna RacH uma cepa de vacina muito segura, já que a reversão à virulência por passagem em animais vacinados é altamente improvável, se for possível de todo.
[004]Duas variantes de um cromossomo artificial bacteriano de E.coli (BAC) abrigando o genoma completo da vacina de Alfaherpesvírus Equídeo 1 (EHV-1) cepa RacH: pRacH e pRacH-SE são conhecidas como uma plataforma para o desenvolvimento da vacina do vetor. O BAC pRacH-SE foi criado com base em pRacH, um BAC originalmente clonado no laboratório de Klaus Osterrieder, FU Berlim. pRacH tinha uma deleção de orf71 (US5) codificando glicoproteína II (gpII; Wellington et al., 1996). Em seu local, as sequências do BAC-vetor e um cassete de expressão de GFP foram introduzidos. A fim de resgatar RacH de EHV-1 não modificado de pRacH, ele precisou ser co-transfectado com um plasmídeo contendo o orf71 completo (US5) mais regiões de flanco, de modo que, durante o curso de replicação viral do vetor BAC, porções da sequência e o cassete de expressão de GFP foram substituídos por orf71 (US5) através de recombinação homóloga, de modo que o genoma original de RacH poderia ser restaurado. pRacH foi modificado na presente invenção de modo que as sequências de vetor BAC/cassete de expressão de GFP se tornam auto-excisáveis (SE) quando da transfecção em culturas celulares (Tischer et al., 2007). Este BAC aperfeiçoado foi designado pRacH- SE. pRacH e pRacH-SE podem servir, ambos, como plataformas para o desenvolvimento de vacina de vetor, com a única diferença de que pRacH-SE facilita o resgate de vírus reparado por orff71 (US5) de modo significante.
[005]Foi demonstrado que vacinas de vetor à base de RacH de EHV-1 são capazes de elicitar imunidade em várias espécies de mamíferos incluindo porcos, bovinos e cachorros (Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, dito et al. 2013). Genes codificando para proteínas antigênicas de patógenos podem ser expressados por RacH de EHV-1 recombinante. O genoma EHV-1-RacH é manipulado em sua forma BAC em E.coli e ajustado para expressar proteínas adicionais geralmente por inserção de cassetes de expressão de transgene (Tischer et al., 2010). Quando da transfecção de DNA de pRacH-SE em células permissivas cultivadas, replicação de EHV-1 é iniciada por fatores de transcrição celular. A atividade da DNA viral polimerase leva à deleção de todas as sequências relacionadas com o vetor BAC e restauração do genoma EHV-1-RacH para seu estado original. Vírus infeccioso é gerado, o qual não é distinguível de RacH.
[006]Quando pRacH-SE é manipulado em E.coli, por exemplo, por inserção de cassetes de expressão de transgene, vírus reconstituído após transfecção em células permissivas irá carregar a modificação e expressar o gene adicional. O RacH de EHV-1 recombinante pode ser usado como uma vacina de vetor.
[007]Cepas de EHV-1 tipo selvagem possuem três quadros de leitura aberta (orf) chamados orf1 (UL56), orf 2 e orf3 em uma extremidade do segmento único longo de seu genoma (coordenadas de sequência 1298-3614; figura 1). Orf1 (UL56) e orf3 são dispostos em série em uma fita do DNA, enquanto orf 2 é codificado por fita complementar. A cepa RacH de vacina tem uma deleção de 1283 bp nesta região afetando orfs 1 e 2 indicando que estes genes não são essenciais para a replicação viral. Por esta razão, o sítio serve como um sítio de inserção de transgene. Este sítio de inserção é chamado ORF1/3 (UL56).
[008]No entanto, o tamanho e número de transgenes que podem ser inseridos no sítio de inserção ORF1/3 (UL56) são geralmente limitados. Assim, a fim de aumentar as capacidades do vetor de EHV, existe uma necessidade não atendida para modos novos e alternativos para inserir e expressar transgenes do vetor de EHV, especialmente o vetor recombinante RacH de EHV-1.
[009]Seria benéfico disposto de uma vacina vetorizada com EHV deficiente em replicação. Uma tal vacina vetorizada com EHV deficiente em replicação não pode replicar no animal hospedeiro e não se espalha de um animal para outro animal e, assim, é vantajosa por razões de segurança ou regulatórias.
[0010]Barnard et al 1997 (Virology; 237, 97–106) descrevem que alguns mutantes de UL8 em Vírus de Herpes Simplex Tipo 1 mostram alguma inibição de replicação. Adicionalmente, Muylaert et al 2012 (Journal of Biological Chemistry; VOL. 287, NO. 40, pp. 33142–33152) descrevem alguns mutantes de UL8 em vírus de Herpes Simplex Tipo 1 tendo defeitos na síntese de DNA. Em adição, algumas mutações foram introduzidas em EHV e fenótipos similares foram observados quando as mutações correspondentes foram introduzidas em UL8 de EHV-1.
[0011]CN 105641692 A descreve a deleção completa (nocaute) de UL18 no vírus de Herpes Simplex Tipo 1 (HSV- 1). No entanto, CN 105641692 A descreve que a taxa de inibição de placa é reduzida para dito nocaute de UL18 em HSV-1 por cerca de 80%, mas a replicação não foi completamente abolida. Adicionalmente, CN 105535959 também estudou o fenótipo de nocaute de UL18 em HSV-1 e descreve que a replicação e a infecção foram menores de modo significante e que quase nenhuma infecção foi observada. Assim, com relação à replicação, CN 105535959 descreve um fenótipo similar como o de CN 105641692 A (uma redução, mas não abolimento completo de replicação). Adicionalmente, CN 105535959 quase não descreve nenhuma infecção para o nocaute de UL18 em HSV-1, o que é problemático para uma vacina vetorizada (tal como uma vacina de EHV recombinante) porque as vacinas vetorizadas precisam infectar as células hospedeiras para fornecer uma resposta imune adequada. Em particular, infectividade e expressão de transgenes em células infectadas são essenciais para vacinas vetorizadas expressando antígenos estranhos para serem eficazes. Assim, nota-se uma necessidade não atendida para vetor deficiente em replicação (mas infeccioso) de sistemas de EHV.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012]A fim de aumentar as capacidades do vetor de EHV, a presente invenção prevê modos para produzir EHVs deficientes em replicação e para inserir e expressar transgenes a partir de cadeia principal do vetor de EHV.
[0013]A presente invenção refere-se a EHVs deficientes em replicação compreendendo uma inativação de UL18 e/ou UL8 e novos sítios de inserção de transgenes alternativos UL18 e/ou UL8 que podem ser usados para inserir sequências transgênicas e expressar proteínas a partir de um vetor de EHV.
[0014]A inativação de UL8 e/ou UL18 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
[0015]A presente invenção refere-se adicionalmente a células de hospedeiros mamíferos compreendendo um vetor de EHV deficiente em replicação da presente invenção.
[0016]A presente invenção refere-se adicionalmente a linhagens de células expressando UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo para cultivar o vetor de EHV deficiente em replicação da presente invenção.
[0017]A presente invenção refere-se adicionalmente a linhagens de células compreendendo um plasmídeo compreendendo um cassete de expressão compreendendo UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo, em que a linhagem de células está expressando UL8 e/ou UL18 ou partes funcionais dos mesmos.
[0018]A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo a inativação de UL18 e/ou UL8 de acordo com a presente invenção.
[0019]A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo as etapas de: a) fornecer um EHV tipo selvagem ou um EHV atenuado; b) inativar UL18 e/ou UL8 do EHV de etapa a) e selecionar por clones de EHV que não estão carregando parte completa ou funcional de UL18 e/ou UL 8; c) fornecer uma linhagem de células de complementação expressando UL18 e/ou UL8 ou partes funcionais dos mesmos; d) obter o Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) por cultivo do EHV a partir de etapa b) com a linhagem de células de complementação a partir de etapa c).
[0020]A presente invenção refere-se adicionalmente a composições imunogênicas compreendendo um ou mais vetores de EHV da presente invenção.
[0021]A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos para imunizar um indivíduo compreendendo administrar a um tal indivíduo uma composição imunogênica da presente invenção.
[0022]A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos de tratamento ou prevenção de sinais clínicos causados por um patógeno em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica da presente invenção.
[0023]Assim, a solução para o problema técnico acima descrito é obtida pela descrição e as modalidades caracterizadas nas reivindicações e a invenção em seus diferentes aspectos é implementada de acordo com as reivindicações.
[0024]Estas propriedades permitem a criação de vacinas de vetor recombinante com base em EHV sendo deficientes em replicação por inativação de UL18 e/ou UL8. Adicionalmente, antígenos podem ser inseridos no dito vetor de EHV. Pelo menos um antígeno de outro sítio de inserção ORF1/3 (UL56) e/ou US4 (ORF70) ou pelo menos dois diferentes antígenos em paralelo com eficiência similar podem ser expressados a partir de ORF1/3 (UL56) e/ou US4 (ORF70). Adicionalmente, pelo menos um antígeno do sítio de inserção UL18 e/ou UL8 recentemente descrito ou pelo menos dois diferentes antígenos em paralelo com eficiência similar de UL18 e/ou UL8 recentemente descrito podem ser expressados. Além disso, antígenos a partir de ambos os sítios de inserção UL18 e/ou UL8 recentemente descritos e dito outro sítio de inserção ORF1/3 (UL56) e/ou US4 (ORF70) podem ser expressados. A vacina de vetor de EHV deficiente em replicação é vantajosa por razões de segurança e regulatórias. Adicionalmente, se um alvo de vacina consiste em dois ou mais diferentes patógenos/antígenos, a aplicação de novo sítio de inserção UL18 e/ou UL8 em paralelo com um sítio de inserção estabelecido como ORF1/3 (UL56) e/ou US4 (ORF70) pode reduzir o custo de bens de modo significante e representar uma vantagem clara sobre um vetor expressando somente um componente antigênico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025]Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.
[0026]Figura 1: Mapa de plasmídeo do plasmídeo de expressão, pCEP-ORF43(CO). Este vetor expressa um gene de EHV-1 ORF43 otimizado no códon através de um promotor CMV e foi usado para gerar uma das linhagens de células estáveis.
[0027]Figura 2: Mapa de plasmídeo do plasmídeo de expressão, pCEP-ORF54(CO). Este vetor expressa um gene de EHV-1 ORF54 otimizado no códon através de um promotor CMV e foi usado para gerar uma das linhagens de células estáveis.
[0028]Figura 3: Ilustração esquemática de clonagem de RFP dirigido por mCMV em sítio ORF 43 em DNA de EHV-1 BAC, com a região ORF42-ORF45 aumentada. UL = segmento único longo US = segmento único curto IR = repetição invertida interna TR = repetição invertida terminal orf = quadro de leitura aberta bp = pares de base
[0029]Figura 4: Ilustração esquemática de clonagem de RFP em sítio ORF 43 em DNA de EHV-1 BAC, com a região ORF42-ORF45 aumentada. UL = segmento único longo US = segmento único curto IR = repetição invertida interna TR = repetição invertida terminal orf = quadro de leitura aberta bp = pares de base
[0030]Figura 5: Recombinação de red modificado usada para clonagem de RFP em região ORF43. Painel superior: Plasmídeos fora de escala. Plasmídeo SceI/Kan digerido com endonuclease de restrição I-CeuI. Fragmento SceI/Kan (flanqueado por sequências ORF 43) transformado em células GS183 carregando DNA de EHV-/RacH BAC. A seleção de cloranfenicol e canamicina foi usada para selecionar clones EHV-1/RacH onde ORF43 foi substituído por SceI/Kan. O clone intermediário foi designado EHV-1/SceI-Kan. Painel inferior: Plasmídeos fora de escala. DNA g-block de RFP (flanqueado por sequências ORF 43) foi transformado em células GS1783 carregando EHV-1/SceI-Kan, incubado com Arabinose e selecionado com Cloranfenicol/Arabinose. DNA de RFP substituiu o fragmento SceI/Kan em ORF43 em clones EHV- 1/Sce-Kan para gerar EHV-1-43-RFP.
[0031]Figura 6: Ilustração esquemática de clonagem de mCMV-RFP-pA em sítio EHV-1 ORF 54 em DNA de EHV-1 BAC, com a região ORF53-ORF55 aumentada. UL = segmento único longo
US = segmento único curto IR = repetição invertida interna TR = repetição invertida terminal orf = quadro de leitura aberta bp = pares de base
[0032]Figura 7: Células ST (painel superior), ST-43-CO e (painel do meio), ST-54-CO infectadas com vírus EHV- 1/RacH mostram CPE similar. Células infectadas expressam GFP (painel direito), mas não RFP (dados não mostrados).
[0033]Figura 8: ST (painel superior) e ST-43-CO e (painel inferior) vírus rEHV-1-43-RFP. Células infectadas expressam GFP (painel do meio) e RFP (painel direito), mas espalhamento de vírus e CPE observados apenas em rEHV-1-43- RFP vírus células ST-43-CO infectadas.
[0034]Figura 9: ST (painel superior) e ST-43-CO e (painel inferior) rEHV-1-43-mCMV-RFP vírus. Infectadas células expressam GFP (painel do meio) e RFP (painel direito), mas vírus espalhamento e CPE observados apenas em células ST-43-CO infectadas com vírus rEHV-1-43-mCMV-RFP.
[0035]Figura 10: ST (painel superior) e ST-54-CO e (painel inferior) vírus rEHV-1-54-mCMV-RFP. Células infectadas expressam GFP (painel do meio) e RFP (painel direito), mas espalhamento de vírus e CPE observados apenas em células ST-54-CO infectadas com vírus rEHV-1-54-mCMV- RFP.
[0036]Figura 11: Mapa de plasmídeo de vetor de transferência pU70-p455-71K71.
[0037]Figura 12: Mapa de plasmídeo do plasmídeo de transferência para inserção de cassete de expressão p455- H3-71 em ORF70 de EHV-1 RacH.
[0038]Figura 13: Ilustração esquemática do genoma de rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 com a região de inserção orf70 aumentada. orf69: quadro de leitura aberta número 69 a montante do sítio de inserção em orf70; p455: novo promotor descrito aqui, ver, por exemplo, exemplo 1; H3: transgene Vírus de Influenza hemaglutinina; 71pA: nova sequência de poliadenilação; ∆orf70: restante de orf70 contendo o promotor para orf71, que codifica a glicoproteína viral II estrutural (gpII).
[0039]Figura 14: Ensaio de imunofluorescência indireta: Ensaio de imunofluorescência indireta de células VERO infectadas com rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3. 24 h p.i. células foram fixadas com etanol e secadas ao ar. Usando um anticorpo monoclonal comercial contra H3 como anticorpo primário e um IgG anti-camundongo de coelho conjugado a FITC como anticorpo secundário, H3 foi mostrado em células infectadas com o EHV-1 RacHSE-70-p455-H3 recombinante por microscopia de fluorescência.
[0040]Figura 15: Temperaturas médias corporais de grupos antes e em 1, 2, e 3 dias após desafio. Barras de erro, desvios padrão. Da esquerda para direita por dia de estudo: grupo de controle negativo (controle negativo), grupo de controle de desafio (controle de desafio), animais vacinados uma vez com RacH-SE-70-p455-H3 (1x EHV-1), vacinados duas vezes com RacH-SE-70-p455-H3 (2x EHV-1), ou duas vezes com vacina inativada IAV suíno (2x mortos).
[0041]Figura 16: Classificações medidas de pulmão de grupos de um e três dias após desafio. Barras de erro, desvios padrão. Grupo de controle negativo (controle negativo), grupo de controle de desafio (controle de desafio), animais vacinados uma vez com RacH-SE-70-p455-H3 (1x EHV-1), vacinados duas vezes com RacH-SE-70-p455-H3 (2x EHV-1), ou duas vezes com vacina inativada IAV suíno (2x morto).
[0042]Figura 17: Títulos virais: Gráficos mostrando cargas virais de amostras de pulmão de porcos vacinados ou não vacinados após desafio. Inat. = vacina inativada comercialmente disponível. EHV= rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3
[0043]Figura 18: Títulos de neutralização de soro recíprocos (SN) de soro animal contra desafio IAV H3 Suíno cepa R452-14 coletado em dia de desafio. 20, limite de detecção. Grupo de controle negativo (controle negativo), grupo de controle de desafio (controle de desafio), animais vacinados uma vez com RacH-SE-70-p455-H3 (1x EHV-1), vacinados duas vezes com RacH-SE-70-p455-H3 (2x EHV-1), ou duas vezes com vacina inativada IAV suíno (2x morto).
[0044]Figura 19: Ensaio IFA com ST-43-CO infectado com vírus rEHV-1-∆ORF43-HA (painel superior) e células ST de não complementação (painel inferior). Células infectadas expressam EHV-1 (painel esquerdo) e proteínas HA (painel direito), mas espalhamento de vírus e CPE observados apenas em células ST-43-CO infectadas com vírus rEHV-1-∆ORF43-HA.
[0045]Figura 20: Ensaio HI com soro de controle e porcos vacinados com vírus rEHV-1-∆ORF43-HA (5 porcos cada grupo).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0046]A presente invenção resolve os problemas inerentes da técnica anterior e proporciona um avanço distinto no estado da técnica.
[0047]A presente invenção refere-se adicionalmente a um herpesvírus equídeo (EHV), especificamente um Alfaherpesvírus equídeo, tal como EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV- 8 e EHV-9, mais especificamente um vetor de Alfaherpesvírus equídeo 1 (EHV-1), o mais especificamente cepa RacH, compreendendo uma inativação de UL18 e/ou UL8.
[0048]Geralmente, a presente invenção provê um vetor de Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV), preferivelmente cepa RacH, compreendendo uma inativação de UL18 e/ou UL8.
[0049]Com vantagem, os vetores de EHV, como descritos aqui, apresentam um fenótipo deficiente em replicação. Tal vacina de vetor de EHV deficiente em replicação não replica no animal hospedeiro e não se espalha de um animal para outro animal e, assim, é vantajosa por razões de segurança ou regulatórias.
[0050]Em um aspecto do vetor da presente invenção, UL18 é inativado.
[0051]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, UL8 é inativado.
[0052]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, UL18 e UL8 são inativados. Inativação de UL18 e UL8
[0053]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inativação de UL18 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
[0054]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inativação de UL8 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
[0055]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o códon de partida de UL18 (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) é inativado.
[0056]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, dita inativação do códon de partida (ATG) de UL18 é uma deleção, substituição, inversão ou inserção.
[0057]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o códon de partida de UL8 (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) é inativado.
[0058]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, dita inativação do códon de partida (ATG) de UL8 é uma deleção, substituição, inversão ou inserção. Inativação de UL18
[0059]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos do 5’-Término do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) do UL18 são deletados, substituídos ou invertidos.
[0060]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos dos A, T, ou G do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) do UL18 são deletados, substituídos ou invertidos.
[0061]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL18.
[0062]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:1 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL18.
[0063]Em outro aspecto do vetor da presente invenção,
pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos são inseridos dentro do UL18. Inativação de UL8
[0064]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos do 5’-Término do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) do UL8 são deletados, substituídos ou invertidos.
[0065]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos dos A, T, ou G do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) do UL8 são deletados, substituídos ou invertidos.
[0066]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL8.
[0067]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:2 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL8.
[0068]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, pelo menos 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos são inseridos dentro do UL8. Cassete de expressão
[0069]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, é operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:9 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO.: 6 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:10 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[0070]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO.: 9 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:10 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[0071]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse,
preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno é operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO.: 12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[0072]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[0073]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inserção do cassete de expressão inativa UL18 e/ou UL8.
Deleção por inserção do cassete de expressão em UL18
[0074]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inserção do cassete de expressão em UL18 é caracterizada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 945 bp dentro de UL18 para RacH (SEQ ID NO:1) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma. Deleção por inserção do cassete de expressão em UL8
[0075]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inserção do cassete de expressão em UL8 é caracterizada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 2256 bp dentro de UL8 para RacH (SEQ ID NO:2) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma. Regiões de flanco para UL18
[0076]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[0077]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:9, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:10. Regiões de flanco para UL8
[0078]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[0079]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12.
[0080]A presente invenção refere-se adicionalmente a um plasmídeo compreendendo as regiões de flanco para recombinação homóloga ou recombinação mediada por red (ver ambas descritas acima) em um sítio alvo específico no genoma do vetor viral, preferivelmente no sítio UL18 e/ou UL8 do vetor de EHV, especificamente EHV-1, mais especificamente o vetor de RacH. EHV Recombinante
[0081]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, dito vetor de EHV é um EHV não natural e/ou recombinante. Definição funcional para deficiente em replicação
[0082]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 90%.
[0083]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 95%.
[0084]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 99%.
[0085]Em outro aspecto do vetor da presente invenção,
deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 99,5%.
[0086]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 99,75%.
[0087]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é abolida completamente.
[0088]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a taxa de replicação é medida por um TCID50 ensaio.
[0089]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV deficiente em replicação ainda é infeccioso.
[0090]Com vantagem, o vetor de EHV como descrito aqui tem um fenótipo deficiente em replicação, mas ainda é infeccioso. Uma infectividade é necessária porque a vacina de vírus precisa infectar as células hospedeiras para fornecer resposta imune adequada. Em particular, infectividade é necessária para vacinas de vetor viral expressando antígenos estranhos.
[0091]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o EHV ainda é infeccioso, pode replicar em linhagens de células eucarióticas infectadas, mas somente ser acondicionado como um vírus competente em replicação em linhagens de células de complementação. Com vantagem, DNA de vírus e proteína de vírus ainda são produzidos no hospedeiro e, assim, o EHV com deficiente em replicação da presente invenção ainda induz uma resposta imune e/ou imunidade protetora. Com vantagem, os dados da presente invenção mostram que a expressão de proteína (expressão de proteína de marcador) ainda ocorre no vírus de EHV com deficiente em replicação da presente invenção. Inserção em UL56 ou US4
[0092]Em um aspecto adicionalmente específico do vetor da presente invenção, dito vetor de EHV adicionalmente compreende, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente outro gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno. Em um aspecto, pelo menos uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente outro gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, é inserida no mesmo sítio de inserção UL18 e/ou UL8, por exemplo, via peptídeo(s) IRES /2a. Em outro aspecto, dito vetor ou cassete de expressão compreende, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente outro gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, sendo inserido em outro sítio de inserção, preferivelmente em UL56 e/ou US4.
[0093]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, inserida em um sítio de inserção, preferivelmente UL56 e/ou US4.
[0094]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e/ou UL8 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e/ou US4.
[0095]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 (vacina monovalente).
[0096]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em US4 (vacina monovalente).
[0097]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 (vacina monovalente).
[0098]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em US4 (vacina monovalente).
[0099]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e
US4 (vacina bivalente).
[00100]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e US4 (vacina bivalente).
[00101]A presente invenção refere-se adicionalmente a um Herpesvírus equídeo (EHV), especificamente um Alfaherpesvírus equídeo tal como EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 e EHV-9, mais especificamente um vetor de Alfaherpesvírus equídeo 1 (EHV-1), o mais especificamente cepa RacH, compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeo ou gene de interesse, preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, inserida em UL18 e/ou UL8 e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional ou gene de interesse, preferivelmente outra sequência de codificação de antígeno, inserida em, pelo menos, um sítio de inserção adicional, preferivelmente UL56 (ORF1/3) e/ou US4 (ORF70). Em um aspecto específico do dito vetor de EHV da presente invenção, os, pelo menos, dois genes de interesse são operacionalmente ligados a sequências regulatórias preferivelmente sequências de promotor.
[00102]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende duas ou mais sequências de nucleotídeo de interesse, preferivelmente genes de interesse, mais preferivelmente sequências de codificação de antígeno inseridas em dois ou mais sítios de inserção.
[00103]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e/ou UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e/ou US4.
[00104]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56.
[00105]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em US4.
[00106]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e US4.
[00107]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56.
[00108]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em US4.
[00109]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e US4.
[00110]Em outro aspecto do vetor da presente invenção,
o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56.
[00111]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em US4.
[00112]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende uma inativação de UL18 e UL8 por inserção de, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno (ou um cassete de expressão compreendendo a mesma) e, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo adicional de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno inserida em UL56 e US4. US4 (ORF70)
[00113]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inserção em US4 é caracterizada por uma deleção, truncagem, substituição, modificação parciais, ou similares, em US4, em que US5 permanece funcional.
[00114]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a inserção em US4 é caracterizada pela deleção de uma porção de aproximadamente 801bp dentro de US4 para RacH (SEQ ID NO:24) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00115]Em um aspecto específico do vetor da presente invenção, a inserção em US4 (ORF70) é caracterizada por uma deleção, truncagem, substituição, modificação parciais, ou similares, em US4 (ORF70), pelo que US5 (ORF71) permanece funcional.
[00116]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, e SEQ ID NO:22 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[00117]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco US4 esquerda selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:21, e (ii) pelo menos uma região de flanco US4 direita selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22. Sequências de Nucleotídeo e Patógenos
[00118]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, dita sequência de nucleotídeo de interesse é recombinante e/ou heteróloga e/ou exógena.
[00119]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, dita sequência de codificação de antígeno refere-se a um patógeno infectando um animal produtor de alimento, tal como suínos, bovinos ou aves de criação ou animais de companhia como gato, equino ou cachorro.
[00120]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a sequência de codificação de antígeno é de um patógeno selecionado, mas não limitado a, dentre a lista: vírus Schmallenberg, Vírus da Influenza A, Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, Circovírus porcino, Vírus da Peste Suína Clássica, Vírus da Peste Suína Africana, Vírus de Hepatite E, Vírus da Diarreia Viral Bovina, Vírus da Raiva, Morbillivírus Felino, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Actinobacillus Pleuropneumoniae.
[00121]Em um aspecto específico do vetor ou do cassete de expressão da presente invenção, dita sequência de codificação de antígeno refere-se a um patógeno infectando suínos. Em um aspecto adicionalmente específico, dito patógeno é vírus de Influenza A suíno (IAV). Em um aspecto adicionalmente específico, dito antígeno é antígeno de hemaglutinina (HA), especialmente dito antígeno de hemaglutinina é derivado de um vírus de Influenza A. Por exemplo, o vírus de Influenza A é vírus de Influenza A (A/suínos/Italy/116114/2010(H1N2)), vírus de Influenza A (A/suínos/Italy/7680/2001(H3N2)), vírus de Influenza A (A/suínos/Gent/132/2005(H1N1)), e/ou vírus de Influenza A (A/suínos/Italy/4675/2003(H1N2)). Em um aspecto adicionalmente específico, dito antígeno compreende ou consiste em uma sequência codificada pela SEQ ID NO SEQ ID NO:14. Em outro aspecto específico, dito antígeno compreende ou consiste em uma sequência codificando uma sequência de aminoácido com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para uma sequência de aminoácido como especificada em SEQ ID NO:14. Sequências regulatórias e Promotores
[00122]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o gene de interesse é operacionalmente ligado a uma sequência regulatória, preferivelmente uma sequência de promotor.
[00123]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a(s) sequência(s) de promotor operacionalmente ligada(s) à sequência ou gene de interesse, é(são) selecionada(s) de, mas não limitada(s) a, o grupo consistindo em: SV40 grande T, HCMV e gene prematuro imediato 1 MCMV, promotor alfa de fator de alongamento humano, promotor de polihedrina de baculovírus, um promotor de Polimerase II, um fragmento funcional.
[00124]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a sequência de promotor operacionalmente ligada a, pelo menos, um gene de interesse é MCMV ou um fragmento funcional do mesmo ou a sequência de nucleotídeos complementar do mesmo.
[00125]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, a sequência de promotor operacionalmente ligada a, pelo menos um gene de interesse é o promotor endógeno de UL8 ou UL18.
[00126]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV é selecionado dentre o grupo consistindo em EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 e EHV-9.
[00127]Em outro aspecto do vetor da presente invenção, o vetor de EHV é EHV-1, preferivelmente RacH.
[00128]A presente invenção refere-se adicionalmente a um vetor de EHV de acordo com a presente invenção compreendendo: a. uma primeira sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, inserida em UL18 e/ou UL8, b. dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, c. dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com um ácido nucleico regulador (adicional), por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA.
[00129]Em um aspecto específico, o vetor de EHV compreende adicionalmente a. uma segunda sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um segundo gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, em um segundo sítio de inserção, preferivelmente UL56 e/ou US4, b. dita segunda sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, c. dita segunda sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com um ácido nucleico regulador, por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA.
[00130]A presente invenção refere-se adicionalmente a um vetor de EHV de acordo com a presente invenção compreendendo: a. um UL18 e/ou UL8 inativado; b. uma primeira sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, inserida em UL56 e/ou US4, c. dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, d. dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse é opcionalmente operacionalmente ligada com um ácido nucleico regulador (adicional), por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA. Célula hospedeira
[00131]Adicionalmente, a presente invenção fornece uma célula de hospedeiro mamífero caracterizada em que ela compreende um vetor de EHV deficiente em replicação, como descrito aqui.
[00132]A presente invenção também se refere a uma célula de hospedeiro mamífero caracterizada em que ela compreende um vetor de acordo com a presente invenção.
[00133]A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de preparar uma célula hospedeira, caracterizada pelas seguintes etapas: a. infectar a célula de hospedeiro mamífero, de acordo com a presente invenção, com o vetor de acordo com a presente invenção, b. cultivar as células infectadas sob condições apropriadas, c. opcionalmente coletar a dita célula hospedeira.
[00134]A invenção refere-se adicionalmente ao uso do vetor, de acordo com a presente invenção, ou da célula de hospedeiro mamífero, de acordo com a presente invenção, para a fabricação de uma composição imunogênica ou vacina. Linhagem de células de complementação
[00135]Adicionalmente, a presente invenção fornecer uma linhagem de células expressando UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo para cultivar o vetor de EHV deficiente em replicação, como descrito aqui.
[00136]Além disso, a presente invenção fornece uma linhagem de células compreendendo um plasmídeo compreendendo um cassete de expressão compreendendo UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo, em que a linhagem de células está expressando UL8 e/ou UL18 ou partes funcionais dos mesmos.
[00137]Em outro aspecto da linhagem de células da presente invenção, a linhagem de células é selecionada, mas não limitada a, dentre o grupo de: células Vero, RK-13 (rim de coelho), ST (testículo de suíno), MDCK (rim canino Madin-Darby), MDBK (rim bovino Madin-Darby) e células dérmicas equinas (NBL-6).
[00138]Em outro aspecto da linhagem de células da presente invenção, a linhagem de células é uma linhagem celular ST. Método de produção
[00139]Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo inativar UL18 e/ou UL8, como descrito aqui.
[00140]Além disso, a presente invenção fornece um método para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo as etapas de: a) fornecer um EHV tipo selvagem ou um EHV atenuado; b) inativar UL18 e/ou UL8 do EHV de etapa a) e selecionar por clones de EHV que não estão carregando a parte completa ou funcional de UL18 e/ou UL 8; c) fornecer uma linhagem de células de complementação expressando UL18 e/ou UL8 ou partes funcionais dos mesmos; d) obter o Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) por cultivo do EHV a partir de etapa b) com a linhagem de células de complementação a partir de etapa c).
[00141]A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de produção do vetor de acordo com a presente invenção compreendendo: a. inserir uma primeira sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, em UL18 e/ou UL8, b. opcionalmente operacionalmente ligar dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, c. opcionalmente operacionalmente ligar dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse com um ácido nucleico regulador (adicional), por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA.
[00142]Em um aspecto específico o método compreende adicionalmente a. inserir uma segunda sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um segundo gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, em um segundo sítio de inserção, preferivelmente UL56 e/ou US4, b. opcionalmente operacionalmente ligar dita segunda sequência de nucleotídeo de interesse com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, c. opcionalmente operacionalmente ligar referida segunda sequência de nucleotídeo de interesse com um ácido nucleico regulador, por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA.
[00143]A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de produção do vetor de acordo com a presente invenção compreendendo: a. inativar UL18 e/ou UL8 do EHV; b. inserir uma primeira sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, tal como uma sequência de codificação de antígeno, em UL56 e/ou US4, c. opcionalmente operacionalmente ligar dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse com uma sequência de ácido nucleico regulador/sequência de promotor, d. opcionalmente operacionalmente ligar dita primeira sequência de nucleotídeo de interesse com um ácido nucleico regulador (adicional), por exemplo, uma sequência de poliadenilação, preferivelmente 71pA ou BGHpA.
[00144]A invenção refere-se adicionalmente a um método para a preparação de uma composição imunogênica ou uma vacina para reduzir a incidência ou a gravidade de um ou mais sinais clínicos associados com ou causados por uma infecção, compreendendo as seguintes etapas: a. infectar a linhagem de células de complementação, de acordo com a presente invenção, com o vetor de acordo com a presente invenção, b. cultivar as células infectadas sob condições apropriadas, c. coletar as culturas de células infectadas, d. opcionalmente purificar as culturas de células infectadas coletadas de etapa c) e. opcionalmente misturar dita cultura de células infectadas coletada com um carreador farmaceuticamente aceitável. Vacina
[00145]Adicionalmente, a presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo um ou mais vetores de EHV, como descrito aqui.
[00146]Em outro aspecto da composição imunogênica da presente invenção, dita composição imunogênica adicionalmente compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00147]Em outro aspecto da composição imunogênica da presente invenção, dita composição imunogênica é uma vacina.
[00148]Assim, a invenção refere-se adicionalmente a uma composição imunogênica compreendendo a. o vetor de acordo com a presente invenção, e/ou b. um polipeptídeo expressado pelo vetor de acordo com a presente invenção, tal como um vírus, um vírus vivo modificado, uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou similares, e c. opcionalmente um carreador ou excipiente aceitável de modo farmacêutico ou veterinário, preferivelmente dito carreador é apropriado para aplicação oral, intradérmica, intramuscular ou intranasal, preferivelmente dita composição imunogênica compreende um vírus. Em um aspecto específico, dito vírus é um vírus infeccioso.
[00149]A invenção refere-se adicionalmente a uma vacina ou composição farmacêutica compreendendo a. o vetor de acordo com a presente invenção, e/ou b. um polipeptídeo expressado pelo vetor de acordo com a presente invenção, tal como um vírus vivo modificado, uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou similares, e c. um carreador ou excipiente aceitável de modo farmacêutico ou veterinário, preferivelmente dito carreador é apropriado para aplicação oral, intradérmica, intramuscular ou intranasal, d. opcionalmente dita vacina adicionalmente compreende um adjuvante. Método de Tratamento e Usos
[00150]Adicionalmente, a presente invenção fornece um método para imunizar um indivíduo compreendendo administrar, a um tal indivíduo, uma composição imunogênica, como descrito aqui.
[00151]Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de sinais clínicos causados por um patógeno em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar, ao indivíduo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica, como descrito aqui.
[00152]A presente invenção fornece a composição imunogênica, como descrito aqui, para uso em um método para imunizar um indivíduo compreendendo administrar dita composição imunogênica a um tal indivíduo.
[00153]A presente invenção fornece a composição imunogênica, como descrito aqui, para uso em um método de tratamento ou prevenção de sinais clínicos causados por um patógeno em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de dita composição imunogênica.
[00154]Em outro aspecto do método ou uso da presente invenção, dito indivíduo é selecionado dentre a lista consistindo em suínos, bovinos, aves de criação, gatos, equinos e cachorros.
[00155]Em outro aspecto do método ou uso da presente invenção, a composição imunogênica é administrada uma vez.
[00156]Em outro aspecto do método ou uso da presente invenção, a composição imunogênica é administrada em duas ou mais doses.
[00157]A invenção também se refere a um kit para vacinar um animal, preferivelmente um animal produtor de alimento, tal como suínos ou bovinos, ou animais de companhia como gatos, equinos ou cachorros, contra uma doença associada com e/ou reduzindo a incidência ou a gravidade de um ou mais sinais clínicos associados com ou causados por um patógeno em um animal compreendendo: a) um dispensador capaz de administrar uma vacina ao dito animal; e b) a composição imunogênica ou a vacina de acordo com a presente invenção, e c) opcionalmente um folheto de instruções.
[00158]A presente invenção refere-se adicionalmente a um kit consistindo em um vetor, de acordo com a presente invenção, opcionalmente reagente(s) de transfecção, e um folheto de instruções.
DEFINIÇÕES
[00159]Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence no momento do depósito. O significado e o escopo dos termos devem ser claros; entretanto, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições apresentadas aqui têm precedência sobre qualquer definição de dicionário ou extrínseca. Além disso, salvo se exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Aqui, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que indicado de outra forma. Além disso, o uso do termo "incluindo", bem como outras formas, como "inclui" e "incluído", não é limitativo. Todas as patentes e publicações aqui referidas são aqui incorporadas por referência.
[00160]A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de virologia, biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante, química de proteínas e imunologia, que estão dentro da especialidade na técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II e III, 2a. ed. (1989); DNA Cloning, Vols. I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série, Methods in Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods – a practical approach (E.L.V. Harris e S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); e Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir e C. C. Blackbem eds., 1986, Blackbem Scientific Publications).
[00161]Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a DNA, sequências de polipeptídeos ou parâmetros de processo particulares, pois tais podem, é claro, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares da invenção apenas e não se destina a ser limitante. Deve-se notar que, conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as referências no plural, salvo se o conteúdo indicar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um antígeno" inclui uma mistura de dois ou mais antígenos, a referência a "um excipiente" inclui misturas de dois ou mais excipientes e similares. Definições de Biologia Molecular
[00162]O termo “vetor” como ele é conhecido na técnica, refere-se a um construto de polinucleotídeo, tipicamente um plasmídeo ou um cromossomo artificial bacteriano, usados para transmitir material genético a uma célula hospedeira. Vetores podem ser, por exemplo, bactérias, vírus, fagos, cromossomos artificiais bacterianos, cosmídeos ou plasmídeos. Um vetor como usado aqui podem ser composto de ou conter ou DNA ou RNA. Em algumas modalidades, um vetor é composto de DNA. Em algumas modalidades, um vetor é um vírus infeccioso. Tal vetor viral contém um genoma viral que foi manipulado em um modo tal que ele carrega um gene estranho, que não tem função na replicação do vetor viral nem na cultura celular nem em um animal hospedeiro. De acordo com aspectos específicos da presente exposição, um vetor pode ser usado para vários aspectos, tal como mera transmissão de material genético, para a transfecção de células hospedeiras ou organismos, para uso como vacinas, por exemplo, vacinas de DNA ou para fins de expressão de genes. A expressão de genes é um termo descrevendo a biossíntese de uma proteína em uma célula como dirigida por uma sequência de polinucleotídeo específica chamada gene. Em um aspecto específico, um vetor pode ser um "vetor de expressão", que é um vetor que é capaz de dirigir a expressão de uma proteína codificada por um ou mais genes carregados pelo vetor quando ele está presente no meio apropriado.
[00163]Vetores e métodos para produzir e/ou usar vetores (ou recombinantes) para expressão podem ser por ou análogos aos métodos divulgados em: Patente US Nos.
4.603,112, 4.769.330, 5.174,993, 5.505,941, 5.338.683,
5.494.807, 4.722.848, 5,942,235, 5.364.773, 5.762,938,
5.770,212, 5,942,235, 382.425, Publicações PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, outubro de 1996; Moss, "Genetically engineered poxvírus for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, outubro de 1996; Smith et al., Patente US No. 4.745.051(baculovírus recombinante); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector ", Molecular and Cellular Biology, Dezembro, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology, março de 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0 370 573; Pedido US No. 920,197, depositado em 16 de outubro de 1986; Publicação de Patente EP No. 265785; Patente US No. 4.769.331 (herpesvírus recombinante);
Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, outubro de 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex virus to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, outubro de 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, outubro de 1996; Frolov et al., "Alfavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, outubro de 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; Patente US Nos. 5.591.439.,5.552,143; WO 98/00166; Pedidos US concedidos números de série 08/675.556, e 08/675.566 ambos depositados em 3 de julho de 1996 (adenovírus recombinante); Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, Abril, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; e McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, outubro de 1996; e Patentes US Nos. 5.591.639,
5.589.466, e 5.580.859, assim como WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang et al., Nature, e Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. Ver também WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expressão lentiviral); Sanford et al., Patente US No.
4.945.050; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars em Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (sistemas de vetor de DNA); Szoka et al., Patente US no. 4.394.448 (método de inserção de DNA em células vivas); McCormick et al., Patente US No. 5.677,178 (uso de vírus citopático); e Patente US No. 5,928,913 (vetores para entrega de genes); assim como outros documentos citados aqui.
[00164]O termo “vetor viral” descreve um vírus geneticamente modificado que foi manipulado por técnica de DNA recombinante em um modo que sua entrada em uma célula hospedeira resulta em uma atividade biológica específica, por exemplo, a expressão de um transgene carregado pelo vetor. Em um aspecto específico, o transgene é um antígeno. Um vetor viral pode ou não ser competente em replicação na célula, tecido ou organismo alvo.
[00165]Geração de um vetor viral pode ser alcançada usando quaisquer técnicas apropriadas de engenharia genética bem conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, as técnicas padrão de digestão de endonuclease de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo, sequenciamento de DNA, transfecção em culturas celulares, por exemplo, como descrito em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) ou K. Maramorosch e H. Koprowski (Methods em Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)).
[00166]Um vetor viral pode incorporar sequências do genoma de qualquer organismo conhecido. As sequências podem ser incorporadas em sua forma nativa ou podem ser modificadas de qualquer modo para obter uma atividade desejada. Por exemplo, as sequências podem compreender inserções, deleções ou substituições.
[00167]Um vetor viral pode incluir regiões codificantes para duas ou mais proteínas de interesse. Por exemplo, o vetor viral pode incluir a região codificante para uma primeira proteína de interesse e a região codificante para uma segunda proteína de interesse. A primeira proteína de interesse e a segunda proteína de interesse podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, o vetor viral pode incluir a região(s) codificante(s) para uma terceira ou quarta proteína de interesse. A terceira e a quarta proteínas de interesse podem ser iguais ou diferentes. O comprimento das duas ou mais proteínas de interesse codificadas por um vetor viral pode variar. Por exemplo, o comprimento total das duas ou mais proteínas podem ser pelo menos cerca de 200 aminoácidos. Pelo menos cerca de 250 aminoácidos, pelo menos cerca de 300 aminoácidos, pelo menos cerca de 350 aminoácidos, pelo menos cerca de 400 aminoácidos, pelo menos cerca de 450 aminoácidos, pelo menos cerca de 500 aminoácidos, pelo menos cerca de 550 aminoácidos, pelo menos cerca de 600 aminoácidos, pelo menos cerca de 650 aminoácidos, pelo menos cerca de 700 aminoácidos, pelo menos cerca de 750 aminoácidos, pelo menos cerca de 800 aminoácidos, ou mais longo.
[00168]Os vetores virais preferidos incluem vetores herpes vírus, tal como derivados de EHV-1 ou EHV-4 ou outros varicelovírus como PrV (vírus de pseudoraiva) ou BHV-1 (Herpesvírus bovino 1).
[00169]De acordo com aspectos específicos da presente exposição, o termo “vetor viral” ou alternativamente “construto viral” refere-se a um construto viral recombinante derivado de um vírus, que é selecionado dentre as famílias de Herpesviridae, tal como EHV-1, EHV-4. Os vetores virais preferidos incluem vetores de herpesvírus, tal como derivados de EHV-1 ou EHV-4
[00170]Os termos “vetor viral” e “construto viral” podem ser usados de modo interpermutável.
[00171]O termo "construto," como usado aqui, refere-se a um ácido nucleico recombinante, tal como um plasmídeo, um BAC, ou um vírus recombinante que foi gerado artificialmente.
[00172]O termo “plasmídeo” refere-se a DNA citoplásmico que replica independentemente do cromossomo bacteriano dentro de uma célula hospedeira bacteriana. Em um aspecto específico da presente invenção, o termo “plasmídeo” e/ ou “plasmídeo de transferência” refere-se a um elemento de tecnologia de DNA recombinante utilizável para construção de, por exemplo, um cassete de expressão para inserção em um vetor viral. Em outro aspecto específico, o termo “plasmídeo” pode ser usado para especificar um plasmídeo utilizável para fins de vacinação com DNA.
[00173]Como usados aqui, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são interpermutáveis e se referem a qualquer ácido nucleico.
[00174]Os termos “ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico”, “sequência de nucleotídeo”, “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeo”, “sequência de RNA” ou “sequência de DNA” como usados aqui referem-se a um oligonucleotídeo, nucleotídeo ou polinucleotídeo e fragmentos e porções dos mesmos, e a DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, que podem ser de fita simples ou fita dupla e representam a fita senso ou antisenso. A sequência pode ser uma sequência não codificante, uma sequência codificante ou uma mistura de ambas. As sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser preparadas usando técnicas padrão bem conhecidas do versado na técnica.
[00175]Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" também incluem especificamente ácidos nucleicos compostos de bases diferentes das cinco bases biologicamente ocorrendo (adenina, guanina, timina, citosina e uracila).
[00176]Os termos “ácido nucleico regulatório”, "elemento regulatório" e "elemento de controle de expressão" são usados de modo interpermutável e se referem a moléculas de ácido nucleico que podem influenciar a expressão de uma sequência codificante operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro particular. Estes termos são usados amplamente e cobrem todos os elementos que promovem ou regulam a transcrição, incluindo promotores, sequências de promotores, elementos de núcleo requeridos para a interação básica de RNA polimerase e fatores de transcrição, elementos a montante, intensificadores, e elementos de resposta. Os elementos regulatórios exemplares em procariotos incluem promotores, sequências de operador e sítios de ligação de ribossomo. Elementos regulatórios que são usados em células eucarióticas podem incluir, sem limitação, sequências de controle de transcrição e tradução, tal como promotores, intensificadores, sinais de emenda, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteína, sítios de entrada de ribossomos internos (IRES), sequências picornaviridal 2A, e similares, que fornecem e/ou regulam a expressão de uma sequência codificante e/ou produção de um polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira.
[00177]Um “sítio de entrada de ribossomo interno” ou “IRES” descreve uma sequência que funcionalmente promove o início da tradução independente do gene 5´do IRES e permite que dois cistrons (quadros de leitura aberta) sejam traduzidos a partir de um único transcrito em uma célula de animal. O IRES fornece um sítio de entrada de ribossomo independente para tradução do quadro de leitura aberta imediatamente a jusante do mesmo. Diferente de mRNA bacteriano que pode ser policistrônico, isto é, codificar vários diferentes polipeptídeos que são traduzidos sequencialmente a partir dos mRNAs, a maior parte dos mRNAs de células de animais são monocistrônicos e codificam para a síntese de somente um polipeptídeo. Com um transcrito policistrônico em uma célula eucariótica, tradução deve se iniciar a partir do sítio de iniciação de tradução o mais a 5’, terminar no primeiro códon de parada, e o transcrito deve ser liberado do ribossomo, resultando na tradução de somente o primeiro polipeptídeo codificado no mRNA. Em uma célula eucariótica, um transcrito policistrônico tendo um IRES operacionalmente ligado ao segundo ou subsequente quadro de leitura aberta no transcrito permite a tradução sequencial deste quadro de leitura aberta a jusante para produzir os dois ou mais polipeptídeos codificados pelo mesmo transcrito. O IRES pode ser de variado comprimento e de várias fontes, por exemplo, vírus da Encefalomiocardite (EMCV), picornavírus (por exemplo Vírus da febre aftosa, FMDVou vírus de poliomielite (PV), ou vírus de Hepatite C (HCV). Várias sequências de IRES e seu uso na construção de vetor foram descritas e são bem conhecidas na técnica. A sequência codificante a jusante é operacionalmente ligada à extremidade 3’ do IRES em qualquer distância que não irá afetar negativamente a expressão do gene a jusante. A distância ótima ou permissível entre o IRES e o início do gene a jusante pode ser prontamente determinada por variação da distância e medindo a expressão como uma função da distância.
[00178]O termo “2a” ou “peptídeo 2a” significa sequências curtas de oligopeptídeo, descritas como 2a e ‘semelhante a 2a', que servem como ligadores que são capazes de mediar uma clivagem co-traducional entre proteínas por um processo definido como omissão ribossômica. Tais sequências 2a e ‘semelhante a 2a’ (de Picornaviridae e outros vírus ou sequências celulares) podem ser usadas para concatenar sequências múltiplas de genes em um único gene, assegurando sua co-expressão dentro da mesma célula (ver Luke e Ryan, 2013).
[00179]Como usado aqui, o termo "promotor" ou “sequência de promotor” significa uma sequência de nucleotídeo que permite a ligação de RNA polimerase e dirige a transcrição de um gene. Tipicamente, um promotor está localizado na região não codificante 5' de um gene, proximal ao sítio de início de transcrição do gene. Os elementos de sequência dentro de promotores que funcionam na iniciação de transcrição são com frequência caracterizados por sequências de nucleotídeo de consenso. Exemplos de promotores incluem, mas não são limitados a, promotores de bactérias, levedura, plantas, vírus, e animais, tal como mamíferos (incluindo cavalos, porcos, bovinos e humanos), pássaros ou insetos. Um promotor pode ser indutível, repressível, e/ou constitutivo. Os promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição de DNA sob seu controle em resposta a alguma mudança em condições de cultura, tal como uma mudança em temperatura (Ptashne, 2014). Exemplos de promotores bem conhecidos dos versados na técnica são, por exemplo, SV40 grande T, HCMV e gene prematuro imediato MCMV 1, promotor alfa de fator de alongamento humano, promotor de polihedrina de baculovírus, promotor de Polimerase II.
[00180]O termo “intensificador” denota uma sequência de polinucleotídeo que na localização cis atua sobre a atividade de um promotor e, assim, estimula a transcrição de um gene ou sequência codificante funcionalmente conectada a este promotor. Diferente de promotores, o efeito de intensificadores é independente de posição e orientação e eles podem, assim, ser posicionados na frente de ou atrás de uma unidade de transcrição, dentro de um íntron ou mesmo dentro da região codificante. O intensificador pode estar localizado tanto na proximidade imediata da unidade de transcrição, como a uma distância considerável do promotor. Também é possível ter uma sobreposição física e funcional com p promotor. Os versados terão conhecimento de vários intensificadores a partir de várias fontes (e depositados em bancos de dados, tal como GenBank, por exemplo, intensificadores de SV40,
intensificadores de CMV, intensificadores de polioma, intensificadores de adenovírus) que são disponíveis como elementos independentes ou elementos clonados dentro das sequências de polinucleotídeo (por exemplo depositados no ATCC ou de fonte comerciais e individuais). Um número de sequências de promotor também contém sequências de intensificador, tal como o promotor CMV frequentemente usado. O intensificador de CMV humano é um dos intensificadores mais fortes identificados até agora. Um exemplo de um intensificador indutível é o intensificador de metalotioneina, que pode ser estimulado por glucocorticoides ou metais pesados.
[00181]O termo “sequências de nucleotídeos complementares” descreve uma fita de dois pares de fitas pareados de polinucleotídeos, tal como DNA ou RNA. A sequência de nucleotídeo da fita complementar espelha a sequência de nucleotídeo de sua fita pareada, de modo que, para cada adenosina, ela contém uma timina (ou uracila para RNA), para cada guanina uma citosina, e vice-versa. A sequência de nucleotídeo é complementar para, por exemplo, 5’-GCATAC-3’ é 3’-CGTATG-5’ ou para RNA 3’-CGUAUG-5’.
[00182]Os termos “gene”, “gene de interesse”, como usados aqui têm o mesmo significado e se referem a uma sequência de polinucleotídeo de qualquer comprimento que codifica um produto de interesse. O gene pode compreender adicionalmente sequências regulatórias precedentes (sequências 5’ não codificantes ou não traduzidas) e seguindo (sequências 3’ não codificantes ou não traduzidas) a sequência codificante. A sequência selecionada pode ser de comprimento completo ou truncada, um gene etiquetado ou fusão, e pode ser um cDNA, um DNA genômico, ou um fragmento de DNA. É geralmente entendido que DNA genômico codificando para um polipeptídeo ou RNA pode incluir regiões não codificantes (isto é, íntrons) que são emendados de RNA mensageiro maduro (mRNA) e, assim, não estão presentes em cDNA codificando para o mesmo polipeptídeo ou RNA. Ela pode ser a sequência nativa, isto é, forma(s) naturalmente ocorrente, ou pode ser mudada, ou compreendendo sequências derivadas de diferentes fontes ou, de outra forma, modificada como desejado. Estas modificações incluem otimizações de códons para otimizar o uso de códons na célula hospedeira selecionada ou marcação. Além disso, elas podem incluir remoções ou adições de sítios cis-atuantes, tal como doador de emenda (críptico), sítios de aceitador e pontos de ramificação, sinais de poliadenilação, caixas TATA, sítios X, sítios de entrada ribossômica, sequências de repetição, estruturas secundárias (por exemplo alças de haste), sítios de ligação para fatores de transcrição ou outros fatores regulatórios, sítios de enzima de restrição, etc, para apenas mencionar alguns exemplos, mas não de modo limitativo. A sequência selecionada pode codificar um polipeptídeo secretado, citoplásmico, nuclear, ligado a membrana ou de superfície celular.
[00183]O termo “sequência de nucleotídeo de interesse” como usado aqui é um termo mais geral do que gene de interesse, como ele não necessariamente compreende um gene, mas pode compreender elementos ou partes de um gene ou outra informação genética, por exemplo, ori (origem de replicação). A sequência de nucleotídeo de interesse pode ser qualquer sequência de DNA ou RNA independentemente de se ela compreende uma sequência codificante ou não.
[00184]"Quadro de leitura aberta" ou “ORF” refere-se a um comprimento de sequência de ácido nucleico, ou DNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeo.
[00185]O termo “UL (único longo)” é uma abreviatura para descrever o segmento único longo do genoma de EHV, preferivelmente o genoma de EHV-1.
[00186]O termo “US (único curto)” é uma abreviatura para descrever o segmento único curto do genoma de EHV-1, preferivelmente o genoma de EHV-1.
[00187]O termo “transcrição” descreve a biossíntese de mRNA em uma célula.
[00188]O termo “expressão” como usado aqui refere-se à transcrição e/ou tradução de uma sequência de ácido nucleico dentro de uma célula hospedeira. De acordo com aspectos específicos da presente invenção, o termo “expressão” refere-se à transcrição e/ou tradução de uma sequência de ácido nucleico heteróloga e/ou exógena dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão de um produto desejado em uma célula hospedeira pode ser determinado com base ou na quantidade de RNA ou mRNA correspondente que está presente na célula, ou na quantidade do polipeptídeo codificado desejado para a sequência selecionada. Por exemplo, mRNA transcrito de uma sequência selecionada pode ser quantificado por hibridização Northern blot, proteção de RNA ribonuclease, hibridização in situ para RNA celular ou por RTqPCR
(transcrição reversa seguida por PCR quantitativa). Proteínas expressadas a partir de uma sequência selecionada podem ser quantificadas por vários métodos, por exemplo, por ELISA, por Western blotting, por radioimunoensaios, por imunoprecipitação, por ensaio da atividade biológica da proteína, ou por imunocoloração da proteína seguido por análise FACS.
[00189]O termo “cassete de expressão” ou “unidade de transcrição” ou “unidade de expressão” define uma região dentro de um vetor, construto ou sequência de polinucleotídeo que contém um ou mais genes a serem transcritos, em que as sequências de nucleotídeos codificando o(s) gene(s) transcrito(s), assim como as sequências de polinucleotídeo contendo os elementos regulatórios contidos dentro de um cassete de expressão são operacionalmente ligadas um a cada outro. Eles são transcritos a partir de um promotor e transcrição é terminada por, pelo menos, um sinal de poliadenilação. Em um aspecto específico, eles são transcritos a partir de um único promotor. Como um resultado, os genes diferentes são pelo menos transcripcionalmente ligados. Mais do que uma proteína ou produto pode ser transcrita e expressada a partir de cada unidade de transcrição (unidade de transcrição multicistrônica). Cada unidade de transcrição compreenderá os elementos regulatórios necessários para a transcrição e tradução de qualquer uma das sequências selecionadas que estão contidos dentro da unidade e cada unidade de transcrição pode conter os mesmos ou diferentes elementos regulatórios. Por exemplo, cada unidade de transcrição pode conter os mesmos terminador, elemento IRES ou íntrons podem ser usados para a ligação funcional dos genes dentro de uma unidade de transcrição. Um vetor ou sequência de polinucleotídeo pode conter mais do que uma unidade de transcrição.
[00190]Pelo termo “expressão aumentada”, "título ou produtividade aumentada" ou “expressão ou produtividade melhorada” é entendido o aumento em expressão, síntese ou secreção de uma sequência heteróloga e/ou exógena introduzida em uma célula hospedeira, por exemplo de um gene codificando para uma proteína terapêutica, por comparação com um controle apropriado, por exemplo uma proteína codificada por um cDNA versus uma proteína codificada por um gene contendo íntron. Nota-se um título ou produtividade aumentada se uma célula, de acordo com a invenção, for cultivada conforme um método de acordo com a invenção aqui descrita, e se esta célula tiver pelo menos um aumento de 1,2 vez, um de 1,5 vez, um de duas vezes, um de três vezes, um de quatro vezes ou um de cinco vezes na produtividade ou título específico. Também se nota um título ou produtividade aumentada se uma célula, de acordo com a invenção, for cultivada conforme um método de acordo com a invenção aqui descrita, e se esta célula tiver pelo menos um aumento de 1,2 vez ou pelo menos um de 1,5 vez ou pelo menos um de duas vezes ou pelo menos um de três vezes em produtividade ou título específico. Também, em particular, nota-se um título ou produtividade aumentada se uma célula, de acordo com a invenção, for cultivada conforme um método de acordo com a invenção aqui descrita, e se este célula apresentar um aumento de pelo menos 1,2 vez a cinco vezes, preferivelmente de 1,5 vez a cinco vezes, mais preferivelmente duas vezes a cinco vezes, particularmente preferivelmente um aumento de três vezes a cinco vezes em título ou produtividade específica “Expressão aumentada” pode significar também que mais células estão realmente expressando o gene/ sequência de interesse. Por exemplo, expressão aumentada pode significar que os novos promotores da presente invenção são ativos durante um período de tempo mais longo durante o ciclo de replicação viral relativo aos outros promotores.
[00191]Uma expressão, título ou produtividade aumentados podem ser obtidos usando um vetor heterólogo de acordo com a invenção. Isto pode ser combinado com outras abordagens, tal como uma seleção assistida por FACS de células hospedeiras recombinantes que contém, como marcador selecionável adicional, uma ou mais proteínas fluorescentes (por exemplo GFP) ou um marcador de superfície de célula. Outros métodos de obter expressão aumentada, e uma combinação de diferentes métodos também podem ser usados, são baseados, por exemplo, no uso de elementos cis-ativos para manipular a estrutura de cromatina (por exemplo, elementos LCR, UCOE, EASE, isoladores, S/MARs, STAR), no uso de fatores (artificiais) de transcrição, tratamento do células com agentes naturais ou sintéticos para a regulação positiva de expressão de genes endógenos ou heterólogos e/ou exógenos, melhorando a estabilidade (meia-vida) de mRNA ou a proteína, aprimorando a iniciação de tradução de mRNA, aumentando a dose de gene pelo uso de plasmídeos epissomais (com base no uso de sequências virais como origens de replicação, por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, EBV ou BPV), o uso de sequências promovendo a amplificação ou sistemas de amplificação in vitro com base em concatêmeros de DNA.
[00192]O termo “obtido” pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação, conhecidos dos versados na técnica, preferivelmente usando precipitação, colunas, etc.
[00193]Um ensaio para medir “expressão aumentada” é medições de proteína à base de LC-MS/MS, tal como monitoramento de reação múltipla (MRM); métodos de detecção à base de anticorpos, tal como Western blot, dot blot, ou Imunodifusão, e citometria de fluxo; e medidas de atividade biológica por ensaio de hemaglutinação.
[00194]“Atividade de promotor” é medida indiretamente por quantificação de mRNA transcrito sob controle do respectivo promotor. O mRNA é quantificado por RTqPCR relativo a um endógeno padrão.
[00195]O termo "título viral" é uma medida de unidades infecciosas por volume de uma preparação de vírus. Título viral é um ponto final em um procedimento biológico e é definido como a diluição em que uma certa proporção de testes realizados em paralelo mostram um efeito (Reed e Muench, 1938). Especificamente, uma dose infecciosa de cultura de tecido de cinquenta por mililitro (TCID50/ml) dá uma diluição de uma preparação de vírus em que 50% de um número de culturas celulares inoculadas em paralelo com esta diluição são infectadas.
[00196]"Elementos regulatórios de transcrição" normalmente compreendem um promotor a montante da sequência de gene a ser expressado, sítios de iniciação de transcrição e terminação e um sinal de poliadenilação.
[00197]O termo "sítio de iniciação de transcrição"
refere-se a um ácido nucleico no construto correspondendo ao primeiro ácido nucleico incorporado no primeiro transcrito, isto é, o precursor de mRNA. O sítio de iniciação de transcrição pode se sobrepor com as sequências de promotor.
[00198]O “sinal de terminação” ou “terminador” ou “sinal de poliadenilação” ou “poliA” ou sítio de terminação de transcrição” ou “elemento de terminação de transcrição” é uma sequência de sinal que causa clivagem em um sítio específico na extremidade 3' do mRNA eucariótico e incorporação pós-transcripcional de uma sequência de cerca de 100 - 200 nucleotídeos adenina (cauda poliA) na extremidade 3' clivada e, assim, leva a RNA polimerase a terminar a transcrição. O sinal de poliadenilação compreende a sequência AATAAA de cerca de 10-30 nucleotídeos a montante do sítio de clivagem e uma sequência localizada a jusante. Vários elementos de poliadenilação são conhecidos, tal como tk poliA, SV40 tardio e poliA prematuro, BGH poliA (descritos, por exemplo, em Patente US No. 5.122.458) ou poliA de hormônio de crescimento de hamster (WO2010010107).
[00199]"Elementos regulatórios de tradução” compreendem um sítio de iniciação de tradução (AUG), um códon de parada e um sinal poliA para cada polipeptídeo individual a ser expressado. Um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) pode ser incluído em alguns construtos. A fim de otimizar a expressão, pode ser aconselhável remover, adicionar ou alterar regiões 5'- e/ou 3' não traduzidas da sequência de ácido nucleico a ser expressada para eliminar quaisquer códons de iniciação de tradução alternativa, potencialmente suplementares, ou outras sequências que possam interferir com ou reduzir expressão, seja no nível de transcrição ou tradução. Os sítios de ligação de ribossomo de consenso (sequência Kozak) podem ser inseridos imediatamente a montante do códon de partida para intensificar a tradução e, assim, expressão. Os teores de A/U aumentados em torno destes sítios de ligação de ribossomo ainda dão uma ligação de ribossomo mais eficiente.
[00200]Por definição, cada sequência de polinucleotídeo ou cada gene inserido em uma célula hospedeira e a proteína respectiva ou RNA codificado assim é referi como “exógena”, “sequência exógena”, “gene exógeno”, “sequência codificante exógena”, com relação à célula hospedeira, quando ela provém de uma espécie diferente (vírus). Consequentemente, um promotor à base EHV-4 é exógeno em vista de um vetor viral de EHV-1. Como usado aqui com relação a uma sequência ou gene de interesse, tal como um antígeno, o termo “exógena” significa que dita sequência ou gene de interesse, especificamente dito antígeno, é expressado fora de seu contexto de espécie natural. Consequentemente, o antígeno de HA de IAV suíno é um exemplo de um antígeno exógeno com relação ao vetor de EHV-1. Qualquer sequência derivada de um patógeno diferente do de EHV-1 é, portanto, uma sequência exógena ou gene de interesse ou antígeno de acordo com um aspecto específico da presente invenção.
[00201]Por definição, cada sequência de polinucleotídeo ou cada gene inserido em uma célula hospedeira e a proteína respectiva ou RNA codificado assim é referido a como “heterólogo”, "sequência heteróloga", "gene heterólogo",
“sequência codificante heteróloga”, “transgene” ou “proteína heteróloga” com relação à célula hospedeira. Isto se aplica mesmo se a sequência a ser introduzida ou o gene a ser introduzido é idêntica a uma sequência endógeno ou a um gene endógeno da célula hospedeira. Por exemplo, uma sequência de promotor de EHV-4, introduzida em um vetor viral de EHV-4 em um diferente sítio ou em forma modificada da no vírus de tipo selvagem EHV-4, é por definição uma sequência heteróloga. Como usado aqui com relação a uma sequência ou gene de interesse tal como um antígeno, o termo “heterólogo” significa que dita sequência ou gene de interesse, especificamente dito antígeno, é expressado fora de seu contexto de subespécie natural. Consequentemente, qualquer sequência específica não EHV-1 ou gene de interesse, tal como um antígeno, por exemplo um antígeno de qualquer Alfaherpesvírus equídeo exceto EHV-1, por exemplo, EHV-3, EHV-8, é, portanto, uma sequência heteróloga ou gene de interesse ou antígeno de acordo com um aspecto específico da presente invenção.
[00202]O termo “não ocorrendo naturalmente” significa qualquer sequência ou gene de interesse tal como um antígeno, que não está ocorrendo nesse contexto naturalmente, tal como uma sequência híbrida ou uma sequência ou gene de interesse, tal como um antígeno de uma espécie diferente, ou sequência ou gene de interesse, tal como um antígeno, que não é um produto de natureza devido a mutação, inserção, deleção artificiais, ou similares.
[00203]O termo "recombinante" é usado de modo permutável com os termos “não naturalmente ocorrente”, "heterólogo" e “exógeno” em todo o relatório descritivo desta presente invenção. Assim, uma proteína "recombinante" é uma proteína expressada a partir de ou uma sequência de polinucleotídeo heteróloga ou uma exógena. O termo recombinante, com usado com relação a um vírus, significa um vírus produzido por manipulação artificial do genoma viral. Um vírus compreendendo uma sequência heteróloga ou uma exógena, tal como uma sequência exógena de codificação de antígeno é um vírus recombinante. O termo vírus recombinante e o termo vírus não naturalmente ocorrente são usados de modo interpermutável.
[00204]Assim, o termo “vetor heterólogo” significa um vetor que compreende uma sequência de polinucleotídeo heteróloga ou uma exógena. O termo “vetor recombinante” significa um vetor que compreende uma sequência de polinucleotídeo heteróloga ou uma recombinante.
[00205]Como usado aqui, o termo "operacionalmente ligado" é usado para descrever a conexão entre elementos regulatórios e um gene ou sua região codificante. Tipicamente, expressão gene é colocada sob o controle de um ou mais elementos regulatórios, por exemplo, sem limitação, promotores constitutivos ou indutíveis, elementos regulatórios específicos de tecido, e intensificadores. Um gene ou região codificante é dito como sendo "operacionalmente ligado a" ou "operativamente ligado a" ou "operacionalmente associado com" os elementos regulatórios, significando que o gene ou região codificante é controlado ou influenciado pelo elemento regulatório. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante se o promotor efetua transcrição ou expressão da sequência codificante.
[00206]Além disso, dentro do escopo da presente descrição, os termos "ligação funcional", "funcionalmente ligado" ou “operacionalmente ligado” significa que duas ou mais sequências de ácido nucleico ou elementos de sequência estão posicionadas em um modo que permite, às mesmas, funcionar em seu modo pretendido.
Por exemplo, um promotor/intensificador ou terminador é funcionalmente ligado a uma sequência codificante de gene se for capaz de controlar ou modular a transcrição da sequência de gene ligada na posição cis.
Geralmente, mas não necessariamente, as sequências de DNA, que estão funcionalmente ligadas, são contíguas e, onde necessário, unem duas regiões codificantes de polipeptídeo ou, no caso de um peptídeo de sinal de secreção, são contíguas e em quadro de leitura.
No entanto, embora um promotor operacionalmente ligado esteja geralmente localizado a montante ou um terminador operacionalmente ligado esteja geralmente localizado a jusante da sequência codificante, ele não é necessariamente contíguo com o mesmo.
Intensificadores não precisam ser contíguos, desde que eles aumentem a transcrição da sequência codificante.
Por isto, eles podem estar localizados a montante ou a jusante da sequência codificante e mesmo em alguma distância.
Um sítio de poliadenilação é operacionalmente ligado a uma sequência codificante se estiver localizado na extremidade 3’ da sequência codificante em um modo que a transcrição prossegue através da sequência codificante no sinal de poliadenilação.
Ligação é obtida por métodos recombinantes conhecidos na técnica, por exemplo, por ligação em sítios de restrição apropriados ou extremidade cegas ou usando metodologia PCR de fusão. Os ligadores ou adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados de acordo com a prática convencional, se sítios de restrição apropriados não estão presentes.
[00207]Consequentemente, o termo “fragmento funcional” ou “derivado funcional” de uma sequência de promotor significa que um fragmento ou derivado ainda afeta a atividade do promotor. Os ensaios funcionais de como avaliar a atividade do promotor são bem conhecidos do especialista na técnica (Bustin 2000, Nolan et al. 2006). Uma modalidade exemplar de um tal ensaio funcional inclui, por exemplo, um experimento de cinética de promotor. Células infectadas com vetores virais carregando cassetes de expressão, onde um promotor ou fragmento do mesmo dirige a transcrição de um repórter de transgene, são incubadas durante tempos diferentes. RNA total é preparado a partir de amostras coletadas em tempos diferentes após infecção. Após a destruição DNA contaminante por digestão de DNAse I, o RNA é transcrito reverso. Uma amostra de réplica é processada com adição de transcriptase reversa (RT), a segunda réplica é processada sem adição de RT a fim de demonstrar a remoção com sucesso de DNA contaminante a partir da preparação de RNA. O resultante cDNA é purificado e usado como gabarito em um PCR convencional. Somente as amostras processadas com a adição e RT devem produzir um produto de PCR. Estes cDNAs podem ser, então, usados para qPCR com iniciadores para o transgene repórter e em paralelo com iniciadores para um gene do vetor viral essencial (gene de padrão interno), cuja transcrição fornece um padrão interno para a eficiência de infecção e replicação. Os valores de qPCR do repórter são normalizados entre os diferentes construtos e tempos após infecção usando os valores de qPCR do gene de padrão interno. Isto permite uma interpretação de atividades do promotor de diferentes promotores e fragmentos dos mesmos.
[00208]“Homologia de sequência”, como usado aqui, refere-se a um método de determinar o parentesco das duas sequências. Para determinar homologia de sequência, duas ou mais sequências são otimamente alinhadas, e lacunas são introduzidas, se necessário. No entanto, em contraste com “identidade de sequência”, substituições de aminoácidos conservativas são contadas como uma correspondência quando determinando a homologia de sequência.
[00209]Em outras palavras, para obter um polipeptídeo ou polinucleotídeo comparável tendo 95% de homologia de sequência com uma sequência de referência, 85%, preferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, mesmo mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% dos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos na sequência de referência devem corresponder ou compreender uma substituição conservativa com outro aminoácido ou nucleotídeo. Alternativamente, um número de aminoácidos ou nucleotídeos de até 15%, preferivelmente até 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, mesmo mais preferivelmente até 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% dos resíduos de aminoácidos totais ou nucleotídeos, não incluindo substituições conservativas, na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência. Preferivelmente a sequência homóloga compreende, pelo menos, um pedaço de 50, mesmo mais preferido de 100, mesmo mais preferido de 250, mesmo mais preferido de 500 nucleotídeos.
[00210]“Identidade de sequência”, como é conhecida na técnica, refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, ou seja, uma sequência de referência e uma dada sequência a ser comparada com a sequência de referência. A identidade de sequência é determinada por comparação da dada sequência com a sequência de referência após as sequências serem otimamente alinhadas para produzir o maior grau de similaridade de sequência, como determinado pela correspondência entre os cordões de tais sequências. Quando de tal alinhamento, identidade de sequência é verificada em uma base de posição-por-posição, por exemplo, as sequências são “idênticas” a uma posição particular se, nesta posição, os nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos são idênticos. O número total de tais identidades de posição é, então, dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos na sequência de referência para dar a % de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados a, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); e Carillo, H., e Lipman,
D., SIAM J.
Applied Math., 48: 1073 (1988), os seus ensinamentos sendo incorporados aqui por referência.
Preferidos métodos para determinar a identidade de sequência são planejados para dar a maior correspondência entre as sequências testadas.
Métodos para determinar a identidade de sequência são codificados em programas de computador disponíveis para o público que determinam a identidade de sequência entre dadas sequências.
Exemplos de tais programas incluem, mas não são limitados a, o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acid Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S.
F. et al., J.
Molec.
Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX é disponível para o público de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S.
F. et al., J.
Molec.
Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são incorporados aqui por referência). Estes programas alinham de modo ótimo as sequências usando pesos de lacunas de default a fim de produzir o nível mais elevado de identidade de sequência entre as dadas e as sequências de referência.
Como uma ilustração, para um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, mesmo mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% de “identidade de sequência” para uma sequência de referência de nucleotídeo, é pretendido que a sequência de nucleotídeo do dado polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a dada sequência de polinucleotídeo pode incluir até 15, preferivelmente até 10, mesmo mais preferivelmente até 5 mutações por ponto,
para cada 100 nucleotídeos da sequência de referência de nucleotídeos.
Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, mesmo mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% de identidade com relação à sequência de referência de nucleotídeos, até 15%, preferivelmente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, mesmo mais preferivelmente 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% do nucleotídeos na sequência de referência, podem ser deletados ou substituídos com outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 15%, preferivelmente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, mesmo mais preferivelmente 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,1% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência.
Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou 3' terminais da sequência de referência de nucleotídeo ou em qualquer ponto entre estas posições terminais, interdispersas ou individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência, ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
De modo análogo, para um polipeptídeo tendo uma dada sequência de aminoácido tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, mesmo mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com uma sequência de referência de aminoácido, é pretendido que a dada sequência de aminoácido do polipeptídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto que a dada sequência de polipeptídeo pode incluir até 15, preferivelmente até 10, 9, 8, 7, 6, mesmo mais preferivelmente ate 5, 4, 3, 2, 1 alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de referência de aminoácido. Em outras palavras, para obter uma dada sequência de polipeptídeo, tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, mesmo mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com uma sequência de referência de aminoácido, até 15%, preferivelmente até 10%, 9%, 8%, 7%, mesmo mais preferivelmente até 5%, 4%, 3%, 2%, 1% dos resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro aminoácido, ou um número de aminoácidos de até 15%, preferivelmente até 10%, 9%, 8%, 7%, mesmo mais preferivelmente de até 5%, 4%, 3%, 2%, 1% do número total de resíduos de aminoácido na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminal da sequência de referência de aminoácido ou em qualquer ponto entre estas posições terminais, interdispersas ou individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou no um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservativas. No entanto, substituições conservativas não são incluídas como uma correspondência quando determinando a identidade de sequência.
[00211]Os termos "identidade de sequência" ou "identidade percentual" são usados de modo interpermutável aqui. Para os fins desta invenção, é definido aqui que, a fim de determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácido ou duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou ácido nucleico para alinhamento ótimo com uma segunda sequência de ácido nucleico ou amino). Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeo nas posições correspondentes de aminoácido ou nucleotídeo são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo, como a posição correspondente na segunda sequência, então, as moléculas são idênticas nesta posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % identidade=número de posições idênticas/ número total de posições (isto é, posições de sobreposição) x 100). Preferivelmente, as duas sequências têm o mesmo comprimento.
[00212]Uma comparação de sequência pode ser realizada sobre os comprimentos completos das duas sequências sendo comparadas ou sobre fragmento das duas sequências. Tipicamente, a comparação será realizada sobre o comprimento completo das duas sequências sendo comparadas. No entanto, identidade de sequência pode ser realizada sobre uma região de, por exemplo, vinte, cinquenta, cem ou mais resíduos de aminoácidos contíguo.
[00213]O especialista estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos ou de ácido nucleico é determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444- 453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software Accelrys GCG, usando ou uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. O versado irá apreciar que estes diferentes parâmetros irão produzir resultados levemente diferentes, mas que a identidade percentual global de duas sequências não é alterada de modo significante quando usando algoritmos diferentes.
[00214]As sequências de proteína ou sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser adicionalmente usadas como uma "sequência de interrogação" para realizar uma busca em bases de dados públicas ou, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas BLASTN e BLASTP (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTP, pontuação=50, comprimento da palavra=3 para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas gap para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado, como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25(17): 3389-3402. Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, BLASTP e BLASTN) podem ser usados.
Ver a homepage do “National Center for Biotechnology Information”. Definições de Tecnologia de vetor EHV-1 e EHV-4/ recombinante
[00215]O termo “equídeo” ou “equino” ou “equina” significa da ou pertencendo à família Equidae, que inclui os cavalos, jumentos e zebras, preferivelmente cavalos. Em adição, o termo “equídeo” ou “equino” ou “equina” engloba também híbridos de membros da família Equidae (por exemplo mulas, muares, etc.).
[00216]Um “Herpes vírus” ou “vetor de Herpes vírus” refere-se a uma espécie na família Herpesviridae na ordem Herpesvirales.
[00217]O termo “Vetor de herpes vírus equídeo” ou “Herpes vírus equídeo” ou “EHV” significa um membro da família Herpesviridae afetando os cavalos. Até agora, oito diferentes espécies de herpesvírus equídeos foram identificadas, cinco pertencendo à subfamília Alfaherpesvirinae (EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 e EHV-9) e três á Gammaherpesvirinae. (Taxonomia do vírus: 2015 Release EC 47, Londres, UK, Julho 2015; ratificação do Email 2016 (MSL #30)).
[00218]O termo “EHV-1” significa Alfaherpesvírus equídeo 1, um membro do subgênero Varicellovírus no gênero Alfaherpesvirinae na família Herpesviridae. Uma sequência de referência não limitativa para EHV-1 poderia ser, por exemplo, a de EHV tipo selvagem-1 cepa ab4 (número de acesso ao Genbank AY665713,1) ou a RacH (Hübert 1996).
[00219]O termo EHV-4 significa Alfaherpesvírus equídeo 4, um membro do subgênero Varicellovírus no gênero
Alfaherpesvirinae na família Herpesviridae.
[00220]O termo “inserido em UL18” ou “inserido em ORF43” significa que um fragmento de DNA foi inserido no DNA genômico em um local codificando o quadro de leitura aberta 43 de Alfaherpesvírus equídeo 1 (UL18). Em um aspecto específico da presente invenção a inserção referida resultou em uma deleção completa (945bp) de ORF43 (UL18).
[00221]O termo “inserido em UL8” ou “inserido em ORF54”significa que um fragmento de DNA foi inserido no DNA genômico em um local codificando o quadro de leitura aberta 54 de Alfaherpesvírus equídeo 1 (UL8). Em um aspecto específico da presente invenção, inserção referida resultou em uma deleção de (2256bp) de ORF 54 (UL8).
[00222]O termo “inserido em ORF70” ou “inserido em US4” significa que um fragmento de DNA foi inserido no DNA genômico em um local codificando o quadro de leitura aberta 70 de Alfaherpesvírus equídeo 1 (US4). Em um aspecto específico da presente invenção a inserção referida resultou em uma deleção dos 801 pares de bases 5’ de ORF70 (US4) deixando os restantes 423 bp da extremidade 3’ intacto, mas abolindo a expressão do produto de gene orf70 (US4) glicoproteína G. A glicoproteína G de vários Alfaherpesvíruses incluindo EHV-1 foi mostrada como sendo secretada a partir de células infectadas e funciona como uma proteína imunomodulatória por ligação a citocinas pró- inflamatórias. Abolimento de sua expressão no vetor viral deve aumentar a imunogenicidade da infecção viral, como comparado a um EHV tipo selvagem-1 com expressão intacta de glicoproteína G.
[00223]O termo “inserido em ORF1/3” ou “inserido em
UL56” significa que um fragmento de DNA foi inserido no genoma viral a uma posição onde, por deleção acidental sobre passagem durante o procedimento de atenuação da vacina cepa EHV-1 RacH, um fragmento de 1283 bp compreendendo 90% de ORF1 e o ORF2 completo foram perdidos. Este sítio de inserção foi escolhido devido à probabilidade de que a expressão de um transgene a partir deste local iria interferir com a replicação viral foi esperado como sendo extremamente baixo.
[00224]O termo "inativação” refere-se a uma mutação dentro do UL8 (ORF54) e/ou UL18 (ORF43). O termo mutação compreende modificações no DNA viral codificando ditas proteínas levando a uma alteração de dita proteína codificada. O termo mutação refere-se a, mas não é limitado a, substituições (troca de um ou vários nucleotídeos/pares de base), deleções (remoção de um, vários ou todos os nucleotídeos/pares de base), e/ou inserções (adição de um ou vários nucleotídeos/pares de base). Assim, o termo mutação compreende mutações incluindo, mas não limitadas a mutações de ponto (mutações de nucleotídeo único) ou mutações maiores em que, por exemplo, partes dos codificantes (e/ou não codificantes) nucleotídeos/pares de base são deletados (deleção parcial) ou todos os codificantes (e/ou não codificantes) nucleotídeos/pares de base são deletados (deleção completa), substituídos e/ou adicionais codificantes (e/ou não codificantes) nucleotídeos/pares de base são inseridos. Deve ser entendido que o termo mutação compreende mutações dentro dos nucleotídeos/pares de base codificantes, mutações dentro dos nucleotídeos/pares de base não codificantes, tal como dentro das mutações regulatórias de nucleotídeos/pares de base e dentro de ambos, os codificantes nucleotídeos/pares de base e não codificantes nucleotídeos/pares de base. Adicionalmente, o termo mutação também compreende a inversão de nucleotídeos/pares de base (codificantes e/ou não codificantes), tal como inversão de uma parte ou todos os codificantes nucleotídeos/pares de base ou inversão de uma parte ou todos dos nucleotídeos/pares de base não codificantes ou uma combinação dos mesmos. Além disso, o termo mutação também compreende a relocação de nucleotídeos/pares de base (codificantes e/ou não codificantes), tal como relocação de uma parte ou todo os nucleotídeos/pares de base codificantes ou relocação de uma parte ou todos os nucleotídeos/pares de base não codificantes ou uma combinação dos mesmos. Como usado aqui, mutação pode ser uma mutação única ou várias mutações, assim, com frequência, o(s) termo(s) "mutação(s)" usado(s) e referem- se a ambos uma mutação única e várias mutações. As ditas mutações podem resultar em uma proteína expressada modificada devido à mudança na sequência codificante. No entanto, o termo mutação é bem conhecido dos versados na técnica e o versado na técnica pode gerar mutações mais tarde.
[00225]Adicionalmente, o termo "inativação” engloba uma expressão reduzida (ou eliminada) de UL18 e/ou UL8 RNA e/ou proteína. Deve ser entendido que a expressão reduzida engloba tanto a transcrição de RNA reduzida, assim como expressão reduzida de proteína. Preferivelmente, a expressão de UL18 e/ou UL8 RNA e/ou proteína é reduzida por
5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70- 80%, 80-90%, 90-95%, 95-99% ou mais por RNA e/ou proteína quando comparada à expressão de um vírus EHV tipo selvagem ou o vírus EHV da presente invenção cultivado em uma linhagem de células de complementação. Mais preferivelmente, a expressão de UL18 e/ou UL8 RNA e/ou proteína é reduzida por 50-100%, 60-100%, 70-100% 80-100% ou 90-100% por RNA e/ou proteína quando comparada com a expressão de um vírus EHV tipo selvagem ou o vírus EHV da presente invenção cultivado em uma linhagem de células de complementação. Ainda mais preferivelmente, a expressão de UL18 e/ou UL8 RNA e/ou proteína é reduzida no EHV da presente invenção em 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% por RNA e/ou proteína quando comparada com a expressão de um vírus EHV tipo selvagem ou o vírus EHV da presente invenção cultivado em uma linhagem de células de complementação.
[00226]O termo “completo ou parcialmente deletado, substituído ou invertido" engloba uma deleção completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial e uma inversão completa ou parcial. O termo “completo” significa que um ORF completo (UL) é afetado a partir do códon de partida para o de parada do ORF (UL). preferivelmente, o UL18 e/ou UL8 é complete deletados, substituídos ou invertidos. No entanto, o termo “parcial” significa que somente uma parte do ORF completo (UL) é afetada. Preferivelmente, UL18 e/ou UL8 são parcialmente deletados, substituídos ou invertidos.
[00227]O termo “a partir do Término 5’ do códon de partida” refere-se à deleção, substituição ou inversão do ORF (UL) no Término 5’. O termo como usado aqui deve ser entendido como a dita deleção, substituição ou inversão afeta (inclui) o códon de partida do ORF. Assim, porções do Término 3’ do ORF são retidas, enquanto porções a região do ORF do Término 5’ são deletadas. No entanto, ditas deleção, substituição ou inversão a partir do Término 5’ podem resultar na deleção de um ou mais aminoácidos dentro da proteína correspondente ou em um deslocamento do quadro de leitura no ORF que resulta em uma região codificante que é diferente da proteína do tipo selvagem. No entanto, dita deleção, substituição ou inversão no Término 5’ pode resultar na expressão de sem proteína de todo, como o códon de partida é truncado.
[00228]O termo “a partir de A, T ou G do códon de partida” como usado aqui deve ser entendido como que a dita deleção, substituição ou inversão pode iniciar com A ou T ou G. No caso em que a deleção começa com A, o A é deletado. No entanto, se a deleção a partir de A compreende a deleção de dois ou mais nucleotídeos, o T é deletado também. Adicionalmente, se a deleção do A compreende a deleção de três ou mais nucleotídeos, o A, T, e G é deletado. No entanto, deve ser entendido que se a deleção começa com o T, o T é deletado, enquanto o A de ATG ainda permanece. Adicionalmente, se a deleção começa com o G, o G é deletado, enquanto A e T de ATG ainda permanecem.
[00229]O termo “dentro de UL18” ou “dentro de UL8” como usado aqui deve ser entendido que dita deleção, substituição ou inversão de nucleotídeos pode ocorrer em qualquer ponto dentro de dito ORF (UL). Assim, dita deleção, substituição ou inversão de nucleotídeos pode afetar somente o Término 5’ de UL8 (ORF54) e/ou UL18 (ORF43), somente o Término 3’ de UL8 (ORF54) e/ou UL18 (ORF43) ou o resto dos nucleotídeos de dito ORF (UL) ou qualquer combinações dos mesmos.
[00230]O termo “deficiente em replicação” é bem conhecido dos versados na técnica. Em geral, o termo significa que um vírus tem uma replicação reduzida no hospedeiro (tal como uma célula ou linhagem de células de mamífero). Preferivelmente, a replicação é reduzida por, pelo menos, 90%, preferivelmente 95%, preferivelmente 97,5%, mesmo mais preferivelmente 99,5%, mesmo mais preferivelmente 99,75% e o mais preferivelmente por 100%. No caso de a replicação ser reduzida por 100%, a replicação é completamente abolida. Preferivelmente, a replicação é comparada a um vírus sem deficiente em replicação da mesma espécie. Preferivelmente, a replicação é comparada com a replicação do vírus com deficiente em replicação cultivado em células ou linhagens de células de complementação. Preferivelmente, o EHV com deficiente em replicação da presente invenção ainda é infeccioso e replica, mas somente pode ser embalado como um vírus competente em replicação em células ou linhagens de células de complementação. Preferivelmente, DNA de vírus e proteína de vírus ainda são produzidos no hospedeiro e, assim, o EHV com deficiente em replicação da presente invenção ainda induz uma resposta imune e/ou imunidade protetora.
[00231]O termo “linhagem de células de complementação” ou “célula de complementação” é bem conhecido dos versados na técnica. No contexto da presente invenção, uma linhagem de células de complementação é uma linhagem de células em que as células estão expressando UL8 e/ou UL18 (ou partes funcionais dos mesmos) de EHV (preferivelmente EHV-1). Como o vetor de EHV com deficiente em replicação compreende uma inativação de UL8 e/ou UL18, o EHV com deficiente em replicação não é replicado em uma célula hospedeira (tal como uma célula ou linhagem de células de mamífero), mas na correspondente linhagem de células de complementação expressando UL8 e/ou UL18.
[00232]O termo “TCID50” é bem conhecido dos versados na técnica. Em geral, este ensaio de diluição de ponto final quantifica a quantidade de vírus requerida para manter 50% de hospedeiros infectados ou para produzir um efeito citopático em 50% de células de cultura de tecido inoculadas. Ensaios para medir TCID50 são bem conhecidos dos versados na técnica, tal como o método de Spearman- Karber ou Reed-Muench (Reed e Muench, 1938).
[00233]O termo “infeccioso” significa a introdução de um vírus em um hospedeiro ou uma célula hospedeira. Definições de Vacina
[00234]Uma “composição imunogênica ou imunológica” refere-se a uma composição de matéria que compreende, pelo menos, um antígeno, ou porção imunogênica do mesmo, que elicita uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imune celular ou mediada por anticorpo para a composição.
[00235]O termo "antígeno" usado aqui é bem entendido na técnica e inclui substâncias que são imunogênica, isto é, imunogenes, assim como substâncias que induz uma ausência de resposta imunológica, ou anergia, isto é, uma falta de reações pelos mecanismos de defesa do corpo às substâncias estranhas. Como usado aqui, o termo "antígeno" é destinado a significar proteínas de comprimento completo, assim como fragmentos de peptídeo dos mesmos contendo ou compreendendo epítopo.
[00236]O termo “animal produtor de alimento” significa animais que são usados para consumo humano, tal como suínos, bovinos, aves de criação, peixes e similares, preferivelmente animal produtor de alimento significa suínos e bovinos, o mais preferivelmente suínos.
[00237]Uma “composição imunogênica” como usada aqui pode fazer referência a um polipeptídeo ou uma proteína, tal como por exemplo uma proteína de superfície viral que elicita uma resposta imunológica, como descrito aqui. O termo " fragmento imunogênico" ou “porção imunogênica” refere-se a um fragmento ou uma forma truncada e/ou substituída de uma proteína ou polipeptídeo que inclui um ou mais epítopos e, assim, elicita a resposta imunológica descrita aqui. Em geral, tais formas truncadas e/ou substituídas, ou fragmentos, irão compreender, pelo menos, seis aminoácidos contíguos de uma proteína de comprimento completo. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por sintetização concorrente de grandes números de peptídeos sobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula da proteína, e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão fixados nos suportes. Tais técnicas são conhecidas e descritas na técnica, ver por exemplo, Patente US No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; e Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Similarmente, epítopos conformacionais são prontamente identificados por determinação da conformação especial de aminoácidos, tal como por, por exemplo, cristalografia com raio-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver Epitope Mapping Protocols, supra. Os antígenos sintéticos são também incluidos dentro da definição, por exemplo, poliepítopos, epítopos de flanco e outros antígenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777- 2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; e Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Suíça, Junho 28- Julho 3, 1998. (cujos ensinamentos e conteúdos são incorporados por referência aqui.)
[00238]O termo "imunização" refere-se a uma imunização ativa pela administração de uma composição imunogênica a um animal produtor de alimento a ser imunizado, assim causando uma resposta imunológica contra o antígeno incluído em tal composição imunogênica.
[00239]O termo “em necessidade” ou “de necessidade”, como usado aqui significa que a administração/tratamento é associada com o reforço ou melhora na saúde ou sinais clínicos ou qualquer outro efeito positivo medicinal sobre a saúde dos animais que recebem a composição imunogênica de acordo com a presente invenção.
[00240]O termo “vacina” como usado aqui refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um componente imunologicamente ativo que induz uma resposta imunológica em um animal e, possivelmente, mas não necessariamente, um ou mais componentes adicionais que intensificam a atividade imunológica do componente ativo.
Ainda, vacina pode compreender adicionalmente componentes típicos das composições farmacêuticas.
A título de distinção, o componente imunologicamente ativo de uma vacina pode compreender partículas de vírus completas, ou em sua forma original, ou como partículas atenuadas em uma assim chamada vacina viva modificada (MLV) ou partículas inativadas por métodos apropriados em uma assim chamada vacina morta (KV). Em outra forma, o componente imunologicamente ativo de uma vacina pode compreender elementos apropriados dos organismos (vacinas de subunidade), pelo que estes elementos são gerados ou por destruição da partícula completa, ou das culturas em crescimento contendo tais partículas e, opcionalmente, etapas subsequentes de purificação dando a(s) estrutura(s) desejada(s), ou por processos sintéticos incluindo uma manipulação apropriada para uso de um sistema apropriado com base em, por exemplo, bactérias, insetos, mamíferos, ou outras espécie, mais opcionalmente subsequentes procedimentos de isolamento e purificação, ou por indução dos processos sintéticos no animal necessitando de uma vacina por incorporação direta de material genético usando composições farmacêuticas apropriadas (vacinação com polinucleotídeo). A vacina pode compreender um ou, simultaneamente, mais do que um dos elementos descritos acima. Como usada dentro de aspectos específicos da presente invenção, “vacina” refere-se a uma vacina viva ou vírus vivo, também chamada vacina recombinante. Em outro aspecto específico da presente invenção, “vacina” refere-se a um vírus inativado ou morto incluindo partícula semelhante a vírus (VLPs). Assim, uma vacina pode ser uma vacina de subunidade ou uma vacina morta (KV) ou inativada.
[00241]O termo “Multiplicidade de Infecção (M.O.I.)” descreve como muitas unidades infecciosas, por exemplo, TCID50, de uma preparação de vírus são usadas por célula para infectar as células cultivadas. Por exemplo, uma M.O.I. de 0,01 significa que, para cada 100 células em um vaso de cultura, uma unidade infecciosa é inoculada.
[00242]O termo “vacinação de DNA” ou “vacinação de polinucleotídeo” significa inoculação direta de material genético usando composições farmacêuticas apropriadas.
[00243]Vários métodos físicos e químicos de inativação são conhecidos na técnica. O termo "inativado" refere-se a um vírus ou bactéria previamente virulento ou não virulento que foi irradiado (ultravioleta (UV), raio-X, feixe de elétrons ou radiação gama), aquecido ou tratado quimicamente para inativar ou matar esse vírus ou bactéria, enquanto retendo sua imunogenicidade. Os agentes de inativação apropriados incluem beta-propiolactona, binária ou beta- ou acetil-etilenoimina, gluteraldeído, ozônio e formalina (formaldeído).
[00244]Para inativação por formalina ou formaldeído, formaldeído é tipicamente misturado com água e álcool metílico para criar formalina. A adição de álcool metílico evita a degradação ou reação cruzada durante o processo de ativação. Uma modalidade usa cerca de 0,1 a 1% de uma solução de formaldeído a 37% para inativar o vírus ou bactéria. É fundamental ajustar a quantidade de formalina para garantir que o material seja inativado, mas não tanto que possam ocorrer efeitos colaterais de uma dosagem elevada.
[00245]Mais particularmente, o termo "inativado", no contexto de um vírus, significa que o vírus é incapaz de replicação in vivo ou in vitro e, respectivamente, o termo "inativado" no contexto de uma bactéria significa que a bactéria é incapaz de reprodução in vivo ou in vitro. Por exemplo, o termo "inativado" pode referir-se a um vírus que foi propagado in vitro e, em seguida, foi inativado usando meios químicos ou físicos de modo que não é mais capaz de se replicar. Em outro exemplo, o termo "inativado" pode referir-se a uma bactéria que foi propagada e, então, inativada usando meios químicos ou físicos, resultando em uma suspensão da bactéria, fragmentos ou componentes da bactéria, como resultando em uma bacterina que pode ser usado como um componente de uma vacina.
[00246]Como usado aqui, os termos "inativado", "morto" ou "KV" são usados de modo interpermutável.
[00247]O termo "vacina viva" refere-se a uma vacina compreendendo ou um organismo vivo ou um vírus competente em replicação ou vetor viral.
[00248]Uma "composição farmacêutica" consiste essencialmente em um ou mais ingredientes capazes de modificar funções fisiológicas, por exemplo, funções imunológicas, do organismo ao qual é administrado, ou de organismos que vivem no organismo ou sobre ele. O termo inclui, mas não está restrito a, antibióticos ou antiparasitários, bem como outros constituintes comumente usados para alcançar certos outros objetivos, tais como, mas não limitados a, traços de processamento, esterilidade, estabilidade, viabilidade para administrar a composição por via enteral ou parenteral, como vias oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou outra via adequada, tolerância após administração ou propriedades de liberação controlada. Um exemplo não limitativo de tal composição farmacêutica, dado unicamente para fins de demonstração, poderia ser preparado da seguinte forma: o sobrenadante da cultura de uma célula infectada é misturado com um estabilizador (por exemplo, espermidina e/ou albumina de soro bovino (BSA) e a mistura é subsequentemente liofilizada ou desidratada por outros métodos. Antes da vacinação, a mistura é então reidratada em soluções aquosas (por exemplo, solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou não aquosas (por exemplo, emulsão de óleo, adjuvante à base de alumínio).
[00249]Tal como aqui usado, "carreador farmacêutico ou veterinário aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizadores, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardamento de adsorção e similares. Em algumas modalidades preferidas, e especialmente aquelas que incluem composições imunogênicas liofilizadas, agentes estabilizadores para uso na presente invenção incluem estabilizadores para liofilização ou secagem por congelamento.
[00250]Em algumas modalidades, a composição imunogênica da presente invenção contém um adjuvante. "Adjuvantes", como usados aqui, podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão água em óleo, emulsão óleo em água, emulsão água em óleo em água.
A emulsão pode ser baseada em particular em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia Europeia); óleo isoprenoide, como esqualano ou esqualeno; óleo resultante da oligomerização de alcenos, em particular de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquil linear, mais particularmente óleos vegetais, oleato de etila, di- (caprilato/caprato) de propileno glicol, tri- (caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos graxos ou álcoois ramificados, em particular ésteres de ácido isoestárico.
O óleo é usado em combinação com emulsificantes para formar a emulsão.
Os emulsionantes são preferivelmente tensoativos não iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenoglicol e de ácido oleico, isoestárico, ricinoleico ou hidroxiestárico, que são blocos de copolímero opcionalmente etoxilados e de em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D.
E.
S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Os adjuvantes exemplares são a emulsão SPT descrita na pagina 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M.
Pobem e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo livro.
[00251]Um exemplo adicional de um adjuvante é um composto escolhido entre os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros de anidrido maleico e derivado de alquenila. Compostos adjuvantes vantajosos são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com éteres polialquenílicos de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, No. 2, Junho de 1996). Os versados na técnica também podem se referir à Patente US No. 2.909.462 que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidroxilado com pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados com pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles que contêm de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os próprios radicais insaturados podem conter outros substituintes, como metila. Os produtos comercializados com o nome CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Entre eles, podem ser mencionados Carbopol 974P, 934P e 971P. O mais preferido é o uso de CARBOPOL® 971P. Entre os copolímeros de anidrido maleico e derivado alquenila, estão os copolímeros EMA (Monsanto), que são copolímeros de anidrido maleico e etileno. A dissolução desses polímeros em água leva a uma solução ácida que será neutralizada, preferivelmente ao pH fisiológico, de forma a dar a solução adjuvante na qual a própria composição imunogênica, imunológica ou vacinal será incorporada.
[00252]Adicionalmente adjuvantes apropriados incluem, mas não são limitados a, o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero de bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lipídeo A, Avridine adjuvante lipídeo-amina, enterotoxina lábil em calor de E. coli (recombinante ou de outra forma), toxina de cólera, IMS 1314 ou muramil dipeptídeo, ou citoquinas naturalmente ocorrente ou recombinante ou análogos das mesmas ou estimulantes de liberação de citoquinas endógenas, entre vários outros.
[00253]É esperado que um adjuvante possa ser adicionado em uma quantidade de cerca de 100 µg a cerca de 10 mg por dose, preferivelmente em uma quantidade de cerca de 100 µg a cerca de 10 mg por dose, mais preferivelmente em uma quantidade de cerca de 500 µg a cerca de 5 mg por dose, mesmo mais preferivelmente em uma quantidade de cerca de 750 µg a cerca de 2,5 mg por dose, e o mais preferivelmente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose. Alternativamente, o adjuvante pode estar a uma concentração de cerca de 0.01 a 50%, preferivelmente a uma concentração de cerca de 2% a 30%, mais preferivelmente a uma concentração de cerca de 5% a 25%, ainda mais preferivelmente a uma concentração de cerca de 7% a 22%, e o mais preferivelmente a uma concentração de 10% a 20% por volume do produto final.
[00254]"Diluentes" podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similares. Os agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetracético, entre outros.
[00255]"Isolado" significa alterado "pela mão do homem" de seu estado natural, ou seja, se ocorrer na natureza, foi alterado ou removido de seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivo não é "isolado", mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado", como o termo é empregado aqui.
[00256]"Atenuação" significa reduzir a virulência de um patógeno. Na presente invenção, “atenuação” é sinônimo de “avirulento”. Na presente invenção, um vírus atenuado é aquele em que a virulência foi reduzida de modo que não causa sinais clínicos de infecção, mas é capaz de induzir uma resposta imune no animal alvo, mas também pode significar que os sinais clínicos são reduzidos na incidência ou gravidade em animais infectados com o vírus atenuado, especialmente o vetor viral EHV-1 RacH, como reivindicado, em comparação com um “grupo de controle” de animais infectados com vírus não atenuado ou patógeno e não recebendo o vírus atenuado. Neste contexto, o termo “reduzir/reduzida” significa uma redução de pelo menos 10%, preferivelmente 25%, mesmo mais preferivelmente 50%, ainda mais preferivelmente 60%, mesmo mais preferivelmente 70%, ainda mais preferivelmente 80%, mesmo mais preferivelmente 90% e o mais preferivelmente de 100%, como comparado com o grupo de controle, como definido acima. Assim, um patógeno atenuado, avirulento, tal como por exemplo um vetor viral atenuado, como reivindicado, especialmente o vetor viral EHV-1 (preferivelmente RacH) como reivindicado, é apropriado para a geração de uma vacina viva modificada (MLV) ou composição imunogênica viva modificada.
[00257]O termo "tratamento e/ou profilaxia" refere-se à diminuição da incidência da infecção em um rebanho ou à redução da gravidade dos sinais clínicos causados por ou associados à infecção particular. Assim, o termo "tratamento e/ou profilaxia" também se refere à redução do número de animais em um rebanho que se infectam com o patógeno ou à redução da gravidade dos sinais clínicos normalmente associados ou causados pela infecção em um grupo de animais cujos animais receberam uma quantidade eficaz da composição imunogênica, como aqui provida, em comparação com um grupo de animais cujos animais não receberam tal composição imunogênica.
[00258]O "tratamento e/ou profilaxia" geralmente envolve a administração de uma quantidade eficaz da composição imunogênica da presente invenção a um animal ou rebanho de animais em necessidade, ou que poderiam se beneficiar, de tal tratamento/profilaxia. O termo "tratamento" refere-se à administração da quantidade eficaz da composição imunogênica uma vez que o animal, ou pelo menos alguns animais do rebanho, já está/estão infectados com tal patógeno e em que tais animais já apresentam alguns sinais clínicos causados por ou associados a tal infecção por patógenos. O termo "profilaxia" refere-se à administração a um animal antes de qualquer infecção de tal animal com um patógeno ou pelo menos quando tal animal ou nenhum dos animais em um grupo de animais não mostra quaisquer sinais clínicos causados por ou associados com a infecção por tal patógeno. Os termos "profilaxia" e "prevenção" são usados de forma intercambiável neste pedido.
[00259]O termo "sinais clínicos", tal como aqui usado, refere-se a sinais de infecção de um animal pelo patógeno. Os sinais clínicos de infecção dependem do patógeno selecionado. Exemplos de tais sinais clínicos incluem, mas não estão limitados a dificuldade respiratória, otite, pelagem áspera, febre leve, depressão e apetite reduzido. No entanto, os sinais clínicos também incluem, mas não estão limitados a sinais clínicos que são diretamente observáveis em um animal vivo. Exemplos de sinais clínicos que são diretamente observáveis de um animal vivo incluem secreção nasal e ocular, letargia, tosse, respiração ofegante, batidas, febre elevada, perda de peso, desidratação, claudicação, definhamento, palidez da pele, falta de higiene e similares.
[00260]Aqui, "dose eficaz" significa, mas não está limitada a, uma quantidade de antígeno que induz, ou é capaz de elicitar, uma resposta imune que produz uma redução dos sintomas clínicos em um animal ao qual o antígeno é administrado.
[00261]Tal como aqui usado, o termo "quantidade eficaz" significa, no contexto de uma composição, uma quantidade de uma composição imunogênica capaz de induzir uma resposta imune que reduz a incidência ou diminui a gravidade da infecção ou incidente da doença em um animal. Particularmente, uma quantidade eficaz refere-se a unidades formadoras de colônias (CFU) por dose. Alternativamente, no contexto de uma terapia, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade ou duração de uma doença ou distúrbio, ou um ou mais sintomas dos mesmos, para prevenir o avanço de uma doença ou distúrbio, causar a regressão de uma doença ou distúrbio, prevenir a recorrência, desenvolvimento, início ou progressão de um ou mais sintomas associados a uma doença ou distúrbio, ou intensificar ou melhorar a profilaxia ou tratamento de outra terapia ou agente terapêutico.
[00262]Uma "resposta imune" ou "resposta imunológica" significa, mas não está limitada a, o desenvolvimento de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo à composição (imunogênica) ou vacina de interesse. Geralmente, uma resposta imune ou imunológica inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro exibirá uma resposta terapêutica ou imunológica protetora (memória) de modo que a resistência a novas infecções seja intensificada e/ ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa proteção será demonstrada por uma redução no número de sintomas, gravidade dos sintomas ou a falta de um ou mais dos sintomas associados à infecção do patógeno, retardo no início da viremia, redução da persistência viral, uma redução da carga viral geral e/ ou uma redução da excreção viral.
[00263]“Proteção contra doença”, “imunidade protetora ","imunidade funcional", "redução dos sintomas clínicos"," indução/produção de anticorpos neutralizantes e/ou “conversão de soro” e frases semelhantes, significa uma resposta parcial ou completa contra uma doença ou condição gerada pela administração de uma ou mais composições terapêuticas da invenção, ou uma combinação das mesmas, que resulta em menos efeitos deletérios do que seria esperado em um indivíduo não imunizado que foi exposto à doença ou infecção. Isto é, a gravidade dos efeitos deletérios da infecção é diminuída em um indivíduo vacinado. A infecção pode ser reduzida, retardada ou possivelmente totalmente evitada em um indivíduo vacinado. Aqui, onde se pretende uma prevenção completa de infecção, isso é especificamente indicado. Se a prevenção completa não for declarada, o termo inclui prevenção parcial.
[00264]Aqui, "redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos" ou "redução dos sintomas clínicos" significa, mas não está limitado a, reduzir o número de indivíduos infectados em um grupo, reduzir ou eliminar o número de indivíduos exibindo sinais clínicos de infecção, ou reduzindo a gravidade de quaisquer sinais clínicos que estão presentes em um ou mais indivíduos, em comparação com a infecção de tipo selvagem. Por exemplo, deve referir-se a qualquer redução da carga de patógenos, eliminação ou excreção de patógenos, redução na transmissão de patógenos ou redução de qualquer sinal clínico sintomático de malária. Preferivelmente, estes sinais clínicos são reduzidos em um ou mais indivíduos que recebem a composição terapêutica da presente invenção em pelo menos 10%, em comparação com os indivíduos que não recebem a composição e que se tornam infectados. Mais preferivelmente, os sinais clínicos são reduzidos em indivíduos recebendo a composição da presente invenção por, pelo menos, 20%, preferivelmente por, pelo menos, 30%, mais preferivelmente por, pelo menos, 40%, e mesmo mais preferivelmente por, pelo menos, 50%.
[00265]O termo “proteção aumentada” aqui significa, mas não é limitado a, uma redução estatisticamente significante de um ou mais sintomas clínicos que são associados com infecção por um agente infeccioso em um grupo vacinado de indivíduos versus um grupo de controle de indivíduos não vacinados. O termo “redução estatisticamente significante de sintomas clínicos” significa, mas não é limitado a, a frequência na incidência de, pelo menos, um sintoma clínico no grupo vacinado de indivíduos é pelo menos 10%, preferivelmente 20%, mais preferivelmente 30%, mesmo mais preferivelmente 50%, e mesmo mais preferivelmente 70% menor do que no grupo de controle não vacinado após o desafio com o agente infeccioso.
[00266]"Proteção de longa duração" deve referir-se a "eficácia melhorada" que persiste por pelo menos 3 semanas, mas mais preferivelmente pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente pelo menos 6 meses. No caso de gado, é preferível que a proteção duradoura persista até a idade média em que os animais são comercializados para carne.
[00267]O termo "redução da viremia" induzida por um vírus significa, mas não está limitado a, a redução do vírus que entra na corrente sanguínea de um animal, em que o nível de viremia, isto é, o número de cópias de DNA ou
RNA do vírus por mL de soro sanguíneo ou o número de colônias formadoras de placas por decilitro de soro sanguíneo, é reduzido no soro sanguíneo de animais recebendo a composição da presente invenção em pelo menos 50% em comparação com animais não recebendo a composição e podem ficar infectados. Mais preferivelmente, o nível de viremia é reduzido em animais que recebem a composição da presente invenção em pelo menos 90%, preferivelmente em pelo menos 99,9%, mais preferivelmente em pelo menos 99,99% e ainda mais preferivelmente em pelo menos 99,999%.
[00268]O termo “patógeno” é bem conhecido dos versados na técnica. No entanto, o termo “patógeno” compreende bactérias e vírus. O termo “patógeno” compreende patógenos, tal como vírus Schmallenberg, Vírus da Influenza A, Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, Circovírus porcino, Vírus da Peste Suína Clássica, Vírus da Peste Suína Africana, Vírus de Hepatite E, Vírus da Diarreia Viral Bovina, Vírus da Raiva, Morbillivírus Felino, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Actinobacillus Pleuropneumoniae.
[00269]O termo “animal produtor de alimento” significa animais que são usados para consumo humano, tal como suínos, bovinos, aves de criação, peixes e similares, preferivelmente suínos.
[00270]O termo “animal de companhia” compreende animais tais como gatos, equinos ou cachorros.
[00271]Como usado aqui, o termo “viremia” é particularmente entendido como uma condição em que partículas virais se reproduzem e/ou circulam na corrente sanguínea de um animal, em particular de um mamífero, um pássaro ou de um inseto.
[00272]"Segurança" refere-se à ausência de consequências adversas em um animal vacinado após a vacinação, incluindo, mas não se limitando a: reversão potencial de uma vacina baseada em vírus para virulência, efeitos colaterais clinicamente significativos, como doença persistente, sistêmica ou inflamação inaceitável no local da administração da vacina.
[00273]Os termos "vacinação" ou "vacinar" ou variantes dos mesmos, tal como aqui usados, significam, mas não são limitados a, um processo que inclui a administração de uma composição imunogênica da invenção que, quando administrada a um animal, provoca, ou é capaz de eliciar - diretamente ou indiretamente - uma resposta imune no referido animal.
[00274]"Mortalidade", no contexto da presente invenção, refere-se à morte causada por uma infecção e inclui a situação em que a infecção é tão grave que um animal é sacrificado para evitar o sofrimento e proporcionar um fim humanizado à sua vida. Formulações
[00275]O indivíduo ao qual a composição é administrada é preferivelmente um animal, incluindo mas não limitado a bovinos, cavalos, ovelhas, porcos, aves de criação (por exemplo, galinhas), cabras, gatos, cachorros, hamsters, camundongos e ratos, o mais preferivelmente o mamífero é um suíno.
[00276]As formulações da invenção compreendem uma quantidade imunizante eficaz de uma ou mais composições imunogênicas e um veículo fisiologicamente aceitável. As vacinas compreendem uma quantidade imunizante eficaz de uma ou mais composições imunogênicas e um veículo fisiologicamente aceitável. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[00277]A composição imunogênica, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponantes de pH. A composição imunogênica pode ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada ou pó. A formulação oral pode incluir carreadores padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00278]As vias de administração preferidas incluem, mas não são limitadas a intranasal, oral, intradérmica e intramuscular. A administração em água potável, mais preferivelmente em dose única, é desejável. O versado na técnica reconhecerá que as composições da invenção também podem ser administradas em uma, duas ou mais doses, bem como, por outras vias de administração. Por exemplo, essas outras vias incluem subcutânea, intracutânea, intraperitoneal, intracutânea e, dependendo da duração desejada e da eficácia do tratamento, as composições de acordo com a invenção podem ser administradas uma ou várias vezes, também de forma intermitente, por exemplo, diariamente durante vários dias, semanas ou meses, e em diferentes dosagens, como cerca de 103 a 108TCID50 (ver título viral acima). Em um aspecto específico da presente invenção, a dosagem é de cerca de 103 a 108 TCID50, especialmente para vírus vivo/vacina viva.
[00279]As composições podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender uma folha metálica ou de plástico, tal como uma embalagem tipo blister. A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções para administração, preferivelmente para administração a um mamífero, especialmente a um suíno. Associado com tal(tais) recipiente(s), pode haver um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação, pela agência de fabricação, do uso ou venda para administração humana. Definições de Antígenos
[00280]O termo " vírus de influenza suíno" é conhecido pelos versados na técnica. O termo vírus de influenza suíno refere-se a um vírus de influenza de tipo A ou tipo C da família orthomyxovirus que causa a gripe dos suínos. Embora o orthomyxovirus tenha três grupos: tipo A, tipo B e tipo C, somente os vírus de influenza tipo A e tipo C infectam os porcos. Preferivelmente, o vírus de influenza suíno é um vírus de Influenza A suíno. Subtipos de vírus de influenza suíno incluem H1N1, H1N2, H3N2, e H3N1. H9N2 e H5N1 também podem ser encontrados em suínos. Preferivelmente, um vírus de influenza suíno é um vírus de influenza que foi isolado de suínos.
[00281]Os termos “HA” ou “H”, “NA” ou ”N” e “NP” são conhecidos pelos versados na técnica. No entanto, em geral, vírus de influenza tipo A são divididos em subtipos 17 H
(hemaglutinina) e 10 N (Neuraminidase) que podem dar origem a muitas possíveis combinações (designados como H1N1, H1N2…H2N1, H2N2…H5N1, H5N2… e assim em diante). H (hemaglutinina) e N (neuraminidase) são glicoproteínas de superfície em vírus de influenza A, tal como SIAV. Adicionalmente, N é o alvo principal antigênico de anticorpos neutralizantes. Além disso, NP (nucleoproteína) forma o nucleocapsídeo. Visão Geral de Sequências
[00282]As seguintes sequências são detalhadas e descritas aqui na presente invenção: SEQ ID NO:1 sequência de gene ORF43 (UL18) de EHV-1 SEQ ID NO:2 sequência de gene ORF54 (UL8) de EHV-1 SEQ ID NO:3 sequência de gene ORF43 (UL18) otimizado no códon SEQ ID NO:4 sequência de gene ORF54 (UL8) otimizado no códon SEQ ID NO:5 171 bases a montante de gene ORF43 (UL18) SEQ ID NO:6 265 bases a jusante de gene ORF43 (UL18) SEQ ID NO:7 promotor mCMV dirigido por gene RFP com um BGH poli A flanqueado por SEQ ID NO:5 e 6 SEQ ID NO:8 gene de canamicina flanqueado por SEQ ID NO:5 e 6 SEQ ID NO:9 161 bases a montante de gene ORF43 (UL18) SEQ ID NO:10 120 bases a jusante de gene ORF43 (UL18) SEQ ID NO:11 200 nucleotídeos a montante de gene ORF54 (UL8) SEQ ID NO:12 200 nucleotídeos a jusante de gene ORF54 (UL8) SEQ ID NO:13 promotor mCMV dirigido por gene RFP com um BGH poli A flanqueado por SEQ ID NO:5 e 6
SEQ ID NO:14 sequência HA clonada a ORF1/3 (UL56) site SEQ ID NO:15 sequência de nucleotídeo de vetor de transferência pU70-p455-71K71 SEQ ID NO:16 sequência de nucleotídeo de plasmídeo de transferência pU70-p455-H3-71K71 SEQ ID NO:17 região de flanco esquerda (Up70) (417 bp) SEQ ID NO:18 região de flanco direita (Up71) (431 bp) SEQ ID NO: 19 região de flanco esquerda (up orf70) no EHV tipo selvagem-1 cepa ab4 (número de acesso ao Genbank AY665713,1), localizado em nucleotídeos 127264 – 127680 SEQ ID NO:20 região de flanco direita (up orf71) no EHV-1 tipo selvagem cepa ab4 (número de acesso ao Genbank AY665713,1), localizado em nucleotídeos 128484 – 128913 SEQ ID NO:21 região truncada de flanco no sistema RED: (Up70) região de flanco esquerda (283 bp) = idêntica a 3’ 283 bp da região de flanco “clássica” de 417 bp SEQ ID NO:22 região truncada de flanco no sistema RED: (Up71) região de flanco direita (144 bp) = idêntica a 5’ 144 bp da região de flanco “clássica” de 431 bp SEQ ID NO:23 porção deletada na sequência de genoma de ab4 de tipo selvagem (número de acesso ao Genbank AY665713,1), nt 127681 – 128482 SEQ ID NO: 24 porção deletada na sequência de genoma de RacH (sem números de nt disponíveis devido à sequência de genoma não conhecida) SEQ ID NO: 25 sequência de HA clonada em sítio ORF1/3 (UL56)
CLÁUSULAS
[00283]As seguintes Cláusulas são descritas aqui: A invenção apresenta as seguintes cláusulas:
[00284]1. Um vetor de Alfaherpesvírus equídeo (EHV) deficiente em replicação compreendendo uma inativação de UL18 e/ou UL8.
[00285]2. O vetor de EHV deficiente em replicação de cláusula 1, em que UL18 é inativado.
[00286]3. O vetor de EHV deficiente em replicação de cláusula 1 ou 2, em que UL8 é inativado.
[00287]4. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 3, em que UL18 e UL8 são inativados.
[00288]5. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 4, em que a inativação de UL18 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
[00289]6. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 5, em que a inativação de UL8 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
[00290]7. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 6, em que o códon de partida de UL18 (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) é inativado.
[00291]8. O vetor de EHV deficiente em replicação de cláusula 7, em que dita inativação do códon de partida (ATG) of UL18 é uma deleção, substituição, inversão ou inserção.
[00292]9. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 8, em que o códon de partida de UL8 (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) é inativado.
[00293]10. O vetor de EHV deficiente em replicação de cláusula 9, em que dita inativação do códon de partida (ATG) de UL8 é uma deleção, substituição, inversão ou inserção.
[00294]11. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma cláusulas 1 a 10, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos do 5’-Término do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) do UL18 são deletados, substituídos ou invertidos.
[00295]12. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma cláusulas 1 a 11, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos dos A, T, ou G do códon de partida (ATG,
nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:1) do UL18 são deletados, substituídos ou invertidos.
[00296]13. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma cláusulas 1 a 12, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL18.
[00297]14. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 13, em que uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:1 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL18.
[00298]15. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 14, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos são inseridos dentro do UL18.
[00299]16. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 15, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos do 5’-Término do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) do UL8 são deletados, substituídos ou invertidos.
[00300]17. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma cláusulas 1 a 16, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos dos A, T, ou G do códon de partida (ATG, nucleotídeos 1-3 de SEQ ID NO:2) do UL8 são deletados, substituídos ou invertidos.
[00301]18. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma cláusulas 1 a 17, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL8.
[00302]19. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 18, em que uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:2 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL8.
[00303]20. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 19, em que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos são inseridos dentro do UL8.
[00304]21. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 20, em que o EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno é opcionalmente operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:9 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:10 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00305]22. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 21, em que o EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno é opcionalmente operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00306]23. O vetor de EHV deficiente em replicação de cláusula 21 ou 22, em que a inserção do cassete de expressão inativa UL18 e/ou UL8.
[00307]24. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 21 a 23, em que a inserção do cassete de expressão em UL18 é caracterizada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 945 bp dentro de UL18 para RacH (SEQ ID NO:1) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00308]25. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 21 a 24, em que a inserção do cassete de expressão em UL8 é caracterizada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 2256 bp dentro de UL8 para RacH (SEQ ID NO:2) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00309]26. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 25, em que o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[00310]27. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 26, em que o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:9, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:10.
[00311]28. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 27, em que o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[00312]29. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 28, em que o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12.
[00313]30. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 29, em que dito vetor de EHV é um EHV não natural e/ou recombinante.
[00314]31. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 30, em que deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 90%.
[00315]32. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 31, em que deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 95%.
[00316]33. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 32, em que deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 99%.
[00317]34. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 33, em que deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é abolida completamente.
[00318]35. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 34, em que a taxa de replicação é medida por um ensaio TCID50.
[00319]36. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 35, em que o vetor de EHV deficiente em replicação ainda é infeccioso.
[00320]37. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma das cláusulas 1 a 36, em que o vetor de EHV ainda é infeccioso, pode replicar em linhagens de células eucarióticas infectadas, mas somente ser acondicionado como um vírus competente em replicação em linhagens de células de complementação.
[00321]38. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 37, em que o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, inserida em um sítio de inserção, preferivelmente UL56 e/ou US4.
[00322]39. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 38, em que o vetor de EHV compreende duas ou mais sequência de nucleotídeos de interesse, preferivelmente genes de interesse, mais preferivelmente sequências de codificação de antígeno inseridas em dois ou mais ou mais sítios de inserção.
[00323]40. O vetor de EHV de cláusula 38 ou 39, em que a inserção em US4 é caracterizada por uma deleção, truncagem, substituição, modificação parcial ou similares em US4, em que US5 permanece funcional.
[00324]41. O vetor de EHV de qualquer uma cláusula 38 a 40, em que a inserção em US4 é caracterizada pela deleção de uma porção de aproximadamente 801bp dentro de US4 para RacH (SEQ ID NO:24) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
[00325]42. O vetor de EHV de qualquer uma de cláusulas 38 a 41, em que o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma região de flanco selecionada dentre o grupo consistindo em:
SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, e SEQ ID NO:22 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica de qualquer uma destas sequências.
[00326]43. O vetor de EHV de qualquer uma de cláusulas 38 a 42, em que o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco US4 esquerda selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, e SEQ ID NO:21, e (ii) pelo menos uma região de flanco US4 direita selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, e SEQ ID NO:22.
[00327]44. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 43, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse é recombinante e/ou heteróloga e/ou exógena.
[00328]45. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 44, em que dita sequência de codificação de antígeno refere-se a um patógeno infectando um animal produtor de alimento tal como suínos, bovinos ou aves de criação ou animais de companhia como gato, equino ou cachorro.
[00329]46. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 45, em que a sequência de codificação de antígeno é de um patógeno selecionado, mas não limitado a, dentre a: vírus Schmallenberg, Vírus da Influenza A, Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, Circovírus porcino, Vírus da Peste Suína Clássica, Vírus da Peste Suína Africana, Vírus de Hepatite E, Vírus da Diarreia Viral Bovina, Vírus da Raiva, Morbillivírus Felino, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis,
Actinobacillus Pleuropneumoniae.
[00330]47. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 46, compreendendo adicionalmente sequências regulatórias adicionais tal como um sinal de terminação ou sequência de poliadenilação.
[00331]48. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 47, em que o gene de interesse é operacionalmente ligado a uma sequência regulatória, preferivelmente uma sequência de promotor.
[00332]49. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 48, em que a(s) sequência(s) de promotor operacionalmente ligadas à sequência ou gene de interesse são selecionadas dentre, mas não limitadas a, o grupo consistindo em: SV40 grande T, HCMV e MCMV gene prematuro imediato 1, promotor alfa de fator de alongamento humano, promotor de polihedrina de baculovírus, um promotor de Polimerase II, um fragmento funcional.
[00333]50. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 49, em que a sequência de promotor operacionalmente ligada a pelo menos um gene de interesse é MCMV ou um fragmento funcional do mesmo ou a sequência de nucleotídeos complementar do mesmo.
[00334]51. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 21 a 50, em que a sequência de promotor operacionalmente ligada a pelo menos um gene de interesse é o promotor endógeno de UL8 ou UL18.
[00335]52. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 51, em que o vetor de EHV é selecionado dentre o grupo consistindo em EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 e EHV-9.
[00336]53. O vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 52, em que o vetor de EHV é EHV-1, preferivelmente RacH.
[00337]54. A célula de hospedeiro mamífero caracterizada em que ela compreende um vetor de EHV deficiente em replicação de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 53.
[00338]55. A linhagem de células expressando UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo para cultivar o vetor de EHV deficiente em replicação de qualquer uma de cláusulas 1 a 53.
[00339]56. A linhagem de células compreendendo um plasmídeo compreendendo um cassete de expressão compreendendo UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo, em que a linhagem de células está expressando UL8 e/ou UL18 ou partes funcionais do mesmo.
[00340]57. A linhagem de células de acordo com a cláusula 55 ou 56, em que a célula é selecionada, mas não limitada ao grupo de: células Vero, RK-13 (rim de coelho), ST (testículo de suíno), MDCK (rim canino Madin-Darby), MDBK (Rim bovino Madin-Darby) e células dérmicas equinas (NBL-6).
[00341]58. A linhagem de células de acordo com qualquer uma das cláusulas 55 a 57, em que a linhagem de células é uma linhagem celular ST.
[00342]59. Um método para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo inativar UL18 e/ou UL8 de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 53.
[00343]60. Método para produzir um Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) compreendendo as etapas de: a) fornecer um EHV tipo selvagem ou um EHV atenuado; b) inativar UL18 e/ou UL8 do EHV de etapa a) e selecionar para clones de EHV que não estão carregando uma parte funcional ou completa de UL18 e/ou UL 8; c) fornecer uma linhagem de células de complementação expressando UL18 e/ou UL8 ou partes funcionais do mesmo; d) obter o Alfaherpesvírus equídeo deficiente em replicação (EHV) por cultivo do EHV de etapa b) com a linhagem de células de complementação de etapa c).
[00344]61. A composição imunogênica compreendendo um ou mais vetores de EHV de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 53.
[00345]62. A composição imunogênica de cláusula 61, em que dita composição imunogênica compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00346]63. A composição imunogênica de qualquer uma de cláusula 61 ou 62, em que dita composição imunogênica é uma vacina.
[00347]64. Um método para imunizar um indivíduo compreendendo administrar a um tal indivíduo uma composição imunogênica de qualquer uma de cláusulas 61 a 63.
[00348]65. Um método de tratamento ou prevenção de sinais clínicos causados por um patógeno em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica de acordo com qualquer uma das cláusulas 61 a 63.
[00349]66. A composição imunogênica de qualquer uma de cláusulas 61 a 63 para uso em um método para imunizar um indivíduo compreendendo administrar dita composição imunogênica ao tal indivíduo.
[00350]67. A composição imunogênica de qualquer uma de cláusulas 61 a 63 para uso em um método de tratamento ou prevenção de sinais clínicos causados por um patógeno em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de dita composição imunogênica.
[00351]68. O método ou uso de qualquer uma das cláusulas 64 a 67, em que dito indivíduo é selecionado dentre a lista consistindo em suínos, bovinos, aves de criação, gatos, equinos e cachorros.
[00352]69. O método ou uso de qualquer uma das cláusulas 64 a 68, em que a composição imunogênica é administrada uma vez.
[00353]70. O método de qualquer uma das cláusulas 64 a 69, em que a composição imunogênica é administrada em duas ou mais doses.
EXEMPLOS
[00354]Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. No entanto, os versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda alcançar um resultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. EXEMPLO 1: Geração de linhagem de células estável expressando EHV-1 genes ORF 43 (UL18) ou ORF 54 (UL8)
[00355]Gene ORF 43 (ORF 43(co)), sintético, otimizado no códon, SEQ ID NO:3, (com base na sequência de nucleotídeo de EHV-1 RacH cepa gene ORF 43, SEQ ID NO:1) foi digerido com XhoI/BamHI e ligado em vetor pCEP (Invitrogen, No. Catálogo V044-50) digerido com as mesmas endonucleases de restrição. O plasmídeo resultante, pCEP- ORF43 (co) (Figura 1), foi linearizado e transfectado em células testiculares de suíno (ST). Após duas semanas de seleção com higromicina, células estáveis expressando (co) genes ORF43 (células ST-43-CO) foram usadas para resgatar vírus EHV-1 com deficiente em replicação.
[00356]Gene ORF 54 (ORF 54(co)), sintético, otimizado no códon, SEQ ID NO:4 (com base na sequência de nucleotídeo de EHV-1 RacH cepa gene ORF 54, SEQ ID NO:2) foi digerido com XhoI/BamHI e ligado em vetor pCEP (Invitrogen, No. Catálogo V044-50) digerido com as mesmas endonucleases de restrição. O plasmídeo resultante, pCEP- ORF54 (co) (Figura 2), foi linearizado e transfectado em células testiculares de suíno (ST). Após duas semanas de seleção com higromicina, células estáveis expressando ORF54 (co) genes (ST-54-CO células) foram usados para resgatar vírus EHV-1 com deficiente em replicação. EXEMPLO 2: Construção de vetor e resgate de vírus EHV com deficiente em replicação
Vírus EHV-1∆ORF43, com RFP dirigido por promotor mCMV substituindo ORF 43
[00357]DNA sintético com um sítio de clonagem múltipla (MCS) flanqueado por 171 nucleotídeos a montante (SEQ ID NO:5) e 265 nucleotídeos a jusante (SEQ ID NO:6) de gene ORF 43 foi planejado. Proteína fluorescente red dirigida por mCMV (promotor CMV murino) (RFP/mCherry) (Shaner et al., 2004) foi usada como um gene repórter. Como o sinal de transcrição terminação e função estabilizante de mRNA, sequência de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGHpA, Goodwin & Rottman, 1992) foi usada diretamente a jusante na extremidade do gene repórter (RFP). Gene RFP digerido com endonucleases de restrição MluI/SalI foi clonado no MCS para gerar o plasmídeo pUC43- mCMV-RFP. A partir deste plasmídeo, fragmento de DNA com mCMV-RFP-BGH poli-A flanqueado por 43 flancos de ORF (SEQ ID NO 7) foi digerido e clonado em EHV-1 RacH BAC DNA usando o sistema de recombinação red para gerar EHV-1-43- mCMV RFP. A recombinação red abate ORF43 e substitui o mesmo com mCMV-RFP-BGH poli-A (Figura 3). Após uma seleção por canamicina, EHV-1-43-mCMV RFP BAC DNA foi depois transfectado em células ST-43-CO para resgatar vírus rEHV- 1-43-mCMV-RFP recombinante. EXEMPLO 3: Vírus EHV-1∆ORF43, com RFP dirigindo promotor EHV-1 endógeno substituindo ORF 43
[00358]Em outra versão de substituição de vírus EHV-1 com deficiente em replicação, ORF 43 foi substituído por gene RFP em quando usando protocolo de recombinação red modificado (Figura 5). Primeiro, DNA SceI sintético/DNA de canamicina, flanqueados por 171 nucleotídeos a montante (SEQ ID NO:5) e 265 nucleotídeos a jusante (SEQ ID NO:6) de gene ORF 43 foi planejado. Este fragmento de DNA (SEQ ID NO:8) foi transformado em E.coli K12 GS1783 carregando EHV- 1 BAC DNA. Seleção com canamicina resultou em clones de EHV-1 intermediários, onde ORF 43 foi substituído com fragmento de SceI/Canamicina. A seguir, gene RFP flanqueado por 161 nucleotídeos a montante (SEQ ID NO: 9) e 120 nucleotídeos a jusante (SEQ ID NO:10) de gene ORF 43 foi transformado nos clones acima para selecionar para clones EHV-1 BAC DNA, onde o gene ORF43 foi substituído com RFP em quadro (EHV-1-43-RFP) (Figura 4). EHV-1-43 RFP BAC DNA foi transfectado em células ST-43-CO para resgatar vírus rEHV- 1-43-RFP recombinante. Porque os requerentes não incluíram um promotor externo, expressão de RFP neste cenário é dependente da expressão de gene EHV-1 inerente pelo promotor de ORF 43 endógeno. EXEMPLO 4: Vírus EHV-1∆ORF 54, com RFP dirigido por promotor mCMV substituindo ORF 54
[00359]DNA sintético com um MCS flanqueado por 200 nucleotídeos a montante (SEQ ID NO:11) e 200 nucleotídeos a jusante (SEQ ID NO:12) de gene ORF 54 foi projetado. Gene RFP dirigido por mCMV digerido com endonucleases de restrição MluI/SalI foi clonado no MCS para gerar o plasmídeo pUC54-mCMV-RFP. A partir deste plasmídeo, fragmento de DNA com mCMV-RFP-BGH poli-A flanqueado por flancos de ORF 54 (SEQ ID NO:13) foi digerido com I-CeuI e clonado em EHV-1 RacH BAC DNA usando o sistema de recombinação red para gerar EHV-1-54-mCMV RFP. O nocaute de recombinação red ORF54 e inserto mCMV-RFP-BGH poli-A estão na mesma região (Figura 6). Após uma seleção com canamicina, o EHV-1-54-mCMV RFP BAC DNA foi depois transfectado em células ST-54-CO para resgatar vírus- rEHV- 1-54-mCMV-RFP recombinante. EXEMPLO 5 Vírus EHV-1 com deficiente em replicação com transgenes a ORF43 ou ORF54
[00360]Células ST regulares, células ST-43-CO e células ST-54-CO foram infectadas com diferente multiplicidade de infecção (MOI) de vírus EHV-1/RacH, rEHV-1-43-mCMV-RFP, rEHV-1-43-RFP e rEHV-1-54-mCMV-RFP. As células infectadas foram observadas a cada 24h para expressão de genes e formação de placas por microscopia de fluorescência. O efeito citopático (CPE) foi monitorado por microscopia luminosa; vírus foi coletado a 70% CPE e titulado por TCID50.
[00361]Como visto em Figura 7, vírus EHV-1/RacH causa significante CPE em todas as três linhagens de células. Placas distintivas observadas em todas as células infectadas com vírus EHV-1/RacH estabeleceram que as células estáveis geradas em Exemplo 1 e Exemplo 2 sustentam a replicação de EHV-1, assim como células ST regulares.
[00362]Células ST regulares e células ST-43-CO foram infectadas com vírus rEHV-1-43 -RFP (Figura8). Embora ambas as células sejam infectadas com vírus rEHV-1-43 -RFP (como visto da expressão de GFP), produção de CPE e vírus foi observada apenas em células ST-43-CO. Expressão de transgene (RFP) foi observada em todas as células infectadas, mas CPE ou placas visíveis foram somente observados em apenas as células ST-43-CO.
[00363]A seguir, células ST regulares e células ST-43- CO foram infectadas com vírus rEHV-1-43-mCMV-RFP (Figura 9). Embora ambas as células tenham sido infectadas com vírus rEHV-1-43-mCMV-RFP (como visto da expressão de GFP), a produção de CPE e vírus foi observada apenas em células ST-43-CO. A expressão de transgene (RFP) foi observado em todas as células infectadas mas CPE ou placas visíveis foram somente observados apenas em células ST-43-CO.
[00364]Os dados acima confirmam que vírus EHV-1 desprovidos de gene ORF43 podem somente replicar em células expressando proteína ORF 43 (como em células ST-43-CO) e não em células regulares. Os dados também demonstram que ORF43 pode ser substituído com um diferente transgene que poderia ser expressado em células infectadas através de um promotor externo (tal como mCMV) ou como uma parte de genes de EHV-1 (sem um promotor externo; com o promotor endógeno).
[00365]Finalmente, células ST regulares e células ST- 54-CO foram infectadas com vírus rEHV-1-54-mCMV-RFP (Figura10). Embora ambas as células tenham sido infectadas com vírus rEHV-1-54-mCMV-RFP (como visto a partir da expressão de GFP), a produção de CPE e vírus foi observada apenas em células ST-54-CO. Expressão de transgene (RFP) foi observada em todas as células infectadas, mas CPE ou placas visíveis foram somente observados apenas em células ST-54-CO. Estes dados acima confirmam que vírus EHV-1 desprovidos de gene ORF54 somente podem replicar em células expressando proteína ORF 54 (como em células ST-54-CO) e não em células regulares. Os dados também demonstram que
ORF54 pode ser substituído com um transgene diferente que poderia ser expressado em células infectadas através de um promotor externo (tal como mCMV).
[00366]Os Requerentes compararam títulos de vários vírus recombinantes produzidos em diferentes linhagens de células (em triplicatas). Os dados claramente demonstram que vírus desprovidos de ORF 43 ou ORF 54 não podem replicar em células regulares (Tabela 1). Tabela 1 Amostra Vírus Produzidos em Título No. células (TCID50/ml) 1 rEHV-1-43 -RFP ST 0 2 rEHV-1-43 -RFP ST-43-CO 6.49E+06 3 rEHV-1-43-mCMV-RFP ST 0 4 rEHV-1-43-mCMV-RFP ST-43-CO 5,99E+06 5 rEHV-1-54-mCMV-RFP ST 0 6 rEHV-1-54-mCMV-RFP ST-54-CO 1,24E+06 EXEMPLO 6: Vírus EHV-1 com deficiente em replicação com transgenes em outros sítios de inserção
[00367]DNA sintético com flancos para abater ORF 43 completamente por recombinação red em duas etapas foi projetado e transformado em células GS1783 carregando EHV- 1/HA BAC DNA (sequência HA, SEQ ID NO:14). Após a recombinação red em duas etapas, ORF 43 é abatido (confirmado por Sequenciamento Sanger, dados não mostrados) para gerar EHV-1-∆ORF43-HA. EHV-1-∆ORF43-HA BAC DNA (com um gene HA dirigido por mCMV em sítio ORF 1/3 e desprovido de ORF 43) é transfectado em células ST-43-CO para resgatar vírus recombinante: rEHV-1-∆ORF43-HA.
[00368]DNA sintético com flancos para nocautear ORF 54 completamente por recombinação red em duas etapas foi projetado e transformado em células GS1783 carregando EHV-
1/HA BAC DNA (sequência HA, SEQ ID NO:14). Após a recombinação red em duas etapas, ORF 54 é abatido (confirmado por sequenciamento Sanger, dados não mostrados) para gerar EHV-1-∆ORF54-HA. EHV-1-∆ORF54-HA BAC DNA (com um gene HA dirigido por mCMV em sítio ORF 1/3 e desprovido de ORF 54) é transfectado em células ST-43-CO para resgatar vírus recombinante: rEHV-1-∆ORF54-HA.
[00369]Quando células ST e ST-43-CO regulares são infectadas com rEHV-1-∆ORF43-HA em diferente MOI, produção de CPE/vírus é observada apenas em células ST-43-CO infectadas. A expressão de HA em células infectadas pode ser confirmada por IFA (ensaio de imunofluorescência) usando anticorpo anti-HA.
[00370]Quando células ST e ST-54-CO regulares são infectadas com rEHV-1-∆ORF54-HA em diferente MOI, produção de CPE/vírus é observada apenas em células ST-54-CO infectadas. A expressão de HA em células infectadas pode ser confirmada por IFA (ensaio de imunofluorescência) usando anticorpo anti-HA. EXEMPLO 7: Testando uma vacina vetorizada de EHV-1 com deficiente em replicação expressando HA em outros sítios de inserção in vivo em suínos
[00371]DNA sintético com flancos para nocautear ORF 43 completamente por recombinação red em duas etapas é planejado e transformado em células GS1783 carregando EHV- 1/HA BAC DNA (sequência HA, SEQ ID NO:25). Após a recombinação red em duas etapas, ORF 43 é abatido (confirmado por sequenciamento Sanger, dados não mostrados) para gerar EHV-1-∆ORF43-HA. EHV-1-∆ORF43-HA BAC DNA (com gene HÁ dirigido por mCMV a ORF 1/3 sítio e desprovido de ORF 43) é transfectado em células ST-43-CO para resgatar vírus recombinante: rEHV-1-∆ORF43-HA.
[00372]Quando células ST e células ST-43-CO não de complementação são infectadas com rEHV-1-∆ORF43-HA, a produção de CPE/vírus é observada apenas em células ST-43- CO infectadas. A expressão de HA (SEQ ID NO: 25) em células infectadas pode ser confirmada por IFA (ensaio de imunofluorescência) anticorpo usando anti-HA (Figura 19).
[00373]Para testar o potencial de Vírus EHV-1 com deficiente em replicação como vacinas, 5 porcos com onze semanas de idade foram vacinados duas vezes (Dia-0 e Dia- 14) com vírus rEHV-1-∆ORF43-HA. O grupo de controle de animais foi vacinado com placebo. O ensaio de inibição de hemaglutinação (HI) foi realizado a partir de todas as amostras de soro para testar se porcos vacinados carregam anticorpos para o antígeno presente no Vírus EHV-1 com deficiente em replicação.
[00374]Todos os 5 animais vacinados tinham significantes títulos HI após uma vacinação. Os títulos de HI adicionalmente aumentaram em todos os porcos vacinados após a segunda vacinação. Nenhum dos animais de controle tinha títulos de HI substanciais em dias de teste similares (Figura 20). EXEMPLO 8: Uso do sítio de inserção ORF70 (US4) com promotor p455 em vacinas de vetor EHV-1 recombinante e construção de um vírus recombinante
[00375]Hemaglutinina de Influenza subtipo H3 (A/suínos /Italy/7680/2001(H3N2), Número de acesso GenBank.:
ABS50302,2) foi clonada em pU70-p455-71K71 (Figura 11, SEQ ID NO. 15) para gerar plasmídeo de transferência pU70-p455- H3-71K71, colocando H3 sob controle do promotor p455 e o novo sinal de poliadenilação de 71pA e flanqueando o cassete com as regiões de recombinação para inserção em ORF70 (Figura 12, SEQ ID NO:16). O sistema de recombinação RED (Tischer et al. 2006 Biotechnol. Tech. 40, 191–197) foi usado para clonar o cassete de expressão p455-H3-71 a ORF70 de pRacH-SE para gerar pRacH-SE70-p455-H3 (Figura 13).
[00376]Células PK/WRL foram transfectadas com pRacH- SE70-p455-H3, para resgatar vírus recombinante rEHV-1 RacH- SE70-p455-H3. Inserção do cassete de expressão foi confirmada por sequenciamento de um produto PCR de alta fidelidade da região de inserção. Expressão do transgene em células infectadas foi analisada por ensaio de imunofluorescência indireto (IFA, Figura 14). EXEMPLO 9 Testagem in vivo de uma vacina de vírus de influenza vetorizada com EHV-1 monovalente (vacina H3) para suínos
[00377]Para testar a eficácia de rEHV-1 RacH-SE-70- p455-H3 como uma vacina potencial, leitões sem imunidade de origem materna contra IAV suíno (sem anticorpos maternos) foram vacinados duas vezes com rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 em uma dose de 1x10^7 TCID50/mL por via intramuscular em uma idade de duas e cinco semanas, respectivamente, ou em uma idade de cinco semanas apenas (vacinação única). Um grupo de leitões não vacinados serviu como controle negativo e um grupo de animais que foram vacinados às duas e cinco semanas de idade com uma vacina suína IAV inativada comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante (exceto para os pontos de tempo de vacinação) serviu como positivo controle (sacrificado). Com a idade de 8 semanas, todos os animais, exceto o grupo de controle negativo, foram desafiados por uma dosagem intratraqueal aplicada de 1x10^7 TCID50/mL de uma cepa de desafio H3N2 Suíno IAV (vírus de campo europeu isolado R452-14, cujo H3 é heterólogo para o antígeno de vacina H3 usado em RacH-SE- 70-p455-H3). Animais não vacinados e não desafiados serviram como controle negativo, enquanto os animais não vacinados, mas desafiados, serviram como controle de pontos no tempo selecionados. Um dia após o desafio, metade dos animais em cada grupo foram sacrificados e os pulmões foram avaliados quanto a lesões típicas de infecção IAV de suíno, três amostras de pulmão por pulmão esquerdo e direito foram coletadas por animal, respectivamente, para determinar os títulos de IAV de suíno infeccioso nos homogenatos de pulmão e fluido de lavagem bronquioalveolar (BALF) foi amostrado. O mesmo procedimento foi realizado com a metade restante em animais por grupo, três dias após o desafio.
[00378]Quando investigando o aumento da temperatura corporal após a aplicação do vírus de desafio IAV suínos, diferente dos leitões vacinados duas vezes com o rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3, animais não vacinados mostraram um aumento de temperatura corporal de cerca de 1°C um dia após o desafio (Figura 15).
[00379]As pontuações pulmonares foram avaliadas em animais sacrificados em 1 ou 3 dias após o desafio. Lesões pulmonares típicas associadas à infecção IAV suína estavam ausentes nos leitões do grupo de controle negativo. Mas, lesões pulmonares (na faixa média de 6 a 7%) foram observadas no grupo de controle de desafio. Finalmente, as pontuações médias de lesão pulmonar foram substancialmente mais baixas (menos de 4%) em leitões vacinados duas vezes com a vacina rEHV1-RacH-SE-70-p455-H3 (Figura 16).
[00380]Os títulos médios de IAV de suíno no pulmão foram avaliados em animais sacrificados em 1 ou 3 dias após o desafio. Enquanto o IAV suíno estava ausente nas amostras de pulmão dos leitões do grupo de controle negativo, o grupo de controle de desafio mostrou títulos de vírus por g de tecido pulmonar na faixa de mais de 5 (dia 3) a mais de 7 logs (dia 1). Em contraste, os valores médios do grupo foram fortemente reduzidos a cerca de dois logs ou menos para o grupo vacinado uma vez com a vacina rEHV1 RacH-SE- 70-p455-H3 e reduzidos a níveis indetectáveis para o grupo vacinado duas vezes com a vacina rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 (Figura 17).
[00381]Quando testando a indução de anticorpos neutralizantes IAV de suíno, após vacinação, soros dos animais vacinados uma vez com a vacina rEHV-1 RacH-SE-70- p455-H3 mostraram títulos neutralizantes recíprocos na faixa de cerca de 160, três semanas após a primeira vacinação e soros de animais vacinados duas vezes com a vacina rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 mostraram títulos neutralizantes de cerca de 2560 três semanas após a 2ª vacinação, enquanto soros dos grupos não vacinados não tinha níveis detectáveis de anticorpo neutralizante IAV de suíno (Figura 18).
[00382]Tomados juntos, dados deste exemplo demonstram que transgenes inseridos em ORF70 em fundo do vetor EHV-1 podem ser expressados usando um promotor externo e os vetores resultantes de EHV-1 recombinante podem ser usados in vivo como um candidato de vacina potencial.
REFERÊNCIAS
[00383]As seguintes referências, na medida em que apresentam procedimentos exemplares ou outros detalhes complementares aos aqui especificados, são especificamente incorporadas aqui por referência.
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8.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor de Alfaherpesvírus equídeo (EHV) deficiente em replicação caracterizado pelo fato de compreender uma inativação de UL18 e/ou UL8.
2. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inativação de UL18 e/ou UL8 é uma deleção completa ou parcial, uma truncagem completa ou parcial, uma substituição completa ou parcial, uma inversão completa ou parcial, uma inserção.
3. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 925 nucleotídeos, pelo menos 940 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL18.
4. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que, pelo menos, 1 nucleotídeo, pelo menos 2 nucleotídeos, pelo menos 3 nucleotídeos, pelo menos 4 nucleotídeos, pelo menos 5 nucleotídeos, pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos, pelo menos 50, nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, pelo menos 900, nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, pelo menos 1250 nucleotídeos, pelo menos 1500, nucleotídeos, pelo menos 1750 nucleotídeos, pelo menos 2000 nucleotídeos, pelo menos 2225 nucleotídeos são deletados, substituídos ou invertidos dentro do UL8.
5. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:1 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL18.
6. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma sequência de DNA tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% identidade para a sequência de DNA como especificada em SEQ ID NO:2 é deletada, substituída ou invertida dentro do UL8.
7. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo:
(i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno é opcionalmente operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:9 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, (iii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, SEQ ID NO:10 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
8. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV compreende um cassete de expressão compreendendo: (i) pelo menos uma sequência de nucleotídeo exógena de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, em que dita sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno é opcionalmente operacionalmente ligada a uma sequência de promotor, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma, e (iii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12 e uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
9. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a inserção do cassete de expressão em UL18 é representada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 945 bp dentro de UL18 para RacH (SEQ ID NO:1) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
10. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a inserção do cassete de expressão em UL8 é representada por uma deleção de uma porção de aproximadamente 2256 bp dentro de UL8 para RacH (SEQ ID NO:2) ou uma sequência 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homóloga e/ou idêntica da mesma.
11. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL18 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:9, e (ii) pelo menos uma região de flanco UL18 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:10.
12. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV compreende (i) pelo menos uma região de flanco UL8 a montante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:11 e (ii) pelo menos uma região de flanco UL8 a jusante selecionada dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:12.
13. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que deficiente em replicação significa que a taxa de replicação é reduzida por, pelo menos, 90%.
14. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV deficiente em replicação ainda é infeccioso.
15. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV compreende, pelo menos, uma sequência de nucleotídeo de interesse, preferivelmente um gene de interesse, mais preferivelmente uma sequência de codificação de antígeno, inserida em um sítio de inserção, preferivelmente UL56 e/ou US4.
16. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que dita sequência de codificação de antígeno refere-se a um patógeno infectando um animal produtor de alimento tal como suínos, bovinos ou aves de criação ou animais de companhia como gato, equino ou cachorro, preferivelmente, a sequência de codificação de antígeno é de um patógeno selecionado, mas não limitado a, dentre a lista: vírus Schmallenberg, Vírus da Influenza A, Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, Circovírus porcino, Vírus da Peste Suína Clássica, Vírus da Peste Suína Africana, Vírus de Hepatite E, Vírus da Diarreia Viral Bovina, Vírus da Raiva, Morbillivírus Felino, Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Actinobacillus Pleuropneumoniae.
17. Vetor de EHV deficiente em replicação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o vetor de EHV é selecionado dentre o grupo consistindo em EHV-1, EHV-3, EHV-4, EHV-8 e EHV-9.
18. Linhagem de células expressando UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo, caracterizada pelo fato de ser para cultivar o vetor de EHV deficiente em replicação, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
19. Linhagem de células, caracterizada pelo fato de compreender um plasmídeo compreendendo um cassete de expressão compreendendo UL8 e/ou UL18 de EHV ou partes funcionais do mesmo, em que a linhagem de células está expressando UL8 e/ou UL18 ou partes funcionais dos mesmos.
20. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vetores de EHV, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
21. Método para imunizar um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um tal indivíduo uma composição imunogênica conforme definida na reivindicação 20.
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