JP2021516061A - 不活性化ｕｌ１８および／またはｕｌ８を有する新しいｅｈｖ - Google Patents

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Abstract

本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特にＵＬ１８および／またはＵＬ８が不活性化した新規のＥＨＶに関する。本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に好適な関連する発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。

Description

配列表
本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．技術分野
本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特にＥＨＶにおけるＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化に関する。本発明は、ＵＬ１８および／またはＵＬ８が不活性化した複製欠損ＥＨＶにさらに関する。本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に好適な関連する発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
Ｂ．関連技術の背景および説明
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ウマ流産ウイルス、ＥＨＶ−１）は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ１５０，０００塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス３型（水痘帯状疱疹ウイルス）、ブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス）、ウシアルファヘルペスウイルス１型（感染性気管支炎ウイルス）、およびウマアルファヘルペスウイルス４型（ウマ鼻肺炎ウイルス、ＥＨＶ−４）（Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。ＥＨＶ−４は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、ＥＨＶ−１は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。ＥＨＶ−１に対して使用許諾を得た２つの改変生ワクチン（ＭＬＶ）がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれＲｈｉｎｏｍｕｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＰｒｅｖａｃｃｉｎｏｌ（登録商標）（ＭＳＤ）である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において２５６回継代された、古典的に弱毒化したＥＨＶ−１ ＲａｃＨ株を含有する（Ma et al. 2013）。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、ＲａｃＨがｏｒｆ６７（ＩＲ６）の２つのゲノムコピーを欠如し、１つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするｏｒｆ１（ＵＬ５６）のコード配列の９０％より多くを除去する１２８３ｂｐの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、ＲａｃＨは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ワクチン株ＲａｃＨ：ｐＲａｃＨおよびｐＲａｃＨ−ＳＥの全ゲノムを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌人工染色体（ＢＡＣ）の２つのバリアントは、ベクターワクチン開発のプラットフォームとして公知である。ＢＡＣ ｐＲａｃＨ−ＳＥはｐＲａｃＨ、元々はＫｌａｕｓ Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅ，ＦＵ Ｂｅｒｌｉｎの研究室でクローニングされたＢＡＣをもとに作製された。ｐＲａｃＨは、糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ；Wellington et al., 1996）をコードするｏｒｆ７１（ＵＳ５）が欠損している。その場所に、ＢＡＣベクター配列およびＧＦＰ発現カセットが導入された。ｐＲａｃＨから未改変ＥＨＶ−１ ＲａｃＨをレスキューするため、ウイルス複製の間に、ＢＡＣベクター配列部分およびＧＦＰ発現カセットが相同組換えによってｏｒｆ７１（ＵＳ５）によって置き換えられ、元々のＲａｃＨゲノムが回復されるように、それは、全ｏｒｆ７１（ＵＳ５）プラス隣接領域を含有するプラスミドとコトランスフェクトされなければならなかった。ＢＡＣベクター配列／ＧＦＰ発現カセットが細胞培養でのトランスフェクション時に自己切断可能（ＳＥ）になるように、ｐＲａｃＨは本発明において改変された（Tischer et al., 2007）。この改善されたＢＡＣはｐＲａｃＨ−ＳＥと名付けられた。ｐＲａｃＨおよびｐＲａｃＨ−ＳＥは、ｐＲａｃＨ−ＳＥがｏｒｆ７１（ＵＳ５）修復ウイルスのレスキューを著しく促進する点が違うのみで、両方ともベクターワクチン開発のためのプラットフォームとなり得る。
ＥＨＶ−１ ＲａｃＨベースのベクターワクチンは、ブタ、ウシ、およびイヌを含むいくつかの哺乳動物種で免疫性を引き出すことができることが示された（Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, Said et al. 2013）。病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子は、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨによって発現され得る。ＥＨＶ−１−ＲａｃＨゲノムは、大腸菌においてそのＢＡＣ形態で操作し、通常導入遺伝子発現カセットを挿入することによってさらなるタンパク質を発現するように調製することができる（Tischer et al., 2010）。培養した許容細胞においてｐＲａｃＨ−ＳＥ ＤＮＡをトランスフェクションすると、ＥＨＶ−１複製が細胞の転写因子によって開始される。ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性は、全てのＢＡＣベクター関連配列の欠損およびＥＨＶ−１ ＲａｃＨゲノムのその元々の状態への回復をもたらす。感染性ウイルスが生成され、それはＲａｃＨと区別がつかない。
ｐＲａｃＨ−ＳＥが、例えば導入遺伝子発現カセットの挿入によって、大腸菌中で操作される場合、許容細胞へのトランスフェクション後に再構築されたウイルスは改変を保持し、さらなる遺伝子を発現するであろう。組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨはベクターワクチンとして使用することができる。
野生型ＥＨＶ−１株は、それらのゲノムの長いユニーク断片の一端にｏｒｆ１（ＵＬ５６）、ｏｒｆ２、およびｏｒｆ３と呼ばれる３つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を保持する（配列座標 １２９８−３６１４；図１）。Ｏｒｆ１（ＵＬ５６）およびｏｒｆ３は、ＤＮＡの１つの鎖に連続して配置されているが、ｏｒｆ２は相補鎖にコードされている。ワクチン株ＲａｃＨは、ｏｒｆ１および２に影響を及ぼす領域内に１２８３ｂｐの欠損があり、これは、これらの遺伝子はウイルス複製に必須ではないことを示している。このため、その部位は導入遺伝子挿入部位となる。この挿入部位はＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）と呼ばれる。
しかしながら、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）挿入部位に挿入され得る導入遺伝子のサイズおよび数は、通常制限される。したがって、ＥＨＶベクターの能力を増強するため、ＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨベクターに導入遺伝子を挿入する、およびＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨベクターから導入遺伝子を発現する、新しいおよび代わりの方法の満たされていない要求がある。
複製欠損ＥＨＶベクターワクチンには利点があり得る。そのような複製欠損ＥＨＶベクターワクチンは、宿主動物内で複製できず、ある動物から別の動物に拡散せず、したがって、安全性または制御の目的のためには有利である。
Barnard et al 1997 (Virology; 237, 97-106)は、ヘルペス単純ウイルスＩ型のＵＬ８のいくつかの変異体が複製のいくらかの阻害を示すことを記載している。さらに、Muylaert et al 2012 (Journal of Biological Chemistry; VOL. 287, NO. 40, pp. 33142-33152)は、ＤＮＡ合成が欠損したヘルペス単純ウイルスＩ型のＵＬ８のいくつかの変異体を記載している。さらに、いくつかの変異がＥＨＶに導入され、相当する変異がＥＨＶ−１ ＵＬ８に導入された場合、類似の表現型が観察された。
中国特許出願公開第１０５６４１６９２号は、ヘルペス単純ウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）のＵＬ１８の完全な欠損（ノックアウト）を記載している。しかしながら、中国特許出願公開第１０５６４１６９２号は、前記ＨＳＶ−１ ＵＬ１８ノックアウトは約８０％までプラーク形成阻害率が低減されたが、複製は完全には消失しなかったことを記載している。さらに、中国特許出願公開第１０５５３５９５９号は、ＨＳＶ−１ ＵＬ１８ノックアウトの表現型も研究しており、複製および感染が著しく低く、感染がほぼ観察されなかったことを記載している。したがって、複製に関し、中国特許出願公開第１０５５３５９５９号は、中国特許出願公開第１０５６４１６９２号と類似の表現型（複製の低減だが、完全な消失ではない）を記載している。さらに、中国特許出願公開第１０５５３５９５９号は、ＨＳＶ−１ ＵＬ１８ノックアウトの感染がほぼないことを記載しており、これはベクターワクチン（例えば、組換えＥＨＶワクチン）の場合は問題である。ベクターワクチンは十分な免疫応答を提供するために宿主細胞に感染しなければならないからである。特に、感染細胞における感染性および導入遺伝子発現は、外来抗原を発現するベクターワクチンが有効であるために必須である。したがって、複製欠損（だが、感染性）ＥＨＶベクターシステムの満たされていない要求がある。
ＥＨＶベクターの能力を増強するため、本発明は、複製欠損ＥＨＶを産生する方法、ＥＨＶベクター骨格に導入遺伝子を挿入する方法およびＥＨＶベクター骨格から導入遺伝子を発現する方法を提供する。
本発明は、ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化、ならびにＥＨＶベクターに導入遺伝子配列を挿入する、およびＥＨＶベクターからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用され得る新しい、代わりの導入遺伝子挿入部位ＵＬ１８および／またはＵＬ８を含む複製欠損ＥＨＶに関する。
ＵＬ８および／またはＵＬ１８の不活性化は、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である。
本発明は、本発明の複製欠損ＥＨＶベクターを含む哺乳動物宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明の複製欠損ＥＨＶベクターを培養するためのＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現する細胞株にさらに関する。
本発明は、ＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を含む発現カセットを含むプラスミドを含む細胞株であって、ＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現している細胞株にさらに関する。
本発明は、本発明に記載の不活性化ＵＬ１８および／またはＵＬ８を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生するための方法にさらに関する。
本発明は、
ａ）野生型ＥＨＶまたは弱毒化ＥＨＶを提供するステップ；
ｂ）ステップａ）のＥＨＶのＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化するステップならびに完全ＵＬ１８および／またはＵＬ８またはＵＬ１８および／またはＵＬ８の機能性部分を持たないＥＨＶクローンを選択するステップ；
ｃ）ＵＬ１８および／またはＵＬ８またはその機能性部分を発現する補完細胞株を提供するステップ；
ｄ）ステップｂ）からのＥＨＶをステップｃ）からの補完細胞株と培養することによって複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を得るステップ
を含む、複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生する方法にさらに関する。
本発明は、本発明の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物にさらに関する。
本発明は、そのような対象に本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む、対象を免疫するための方法にさらに関する。
本発明は、必要とする対象において病原体によって引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法にさらに関する。
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
これらの特徴は、ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化によって複製欠損であるＥＨＶに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。さらに、抗原は、前記ＥＨＶベクターに挿入され得る。別の挿入部位ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）からの少なくとも１つの抗原、または類似の効率で並行して少なくとも２つの異なる抗原が、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）から発現され得る。さらに、新しく記載されたＵＬ１８および／またはＵＬ８挿入部位からの少なくとも１つの抗原、または新しく記載されたＵＬ１８および／またはＵＬ８から類似の効率で並行して少なくとも２つの異なる抗原が発現され得る。さらに、新しく記載されたＵＬ１８および／またはＵＬ８挿入部位と前記他の挿入部位ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）の両方からの抗原が発現され得る。複製欠損ＥＨＶベクターワクチンは、安全性または制御の目的のためには有利である。さらに、ワクチン標的が２つまたはそれ以上の異なる病原体／抗原からなる場合、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）のような確立された挿入部位と並行する新しいＵＬ１８および／またはＵＬ８挿入部位の適用は、グッズの費用を著しく削減でき、１つの抗原成分のみを発現するベクターよりもはっきりとした利点となる。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組合せて参照することによってよりよく理解することができる。
発現プラスミド、ｐＣＥＰ−ＯＲＦ４３（ＣＯ）のプラスミドマップを示す図である。このベクターは、ＣＭＶプロモーターによってコドン最適化ＥＨＶ−１ ＯＲＦ４３遺伝子を発現し、安定した細胞株の１つを生成するために使用された。 発現プラスミド、ｐＣＥＰ−ＯＲＦ５４（ＣＯ）のプラスミドマップを示す図である。このベクターは、ＣＭＶプロモーターによってコドン最適化ＥＨＶ−１ ＯＲＦ５４遺伝子を発現し、安定した細胞株の１つを生成するために使用された。 ＯＲＦ４２−ＯＲＦ４５領域を拡大したＥＨＶ−１ ＢＡＣ ＤＮＡのＯＲＦ４３部位へのｍＣＭＶ由来ＲＦＰのクローニングの概略図である。ＵL＝長いユニーク断片ＵS＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｂｐ＝塩基対 ＯＲＦ４２−ＯＲＦ４５領域を拡大したＥＨＶ−１ ＢＡＣ ＤＮＡのＯＲＦ４３部位へのＲＦＰのクローニングの概略図である。ＵL＝長いユニーク断片ＵS＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｂｐ＝塩基対 ＯＲＦ４３領域へのＲＦＰのクローニングのために使用される改変ＲＥＤ組換えを示す図である。上のパネル：プラスミドは正確な縮尺ではない。Ｉ−ＣｅｕＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化されたＳｃｅＩ／Ｋａｎプラスミド。ＥＨＶ−／ＲａｃＨ ＢＡＣ ＤＮＡを持つＧＳ１８３細胞に形質転換されたＳｃｅＩ／Ｋａｎ断片（ＯＲＦ４３配列に隣接する）。ＯＲＦ４３がＳｃｅＩ／Ｋａｎによって置き換えられたＥＨＶ−１／ＲａｃＨクローンを選択するため、クロラムフェニコールおよびカナマイシン選択が使用された。中間のクローンはＥＨＶ−１／ＳｃｅＩ−Ｋａｎと名付けられた。下のパネル：プラスミドは正確な縮尺ではない。ＲＦＰ（ＯＲＦ４３配列に隣接する）ｇ−ｂｌｏｃｋ ＤＮＡは、ＥＨＶ−１／ＳｃｅＩ−Ｋａｎを持つＧＳ１７８３細胞に形質転換され、アラビノースとインキュベートされ、クロラムフェニコール／アラビノースによって選択された。ＥＨＶ−１／Ｓｃｅ−ＫａｎクローンのＯＲＦ４３でＲＦＰ ＤＮＡはＳｃｅＩ／Ｋａｎ断片を置き換え、ＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰを生成する。 ＯＲＦ５３−ＯＲＦ５５領域を拡大したＥＨＶ−１ ＢＡＣ ＤＮＡのＥＨＶ−１ ＯＲＦ５４部位へのｍＣＭＶ−ＲＦＰ−ｐＡのクローニングの概略図である。ＵL＝長いユニーク断片ＵS＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｂｐ＝塩基対 ＥＨＶ−１／ＲａｃＨウイルスを感染させたＳＴ（上のパネル）、ＳＴ−４３−ＣＯ（中央のパネル）およびＳＴ−５４−ＣＯ細胞が類似のＣＰＥを示す図である。感染細胞はＧＦＰを発現するが（右のパネル）、ＲＦＰは発現しない（データは示さない）。 ＳＴ（上のパネル）およびＳＴ−４３−ＣＯ（下のパネル）およびｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰウイルスを示す図である。感染細胞はＧＦＰ（中央のパネル）およびＲＦＰ（右のパネル）を発現するが、ウイルスは拡散し、ｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰウイルスが感染したＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみＣＰＥが観察された。 ＳＴ（上のパネル）およびＳＴ−４３−ＣＯ（下のパネル）およびｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを示す図である。感染細胞はＧＦＰ（中央のパネル）およびＲＦＰ（右のパネル）を発現するが、ウイルスは拡散し、ｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスが感染したＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみＣＰＥが観察された。 ＳＴ（上のパネル）およびＳＴ−５４−ＣＯ（下のパネル）およびｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを示す図である。感染細胞はＧＦＰ（中央のパネル）およびＲＦＰ（右のパネル）を発現するが、ウイルスは拡散し、ｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスが感染したＳＴ−５４−ＣＯ細胞においてのみＣＰＥが観察された。 トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のプラスミドマップを示す図である。 ＥＨＶ−１ ＲａｃＨのＯＲＦ７０への発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１の挿入のためのトランスファープラスミドのプラスミドマップを示す図である。 ｏｒｆ７０挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図である。ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９；ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば実施例１を参照；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。 間接免疫蛍光法：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させたＶＥＲＯ細胞の、間接免疫蛍光法を示す図である。感染後２４時間の細胞は、エタノールによって固定され、風乾された。一次抗体としてＨ３に対する市販のモノクローナル抗体および二次抗体としてＦＩＴＣコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧを使用して、Ｈ３は組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた細胞において蛍光顕微鏡によって示された。 チャレンジの前、ならびにチャレンジの１、２、および３日後の群の平均体温を示すグラフである。エラーバー、標準偏差。試験日当たり左から右へ：陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 チャレンジ後１および３日の群の平均肺スコアを示すグラフである。エラーバー、標準偏差。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 ウイルス力価：チャレンジ後ワクチン接種されたまたはワクチン接種されていないブタの肺試料のウイルス負荷量を示すグラフである。Ｉｎａｃｔ＝市販の不活性化ワクチン。ＥＨＶ＝ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ ウイルス力価：チャレンジ後ワクチン接種されたまたはワクチン接種されていないブタの肺試料のウイルス負荷量を示すグラフである。Ｉｎａｃｔ＝市販の不活性化ワクチン。ＥＨＶ＝ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ チャレンジの日に回収されたブタＩＡＶ Ｈ３チャレンジ株Ｒ４５２−１４に対する動物血清の血清中和（ＳＮ）価の逆数を示すグラフである。２０、検出限界。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 ｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡウイルスを感染させたＳＴ−４３−ＣＯ（上のパネル）および非補完ＳＴ細胞（下のパネル）によるＩＦＡアッセイを示す図である。感染細胞はＥＨＶ−１（左のパネル）およびＨＡタンパク質（右のパネル）を発現するが、ウイルスは拡散し、ｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡウイルスを感染させたＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみＣＰＥが観察された。 対照およびｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡウイルスワクチン接種したブタ（各群５匹のブタ）からの血清によるＨＩアッセイを示す図である。
本発明は、先行技術につきものの問題を解決し、当技術の状態の明らかな進歩を提供する。
本発明は、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９、より具体的には、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的には、ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化を含むＲａｃＨ株にさらに関する。
一般に、本発明は、複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター、好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化を含むＲａｃＨ株を提供する。
有利なことには、本明細書に記載のＥＨＶベクターは複製欠損表現型である。そのような複製欠損ＥＨＶベクターワクチンは宿主動物内で複製せず、ある動物から別の動物に拡散せず、したがって、安全性または制御の目的のためには有利である。
本発明のベクターの一態様では、ＵＬ１８が不活性化される。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８が不活性化される。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８およびＵＬ８が不活性化される。
不活性化ＵＬ１８およびＵＬ８
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８の不活性化は、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８の不活性化は、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）が不活性化される。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ）の前記不活性化は、欠損、置換、逆位または挿入である。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）が不活性化される。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ）の前記不活性化は、欠損、置換、逆位または挿入である。
不活性化ＵＬ１８
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）の５’末端から少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）のＡ、Ｔ、またはＧから少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドがＵＬ１８内で欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ１８内で欠損、置換、または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチドがＵＬ１８内に挿入されている。
不活性化ＵＬ８
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）の５’末端から少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）のＡ、Ｔ、またはＧから少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドがＵＬ８内で欠損、置換または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、配列番号２に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ８内で欠損、置換、または逆位を生じている。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチドがＵＬ８内に挿入されている。
発現カセット
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号５およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号９およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１０およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域
を含む発現カセットを含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号５およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号９およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１０およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域
を含む発現カセットを含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号１１およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１２およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域
を含む発現カセットを含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号１１およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１２およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域
を含む発現カセットを含む。
本発明のベクターの別の態様では、発現カセットの挿入がＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化する。
ＵＬ１８への発現カセットの挿入による欠損
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ１８への発現カセットの挿入は、ＲａｃＨ（配列番号１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ１８内のおよそ９４５ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる。
ＵＬ８への発現カセットの挿入による欠損
本発明のベクターの別の態様では、ＵＬ８への発現カセットの挿入は、ＲａｃＨ（配列番号２）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ８内のおよそ２２５６ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる。
ＵＬ１８の隣接領域
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶは、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、およびこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶは、（ｉ）配列番号５および配列番号９からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号６および配列番号１０からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域を含む。
ＵＬ８の隣接領域
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶは、配列番号１１および配列番号１２、ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶは、（ｉ）配列番号１１からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、および（ｉｉ）配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域を含む。
本発明は、ウイルスベクターゲノムにおける特定の標的部位への、好ましくはＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターのＵＬ１８および／またはＵＬ８部位への相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記参照）のための隣接領域を含むプラスミドにさらに関する。
組換えＥＨＶ
本発明のベクターの別の態様では、前記ＥＨＶベクターは非天然型および／または組換えＥＨＶである。
複製欠損の機能定義
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が少なくとも９０％低減されていることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が少なくとも９５％低減されていることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が少なくとも９９％低減されていることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が少なくとも９９．５％低減されていることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が少なくとも９９．７５％低減されていることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損は複製率が完全に消失していることを意味する。
本発明のベクターの別の態様では、複製率はＴＣＩＤ50アッセイによって測定される。
本発明のベクターの別の態様では、複製欠損ＥＨＶベクターは依然として感染性である。
有利なことには、本明細書に記載のＥＨＶベクターは複製欠損表現型であるが、依然として感染性である。感染性は、十分な免疫応答を提供するためにウイルスワクチンが宿主細胞に感染しなければならないため必要である。特に、感染性は外来抗原を発現するウイルスベクターワクチンに必要である。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶは依然として感染性であり、感染した真核細胞株において複製できるが、補完細胞株においてのみ複製可能ウイルスとしてパッケージされ得る。有利なことに、ウイルスＤＮＡおよびウイルスタンパク質は宿主において依然として産生され、したがって、本発明の複製欠損ＥＨＶは依然として免疫応答および／または保護免疫を誘導する。有利なことに、本発明のデータは、本発明の複製欠損ＥＨＶウイルスにおいてタンパク質発現（マーカータンパク質発現）が依然として起こることを示す。
ＵＬ５６またはＵＳ４への挿入
本発明のベクターのさらに特定の態様では、前記ＥＨＶベクターは、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列をさらに含む。一態様では、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、例えばＩＲＥＳ／２ａペプチドを介して、同じ挿入部位ＵＬ１８および／またはＵＬ８に挿入されている。別の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、別の挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入されている、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化、ならびにＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ１８の不活性化、およびＵＬ５６に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（一価のワクチン）。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ１８の不活性化、およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（一価のワクチン）。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ８の不活性化、およびＵＬ５６に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（一価のワクチン）。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ８の不活性化、およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（一価のワクチン）。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ１８の不活性化、ならびにＵＬ５６およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（二価のワクチン）。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターはＵＬ８の不活性化、ならびにＵＬ５６およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む（二価のワクチン）。
本発明は、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９、より具体的には、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的には、ＵＬ１８および／またはＵＬ８に挿入された目的の第１のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列、ならびに少なくとも１つのさらなる挿入部位、好ましくはＵＬ５６（ＯＲＦ１／３）および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列を含むＲａｃＨ株にさらに関する。本発明の前記ＥＨＶベクターの特定の態様では、少なくとも２つの目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結される。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、２つまたはそれ以上の挿入部位に挿入された、２つまたはそれ以上の目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８およびＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８およびＵＬ８の不活性化を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、挿入された少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、および少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列（または同じものを含む発現カセット）、およびＵＬ５６およびＵＳ４に挿入された少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を挿入することによるＵＬ１８およびＵＬ８の不活性化を含む。
ＵＳ４（ＯＲＦ７０）
本発明のベクターの別の態様では、ＵＳ４への挿入は、ＵＳ４における部分欠損、トランケーション、置換、改変等によって特徴づけられ、ここでＵＳ５は機能性を維持する。
本発明のベクターの別の態様では、ＵＳ４への挿入は、ＲａｃＨ（配列番号２４）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＳ４内のおよそ８０１ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる。
本発明のベクターの特定の態様では、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）への挿入は、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）における部分欠損、トランケーション、置換、改変等によって特徴づけられるが、ＵＳ５（ＯＲＦ７１）は機能性を維持する。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、（ｉ）配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１からなる群から選択される少なくとも１つの左ＵＳ４隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２からなる群から選択される少なくとも１つの右ＵＳ４隣接領域を含む。
ヌクレオチド配列および病原体
本発明のベクターの別の態様では、目的の前記ヌクレオチド配列は組換えおよび／または異種性および／または外来性である
本発明のベクターの別の態様では、前記抗原コード配列は、ブタ、ウシもしくは家禽などの食物生産動物またはネコ、ウマもしくはイヌなどの伴侶動物に感染する病原体に関する。
本発明のベクターの別の態様では、抗原コード配列は、限定はされないが、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である。
本発明のベクターまたは発現カセットの特定の態様では、前記抗原コード配列はブタに感染する病原体に関する。さらなる特定の態様では、前記病原体は、ブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原であり、特に前記ヘマグルチニン抗原はＡ型インフルエンザウイルスに由来する。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））、および／またはＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、配列番号１４によってコードされる配列を含むまたはからなる。別の特定の態様では、前記抗原は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むまたはからなる。
制御配列およびプロモーター
本発明のベクターの別の態様では、目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結される。
本発明のベクターの別の態様では、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列は、限定はされないが、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ポリメラーゼＩＩプロモーター、機能的断片からなる群から選択される。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列は、ＭＣＭＶまたはその機能的断片またはそれらの相補性ヌクレオチド配列である。
本発明のベクターの別の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列は、ＵＬ８またはＵＬ１８の内在性プロモーターである。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９からなる群から選択される。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、ＥＨＶ−１、好ましくは、ＲａｃＨである。
本発明は：
ａ．ＵＬ１８および／またはＵＬ８に挿入された目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列、
ｂ．制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結されてもよい前記目的の第１のヌクレオチド配列、
ｃ．（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結されてもよい前記目的の第１のヌクレオチド配列
を含む本発明に記載のＥＨＶベクターにさらに関する。
特定の態様では、ＥＨＶベクターは、
ａ．第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４への、目的の第２のヌクレオチド配列、好ましくは目的の第２の遺伝子、例えば抗原コード配列
ｂ．制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結されてもよい前記目的の第２のヌクレオチド配列、
ｃ．制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結されてもよい前記目的の第２のヌクレオチド配列
をさらに含む。
本発明は、
ａ．不活性化ＵＬ１８および／またはＵＬ８；
ｂ．ＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
ｃ．制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結されてもよい前記目的の第１のヌクレオチド配列、
ｄ．（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結されてもよい前記目的の第１のヌクレオチド配列
を含む本発明に記載のＥＨＶベクターにさらに関する。
宿主細胞
さらに、本発明は、本明細書に記載の複製欠損ＥＨＶベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞を提供する。
本発明は、本発明に記載のベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞にも関する。
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクターを、本発明に記載の哺乳動物宿主細胞に感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を好適な条件下で培養するステップ
によって特徴づけられ、
ｃ．前記宿主細胞を回収するステップ
によって特徴づけられていてもよい、宿主細胞を調製する方法にさらに関する。
本発明は、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本発明に記載のベクターまたは本発明に記載の哺乳動物宿主細胞の使用にさらに関する。
補完細胞株
さらに、本発明は、本明細書に記載の複製欠損ＥＨＶベクターを培養するためのＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現する細胞株を提供する。
さらに、本発明は、ＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を含む発現カセットを含むプラスミドを含む細胞株であって、ＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現している細胞株を提供する。
本発明の細胞株の別の態様では、細胞株は、限定はされないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＫ−１３（ウサギ腎臓）、ＳＴ（ブタ睾丸）、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞）、ＭＤＢＫ（メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞）およびウマ真皮細胞（ＮＢＬ−６）の群から選択される。
本発明の細胞株の別の態様では、細胞株はＳＴ細胞株である。
産生方法
さらに、本発明は、本明細書に記載の不活性化ＵＬ１８および／またはＵＬ８を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生する方法を提供する。
さらに、本発明は：
ａ）野生型ＥＨＶまたは弱毒化ＥＨＶを提供するステップ；
ｂ）ステップａ）のＥＨＶのＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化するステップならびに完全ＵＬ１８および／またはＵＬ８またはＵＬ１８および／またはＵＬ８の機能性部分を持たないＥＨＶクローンを選択するステップ；
ｃ）ＵＬ１８および／またはＵＬ８またはその機能性部分を発現する補完細胞株を提供するステップ；
ｄ）ステップｂ）からのＥＨＶをステップｃ）からの補完細胞株と培養することによって複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を得るステップ
を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生する方法を提供する。
本発明は、
ａ．目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列をＵＬ１８および／またはＵＬ８に挿入するステップ
を含み、
ｂ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結するステップ、
を含み、
ｃ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を、（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結するステップ
を含んでもよい、本発明に記載のベクターを産生する方法にさらに関する。
特定の態様では、方法は、
ａ．目的の第２のヌクレオチド配列、好ましくは目的の第２の遺伝子、例えば抗原コード配列を第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入するステップ
を含み、
ｂ．前記目的の第２のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結するステップ、
ｃ．前記目的の第２のヌクレオチド配列を、制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結するステップ
をさらに含んでもよい。
本発明は：
ａ．ＥＨＶのＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化するステップ；
ｂ．目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列をＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入するステップ
を含み、
ｃ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列と作動可能に連結するステップ、
ｄ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を、（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡまたはＢＧＨｐＡと作動可能に連結するステップ
を含んでもよい、本発明に記載のベクターを産生する方法にさらに関する。
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクターを、本発明に記載の補完細胞株に感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
ｃ．感染細胞培養を回収するステップ
を含み、
ｄ．ステップｃ）の回収した感染細胞培養を精製するステップ
ｅ．前記回収した感染細胞培養を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含んでもよい、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンの調製の方法にさらに関する。
ワクチン
さらに、本発明は、本明細書に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
本発明の免疫原性組成物の別の態様では、前記免疫原性組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
本発明の免疫原性組成物の別の態様では、前記免疫原性組成物はワクチンである。
したがって、本発明は、
ａ．本発明に記載のベクター、および／または
ｂ．例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド
を含み、
ｃ．薬学的または獣医学的に許容される担体または賦形剤
を含んでもよく、
好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適であり、
好ましくは前記免疫原性組成物がウイルスを含む、
免疫原性組成物にさらに関する。特定の態様では、前記ウイルスは感染性ウイルスである。
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクター、および／または
ｂ．例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の、本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
ｃ．薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤を含み、好ましくは前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に好適であり、
ｄ．前記ワクチンがアジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物にさらに関する。
処置および使用の方法
さらに、本発明は、本明細書に記載の免疫原性組成物をそのような対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法を提供する。
さらに、本発明は、必要とする対象において病原体によって引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明は、前記免疫原性組成物をそのような対象に投与するステップを含む、対象を免疫するための方法で使用するための本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。
本発明は、必要とする対象において病原体によって引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法で使用するための本明細書に記載の免疫原性組成物を提供する。
本発明の方法または使用の別の態様では、前記対象は、ブタ、ウシ、家禽、ネコ、ウマおよびイヌからなるリストから選択される。
本発明の方法または使用の別の態様では、免疫原性組成物は１回投与される。
本発明の方法または使用の別の態様では、免疫原性組成物は２回またはそれ以上の投与で投与される。
本発明は、
ａ）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー；および
ｂ）本発明に記載の免疫原性組成物またはワクチン
を含み、
ｃ）指示リーフレット
を含んでもよい、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくはブタもしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、ウマもしくはイヌなどの伴侶動物にワクチン接種するための、および／または動物において病原体と関連するまたは病原体によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するためのキットにも関する。
本発明は、本発明に記載のベクターからなり、トランスフェクション試薬および指示リーフレットからなっていてもよいキットにさらに関する。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または（or）」の使用は「および／または（and/or）」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメーターに限定されず、当然変化し得るものと理解される。本明細書で使用する用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が特に明確に規定しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（an antigen）」という言及は２つまたはそれ以上の抗原の混合物を含み、「賦形剤（an excipient）」という言及は２つまたはそれ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
分子生物学定義
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成されるまたはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus)；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；ＥＰＡ０３７０５７３；米国特許出願第９２０，１９７号、１９８６年１０月１６日出願；欧州特許出願公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；国際公開第９８／００１６６号；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許可された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許第５，５９１，６３９号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号、ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示の方法によるまたは類似してよい。また、国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Sanford et al.,米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbachet al. (Intracel)；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Szoka et al.,米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；McCormick et al.,米国特許第５，６７７，１７８号 （細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；ならびに本明細書で引用した他の文献も参照。
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
ウイルスベクターの生成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) or K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載されるように、限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養へのトランスフェクションの標準的な技術を含む、当技術分野で周知の好適な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
ウイルスベクターは２つまたはそれ以上の目的のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、目的の第１のタンパク質のコード領域および目的の第２のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、目的の第３または第４のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第３および第４のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。１つのウイルスベクターによってコードされる目的の２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は異なり得る。例えば、２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸であってよい。少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはそれ以上。
好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４またはＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）またはＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１）のような他のバリセロウイルス由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
本開示の特定の態様に従って、用語「ウイルスベクター」または代わりに「ウイルス構築物」は、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４などのヘルペスウイルス科から選択されるウイルス由来の組換えウイルス構築物を指す。好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４に由来するなどのヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製する細胞質のＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および／または「トランスファープラスミド」は、例えばウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、ＤＮＡワクチン接種目的のために有用なプラスミドを特定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してよい。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合であってよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
用語「制御核酸」、「制御エレメント」および「発現調節エレメント」は交換可能に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または制御する全てのエレメントに広く使用され、全てのエレメントをカバーする。原核生物における例示的な制御エレメントは、プロモーター、オペレーターシーケンスおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞において使用される制御エレメントは、限定はされないが、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列等を含むことができ、コード配列の発現および／または宿主細胞におけるコードポリペプチドの産生を提供および／または制御する。
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’の遺伝子に非依存的に翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一の転写物から翻訳されるようにする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための非依存的なリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロニックであり得る、すなわちｍＲＮＡから順に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞のほとんどのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり１つのポリペプチドのみの合成のためにコードする。真核細胞におけるポリシストロニック転写により、翻訳は翻訳開始部位の最も５’側から開始され、最初の終止コドンで終結され、転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物の第２のまたは続くオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロニック転写は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的な翻訳を可能にし、同じ転写物によってコードされた２つまたはそれ以上のポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳは様々な長さであってよく、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶまたはポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など、様々な起源由来であってよい。ベクター構築物における様々なＩＲＥＳ配列およびそれらの使用が記載され、当技術分野で周知されている。下流のコード配列は、下流の遺伝子の発現にネガティブに影響しないであろう任意の距離でＩＲＥＳの３’端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳと下流の遺伝子の始まりの間の最適なまたは許容的な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
用語「２ａ」または「２ａペプチド」は、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する短いオリゴペプチド配列を意味し、２ａおよび「２ａ様」と記載される。そのような２ａおよび「２ａ様」配列（ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する）は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる（Luke and Ryan, 2013参照）。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。プロモーターの例としては、限定はされないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシおよびヒトを含む）などの動物、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑圧可能、および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化など、培養条件のいくつかの変化に応じてそれらの調節下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。
用語「エンハンサー」は、ｃｉｓ位置にあるポリヌクレオチド配列を意味し、プロモーターの活性に作用し、したがって、このプロモーターに機能的に結合した遺伝子またはコード配列の転写を刺激する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置および方向に非依存的であり、したがってそれらは、イントロン内またはコード領域内でさえも転写ユニットの前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くとプロモーターからかなり距離のある位置の両方に位置し得る。プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することもできる。当業者は、様々な起源由来の（およびＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託された、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）多くのエンハンサーを把握しており、それらは非依存的なエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして利用可能である（例えば、ＡＴＣＣに寄託され、または市販され、および個々の起源）。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの１つの例は、メタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
用語「相補的ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの２対の鎖の１つの鎖を記載する。相補的な鎖のヌクレオチド配列は、各アデノシンはチミン（またはＲＮＡの場合はウラシル）、各グアニンはシトシン、逆もまた同様になるように、その対の鎖のヌクレオチド配列を写す。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の相補的ヌクレオチド配列は３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’、またはＲＮＡの場合は３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列の前（５’非コードまたは非翻訳配列）および後（３’非コードまたは非翻訳配列）に制御配列をさらに含んでよい。選択された配列は全長またはトランケート、融合、またはタグ化遺伝子であってよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片であってよい。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって、同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡには存在しない、非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得ることが通常理解される。それは、天然配列、すなわち自然発生的な形態であってよく、または変異され、または異なる起源由来の配列を含んでもよく、そうでなければ所望のように改変されてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞またはタグ付けにおけるコドン利用を最適化するコドン最適化を含む。さらに、それらは、例えば（潜在性の）スプライスドナー、アクセプター部位および枝分かれ点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、繰り返し配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の制御因子の結合部位、制限酵素部位等のｃｉｓ作用性部位の除去または付加を含み、限定はされないが、わずかな例を挙げることができる。選択された配列は、分泌、細胞質、核、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
本明細書で使用する場合、用語「目的のヌクレオチド配列」は、それが必ずしも遺伝子を含まないが、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは部分、例えばｏｒｉ（複製オリジン）を含み得るため、目的の遺伝子よりも、より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むかどうかに非依存的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得る。
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「ＵＬ（長いユニーク）」は、ＥＨＶゲノム、好ましくはＥＨＶ−１ゲノムの長いユニーク断片を記載する略語である。
用語「ＵＳ（短いユニーク）」は、ＥＨＶ−１ゲノム、好ましくはＥＨＶ−１ゲノムの短いユニーク断片を記載する略語である。
用語「転写」は、細胞でのｍＲＮＡの生合成を記載する。
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の特定の態様に従って、用語「発現」は、宿主細胞内での異種および／または外来性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する相当するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはＲＴｑＰＣＲ（逆転写後の定量的ＰＣＲ）によって定量され得る。選択された配列から発現されたタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物活性のアッセイによって、またはタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ解析によって定量され得る。
用語「発現カセット」または「転写ユニット」または「発現ユニット」は、転写される１つまたは複数の遺伝子を含有するベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびに発現カセット内に含有される制御エレメントを含有するポリヌクレオチド配列が、互いに作動可能に連結されている。それらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの特定の態様では、それらは１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子は少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物は転写され、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から発現される。各転写ユニットは、ユニット内に含有される任意の選択された配列の転写および翻訳に必要な制御エレメントを含むであろう。各転写ユニットは、同じまたは異なる制御エレメントを含有し得る。例えば、各転写ユニットは、同じターミネーターを含有してもよく、ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンは、転写ユニット内での遺伝子の機能的な連結に使用され得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は１つより多くの転写ユニットを含有し得る。
用語「発現増加」、「力価または生産性増加」または「発現または生産性改善」により、好適な対照との比較、例えば、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質による、宿主細胞に導入された異種および／または外来性配列、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子の発現、合成または分泌の増加を意味する。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加した場合、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍または少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍増加した場合も、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍〜５倍、好ましくは１．５倍〜５倍、より好ましくは２倍〜５倍、特に好ましくは３倍〜５倍増加した場合も、特別な力価または生産性増加がある。「発現増加」は、そのうえ、より多くの細胞が目的の遺伝子／配列を実際に発現することを意味し得る。例えば、発現増加は、本発明の新しいプロモーターが、他のプロモーターと比較して、ウイルス複製サイクル中により長い期間活性であることを意味し得る。
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、１つまたは複数の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のＦＡＣＳアシスト選択などの他の手法と組合せることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造（例えば、ＬＣＲ、ＵＣＯＥ、ＥＡＳＥ、アイソレーター、Ｓ／ＭＡＲｓ、ＳＴＡＲエレメント）の操作のためのｃｉｓ活性エレメントの使用、（人工）転写因子の使用、内在性または異種および／または外来性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、ｍＲＮＡ翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＰＶ）、ＤＮＡコンカテマーに基づく増幅促進配列またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅システムの使用に基づく。
用語「得られた」は、好ましくは沈殿、カラム等を使用する当業者に公知の単離および／または精製ステップを含み得る。
「発現増加」を測定するためのアッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのタンパク質測定、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）；抗体ベースの検出方法、例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、または免疫拡散法、およびフローサイトメトリー；ならびに赤血球凝集反応アッセイによる生物活性の測定である。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるｍＲＮＡの定量によって間接的に測定される。ｍＲＮＡは、内因性の標準と比較して、ＲＴｑＰＣＲによって定量される。
用語「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の容積当たりの感染ユニットの測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される（Reed and Muench, 1938）。特に、１ミリリットル当たりの組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の５０％が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物のｍＲＮＡの３’端の特異的部位での切断、および切断された３’端での約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは切断部位および下流に位置する配列の約１０〜３０ヌクレオチド上流に配列ＡＡＴＡＡＡを含む。ｔｋ ポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨ ポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載）またはハムスター増殖ホルモンポリＡ（国際公開第２０１００１０１０７号）など、様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
「翻訳制御エレメント」は、発現される各個々のポリペプチドに翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、いくつかの構築物に含まれてよい。発現を最適化するため、発現される核酸配列の５’−および／または３’−非翻訳領域を除去、付加、または変更し、転写または翻訳のいずれかのレベルで、発現を干渉または減少させ得る、任意の潜在的に余分で不適切な代わりの翻訳開始コドンまたは他の配列を除外することが得策であり得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）は開始コドンのすぐ上流に挿入され、翻訳、したがって発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺の増加Ａ／Ｕ含量は、さらにリボソーム結合により効果的である。
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に対して、「外来性」、「外来性配列」、「外来性遺伝子」、「外来性コード配列」と呼ばれる。したがって、ＥＨＶ−４ベースのプロモーターは、ＥＨＶ−１ウイルスベクターを考慮して外来性である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「外来性」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原はその天然種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、ブタＩＡＶ由来のＨＡ抗原は、ＥＨＶ−１ベクターに関して外来性の抗原の１つの例である。ＥＨＶ−１以外の異なる病原体に由来する任意の配列は、したがって、本発明の特定の態様に記載の目的の外来配列もしくは遺伝子または抗原である。
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して、「異種、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえも適用する。例えば、異なる部位で、またはＥＨＶ−４野生型ウイルスにおいてよりも改変形態でＥＨＶ−４ウイルスベクターに導入されるＥＨＶ−４プロモーター配列は、定義により、異種配列である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「異種」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原は、その天然亜種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、抗原、例えばＥＨＶ−１を除く任意のウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−３、ＥＨＶ−８由来の抗原など、目的の任意の非ＥＨＶ−１特異的配列または遺伝子は、したがって、目的の異種配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、用語「非天然型」、「異種」および「外来性」と交換可能に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される場合、用語組換えは、ウイルスゲノムの人工的な操作によって産生されるウイルスを意味する。外来性抗原コード配列など、異種または外来性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語組換えウイルスおよび用語非天然型ウイルスは、交換可能に使用される。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、制御エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の制御エレメント、例えば、限定はされないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサーの調節下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御エレメントと「作動可能に連結される（operably linked to）」または「作動可能に連結される（operatively linked to）」または「作動可能に関連する（operably associated with）」と言われ、遺伝子またはコード領域が制御エレメントによって調節または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、ｃｉｓ位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、２つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、いくらか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の３’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、好適な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合ＰＣＲ法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、好適な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
したがって、プロモーター配列の、用語「機能的断片」または「機能的誘導体」は、断片または誘導体が依然としてプロモーター活性が有効であることを意味する。プロモーター活性を評価する方法の機能アッセイは当業者に周知である（Bustin 2000, Nolan et al. 2006）。そのような機能アッセイの例示的な実施形態としては、例えば、プロモーター動態実験が挙げられる。プロモーターまたはその断片がレポーター導入遺伝子の転写を導く発現カセットを有するベクターウイルスを感染させた細胞は、異なる時間インキュベートされる。全ＲＮＡは、感染後の異なる時間で回収された試料から調製される。ＤＮＡｓｅＩ消化によるコンタミネートしたＤＮＡの破壊後、ＲＮＡは逆転写される。ＲＮＡ調製物からのコンタミネートしたＤＮＡの除去の成功を実証するため、１つの複製試料が逆転写酵素（ＲＴ）の添加によって処理され、２つ目の複製はＲＴの添加無しで処理される。生じるｃＤＮＡは精製され、従来のＰＣＲの鋳型として使用される。ＲＴの添加によって処理された試料のみがＰＣＲ産物を産生するはずである。これらのｃＤＮＡは、次いで、レポーター導入遺伝子のプライマーによるｑＰＣＲに、ウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のプライマーによるものと並行して使用することができ、その転写は、感染および複製の効率のための内部標準を提供する。レポーターのｑＰＣＲ値は、内部標準遺伝子のｑＰＣＲ値を使用して、異なる構築物および感染後の時間の間でノーマライズされる。これは、異なるプロモーターおよびその断片のプロモーター活性の解釈を可能にする。
「配列相同性」は、本明細書で使用する場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２つまたはそれ以上の配列が最適にアラインされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定する場合には、保存的なアミノ酸置換は一致としてカウントされる。
言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有する比較できるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るため、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが一致しなければならず、別のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的な置換を含まなければならない。代わりに、参照配列における、保存的な置換を含まない、全アミノ酸残基またはヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのアミノ酸またはヌクレオチドの数が、参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、さらにより好ましくは１００、さらにより好ましくは２５０、さらにより好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを含む。
当技術分野で公知のように、「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、配列が最適にアラインされた後に所与の配列を参照配列と比較することによって決定され、そのような配列のストリング間の一致により決定されるように、最も高い程度の配列類似性を産生する。そのようなアライメントにより、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば配列は、その位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、特定の位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、次いで参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数によって割られ、％配列同一性を与える。配列同一性は、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものを含む公知の方法によって容易に算出することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する一般的に利用可能なコンピュータープログラムでコード化される。そのようなプログラムの例としては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に利用可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を産生するため、デフォルトのギャップ重み付けを使用して配列を最適にアラインする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当たり１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までが欠損または別のヌクレオチドによって置換され、参照配列の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのヌクレオチドの数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかのヌクレオチド中で個々に分散される。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり１５まで、好ましくは１０、９、８、７、６まで、さらにより好ましくは５、４、３、２、１までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るため、参照配列のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までが欠損または別のアミノ酸と置換され、参照配列のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかの残基中で個々に分散される。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換は一致として含まれない。
用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされることが本明細書において規定される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列に導入され得る）。相当するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基が、次いで比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能であることを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けのいずれかを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者は、これら全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを使用する場合著しくは変更されないことを認識する。
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、「問い合わせ配列」としてさらに使用され、公共のデータベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るため、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照。
ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４／組換えベクター技術の定義
用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する（例えば、ラバ、ケツテイ等）。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」または「ＥＨＶ」は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまでのところ、８つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、５つはアルファヘルペスウイルス亜科（ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９）に属し、３つはガンマヘルペスウイルス科に属する。（Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。
用語「ＥＨＶ−１」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス１型を意味する。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert 1996）。
用語ＥＨＶ−４は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス４型を意味する。
用語「ＵＬ１８に挿入された」または「ＯＲＦ４３に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレーム４３（ＵＬ１８）をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）の完全な欠損（９４５ｂｐ）をもたらした。
用語「ＵＬ８に挿入された」または「ＯＲＦ５４に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレーム５４（ＵＬ８）をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＯＲＦ５４（ＵＬ８）の（２２５６ｂｐ）の欠損をもたらした。
用語「ＯＲＦ７０に挿入された」または「ＵＳ４に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレーム７０（ＵＳ４）をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＯＲＦ７０（ＵＳ４）の５’の８０１塩基対の欠損をもたらし、３’端の残りの４２３ｂｐは無傷なままで残すが、ｏｒｆ７０（ＵＳ４）遺伝子産物糖タンパク質Ｇの発現を無くす。ＥＨＶ−１を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇは、感染細胞から分泌され、炎症促進性サイトカインの結合によって免疫調節性タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターでのその発現が無くなると、無傷な糖タンパク質Ｇを発現する野生型ＥＨＶ−１と比較した場合、ウイルス感染の免疫原性を増大させるはずである。
用語「ＯＲＦ１／３に挿入された」または「ＵＬ５６に挿入された」は、ワクチン株ＥＨＶ−１ ＲａｃＨの弱毒化手順中の継代での偶発的な欠損によって、ＯＲＦ１の９０％および全ＯＲＦ２を含む１２８３ｂｐの断片が欠失する位置で、ウイルスゲノムにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この位置からの導入遺伝子の発現がウイルスの複製と干渉する可能性が極端に少ないと予測されたため、選択された。
用語「不活性化」は、ＵＬ８（ＯＲＦ５４）および／またはＵＬ１８（ＯＲＦ４３）内の変異を指す。用語変異は、前記コードタンパク質の変更をもたらすウイルスＤＮＡをコードする前記タンパク質における改変を含む。用語変異は、限定はされないが、置換（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の置き換え）、欠損（１つ、いくつかまたは全てのヌクレオチド／塩基対の除去）、および／または挿入（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の付加）を指す。したがって、用語変異は、限定はされないが、点変異（単一ヌクレオチドバリアント）または例えばコード（および／または非コード）ヌクレオチド／塩基対の部分が欠損される（部分欠損）または全てのコード（および／または非コード）ヌクレオチド／塩基対が欠損される（完全欠損）、置換および／または付加コード（および／または非コード）ヌクレオチド／塩基対が挿入される大きな変異を含む変異を含む。用語変異は、コードヌクレオチド／塩基対内の変異、非コードヌクレオチド／塩基対内、例えば制御ヌクレオチド／塩基対内の変異、およびコードヌクレオチド／塩基対と非コードヌクレオチド／塩基対の両方の内の変異を含むと理解される。さらに、用語変異は、ヌクレオチド／塩基対（コードおよび／または非コード）の逆位、例えば部分もしくは全てのコードヌクレオチド／塩基対の逆位、または部分もしくは全ての非コードヌクレオチド／塩基対の逆位、またはそれらの組合せも含む。さらに、用語変異は、ヌクレオチド／塩基対（コードおよび／または非コード）の再配置、例えば部分もしくは全てのコードヌクレオチド／塩基対の再配置、または部分もしくは全ての非コードヌクレオチド／塩基対の再配置、またはそれらの組合せも含む。本明細書で使用する場合、変異は、単一変異またはいくつかの変異であってよく、したがって、使用される用語「変異」は単一変異といくつかの変異の両方に関することが多い。前記変異は、コード配列の変更により改変された発現されるタンパク質をもたらすことができる。しかしながら、用語変異は当業者に周知であり、当業者は、難しい説明なく変異を作製することができる。
さらに、用語「不活性化」は、ＵＬ１８および／またはＵＬ８ ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現減少（または除去）を包含する。発現減少は、ＲＮＡ転写の減少ならびにタンパク質発現の減少の両方を包含すると理解される。好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８ ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現は、野生型ＥＨＶウイルスまたは補完細胞株で培養された本発明のＥＨＶウイルスの発現と比較した場合、ＲＮＡおよび／またはタンパク質によって５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％またはそれ以上低減されている。より好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８ ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現は、野生型ＥＨＶウイルスまたは補完細胞株で培養された本発明のＥＨＶウイルスの発現と比較した場合、ＲＮＡおよび／またはタンパク質によって５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、または９０〜１００％低減されている。さらにより好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８ ＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現は、野生型ＥＨＶウイルスまたは補完細胞株で培養された本発明のＥＨＶウイルスの発現と比較した場合、ＲＮＡおよび／またはタンパク質によって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％本発明のＥＨＶにおいて低減されている。
用語「完全または部分欠損、置換または逆位」は、完全または部分欠損、完全または部分置換、および完全または部分逆位を包含する。用語「完全」は、全ＯＲＦ（ＵＬ）が、ＯＲＦ（ＵＬ）の開始コドンから停止コドンまで影響されることを意味する。好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８は、完全欠損、置換または逆位である。しかしながら、用語「部分」は、全ＯＲＦ（ＵＬ）の部分のみが影響されることを意味する。好ましくは、ＵＬ１８および／またはＵＬ８は、部分欠損、置換または逆位である。
用語「開始コドンの５’末端から」は、５’末端でのＯＲＦ（ＵＬ）の欠損、置換または逆位を指す。本明細書で使用される場合、用語は、前記欠損、置換または逆位がＯＲＦの開始コドンに影響する（を含む）と理解される。したがって、ＯＲＦの３’末端の部分は保持されるが、ＯＲＦの５’末端領域の部分は欠損される。しかしながら、５’末端からの前記欠損、置換または逆位は、相当するタンパク質内の１つまたは複数のアミノ酸の欠損、または野生型のタンパク質とは異なるコード領域をもたらすＯＲＦのフレームシフトをもたらし得る。しかしながら、５’末端における前記欠損、置換または逆位は、開始コドンがトランケートされる場合、全くタンパク質の発現をもたらさないことがある。
本明細書で使用する場合、用語「開始コドンのＡ、ＴまたはＧから」は、前記欠損、置換または逆位がＡまたはＴまたはＧで始まり得ると理解される。欠損がＡで始まる場合、Ａが欠損される。しかしながら、Ａからの欠損が２つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠損を含む場合、Ｔも同様に欠損される。さらに、Ａからの欠損が３つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠損を含む場合、Ａ、ＴおよびＧが欠損される。しかしながら、欠損がＴで始まる場合、Ｔが欠損されるが、ＡＴＧのＡは依然として維持されると理解される。さらに、欠損がＧで始まる場合、Ｇが欠損されるが、ＡＴＧのＡおよびＴは依然として維持される。
本明細書で使用する場合、用語「ＵＬ１８内」または「ＵＬ８内」は、ヌクレオチドの前記欠損、置換または逆位が前記ＯＲＦ（ＵＬ）内のどこでも生じ得ると理解される。したがって、ヌクレオチドの前記欠損、置換または逆位は、ＵＬ８（ＯＲＦ５４）および／またはＵＬ１８（ＯＲＦ４３）の５’末端のみ、ＵＬ８（ＯＲＦ５４）および／またはＵＬ１８（ＯＲＦ４３）の３’末端のみ、または前記ＯＲＦ（ＵＬ）のヌクレオチドの残りまたはこれらの組合せに影響し得る。
用語「複製欠損」は、当業者に周知である。一般に、用語は、ウイルスが宿主（例えば哺乳動物細胞または細胞株）において複製が低減したことを意味する。好ましくは、複製は、少なくとも９０％、好ましくは９５％、好ましくは９７．５％、さらにより好ましくは９９．５％、さらにより好ましくは９９．７５％、および最も好ましくは１００％低減されている。複製が１００％低減されている場合、複製は完全に消失している。好ましくは、複製は、同じ種の非複製欠損ウイルスと比較される。好ましくは、複製は、補完細胞または細胞株で培養された複製欠損ウイルスの複製と比較される。好ましくは、本発明の複製欠損ＥＨＶは依然として感染性であり、複製するが、補完細胞または細胞株においてのみ複製可能ウイルスとしてパッケージされ得る。好ましくは、ウイルスＤＮＡおよびウイルスタンパク質は宿主において依然として産生され、したがって、本発明の複製欠損ＥＨＶは免疫応答および／または保護免疫を依然として誘導する。
用語「補完細胞株」または「補完細胞」は、当業者に周知である。本発明の文脈において、補完細胞株は、細胞がＥＨＶ（好ましくはＥＨＶ−１）のＵＬ８および／またはＵＬ１８（またはそれらの機能性部分）を発現する細胞株である。複製欠損ＥＨＶベクターがＵＬ８および／またはＵＬ１８の不活性化を含む場合、複製欠損ＥＨＶは宿主細胞（例えば哺乳動物細胞または細胞株）における複製ではないが、ＵＬ８および／またはＵＬ１８を発現する相当する補完細胞株における複製である。
用語「ＴＣＩＤ50」は、当業者に周知である。一般に、このエンドポイント希釈アッセイは、感染した宿主の５０％を死滅させる、または接種した組織培養細胞の５０％に細胞変性効果を産生するのに必要なウイルスの量を定量する。ＴＣＩＤ50を測定するアッセイは、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法またはＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed and Muench, 1938）など、当業者に周知である。
用語「感染性」は、宿主または宿主細胞へのウイルスの導入を意味する。
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
本明細書で使用する用語「抗原」は、当技術分野で周知であり、免疫原性、すなわち免疫原である物質、ならびに免疫学的不応性、または免疫不応答、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、エピトープを含有するまたは含む、全長タンパク質ならびにそのペプチド断片を意味することが意図される。
用語「食物生産動物」は、例えば、ブタ、ウシ、家禽、魚等、ヒトによる消費のために使用される動物を意味し、好ましくは、食物生産動物はブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタである。
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、例えば、本明細書に記載のように免疫学的応答を引き出すウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートおよび／または置換形態を指す。一般に、そのようなトランケートおよび／または置換形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６個の隣接するアミノ酸を含む。そのような断片は、当技術分野で周知のいくつかのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが依然として支持体に結合しているうちに、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715参照。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間的な構造を決定することにより容易に同定される。上記のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。合成抗原も、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原の定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998参照。（その教示および内容は全て本明細書に参照により組み込まれる。）
用語「免疫化」は、免疫させる食物産生動物への免疫原性組成物の投与による能動免疫化に関し、それにより、そのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす。
用語「必要とする（in need）」または「必要とする（of need）」は、本明細書で使用する場合、投与／処置が健康または臨床徴候へのブーストまたは改善、または本発明に従って免疫原性組成物を受ける動物の健康への任意の他の正の薬効と関連することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、動物の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的活性成分、および可能だが必ずではない活性成分の免疫学的活性を増強する１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。区別すると、ワクチンの免疫学的活性成分は、いわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）でのその元々の形態または弱毒化粒子のいずれかの完全なウイルス粒子、またはいわゆる死菌ワクチン（ＫＶ）での適切な方法によって不活性化された粒子を含み得る。別の形態では、ワクチンの免疫学的活性成分は、生物の適切なエレメント（サブユニットワクチン）を含んでよく、これらのエレメントは、粒子全体を破壊すること、またはそのような粒子を含有する増殖培地のいずれか、および任意選択により所望の構造を産生する続く精製ステップによって、または例えば細菌、昆虫、哺乳動物、もしくは他の種に基づく好適なシステムの使用による適切な操作を含む合成プロセスによって、さらに任意選択により続く単離および精製手順、または好適な医薬組成物（ポリヌクレオチドワクチン接種）を使用する遺伝材料の直接組込みによるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導によって生成される。ワクチンは、１つのまたは同時に１つより多くの上記のエレメントを含み得る。本発明の特定の態様内で使用される場合、「ワクチン」は生ワクチンまたは生ウイルスを指し、組換えワクチンとも呼ばれる。本発明の別の特定の態様では、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または死菌ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは死菌（ＫＶ）または不活性化ワクチンであってよい。
用語「感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）」は、どのくらいのウイルス調製物の感染単位、例えばＴＣＩＤ５０が、細胞当たり使用され培養細胞に感染するかを記載する。例えば、０．０１のＭ．Ｏ．Ｉ．は、１つの感染ユニットが接種される培養容器中１００個の細胞全てを意味する。
用語「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、好適な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
不活性化の様々な物理的および化学的方法が当技術分野で公知である。用語「不活性化」は、照射（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビームまたはガンマ照射）、加熱、または化学的に処置され、その免疫原性を保持しながらそのようなウイルスまたは細菌を不活性化または死滅させた、以前は毒性だったまたは非毒性ウイルスまたは細菌を指す。好適な不活性化剤としては、ベータ−プロピオラクトン、バイナリーまたはベータまたはアセチルエチレンイミン、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が挙げられる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、３７％ホルムアルデヒド溶液の約０．１〜１％を使用して、ウイルスまたは細菌を不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
より詳細には、ウイルスの文脈における用語「不活性化」は、ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複製することができないことを意味し、細菌の文脈における用語「不活性化」は、細菌がｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できないことを意味する。例えば、用語「不活性化」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで繁殖し、次いでもはや複製できないように化学的または物理的な手段を使用して不活性化されたウイルスを指し得る。別の例では、用語「不活性化」は、繁殖し、次いでワクチンの成分として使用され得るバクテリンを生じるなど、細菌、細菌の断片または成分の懸濁液を生じる、化学的または物理的な手段を使用して不活性化された細菌を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「ＫＶ」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、または住み着いている生物の、または生物上の生理学、例えば免疫学的機能を改変することができる１つまたは複数の成分から基本的になる。用語は、限定はされないが、抗生物質または駆虫薬、ならびに、例えば、限定はされないが、プロセシング特性、無菌性、安定性、経腸または非経口経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の好適な経路を介して組成物を投与する可能性、投与後の耐性、または調節性放出特性などの特定の他の目的を達成するために一般に使用される他の構成成分を含む。そのような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に、実証目的のために挙げられ、以下のように調製され得る：感染細胞培養の細胞培養上澄み液は安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合され、混合物は続いて他の方法により凍結乾燥または脱水される。ワクチン接種の前に、混合物は次いで、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和される。
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に本発明での使用のための凍結乾燥免疫原性組成物、安定化剤を含むものは、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー化から生じるオイル、特にイソブテンまたはデセン；線状アルキル基を含有する酸のまたはアルコールのエステル、より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ−（カプリル酸／カプリン酸）またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルに基づき得る。オイルは乳化剤と組合せて使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（例えば、無水マンニトールオレエート）のエステル、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)参照。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は用語カルボマーで公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載している米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名称で販売されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーは、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）であり、これらは無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
さらに好適なアジュバントとしては、多くの他のものもあり、限定はされないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカイン放出の刺激薬が挙げられる。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、さらにより好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予測される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、なおさらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、および最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにＥＨＶ−１ ＲａｃＨウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する／低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、なおより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにＥＨＶ−１（好ましくはＲａｃＨ）ウイルスベクターが、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の生成に好適である。
用語「処置および／または予防」は、集団における感染の発生率の減少または特定の感染によって引き起こされるまたは特定の感染と関連する臨床徴候の重症度の減少を指す。したがって、用語「処置および／または予防」は、病原体によって感染される集団の動物の数の減少、または通常本明細書に提供する有効量の免疫原性組成物を受ける動物の群での感染と関連するまたは感染によって引き起こされる臨床徴候の重症度のそのような免疫原性組成物を受けない動物の群と比較した減少を指す。
「処置および／または予防」は一般に、有効量の本発明の免疫原性組成物の、そのような処置／予防を必要とするまたはそのような処置／予防が有益であり得る動物または動物の集団への投与を含む。用語「処置」は、その動物またはその集団の少なくともいくらかの動物がそのような病原体によってすでに感染し、そのような動物はそのような病原体感染によって引き起こされるまたはそのような病原体感染と関連するいくつかの臨床徴候をすでに示す場合の、有効量の免疫原性組成物の１回の投与を指す。用語「予防」は、病原体によるそのような動物のいずれの感染よりも前の、または少なくともそのような動物または動物の群のどの動物もそのような病原体による感染によって引き起こされるまたはそのような病原体による感染と関連するいずれの臨床徴候も示さない場合の、動物への投与を指す。用語「予防」および「防止」は、本出願において交換可能に使用される。
本明細書で使用する場合、用語「臨床徴候」は、病原体からの動物の感染の徴候を指す。感染の臨床徴候は、選択された病原体によって変わる。そのような臨床徴候の例としては、限定はされないが、呼吸困難、耳炎、ざらざらの被毛、微熱、うつ病、食欲低下が挙げられる。しかしながら、臨床徴候は、限定はされないが、生きた動物から直接観察可能な臨床徴候も挙げられる。生きた動物から直接観察可能な臨床徴候の例としては、鼻汁および眼漏、無気力、咳、喘鳴、動悸、体温上昇、体重減少、脱水症状、跛行、消耗、皮膚の蒼白、発育不全等が挙げられる。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、組成物の文脈では、動物において感染または付随する疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、用量当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。あるいは、療法の文脈では、用語「有効量」は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは処置を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」、「臨床症状の減少」、「中和抗体および／または血清変換の誘導／産生」、および同様の句は、１つまたはそれ以上の本発明の治療用組成物、またはこれらの組合せの投与によって生じる、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味し、その結果、疾患または感染に暴露された免疫されていない対象において予測されるものよりも生じる有害作用が少ないことを意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、明確に記載される。完全な予防と記載されていない場合、この用語は、部分的な予防を含む。
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」は、限定はされないが、野生型感染と比較した、群内の感染した対象の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象の数の減少もしくは排除、または１または複数の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味する。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはマラリアの任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。好ましくは、本発明の治療用組成物を受けた１またはそれ以上の対象において、組成物を受けておらず感染する対象と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少する。より好ましくは、本発明の組成物を受けた対象において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％減少する。
本明細書では、用語「防御の増大」は、限定はされないが、ワクチン接種された対象の群における感染因子による感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種されていない対象の対照群に対して統計的に優位に減少することを意味する。用語「統計的に有意な臨床症状の減少」は、限定はされないが、感染因子によるチャレンジ後に、ワクチン接種された対象の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％、およびさらにより好ましくは７０％低いことを意味する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３ヵ月、なおより好ましくは少なくとも６ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
ウイルスによって誘導される、用語「ウイルス血症の減少」は、限定はされないが、動物の血流に入るウイルスの減少を意味し、ウイルス血症のレベル、すなわち血清ｍＬ当たりのウイルスＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数または血清デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、組成物を受けておらず、感染し得る動物と比較して少なくとも５０％、本発明の組成物を受けた動物の血清中で減少する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を受けた動物で、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９９９％減少する。
用語「病原体」は、当業者に周知である。しかしながら、用語「病原体」は、細菌またはウイルスを含む。用語「病原体」は、シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアのような病原体を含む。
用語「食物産生動物」は、ブタ、ウシ、家禽、魚等、好ましくはブタのようなヒトの消費のために使用される動物を意味する。
用語「伴侶動物」は、ネコ、ウマまたはイヌのような動物を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および／または循環する状態として特に理解される。
「安全性」は、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、限定はされないが、ウイルスに基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含む、有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種（vaccination）」または「ワクチン接種すること（vaccinating）」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
製剤
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
処置の方法
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照）で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス／生ワクチンに関して、投与量は約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０である。
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタに投与するための指示書が添付されていてよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
抗原定義
用語「ブタインフルエンザウイルス」は、当業者に公知である。用語ブタインフルエンザウイルスは、ブタインフルエンザを引き起こすオルソミクソウイルス科のＡ型またはＣ型インフルエンザウイルスを指す。オルソミクソウイルスは３つの群：Ａ型、Ｂ型およびＣ型を有するが、Ａ型およびＣ型インフルエンザウイルスのみがブタに感染する。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、Ａ型ブタインフルエンザウイルスである。ブタインフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ３Ｎ１を含む。Ｈ９Ｎ２およびＨ５Ｎ１はブタにも見出され得る。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、ブタから単離されたインフルエンザウイルスである。
用語「ＨＡ」または「Ｈ」、「ＮＡ」または「Ｎ」および「ＮＰ」は当業者に公知である。しかしながら、一般に、Ａ型インフルエンザウイルスは、多くの可能な組合せをもたらし得る（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２〜Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２〜Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２などと名付けられる）、１７Ｈ（ヘマグルチニン）および１０Ｎ（ノイラミニダーゼ）亜型に分けられる。Ｈ（ヘマグルチニン）およびＮ（ノイラミニダーゼ）は、ＳＩＡＶのようなＡ型インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質である。さらに、Ｎは、中和抗体の主要な抗原性標的である。さらに、ＮＰ（ヌクレオタンパク質）はヌクレオカプシドを形成する。
シーケンス概要：
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
配列番号１ ＥＨＶ−１ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子配列
配列番号２ ＥＨＶ−１ ＯＲＦ５４（ＵＬ８）遺伝子配列
配列番号３ コドン最適化ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子配列
配列番号４ コドン最適化ＯＲＦ５４（ＵＬ８）遺伝子配列
配列番号５ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子の１７１塩基上流
配列番号６ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子の２６５塩基下流
配列番号７ 配列番号５および６に隣接するＢＧＨ ポリＡを有するｍＣＭＶプロモーター駆動ＲＦＰ遺伝子
配列番号８ 配列番号５および６に隣接するカナマイシン遺伝子
配列番号９ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子の１６１塩基上流
配列番号１０ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）遺伝子の１２０塩基下流
配列番号１１ ＯＲＦ５４（ＵＬ８）遺伝子の２００ヌクレオチド上流
配列番号１２ ＯＲＦ５４（ＵＬ８）遺伝子の２００ヌクレオチド下流
配列番号１３ 配列番号５および６に隣接するＢＧＨ ポリＡを有するｍＣＭＶプロモーター駆動ＲＦＰ遺伝子
配列番号１４ ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）部位にクローニングされたＨＡ配列
配列番号１５ トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号１６ トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号１７ 左（Ｕｐ７０）隣接領域（４１７ｂｐ）
配列番号１８ 右（Ｕｐ７１）隣接領域（４３１ｂｐ）
配列番号１９ ヌクレオチド１２７２６４〜１２７６８０に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域左（ｏｒｆ７０上流）
配列番号２０ ヌクレオチド１２８４８４〜１２８９１３に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域右（ｏｒｆ７１上流）
配列番号２１ ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：左（Ｕｐ７０）隣接領域（２８３ｂｐ）＝４１７ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の３’の２８３ｂｐと同一
配列番号２２ ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：右（Ｕｐ７１）隣接領域（１４４ｂｐ）＝４３１ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の５’の１４４ｂｐと同一
配列番号２３ 野生型ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列の欠損部分、ヌクレオチド１２７６８１〜１２８４８２
配列番号２４ ＲａｃＨゲノム配列の欠損部分（完全なゲノム配列が公知ではないため、ヌクレオチド番号が入手できない）
配列番号２５ ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）部位にクローニングされたＨＡ配列
節
以下の節は本明細書に記載される：
本発明は以下の節を提供する：
１．ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
２．ＵＬ１８が不活性化される、節１に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３．ＵＬ８が不活性化される、節１または２に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４．ＵＬ１８およびＵＬ８が不活性化される、節１〜３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５．ＵＬ１８の不活性化が、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である、節１〜４のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
６．ＵＬ８の不活性化が、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である、節１〜５のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
７．ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）が不活性化される、節１〜６のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
８．ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ）の前記不活性化が欠損、置換、逆位または挿入である、節７に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
９．ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）が不活性化される、節１〜８のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１０．ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ）の前記不活性化が欠損、置換、逆位または挿入である、節９に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１１．ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）の５’末端から少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１０のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１２．ＵＬ１８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号１のヌクレオチド１〜３）のＡ、Ｔ、またはＧから少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１１のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１３．少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドがＵＬ１８内で欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１２のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１４．配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ１８内で欠損、置換、または逆位を生じている、節１〜１３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１５．少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチドがＵＬ１８内に挿入されている、節１〜１４のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１６．ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）の５’末端から少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１５のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１７．ＵＬ８の開始コドン（ＡＴＧ、配列番号２のヌクレオチド１〜３）のＡ、Ｔ、またはＧから少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドが欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１６のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１８．少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドがＵＬ８内で欠損、置換または逆位を生じている、節１〜１７のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
１９．配列番号２に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ８内で欠損、置換、または逆位を生じている、節１〜１８のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２０．少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチドがＵＬ８内に挿入されている、節１〜１９のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２１．ＥＨＶが：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号５およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号９およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１０およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域
を含む発現カセットを含む、節１〜２０のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２２．ＥＨＶが：
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
（ｉｉ）配列番号１１およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号１２およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域
を含む発現カセットを含む、節１〜２１のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２３．発現カセットの挿入がＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化する、節２１または２２に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２４．ＵＬ１８への発現カセットの挿入が、ＲａｃＨ（配列番号１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ１８内のおよそ９４５ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる、節２１〜２３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２５．ＵＬ８への発現カセットの挿入が、ＲａｃＨ（配列番号２）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ８内のおよそ２２５６ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる、節２１〜２４のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２６．ＥＨＶベクターが、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、およびこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む、節１〜２５のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２７．ＥＨＶベクターが、（ｉ）配列番号５および配列番号９からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号６および配列番号１０からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域を含む、節１〜２６のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２８．ＥＨＶベクターが、配列番号１１および配列番号１２、ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む、節１〜２７のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
２９．ＥＨＶベクターが、（ｉ）配列番号１１からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、および（ｉｉ）配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域を含む、節１〜２８のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３０．前記ＥＨＶベクターが非天然型および／または組換えＥＨＶである、節１〜２９のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３１．複製欠損が、複製率が少なくとも９０％低減されていることを意味する、節１〜３０のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３２．複製欠損が、複製率が少なくとも９５％低減されていることを意味する、節１〜３１のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３３．複製欠損が、複製率が少なくとも９９％低減されていることを意味する、節１〜３２のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３４．複製欠損が、複製率が完全に消失していることを意味する、節１〜３３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３５．複製率がＴＣＩＤ50アッセイによって測定される、節１〜３４のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３６．複製欠損ＥＨＶベクターが依然として感染性である、節１〜３５のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３７．ＥＨＶベクターが依然として感染性であり、感染した真核細胞株において複製できるが、補完細胞株においてのみ複製可能ウイルスとしてパッケージされ得る、節１〜３６のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３８．ＥＨＶベクターが、挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された、少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む、節１〜３７のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
３９．ＥＨＶベクターが、２つまたはそれ以上の挿入部位に挿入された、２つまたはそれ以上の目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む、節１〜３８のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４０．ＵＳ４への挿入が、ＵＳ４における部分欠損、トランケーション、置換、改変等によって特徴づけられ、ここでＵＳ５が機能性を維持する、節３８または３９に記載のＥＨＶベクター。
４１．ＵＳ４への挿入が、ＲａｃＨ（配列番号２４）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＳ４内のおよそ８０１ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる、節３８〜４０のいずれか１節に記載のＥＨＶベクター。
４２．ＥＨＶベクターが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む、節３８〜４１のいずれか１節に記載のＥＨＶベクター。
４３．ＥＨＶベクターが、（ｉ）配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１からなる群から選択される少なくとも１つの左ＵＳ４隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２からなる群から選択される少なくとも１つの右ＵＳ４隣接領域を含む、節３８〜４２のいずれか１節に記載のＥＨＶベクター。
４４．前記目的のヌクレオチド配列が組換えおよび／または異種性および／または外来性である、節２１〜４３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４５．前記抗原コード配列が、例えばブタ、ウシもしくは家禽などの食物生産動物またはネコ、ウマもしくはイヌなどの伴侶動物に感染する病原体に関する、節２１〜４４のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４６．抗原コード配列が、限定はされないが、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、節２１〜４５のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４７．さらなる制御配列、例えば終結シグナルまたはポリアデニル化配列をさらに含む、節２１〜４６のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４８．目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結される、節２１〜４７のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
４９．目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列が、限定はされないが、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ポリメラーゼＩＩプロモーター、機能的断片からなる群から選択される、節２１〜４８のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５０．少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列が、ＭＣＭＶまたはその機能的断片またはそれらの相補性ヌクレオチド配列である、節２１〜４９のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５１．少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されるプロモーター配列が、ＵＬ８またはＵＬ１８の内在性プロモーターである、節２１〜５０のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５２．ＥＨＶベクターが、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、節１〜５１のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５３．ＥＨＶベクターが、ＥＨＶ−１、好ましくはＲａｃＨである、節１〜５２のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
５４．節１〜５３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞。
５５．節１〜５３のいずれか１節に記載の複製欠損ＥＨＶベクターを培養するためのＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現する細胞株。
５６．ＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を含む発現カセットを含むプラスミドを含む細胞株であって、ＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現している細胞株。
５７．細胞が、限定はされないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＫ−１３（ウサギ腎臓）、ＳＴ（ブタ睾丸）、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞）、ＭＤＢＫ（メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞）およびウマ真皮細胞（ＮＢＬ−６）の群から選択される、節５５または５６に記載の細胞株。
５８．細胞株がＳＴ細胞株である、節５５〜５７のいずれか１節に記載の細胞株。
５９．節１〜５３のいずれか１節に記載の不活性化ＵＬ１８および／またはＵＬ８を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生する方法。
６０．
ａ）野生型ＥＨＶまたは弱毒化ＥＨＶを提供するステップ；
ｂ）ステップａ）のＥＨＶのＵＬ１８および／またはＵＬ８を不活性化するステップならびにＵＬ１８および／またはＵＬ８の完全または機能性部分を持たないＥＨＶクローンを選択するステップ；
ｃ）ＵＬ１８および／またはＵＬ８またはその機能性部分を発現する補完細胞株を提供するステップ；
ｄ）ステップｂ）からのＥＨＶをステップｃ）からの補完細胞株と培養することによって複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を得るステップ
を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）を産生する方法。
６１．節１〜５３のいずれか１節に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
６２．前記免疫原性組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、節６１に記載の免疫原性組成物。
６３．前記免疫原性組成物がワクチンである。節６１または６２に記載の免疫原性組成物。
６４．節６１〜６３のいずれか１節に記載の免疫原性組成物をそのような対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法。
６５．必要とする対象において病原体によって引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、節６１〜６３のいずれか１節に記載の治療有効量の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法。
６６．前記免疫原性組成物をそのような対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法で使用するための節６１〜６３のいずれか１節に記載の免疫原性組成物。
６７．必要とする対象において病原体によって引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む方法で使用するための節６１〜６３のいずれか１節に記載の免疫原性組成物。
６８．前記対象が、ブタ、ウシ、家禽、ネコ、ウマおよびイヌからなるリストから選択される、節６４〜６７のいずれか１節に記載の方法または使用。
６９．免疫原性組成物が１回投与される、節６４〜６８のいずれか１節に記載の方法または使用。
７０．免疫原性組成物が２回またはそれ以上の投与で投与される、節６４〜６９のいずれか１節に記載の方法。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
（実施例１）
ＥＨＶ−１ ＯＲＦ４３（ＵＬ１８）またはＯＲＦ５４（ＵＬ８）遺伝子を発現する安定細胞株の生成
合成、コドン最適化ＯＲＦ４３（ＯＲＦ４３（ｃｏ））遺伝子、配列番号３（ＥＨＶ−１ ＲａｃＨ株ＯＲＦ４３遺伝子のヌクレオチド配列に基づく、配列番号１）は、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩによって消化され、同じ制限エンドヌクレアーゼによって消化されたｐＣＥＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ０４４−５０）にライゲートされた。生じるプラスミド、ｐＣＥＰ−ＯＲＦ４３（ｃｏ）（図１）は、線状化され、ブタ睾丸細胞（ＳＴ）にトランスフェクトされた。ハイグロマイシンによる２週間の選択後、ＯＲＦ４３（ｃｏ）遺伝子を発現する安定細胞（ＳＴ−４３−ＣＯ細胞）は、複製欠損ＥＨＶ−１ウイルスをレスキューするために使用された。
合成、コドン最適化ＯＲＦ５４（ＯＲＦ５４（ｃｏ））遺伝子、配列番号４（ＥＨＶ−１ ＲａｃＨ株ＯＲＦ５４遺伝子のヌクレオチド配列に基づく、配列番号２）は、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩによって消化され、同じ制限エンドヌクレアーゼによって消化されたｐＣＥＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ０４４−５０）にライゲートされた。生じるプラスミド、ｐＣＥＰ−ＯＲＦ５４（ｃｏ）（図２）は、線状化され、ブタ睾丸細胞（ＳＴ）にトランスフェクトされた。ハイグロマイシンによる２週間の選択後、ＯＲＦ５４（ｃｏ）遺伝子を発現する安定細胞（ＳＴ−５４−ＣＯ細胞）は、複製欠損ＥＨＶ−１ウイルスをレスキューするために使用された。
（実施例２）
ベクター構築および複製欠損ＥＨＶウイルスレスキュー
ＯＲＦ４３を置き換えるｍＣＭＶプロモーター駆動ＲＦＰを有するＥＨＶ−１ ΔＯＲＦ４３ウイルス
ＯＲＦ４３遺伝子の１７１ヌクレオチド上流（配列番号５）および２６５ヌクレオチド下流（配列番号６）に隣接する複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を有する合成ＤＮＡが設計された。ｍＣＭＶ（マウスＣＭＶプロモーター）駆動Ｒｅｄ蛍光タンパク質（ＲＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ）（Shaner et al., 2004）がレポーター遺伝子として使用された。転写終結シグナルおよびｍＲＮＡ安定化機能として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ、Goodwin & Rottman, 1992）が、レポーター（ＲＦＰ）遺伝子の３’端の直接下流に使用された。ＭｌｕＩ／ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化されたＲＦＰ遺伝子がＭＣＳにクローニングされ、プラスミドｐＵＣ４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰが生成された。このプラスミドから、ＯＲＦ４３隣接部に隣接するｍＣＭＶ−ＲＦＰ−ＢＧＨポリＡを有するＤＮＡ断片（配列番号７）が消化され、ＲＥＤ組換えシステムを使用してＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＢＡＣ ＤＮＡにクローニングされ、ＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ ＲＦＰが生成された。Ｒｅｄ組換えはＯＲＦ４３をノックアウトし、それをｍＣＭＶ−ＲＦＰ−ＢＧＨポリＡと置き換える（図３）。カナマイシン選択後、ＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ ＲＦＰ ＢＡＣ ＤＮＡは後にＳＴ−４３−ＣＯ細胞にトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰがレスキューされた。
（実施例３）
ＯＲＦ４３を置き換える内在性ＥＨＶ−１プロモーター駆動ＲＦＰを有するＥＨＶ−１ΔＯＲＦ４３ウイルス
置き換え複製欠損ＥＨＶ−１ウイルスの別のバージョンにおいて、ＯＲＦ４３は、改変ＲＥＤ組換えプロトコールを使用してインフレームでＲＦＰ遺伝子によって置き換えられた（図５）。まず、ＯＲＦ４３遺伝子の１７１ヌクレオチド上流（配列番号５）および２６５ヌクレオチド下流（配列番号６）に隣接する、合成ＤＮＡ ＳｃｅＩ／カナマイシンＤＮＡが設計された。このＤＮＡ断片（配列番号８）は、ＥＨＶ−１ ＢＡＣ ＤＮＡを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＧＳ１７８３へと形質転換された。カナマイシンによる選択は、ＯＲＦ４３がＳｃｅＩ／カナマイシン断片によって置き換えられた中間体ＥＨＶ−１クローンを生じた。次に、ＯＲＦ４３遺伝子の１６１ヌクレオチド上流（配列番号９）および１２０ヌクレオチド下流（配列番号１０）に隣接するＲＦＰ遺伝子が上記のクローンへと形質転換され、ＯＲＦ４３遺伝子がインフレームでＲＦＰによって置き換えられたＥＨＶ−１ ＢＡＣ ＤＮＡクローンが選択された（ＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰ）（図４）。ＥＨＶ−１−４３ ＲＦＰ ＢＡＣ ＤＮＡはＳＴ−４３−ＣＯ細胞へと形質転換され、組換えウイルスｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰをレスキューした。本発明者らは、外部プロモーターを含まなかったため、本シナリオでのＲＦＰ発現は、内在性ＯＲＦ４３プロモーターによる生来のＥＨＶ−１遺伝子発現に依存する。
（実施例４）
ＯＲＦ５４を置き換えるｍＣＭＶプロモーター駆動ＲＦＰを有するＥＨＶ−１ΔＯＲＦ５４ウイルス
ＯＲＦ５４遺伝子の２００ヌクレオチド上流（配列番号１１）および２００ヌクレオチド下流（配列番号１２）に隣接するＭＣＳを有する合成ＤＮＡが設計された。ＭｌｕＩ／ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼによって消化されたｍＣＭＶ駆動ＲＦＰ遺伝子がＭＣＳにクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰが生成された。このプラスミドから、ＯＲＦ５４隣接部に隣接するｍＣＭＶ−ＲＦＰ−ＢＧＨポリＡを有するＤＮＡ断片（配列番号１３）がＩ−ＣｅｕＩによって消化され、ＲＥＤ組換えシステムを使用してＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＢＡＣ ＤＮＡにクローニングされ、ＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ ＲＦＰが生成された。Ｒｅｄ組換えはＯＲＦ５４をノックアウトし、同じ領域にｍＣＭＶ−ＲＦＰ−ＢＧＨポリＡを挿入した（図６）。カナマイシン選択後、ＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ ＲＦＰ ＢＡＣ ＤＮＡは後にＳＴ−５４−ＣＯ細胞にトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰがレスキューされた。
（実施例５）
ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４に導入遺伝子を有する複製欠損ＥＨＶ−１ウイルス
通常のＳＴ細胞、ＳＴ−４３−ＣＯ細胞およびＳＴ−５４−ＣＯ細胞は、異なる感染多重度（ＭＯＩ）のＥＨＶ−１／ＲａｃＨ、ｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰ、ｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰおよびｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを感染させた。感染細胞は、蛍光顕微鏡によって遺伝子発現およびプラーク形成を２４時間ごとに観察された。細胞変性効果（ＣＰＥ）は光学顕微鏡によってモニターされ；ウイルスは７０％ＣＰＥで回収され、ＴＣＩＤ５０によって力価測定された。
図７に見られるように、ＥＨＶ−１／ＲａｃＨウイルスは、３つの細胞株全てにおいて顕著なＣＰＥを引き起こす。ＥＨＶ−１／ＲａｃＨウイルスを感染させた全ての細胞で観察された特有のプラークは、実施例１および実施例２で生成された安定細胞ならびに通常のＳＴ細胞がＥＨＶ−１複製を支持することを確立した。
通常のＳＴ細胞およびＳＴ−４３−ＣＯ細胞は、ｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰウイルスを感染させた（図８）。両細胞はｒＥＨＶ−１−４３−ＲＦＰウイルスを感染させたが（ＧＦＰ発現から見られるように）、ＣＰＥおよびウイルス産生はＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察された。導入遺伝子（ＲＦＰ）発現は、全ての感染細胞で観察されたが、目に見えるＣＰＥまたはプラークはＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察された。
次に、通常のＳＴ細胞およびＳＴ−４３−ＣＯ細胞は、ｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを感染させた（図９）。両細胞はｒＥＨＶ−１−４３−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを感染させたが（ＧＦＰ発現から見られるように）、ＣＰＥおよびウイルス産生はＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察された。導入遺伝子（ＲＦＰ）発現は、全ての感染細胞で観察されたが、目に見えるＣＰＥまたはプラークはＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察された。
上記のデータは、ＯＲＦ４３遺伝子を欠如するＥＨＶ−１ウイルスは、ＯＲＦ４３タンパク質を発現する細胞において（ＳＴ−４３−ＣＯ細胞において）のみ複製でき、通常の細胞では複製できないことを確認する。データは、ＯＲＦ４３が、外部プロモーター（ｍＣＭＶなど）によって感染細胞において発現され得る、またはＥＨＶ−１遺伝子の一部として（外部プロモーターなしで内在性プロモーターによる）異なる導入遺伝子によって置き換えられ得ることも実証する。
最後に、通常のＳＴ細胞およびＳＴ−５４−ＣＯ細胞は、ｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを感染させた（図１０）。両細胞はｒＥＨＶ−１−５４−ｍＣＭＶ−ＲＦＰウイルスを感染させたが（ＧＦＰ発現から見られるように）、ＣＰＥおよびウイルス産生はＳＴ−５４−ＣＯ細胞においてのみ観察された。導入遺伝子（ＲＦＰ）発現は、全ての感染細胞で観察されたが、目に見えるＣＰＥまたはプラークはＳＴ−５４−ＣＯ細胞においてのみ観察された。上記のこのデータは、ＯＲＦ５４遺伝子を欠如するＥＨＶ−１ウイルスは、ＯＲＦ５４タンパク質を発現する細胞において（ＳＴ−５４−ＣＯ細胞において）のみ複製でき、通常の細胞では複製できないことを確認する。データは、ＯＲＦ５４が、外部プロモーター（ｍＣＭＶなど）によって感染細胞において発現され得る異なる導入遺伝子によって置き換えられ得ることも実証する。
本発明者らは、異なる細胞株で産生される様々な組換えウイルスの力価を比較した（３回反復）。データは、ＯＲＦ４３またはＯＲＦ５４を欠如するウイルスが通常の細胞で複製できないことをはっきりと実証する（表１）。
Figure 2021516061
（実施例６）
他の挿入部位に導入遺伝子を有する複製欠損ＥＨＶ−１ウイルス
２ステップｒｅｄ組換えによってＯＲＦ４３を完全にノックアウトする隣接部を有する合成ＤＮＡが設計され、ＥＨＶ−１／ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＨＡ配列、配列番号１４）を持つＧＳ１７８３細胞へと形質転換される。２ステップｒｅｄ組換え後、ＯＲＦ４３はノックアウトされ（サンガーシーケンシングによって確かめられた、データは示さない）、ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡが生成される。ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＯＲＦ１／３部位にｍＣＭＶ駆動ＨＡ遺伝子を有し、ＯＲＦ４３を欠如する）がＳＴ−４３−ＣＯ細胞にトランスフェクトされ、組換えウイルス：ｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡがレスキューされる。
２ステップｒｅｄ組換えによってＯＲＦ５４を完全にノックアウトする隣接部を有する合成ＤＮＡが設計され、ＥＨＶ−１／ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＨＡ配列、配列番号１４）を持つＧＳ１７８３細胞へと形質転換される。２ステップｒｅｄ組換え後、ＯＲＦ５４はノックアウトされ（サンガーシーケンシングによって確かめられた、データは示さない）、ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ５４−ＨＡが生成される。ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ５４−ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＯＲＦ１／３部位にｍＣＭＶ駆動ＨＡ遺伝子を有し、ＯＲＦ５４を欠如する）がＳＴ−４３−ＣＯ細胞にトランスフェクトされ、組換えウイルス：ｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ５４−ＨＡがレスキューされる。
通常のＳＴ細胞とＳＴ−４３−ＣＯ細胞を、異なるＭＯＩのｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡで感染させる場合、ＣＰＥ／ウイルス産生は、感染ＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察される。感染細胞でのＨＡ発現は、抗ＨＡ抗体を使用するＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）によって確かめられ得る。
通常のＳＴ細胞とＳＴ−５４−ＣＯ細胞を、異なるＭＯＩのｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ５４−ＨＡで感染させる場合、ＣＰＥ／ウイルス産生は、感染ＳＴ−５４−ＣＯ細胞においてのみ観察される。感染細胞でのＨＡ発現は、抗ＨＡ抗体を使用するＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）によって確かめられ得る。
（実施例７）
ブタにおいてｉｎ ｖｉｖｏで別の挿入部位でのＨＡを発現する複製欠損ＥＨＶ−１ベクターワクチンの試験
２ステップｒｅｄ組換えによってＯＲＦ４３を完全にノックアウトする隣接部を有する合成ＤＮＡが設計され、ＥＨＶ−１／ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＨＡ配列、配列番号２５）を持つＧＳ１７８３細胞へと形質転換される。２ステップｒｅｄ組換え後、ＯＲＦ４３はノックアウトされ（サンガーシーケンシングによって確かめられた、データは示さない）、ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡが生成される。ＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡ ＢＡＣ ＤＮＡ（ＯＲＦ１／３部位にｍＣＭＶ駆動ＨＡ遺伝子を有し、ＯＲＦ４３を欠如する）がＳＴ−４３−ＣＯ細胞にトランスフェクトされ、組換えウイルス：ｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡがレスキューされる。
非補完ＳＴ細胞およびＳＴ−４３−ＣＯ細胞をｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡで感染させる場合、ＣＰＥ／ウイルス産生は感染ＳＴ−４３−ＣＯ細胞においてのみ観察される。感染細胞におけるＨＡ（配列番号２５）発現は、抗ＨＡ抗体を使用するＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）によって確かめられ得る（図１９）。
複製欠損ＥＨＶ−１ウイルスのワクチンとしての能力を試験するため、５匹の１１週齢のブタはｒＥＨＶ−１−ΔＯＲＦ４３−ＨＡウイルスを２回（０日目および１４日目）ワクチン接種された。動物の対照群はプラセボをワクチン接種された。ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイは、全ての血清試料から実施され、ワクチン接種したブタが複製欠損ＥＨＶ−１ウイルスに存在する抗原に対する抗体を持つかどうか試験された。
５匹のワクチン接種した動物全てが、１回目のワクチン接種後に顕著なＨＩ力価を示した。ＨＩ力価は、２回目のワクチン接種後に全てのワクチン接種したブタでさらに増加した。対照動物群は、類似の試験日に顕著なＨＩ力価を示さなかった（図２０）。
（実施例８）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおけるｐ４５５プロモーターを有するＯＲＦ７０（ＵＳ４）挿入部位の使用および組換えウイルスの構築
インフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢＳ５０３０２．２）は、ｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１にクローニングされ（図１１、配列番号１５）、トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ３をｐ４５５プロモーターおよび新しい７１ｐＡ ポリアデニル化シグナルの調節下に置き、ＯＲＦ７０への挿入のための組換え領域を有するカセットを隣接させた（図１２、配列番号１６）。ＲＥＤ組換えシステム（Tischer et al. 2006 Biotechnol. Tech. 40, 191-197）が使用され、ｐＲａｃＨ−ＳＥのＯＲＦ７０に発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１がクローニングされ、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３が生成された（図１３）。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞はｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３ウイルスがレスキューされた。発現カセットの挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光アッセイによって分析された（ＩＦＡ、図１４）。
（実施例９）
ブタの一価のＥＨＶ−１ベクターＡ型インフルエンザウイルスワクチン（Ｈ３ワクチン）のｉｎ ｖｉｖｏ試験
潜在的ワクチンとしてのｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の有効性を試験するため、ブタＩＡＶに対する母系由来免疫がない（移行抗体がない）子ブタは、それぞれ２および５週齢で、筋肉内に、１×１０7ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量でｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３によって２回ワクチン接種され、または５週齢のみで接種された（１回ワクチン接種）。子ブタの非ワクチン接種群は陰性対照となり、製造業者の指示（ワクチン接種の時点以外）に従って市販の不活性化ブタＩＡＶワクチンによって２および５週齢でワクチン接種された動物の群は陽性対照となる（安楽死させた）。８週齢では、陰性対照群以外の全ての動物が、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で使用されるＨ３ワクチン抗原とは異種性である、ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４）の１×１０7 ＴＣＩＤ５０／ｍｌの投与量の気管内適用によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照となったが、非ワクチン接種だがチャレンジされた動物はチャレンジ対照となった。選択された時点で、体温が測定され血液試料が採取された。チャレンジ１日後、各群の半分の動物を安楽死させ、肺のブタＩＡＶ感染に典型的な病変がスコア化され、それぞれ動物当たり左および右肺につき３つの肺試料が採取され、肺ホモジネートの感染性ブタＩＡＶ力価が決定され、気管支肺胞上皮の洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取された。チャレンジ３日後の群当たり、動物の残り半分で同じ手順が実施された。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後の体温上昇を調べる場合、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を２回ワクチン接種した子ブタとは異なり、非ワクチン接種動物はチャレンジ１日後に約１℃の体温上昇を示した（図１５）。
チャレンジ後１日または３日で安楽死させた動物において肺スコアが評価された。ブタＩＡＶ感染と関連する典型的な肺の病変は陰性対照群の子ブタでは見られなかった。しかし、チャレンジ対照群では、肺の病変（平均範囲６〜７％）が観察された。最終的に、ｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンによって２回ワクチン接種された子ブタでは、平均肺病変スコアが実質的に小さかった（４％より小さい）（図１６）。
チャレンジ後１または３日で安楽死させた動物において平均ブタＩＡＶ肺力価が評価された。陰性対照群の子ブタの肺試料においてブタＩＡＶを示さないが、チャレンジ対照群は５より多い（３日目）から７ｌｏｇより多い（１日目）範囲の肺組織１ｇ当たりのウイルス力価を示した。全く対照的に、群平均値は、ｒＥＨＶ１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した群では、約２ｌｏｇまたはそれより少なくなるまで強く減少し、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した群では、検出できないレベルまで減少した（図１７）。
ワクチン接種後、ブタＩＡＶ中和抗体の誘導を試験する場合、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した動物からの血清は、最初のワクチン接種後３週間で約１６０の範囲の中和価の逆数を示し、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した動物からの血清は、２回目のワクチン接種後３週間で約２５６０の範囲の中和価を示したが、非ワクチン接種群からの血清は検出可能なブタＩＡＶ中和抗体レベルを有さなかった（図１８）。
まとめると、この実施例からのデータは、ＥＨＶ−１ベクターバックグラウンドのＯＲＦ７０に挿入された導入遺伝子が外部プロモーターを使用して発現され、生じる組換えＥＨＶ−１ベクターが潜在的ワクチン候補としてｉｎ ｖｉｖｏで使用され得ることを実証する。
（参考文献）
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2021516061

Figure 2021516061

Claims (21)

  1. ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化を含む複製欠損ウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
  2. ＵＬ１８および／またはＵＬ８の不活性化が、完全または部分欠損、完全または部分トランケーション、完全または部分置換、完全または部分逆位、挿入である、請求項１に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  3. 少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９２５ヌクレオチド、少なくとも９４０ヌクレオチドがＵＬ１８内で欠損、置換または逆位を生じている、請求項１または２に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  4. 少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２２５ヌクレオチドがＵＬ８内で欠損、置換または逆位を生じている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  5. 配列番号１に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ１８内で欠損、置換、または逆位を生じている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  6. 配列番号２に記載のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するＤＮＡ配列がＵＬ８内で欠損、置換、または逆位を生じている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  7. （ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
    （ｉｉ）配列番号５およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号９およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、
    （ｉｉｉ）配列番号６およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１０およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域
    を含む発現カセットを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  8. （ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、ならびに
    （ｉｉ）配列番号１１およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、ならびに
    （ｉｉｉ）配列番号１２およびその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域
    を含む発現カセットを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  9. ＵＬ１８への発現カセットの挿入が、ＲａｃＨ（配列番号１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ１８内のおよそ９４５ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる、請求項７に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  10. ＵＬ８への発現カセットの挿入が、ＲａｃＨ（配列番号２）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列のＵＬ８内のおよそ２２５６ｂｐ部分の欠損によって特徴づけられる、請求項８に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  11. （ｉ）配列番号５および配列番号９からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ１８隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号６および配列番号１０からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ１８隣接領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  12. （ｉ）配列番号１１からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ８隣接領域、および（ｉｉ）配列番号１２からなる群から選択される少なくとも１つの下流ＵＬ８隣接領域を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  13. 複製欠損が、複製率が少なくとも９０％低減されていることを意味する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  14. 依然として感染性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  15. 挿入部位、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入された、少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  16. 前記抗原コード配列が、ブタ、ウシもしくは家禽などの食物生産動物またはネコ、ウマもしくはイヌなどの伴侶動物に感染する病原体に関し、好ましくは、抗原コード配列が、限定はされないが、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  17. ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクター。
  18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複製欠損ＥＨＶベクターを培養するためのＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現する細胞株。
  19. ＥＨＶのＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を含む発現カセットを含むプラスミドを含む細胞株であって、ＵＬ８および／またはＵＬ１８またはその機能性部分を発現している細胞株。
  20. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
  21. 請求項２０に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、対象を免疫する方法。
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