JP7245260B2 - Ehv挿入部位ul43 - Google Patents
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Description
本出願は、37 C.F.R. 1.821~1.825に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
A.技術分野
2、本発明は、(ベクター)ワクチンの分野、特に新規のEHV挿入部位UL43に関する。本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に好適な関連する発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス1型(ウマ流産ウイルス、EHV-1)は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ150,000塩基対の二本鎖DNAゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス3型(水痘帯状疱疹ウイルス)、ブタアルファヘルペスウイルス1型(仮性狂犬病ウイルス)、ウシアルファヘルペスウイルス1型(感染性気管支炎ウイルス)、およびウマアルファヘルペスウイルス4型(ウマ鼻肺炎ウイルス、EHV-4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30))。EHV-1およびEHV-4は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。EHV-4は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、EHV-1は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。EHV-1に対して使用許諾を得た2つの改変生ワクチン(MLV)がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれRhinomune(登録商標)(Boehringer Ingelheim)およびPrevaccinol(登録商標)(MSD)である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において256回継代された、古典的に弱毒化したEHV-1 RacH株を含有する(Ma et al. 2013)。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、RacHがorf67(IR6)の2つのゲノムコピーを欠如し、1つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするorf1(UL56)のコード配列の90%より多くを除去する1283bpの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、RacHは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
pRacH-SEが、例えば導入遺伝子発現カセットの挿入によって、大腸菌中で操作される場合、許容細胞へのトランスフェクション後に再構築されたウイルスは改変を保持し、さらなる遺伝子を発現するであろう。組換えEHV-1 RacHはベクターワクチンとして使用することができる。
しかしながら、ORF1/3(UL56)挿入部位に挿入され得る導入遺伝子のサイズおよび数は、通常制限される。したがって、EHVベクターの能力を増強するため、EHVベクター、特に組換えEHV-1 RacHベクターに導入遺伝子を挿入する、およびEHVベクター、特に組換えEHV-1 RacHベクターから導入遺伝子を発現する、新しいおよび代わりの方法の満たされていない要求がある。
本発明は、EHVベクター、特に組換えEHV-1 RacHに導入遺伝子配列を挿入するためにおよびEHVベクター、特に組換えEHV-1 RacHからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用することができる、新しい、代わりの導入遺伝子挿入部位UL43に関する。
トランスファープラスミドpU-mC70-BGH(配列番号37)の図21、トランスファーベクターpU70-p455-71K71(配列番号28)の図22、およびトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71(配列番号29)の図3のプラスミド/ベクターマップは、新規のORF70挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。トランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGH(配列番号30)の図23、およびトランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(配列番号31)の図4のプラスミド/ベクターマップは、ORF1/3(UL56)挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。
本発明は、1つのプロモーターの調節下でRNAウイルス由来機能(2aペプチド、IRES部位)によって2つの導入遺伝子を結合するのではなく1つのベクター骨格から2つの異なる導入遺伝子を発現するEHVベクターにさらに関する。
本発明は、1つのプロモーターの調節下でRNAウイルス由来機能(2aペプチド、IRES部位)によって2つまたは3つの導入遺伝子を結合するのではなく1つのベクター骨格から2つまたは3つの異なる導入遺伝子を発現するEHVベクターにさらに関する。
本発明は、そのようなベクターを含む哺乳動物宿主細胞、およびそのような宿主細胞を使用してベクターワクチンを生成する方法、ならびに本発明のウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクターを含む免疫原性組成物およびワクチンにさらに関する。
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
(i)少なくとも1つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
(ii)配列番号19ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号26ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
(iii)配列番号20ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号27ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含む発現カセットを提供する。
本発明は、本発明の発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター、好ましくは、EHV-1またはRacH株を提供する。
(i)少なくとも1つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
(ii)配列番号19ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号26ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
(iii)配列番号20ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号27ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含むウマヘルペスウイルス(EHV)、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)ベクター、最も具体的にはRacH株に、さらに関する。
本発明は、UL43に挿入された、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含むウマヘルペスウイルス(EHV)、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)ベクター、最も具体的にはRacH株に、さらに関する。
本発明のベクターの特定の態様では、UL43への挿入は、UL43における部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、UL44は機能性を維持する。
本発明のベクターの別の特定の態様では、UL43への挿入は、RacHのUL43内の約870bp部分(配列番号21)またはその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、UL43への挿入は、野生型EHV-1 V592株(Genbank受入番号AY464052.1)のUL43内のおよそ870bp欠損によって特徴づけられ、野生型V592ゲノム配列の欠損部分は、ヌクレオチド23353~24226の間(配列番号24)またはその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/もしくは同一配列に位置する。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、天然に存在しない、および/または組換えである。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の特定の態様では、前記目的のヌクレオチド配列は、組換えおよび/または異種性および/または外来性である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記抗原コード配列は、動物、例えば、ブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に感染する病原体に関する。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、終結シグナルまたはポリアデニル化配列などの少なくとも1つのさらなる追加の制御配列をさらに含む。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の特定の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、終結シグナルおよび/またはポリアデニル化配列などの追加の制御配列をさらに含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、少なくとも1つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、US4(ORF70)に挿入されている。
代わりの導入遺伝子挿入部位US4(ORF70)を使用して、EHVベクター、特に組換えEHV-1またはEHV-1 RacHに導入遺伝子を挿入すること、およびEHVベクター、特に組換えEHV-1またはEHV-1 RacHから導入遺伝子を発現することができる。
(i)少なくとも1つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
(ii)配列番号9ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号11ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、ならびに配列番号13ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの左US4(ORF70)隣接領域と、
(iii)配列番号10ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号12ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、ならびに配列番号14ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの右US4(ORF70)隣接領域と
をさらに含む。
(i)目的の第1の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
配列番号19ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号26ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
配列番号20ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号27ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含み、かつ
(ii)目的の第2の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
配列番号9ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号11ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、ならびに配列番号13ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの左US4(ORF70)隣接領域と、
配列番号10ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号12ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、ならびに配列番号14ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの右US4(ORF70)隣接領域と
を含むウマヘルペスウイルス(EHV)、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)ベクター、最も具体的にはRacH株に、さらに関する。
本発明のベクターのさらなる態様では、ベクターは、(i)配列番号9、配列番号11、および配列番号13からなる群から選択される少なくとも1つの左US4(ORF70)隣接領域と、(ii)配列番号10、配列番号12、および配列番号14からなる群から選択される少なくとも1つの右US4(ORF70)隣接領域とを含む。
本発明のベクターの特定の態様では、目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、目的の遺伝子は、制御配列、好ましくは、プロモーター配列または本明細書に記載のEHVベクターに、作動可能に連結されており、少なくとも2つの目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、少なくとも1つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、p422(配列番号5)またはその機能的断片またはそれらの相補的ヌクレオチド配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットの特定の態様では、少なくとも2つの目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、少なくとも2つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、異なる。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ポリアデニル化配列は、BGHpA、71pA(配列番号6)、または18pA(配列番号7)である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、EHVベクターまたは発現カセットは、組換えである。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記目的の配列もしくは外来性ヌクレオチド配列または目的の遺伝子は、抗原コード配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、ブタA型インフルエンザウイルス由来である。
さらに、多価ワクチンは、一般に一価ワクチンより対費用効果が高く、時間効率がよいので、多価ワクチンを有することは有利である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、外来性抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型は、H1および/またはH3である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、EHVベクターまたは発現カセットは、NP(核タンパク質)インフルエンザ抗原コード配列もN(ノイラミニダーゼ)インフルエンザ抗原コード配列も含まない。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、プロモーター配列p422(配列番号5)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列は、配列番号44(H1pdm)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、EHVベクターは、2つまたはそれより多くのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号46(H1av)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、UL56に挿入されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、本明細書に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、プロモーター配列p430(配列番号3)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号45(H3)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、US4に挿入されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、本明細書に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、プロモーター配列p455(配列番号4)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
本発明は、
UL43に挿入された配列番号44(H1pdm)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p422(配列番号5)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに、
UL56に挿入された配列番号46(H1av)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p430(配列番号3)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス(EHV)にさらに関する。
UL43に挿入された配列番号44(H1pdm)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p422(配列番号5)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
US4に挿入された配列番号45(H3)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p455(配列番号4)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス(EHV)にさらに関する。
UL43に挿入された配列番号44(H1pdm)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p422(配列番号5)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
UL56に挿入された配列番号46(H1av)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p430(配列番号3)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
US4に挿入された配列番号45(H3)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列p455(配列番号4)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス(EHV)にさらに関する。
本発明のベクターの別の態様では、EHVベクターは、EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9からなる群から選択される。
本発明のベクターの別の態様では、EHVベクターは、EHV-1またはEHV-4である。
本発明のベクターの別の態様では、EHVベクターは、EHV-1、好ましくはRacHである。
a.UL43への、目的の第1のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
を含む、ベクターまたはウマヘルペスウイルス(EHV)にさらに関し、
b.前記目的の第1のヌクレオチド配列は、制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくは、p455、p430またはp422と作動可能に連結されていてもよく、
c.前記目的の第1のヌクレオチド配列は、(さらなる)制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)と作動可能に連結されていてもよい。
a.第2の挿入部位、好ましくはUL56またはUS4への、目的の第2のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
をさらに含み、
b.前記目的の第2のヌクレオチド配列は、制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくは、p455、p430またはp422と作動可能に連結されていてもよく、
c.前記目的の第2のヌクレオチド配列は、(さらなる)制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)と作動可能に連結されていてもよい。
a.第3の挿入部位、好ましくはUL56またはUS4への、目的の第3のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
をさらに含み、
b.前記目的の第3のヌクレオチド配列は、制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくは、p455、p430またはp422と作動可能に連結されていてもよく、
c.前記目的の第3のヌクレオチド配列は、制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは71pA、BGHpA、または18pAと作動可能に連結されていてもよい。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターの、UL43部位への、相同組換えまたはRED媒介組換え(両方とも上記を参照されたい)のための隣接領域を含むプラスミド、例えば、トランスファープラスミドpUUL43-422-18K18(配列番号34)またはpUUL43-422-H1pdm-18K18(配列番号36)にさらに関する。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターの、orf70(US4)部位への、相同組換えまたはRED媒介組換え(両方とも上記を参照されたい)のための隣接領域と、制御核酸、好ましくはプロモーター、好ましくはp455とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターpU70-p455-71K71(配列番号28)、および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71(配列番号29)および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H1pdm-71K71(配列番号32)にさらに関する。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、EHVベクター、具体的にはEHV-1、より具体的にはRacHベクターの、Us4(orf70部位)への、相同組換えまたはRED媒介組換え(両方とも上記を参照されたい)のための隣接領域と、制御核酸配列、好ましくはプロモーター、好ましくはp455と、第2の制御核酸、好ましくはポリアデニル化配列、好ましくは71pAポリアデニル化配列とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターpU70-p455-71K71(配列番号28)、および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71(配列番号29)および/またはトランスファープラスミドpU70-p455-H1pdm-71K71(配列番号32)にさらに関する。
a.目的の第1のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列をUL43に挿入するステップを含み、
b.前記目的の第1のヌクレオチド配列を制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくはp455、p430またはp422と作動可能に連結するステップ、
c.前記目的の第1のヌクレオチド配列を(さらなる)制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)と作動可能に連結するステップ
を含んでいてもよい方法にさらに関する。
a.目的の第2のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列を第2の挿入部位、好ましくはUL56またはUS4に挿入するステップ
をさらに含み、
b.前記目的の第2のヌクレオチド配列を制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくは、p455、p430またはp422と作動可能に連結するステップ、
c.前記目的の第2のヌクレオチド配列を制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)と作動可能に連結するステップ
をさらに含んでいてもよい。
a.目的の第3のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列を第3の挿入部位、好ましくはUL56またはUS4に挿入するステップ
をさらに含み、
b.前記目的の第3のヌクレオチド配列を制御核酸配列/プロモーター配列、好ましくは、p455、p430またはp422と作動可能に連結するステップ、
c.前記目的の第3のヌクレオチド配列を制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)と作動可能に連結させるステップ
をさらに含んでいてもよい。
本発明は、本発明に記載のベクターからなり、トランスフェクション試薬および指示リーフレットからなってもよいキットにさらに関する。
本発明は、本発明に記載のベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞にも関する。
a.本発明に記載の哺乳動物宿主細胞に本発明に記載のベクターを感染させるステップ、
b.感染細胞を好適な条件下で培養するステップ
によって特徴づけられ、
c.前記宿主細胞を回収するステップ
によって特徴づけられていてもよい方法にさらに関する。
本発明は、ウマヘルペスウイルス(EHV)ベクターにおける、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えばEHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9における、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)ベクターにおける、最も具体的にはRacHにおけるUL43の、前記ウマヘルペスウイルス(EHV)ベクターにおける挿入部位としての使用であって、前記挿入部位が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列の発現を支持/助長し、前記UL43挿入部位が、UL43における部分欠損、トランケーション、置換、改変などを含み、UL44が、機能性を維持する、使用にさらに関する。
本発明は、免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、本発明に記載のベクターまたは本発明に記載の哺乳動物宿主細胞の使用にさらに関する。
a.本発明に記載のベクター、および/または
b.ウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)などのような、本発明に記載のベクターにより発現されるポリペプチド
を含み、
c.薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含んでいてもよい、
免疫原性組成物にさらに関し、
好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適であり、
好ましくは、前記免疫原性組成物は、ウイルスを含む。特定の態様では、前記ウイルスは、感染性ウイルスである。
a.本発明に記載のベクター、および/または
b.改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)などのような、本発明に記載のベクターにより発現されるポリペプチド、および
c.薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含む、ワクチンまたは医薬組成物にさらに関し、
好ましくは、前記担体は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適であり、
d.前記ワクチンは、アジュバントをさらに含んでいてもよい。
好ましくは、ワクチンは、本明細書に記載のEHVベクターを含む。好ましくは、免疫原性組成物は、薬学的または獣医学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本発明の一態様では、前記薬学的に許容される担体は、細胞培養培地または生理学的再懸濁緩衝剤である。
本発明の一態様では、前記再懸濁緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水である。
本発明は、本明細書に記載の1つまたは複数のEHVベクターを含む、ワクチンまたはDIVAワクチンにさらに関する。
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および/もしくは外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセットにも関する。
本発明は、本明細書に記載のプロモーター配列または発現カセットを含む、ベクターにも関する。
本発明のプロモーターまたは発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、プロモーター配列の機能的断片は、p422の配列(配列番号5)と70%、80%、85%、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%、99.9%の配列同一性および/または相同性を有する。
本発明の発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、発現カセットまたはベクターは、ポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)をさらに含む。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、組換えおよび/または異種および/または外来性ベクターである。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、ウイルスベクター、好ましくは、ヘルペスウイルス科、例えば、ウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)、ウマアルファヘルペスウイルス4型(EHV-4)、ならびにPrV(仮性狂犬病ウイルス)およびBHV-1(ウシヘルペスウイルス1型)のような他のバリセロウイルス属、アデノウイルス科(AdV)、例えばCAdV(イヌアデノウイルス)、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス属、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択される、ウイルスのベクターである。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属(genus Alphaherpesvirinae)のメンバー、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)である。
効果的なDIVAの大きな利点は、ワクチン接種を受けた動物集団において試料を採取する前に急性感染しているまたはある期間(少なくとも約3週間)感染している食物生産動物(好ましくはブタ)の検出を可能にすること、したがって、動物集団における病原体(好ましくはブタインフルエンザウイルス)の拡散または再導入をモニターする可能性をもたらすことである。したがって、それは、検査室試験の結果に基づいて、ワクチン接種を受けたブタ集団にはブタA型インフルエンザウイルスがないと、ある程度の信頼レベルで、推定することを可能にする。
マーカーワクチンは、迅速かつ有効な投与を容易にし、野外ウイルス(疾患関連)で感染した動物とワクチン接種を受けた動物との判別を可能にする。
本発明の免疫原性組成物またはDIVAワクチンは、N(ノイラミニダーゼ)インフルエンザ抗原コード配列および/またはNP(核タンパク質)インフルエンザ抗原コード配列をコードするいかなる抗原コード配列も含まない。
a)食物生産動物から試料を採取するステップ、および
b)免疫試験および/またはゲノム解析試験で前記試料を分析するステップ
を含む方法を提供する。
本発明の一態様では、免疫試験は、試料が、ブタインフルエンザのN(ノイラミニダーゼ)タンパク質またはNP(核タンパク質)タンパク質を特異的に認識する抗体を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、食物生産動物は、ブタインフルエンザのN(ノイラミニダーゼ)タンパク質またはNP(核タンパク質)タンパク質を特異的に認識する抗体が検出された場合、ブタA型インフルエンザウイルスで感染している。
本発明の一態様では、ゲノム解析試験は、試料が、N(ノイラミニダーゼ)および/またはNP(核タンパク質)をコードするブタA型インフルエンザウイルス特異的配列を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、食物生産動物は、N(ノイラミニダーゼ)および/またはNP(核タンパク質)をコードするブタA型インフルエンザウイルス特異的配列が検出された場合、ブタA型インフルエンザウイルスで感染している。
本発明の一態様では、食物生産動物は、ブタである。
本発明の一態様では、試料は、血清試料である。
しかし、N(ノイラミニダーゼ)および/またはNP(核タンパク質)のエピトープは、進化的に保存され、SIAVに特異的であり、中和抗体の標的である。
本発明の一態様では、ELISAは、間接的ELISA、サンドイッチELISA、競合ELISAまたはブロッキングELISAである。
しかし、様々なELISA技術が当業者には周知である。ELISAは、例示的に、Wensvoort G. et al., 1988 (Vet.Microbiol. 17(2): 129-140)により、Robiolo B. et al., 2010 (J. Virol.Methods. 166(1 -2): 21-27)により、およびColijn, E.O. et al., 1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)により記載されている。
本発明の別の態様では、ゲノム解析試験は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT-PCR(逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)またはリアルタイムPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)である。
a.本発明に記載の哺乳動物宿主細胞に本発明に記載のベクターを感染させるステップ、
b.感染細胞を好適な条件下で培養するステップ
c.感染細胞培養物を回収するステップ
を含み、
d.ステップc)の回収した感染細胞培養物を精製するステップ、
e.前記回収した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含んでいてもよい方法にさらに関する。
医学的使用:
本発明は、動物を免役する方法であって、そのような動物に本明細書に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明は、必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを動物に投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記動物は、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、1回投与される。
単回用量が1回だけ投与されることは理解される。好ましくは、単回用量は、約0.2ml~2.5mlの間、より好ましくは約0.2ml~2.0mlの間、よりいっそう好ましくは約0.2ml~1.75mlの間、さらにより好ましくは約0.2ml~1.5mlの間、よりいっそう好ましくは約0.4ml~1.25mlの間、よりいっそう好ましくは約0.4ml~1.0mlの間の総体積を有し、単回0.5ml用量または1.0ml用量が最も好ましい。単回用量は0.5ml、1ml、1.5mlまたは2mlの総体積を有することが、最も好ましい。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、動物に生後最初の3週間以内、生後最初の2週間以内、生後第1週以内または生後第1日以内に投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、2回の投与で投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、動物に生後第1週以内に投与され、2回目が生後第2、第3または第4週以内に投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、筋肉内または鼻腔内投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンは、1×104~1×107 TCID50のEHVベクターを含む。
a)前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
b)本発明に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチン
を含み、
c)指示リーフレット
を含んでもよいキットにも関する。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または(or)」の使用は「および/または(and/or)」を意味する。さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(includes)」および「含まれる(included)」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、DNAまたはRNAのいずれかから構成されるまたはDNAまたはRNAのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはDNAから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばDNAワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する1つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えDNA技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
好ましいウイルスベクターは、EHV-1またはEHV-4またはPrV(仮性狂犬病ウイルス)またはBHV-1(ウシヘルペスウイルス1)のような他のバリセロウイルス由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、BAC、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、5つの生物学的に生じる塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
用語「2a」または「2aペプチド」は、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する短いオリゴペプチド配列を意味し、2aおよび「2a様」と記載される。そのような2aおよび「2a様」配列(ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する)は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる(Luke and Ryan, 2013参照)。
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、翻訳開始シグナルまたはATGもしくはAUGなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、DNAまたはRNAのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「UL(長いユニーク)」は、EHV、好ましくはEHV-1ゲノムの長いユニーク断片を記載する略語である。
用語「US(短いユニーク)」は、EHV、好ましくはEHV-1ゲノムの短いユニーク断片を記載する略語である。
用語「転写」は、細胞でのmRNAの生合成を記載する。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるmRNAの定量によって間接的に測定される。mRNAは、内因性の標準と比較して、RTqPCRによって定量される。
用語「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の容積当たりの感染ユニットの測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される(Reed and Muench, 1938)。特に、1ミリリットル当たりの組織培養感染量50(TCID50/ml)は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の50%が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちmRNA前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、2つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、cis位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター/エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたDNA配列は隣接し、2つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、いくらか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の3’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、好適な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合PCR法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、好適な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
配列比較は、比較される2つの配列の全長にわたって、または2つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される2つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、20、50、100またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
用語「ウマ(equid)」または「ウマ(equine)」または「ウマ(equin)」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ(equid)」または「ウマ(equine)」または「ウマ(equin)」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する(例えば、ラバ、ケツテイ等)。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「EHV-1」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス1型を意味する。EHV-1の非限定的な参照配列は、例えば野生型EHV-1株ab4(Genbank受入番号AY665713.1)またはRacH(Hubert 1996)。
用語EHV-4は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス4型を意味する。
用語「UL43に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス1型オープンリーディングフレームUL43(ORF17)をコードする位置で、ゲノムDNAにDNA断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、UL43の5’の870塩基対の欠損をもたらし、3’末端の残りの336bpを無傷なまま残すがUL43遺伝子産物pUL43の発現を消失させた。EHV-1のpUL43は、MHC-Iの提示に干渉することにより、pUL56とともに免疫調節性タンパク質として機能することが示された。
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも1つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
用語「食物生産動物」は、例えば、ブタ、ウシ、家禽、魚等、ヒトによる消費のために使用される動物を意味し、好ましくは、食物生産動物はブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタである。
用語「免疫化」は、免疫させる食物産生動物への免疫原性組成物の投与による能動免疫化に関し、それにより、そのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす。
用語「必要とする(in need)」または「必要とする(of need)」は、本明細書で使用する場合、投与/処置が健康または臨床徴候へのブーストまたは改善、または本発明に従って免疫原性組成物を受ける動物の健康への任意の他の正の薬効と関連することを意味する。
用語「DNAワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、好適な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、37%ホルムアルデヒド溶液の約0.1~1%を使用して、ウイルスまたは細菌を不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「KV」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の(免疫原性)組成物またはワクチンに対する細胞および/または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の1つまたは複数を含む:目的の組成物またはワクチンに含まれる1つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的(記憶)応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および/または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の1つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および/またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
「長期にわたる防御」は、少なくとも3週間、より好ましくは少なくとも3ヵ月、なおより好ましくは少なくとも6ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
用語「食物産生動物」は、ブタ、ウシ、家禽、魚等、好ましくはブタのようなヒトの消費のために使用される動物を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および/または循環する状態として特に理解される。
「安全性」は、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、限定はされないが、ウイルスに基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含む、有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種(vaccination)」または「ワクチン接種すること(vaccinating)」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
製剤
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、1用量、2用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、1回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約103~108TCID50(上記のウイルス力価を参照)で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス/生ワクチンに関して、投与量は約103~108TCID50である。
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する1つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタに投与するための指示書が添付されていてよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
用語「ブタインフルエンザウイルス」は、当業者に公知である。用語ブタインフルエンザウイルスは、ブタインフルエンザを引き起こすオルソミクソウイルス科のA型またはC型インフルエンザウイルスを指す。オルソミクソウイルスは3つの群:A型、B型およびC型を有するが、A型およびC型インフルエンザウイルスのみがブタに感染する。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、A型ブタインフルエンザウイルスである。ブタインフルエンザウイルスの亜型は、H1N1、H1N2、H3N2、およびH3N1を含む。H9N2およびH5N1はブタにも見出され得る。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、ブタから単離されたインフルエンザウイルスである。
DIVA定義
用語「DIVA(感染動物とワクチン接種を受けた動物の区別)」は、ワクチン接種を受けた動物を自然感染動物と区別するために使用され得るワクチンを指す。
用語「得られた」は、好ましくは沈殿、カラムなどを使用する、当業者に公知の単離および/または精製ステップを含み得る
以下の条項が本明細書に記載される:
本発明は、以下の条項を提供する:
1.(i)少なくとも1つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
(ii)配列番号19ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号26ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
(iii)配列番号20ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号27ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一のものからなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含む発現カセット。
2.条項1に記載の発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター。
3.(i)少なくとも1つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
(ii)配列番号19ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号26ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
(iii)配列番号20ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列、配列番号27ならびにその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター。
4.UL43に挿入された、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター。
5.UL43に挿入された、目的の第1のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列と、第2の挿入部位、好ましくはUL56またはUS4に挿入された、目的の第2のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列とを含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター。
7.UL43への挿入が、RacHのUL43内のおよそ870bp部分(配列番号21)またはその70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる、条項2~6のいずれか1項に記載のEHVベクター。
8.配列番号19、配列番号20、配列番号26、配列番号27ならびにこれらの配列のいずれか1つの70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同および/または同一配列からなる群から選択される、少なくとも1つの隣接領域を含む、条項2~7のいずれか1項に記載のEHVベクター。
9.(i)配列番号19、配列番号26からなる群から選択される少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、(ii)配列番号20、配列番号27からなる群から選択される少なくとも1つの上流UL44隣接領域とを含む、条項2~8のいずれか1項に記載のEHVベクター。
10.前記目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、天然に存在しない、および/または組換えである、条項2~9のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1に記載の発現カセット。
11.前記目的のヌクレオチド配列が、組換えおよび/または異種性および/または外来性である、条項2~10のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10に記載の発現カセット。
12.前記抗原コード配列が、動物、例えば、ブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に感染する病原体に関する、条項2~11のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10~11のいずれか1項に記載の発現カセット。
14.UL56および/またはUS4などの別の挿入部位に挿入されていてもよい、少なくとも1つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列をさらに含む、条項2~13のいずれか1項に記載のEHVベクター。
15.少なくとも1つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、UL56に挿入されている、条項2~14のいずれか1項に記載のEHVベクター。
16.少なくとも1つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、US4に挿入されている、条項2~15のいずれか1項に記載のEHVベクター。
17.目的の第2のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、US4に挿入されており、目的の第3のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、UL56に挿入されている、条項2~14のいずれか1項に記載のEHVベクター。
18.目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結されている、条項2~17のいずれか1項に記載のEHVベクター、または少なくとも2つの目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結されている、条項5~17に記載のEHVベクター。
19.1つまたは2つもしくはそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列が、SV40ラージT、HCMVおよびMCMV最初期遺伝子1、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、4pgG600(配列番号1)の機能的断片、好ましくは、p430(配列番号3)である前記機能的断片、4pgG600(配列番号1)の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、4pMCP600(配列番号2)の機能的断片、好ましくは、p455(配列番号4)である前記機能的断片、4pMCP600(配列番号2)の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、またはp422(配列番号5)もしくはその機能的断片もしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列からなる群から選択される、条項2~18のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10~13のいずれか1項に記載の発現カセット。
21.少なくとも2つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列が異なる、条項5~20のいずれか1項に記載のEHVベクター。
22.組換えである、条項2~21のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10~13もしくは19~20のいずれか1項に記載の発現カセット。
23.前記目的の配列もしくは外来性ヌクレオチド配列または目的の遺伝子が、抗原コード配列である、条項2~22のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10~13もしくは19~20もしくは22のいずれか1項に記載の発現カセット。
24.抗原コード配列が、リスト:シュマレンベルクウイルス、A型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、E型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、条項2~23のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは条項1もしくは10~13もしくは19~20もしくは22~23のいずれか1項に記載の発現カセット。
26.ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、ブタA型インフルエンザウイルス由来である、条項25に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
27.外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型が、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17およびH18からなる群から選択される、条項25または26に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
28.外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、A/swine/Gent/132/2005(H1N1)、A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)、A/swine/Italy/259543/2003(H1N2)、A/swine/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/swine/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/swine/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/swine/Italy/13962/95(H3N2)、A/swine/Cotes d’Armor/1121/00(H1N1)、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d’Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/North Carolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/985、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98およびA/Swine/Wisconsin/14094/99からなる株の群から選択される、条項25~27のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
30.外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型が、H1および/またはH3である、条項25~29のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
31.抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、最小91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、条項25~30のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
32.NP(核タンパク質)インフルエンザ抗原コード配列もN(ノイラミニダーゼ)インフルエンザ抗原コード配列も含まない、条項25~31のいずれか1項に記載のEHVベクターまたは発現カセット。
34.2つまたはそれ以上のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む、条項2~33に記載のEHVベクター。
35.さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号46(H1av)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である、条項34に記載のEHVベクター。
36.前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、UL56に挿入されている、条項35に記載のEHVベクター。
37.条項35に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、プロモーター配列p430(配列番号3)またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、条項35または36に記載のEHV。
38.さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号45(H3)に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、最小91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である、条項34~37に記載のEHVベクター。
39.前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、US4に挿入されている、条項38に記載のEHVベクター。
41.EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9からなる群から選択される、条項2~40のいずれか1項に記載のEHVベクター。
42.EHV-1またはEHV-4である、条項2~41のいずれか1項に記載のEHVベクター。
43.EHV-1、好ましくはRacHである、条項2~42のいずれか1項に記載のEHVベクター。
44.条項2~43に記載のベクターを含むことを特徴とする、哺乳動物宿主細胞。
45.免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、条項2~43に記載のベクターまたは条項44に記載の哺乳動物宿主細胞の使用。
46.a.条項2~43に記載のベクター、および/または
b.ウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)などのような、条項2~43に記載のベクターにより発現されるポリペプチド
を含み、
c.薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含んでいてもよく、好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である、
免疫原性組成物であって、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む免疫原性組成物。
47.a.条項2~43に記載のベクター、および/または
b.改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)などのような、条項2~43に記載のベクターにより発現されるポリペプチド、および
c.薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含み、好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である、
ワクチンまたは医薬組成物であって、
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでいてもよい、ワクチンまたは医薬組成物。
49.感染と関連するまたは感染によって引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製する方法であって、
a.条項41に記載の哺乳動物宿主細胞に条項2~43に記載のベクターを感染させるステップ、
b.感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
c.感染細胞培養物を回収するステップ
を含み、
d.ステップc)の回収した感染細胞培養物を精製するステップ、
前記回収した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含んでいてもよい方法。
50.動物に免疫する方法であって、前記動物に前記免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを投与するステップを含む方法で使用するための、条項46~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチン。
51.必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを動物に投与するステップを含む方法で使用するための、条項46~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチン。
53.動物を免疫する方法であって、条項46~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンをそのような動物に投与するステップを含む方法。
54.必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の条項46~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを動物に投与するステップを含む方法。
55.必要とする動物においてブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の条項46~48のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンを動物に投与するステップを含む方法。
56.動物が、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである、条項50~55のいずれか1項に記載の方法または使用。
57.免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンが1回投与される、条項50~56のいずれか1項に記載の方法または使用。
58.免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンが、動物に生後最初の6週間以内、生後最初の2週間以内、生後第1週以内または生後第1日以内に投与される、条項50~57のいずれか1項に記載の方法または使用。
59.免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンが、2回の投与で投与される、条項50~58のいずれか1項に記載の方法または使用。
61.前記免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンが、筋肉内または鼻腔内投与で投与される、条項50~60のいずれか1項に記載の方法または使用。
62.免疫原性組成物、ワクチンまたはDIVAワクチンが、1×104~1×107 TCID50のEHVベクターを含む、条項50~61のいずれか1項に記載の方法または使用。
63.前記方法が、同じ種の免疫されていない対照群の動物と比較して、体重減少の軽減、直腸温度低下、臨床症状軽減、(中和)抗体の誘導増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの向上をもたらす、条項50~62のいずれか1項に記載の方法または使用。
64.動物における病原体と関連する疾患に対するワクチンを、動物、好ましくはブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に接種するための、および/または動物において病原体と関連するもしくは病原体によって引き起こされる1つもしくは複数の臨床徴候の発生率もしくは重症度を低減するための、キットであって、
a)前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
b)条項46に記載の免疫原性組成物、条項47に記載のワクチン、または条項48に記載のDIVAワクチン
を含み、
c)指示リーフレット
を含んでもよいキット。
65.プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、の発現をもたらす、p422を含むプロモーター配列(配列番号5)またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列。
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および/もしくは外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセット。
67.条項65または66に記載のプロモーター配列または発現カセットを含むベクター。
68.プロモーター配列の機能的断片が、p422の配列(配列番号5)と70%、80%、85%、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%、99.9%の配列同一性および/または相同性を有する、条項65~67のいずれか1項に記載のプロモーターまたは発現カセットまたはベクター。
69.プロモーター配列の前記機能的断片が、100ヌクレオチド、好ましくは125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400ヌクレオチド、最も好ましくは410もしくは420ヌクレオチドの長さを有するか、またはプロモーター配列の機能的断片が、100~422ヌクレオチド、200~422ヌクレオチド、300~422ヌクレオチドもしくは350~422ヌクレオチドの間の長さを有する、条項65~68のいずれか1項に記載のプロモーターまたは発現カセットまたはベクター。
70.ポリアデニル化配列、好ましくは、BGHpA、71pA(配列番号6)または18pA(配列番号7)をさらに含む、条項66~69のいずれか1項に記載の発現カセットまたはベクター。
72.組換えおよび/または異種および/または外来性ベクターである、条項67~71のいずれか1項に記載のベクター。
73.ウイルスベクター、好ましくは、ヘルペスウイルス科、例えば、ウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)、ウマアルファヘルペスウイルス4型(EHV-4)、ならびにPrV(仮性狂犬病ウイルス)およびBHV-1(ウシヘルペスウイルス1型)のような他のバリセロウイルス属、アデノウイルス科(AdV)、例えばCAdV(イヌアデノウイルス)、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス属、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択される、ウイルスベクターである、条項67~72のいずれか1項に記載のベクター。
74.ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属のメンバー、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV-1)である、条項67~73のいずれか1項に記載のベクター。
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
プロモーターおよびポリA配列
(配列番号1)600bp DNA断片4pgG600
(配列番号2)600bp DNA断片4pMCP600:
(配列番号3)詳細には、600bpプロモーターが、4pgGについて430bpにトランケートされた、新たな名称:p430
(配列番号4)および4pMCPについて449bpにトランケートされた、新たな名称:p455
(配列番号5)p422プロモーターの配列
(配列番号6)71pAポリアデニル化配列の配列
(配列番号7)18pAポリアデニル化配列の配列
挿入領域配列
(配列番号8)RacHのUS4(orf70)配列
(配列番号9)Up70隣接領域(417bp)
(配列番号10)Up71隣接領域(431bp)
(配列番号11)127264~127680(隣接領域up orf70)
(配列番号12)128484~128913(隣接領域up orf71)
(配列番号13)Up70隣接領域(283bp)=417bp「クラシカルな」隣接領域の3’の283bpと同一
(配列番号14)Up71隣接領域(144bp)=431bp「クラシカルな」隣接領域の5’の144bpと同一
(配列番号15)wt ab4株のUS4(orf70)nt127681~128916の配列
(配列番号16)野生型ab4(Genbank受入番号AY665713.1)ゲノム配列のorf70(US4)の欠損部分:nt127681~128482
(配列番号17)RacHゲノム配列のorf70(US4)の欠損部分(完全ゲノム配列が不明であるためnt番号入手不可能)
(配列番号18)RacHのUL43の配列
(配列番号19)上流組換え領域Up UL43の配列
(配列番号21)RacHのUL43の欠損部分の配列
(配列番号22)RacHのUL43の保持3’末端の配列
(配列番号23)wt EHV-1 V592のUL43の配列(逆相補的nt23021~24226)
(配列番号24)wt EHV-1 V592のUL43の欠損部分(870bp)(逆相補的nt23353~24226)
(配列番号25)wt EHV-1 V592のUL43リーディングフレームの保持部分(逆相補的nt23021~23354)
(配列番号26)wt EHV-1 V592の対応する上流組換え領域Up UL43の配列(逆相補的nt24227~24452)
(配列番号27)wt EHV-1 V592の対応する下流組換え領域Up UL44の配列(逆相補的nt23049~23354)
プラスミド配列
(配列番号28)トランスファーベクターpU70-p455-71K71のヌクレオチド配列
(配列番号29)トランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71のヌクレオチド配列
(配列番号30)トランスファーベクターpU-1-3-p430-BGHKBGHのヌクレオチド配列
(配列番号31)トランスファープラスミドpU1-3-p430-H1av-BGHKBGHのヌクレオチド配列
(配列番号32)トランスファープラスミドpU70-p455-H1pdm-71K71のヌクレオチド配列
(配列番号33)トランスファープラスミドpU1-3-p430-H1hu-BGHKBGHのヌクレオチド配列
(配列番号34)トランスファーベクターpUUL43-p422-18K18のヌクレオチド配列
(配列番号35)トランスファープラスミドpUUL43-p422-mC-18K18のヌクレオチド配列
(配列番号36)トランスファープラスミドpUUL43-p422-H1pdm-18K18のヌクレオチド配列
(配列番号37)トランスファープラスミドpUmC70のヌクレオチド配列
プライマー配列
orf70/US4挿入領域について
(配列番号38)フォワードプライマーAGGCTCGTGCGCGGATACATCG
(配列番号39)リバースプライマーTTCGGGGCTGTTAGACTCCTCC
orf1/3/UL56挿入領域について
(配列番号40)フォワードプライマーCCAACTCGCCGCCATGAGACCC
(配列番号41)リバースプライマーAGCGCGCCCCGTACCCAGTGGG
UL43挿入領域について
(配列番号42)フォワードプライマーCGACGCGCGTCGGAGG
(配列番号43)リバースプライマーGTTATAAACATACCATGCACC
A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンのアミノ酸配列
(配列番号44)ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2))];GenBank:ADR01746.1 H1pdm
(配列番号45)ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))];GenBank:ABS50302.2 H3
(配列番号46)ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))];GenBank:AFR76623.1 H1av
(配列番号47)ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2))];GenBank:ADK98476.1* H1hu
新しい挿入部位ORF70/US4の確立
EHV-1ベクターの能力を増強するために、本発明者らは、1つのプロモーターの調節下でRNAウイルス由来の機能によって2つの導入遺伝子を結合するのではなく1つのベクター骨格から2つの異なる導入遺伝子を発現する方法を見つけようとした。本発明者らは、ヘルペスウイルスゲノムが、2つの独立した導入遺伝子挿入部位を並行して使用することを許容するであろうと仮定した。EHV-1 ORF70/US4が好適な導入遺伝子挿入部位であるかどうかを判定するために、orf70/US4(1236bp)の5’末端の801塩基対を、自己蛍光mCherryタンパク質(Shaner et al. 2004)をコードする発現カセットに、古典的相同組換えによって置き換えた。プラスミドpU-mC70-BGHのマップは、図21にある(配列番号37)。相同組換えに使用したDNA断片をpU-mC70-BGHからXbaIで切り出した。ゲル精製した断片をEHV-1 RacHのウイルスゲノムDNAとともにRK13細胞にコトランスフェクトした。組換えベクターウイルスの効率的レスキューおよび培養細胞における効率的複製を、ライブ蛍光およびウイルス滴定により証明した(図示なし)。orf70/US4の3分の2の欠損には、orf70/US4によりコードされる糖タンパク質Gの発現を消失させるという追加の恩恵があった。EHV-1の糖タンパク質Gは、宿主の免疫応答を弱める非構造性分泌ケモカイン結合タンパク質であることが分かっていた(Drummer et al., 1998; Bryant et al., 2003)。ベクターワクチンは、ワクチン接種者の免疫応答を刺激することを意図したものであるので、ウイルスベクターのこの特定の免疫抑制機能の除去は、ウイルスベクタープラットフォームEHV-1 RacH-SEの性能をさらに向上させる可能性がある。
組換えEHV-1ベクターワクチンにおけるp455プロモーターを有する新しいORF70/US4挿入部位の使用および組換えウイルスの構築
p455プロモーター:
第1の動物実験には、ブタ由来A型インフルエンザウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンH3亜型(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、GenBank受入番号ABS50302.2)を使用した。そのコード配列を合成し、トランスファーベクターpU70-p455-71K71(配列番号28)にサブクローニングし、それによって、H3を新しいp455プロモーターおよび新しい71pAポリアデニル化シグナルの調節下に置き、orf70への挿入のための組換え領域でカセットを挟む、トランスファープラスミドpU70-p455-H3-71K71を生成した(図3、配列番号29)。
RED組換えシステム(Tischer et al. 2006)を使用するen-passant変異誘発により、発現カセットp455-H3-71をpRacH-SEのorf70/US4に挿入してpRacH-SE70-p455-H3を生成した。
モノクローナル抗H3抗体およびウマ抗EHV抗血清を使用するP20で感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光アッセイ(dIFA)により、事実上、全てのEHV-1誘導プラークがH3も発現することを確認した(図示なし)。全ての試験で組換えEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3の安定性が認められた。
組換えEHV-1ベクターワクチンにおける新しいp430プロモーターの使用および組換えウイルスの構築
p430プロモーター:
新たに同定したp430プロモーターを使用して、H1N1ウイルス(A/swine/Gent/132/2005(H1N1)、GenBank受入番号AFR76623.1)から別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動した。このウイルス分離株のヘマグルチニン遺伝子はトリIAVが起源であるので、それをH1avと呼ぶことにする。H1avを合成し、orf1/3/UL56挿入領域のトランスファーベクターpU1/3-p430-BGHKBGH(配列番号30)にサブクローニングして、pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH(図4、配列番号31)を生成した。H1avの発現を、p430プロモーターおよびウシ成長ホルモン(BGH)ポリAシグナルの調節下に置いた。
RED組換えシステム(Tischer et al. 2006)を使用するen-passant変異誘発により、発現カセットp430-H1av-BGHをpRacH-SEのorf1/3/UL56に挿入してpRacH-SE1/3-p430-H1avを生成した。
感染細胞の赤血球吸着のこの明確な表現型により、トランスジェニックタンパク質の効率的発現を示し、EHV-1ベクター感染細胞の細胞表面での機能的HA三量体の形成を示唆する、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによる知見が裏づけられる。
組換えEHV-1ベクターワクチンにおける新しいORF70挿入部位およびORF1/3(UL56)挿入部位の並行した使用
2つの新しいプロモーターを並行して使用することができることを明らかにするために、2つの異なるA型インフルエンザウイルス亜型の2つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えEHV-1 RacHを生成した。
H3に対する市販のポリクローナル抗体(PA5-34930)とH1avおよびH1pdmに対する自社モノクローナル抗体についての特異性ならびにこれらの交差反応性の欠如は、図19に示されているように感染細胞のウェスタンブロットから明らかである。同一の試料を、4つの異なる抗体とのインキュベーション前に、4反復SDS-PAGEで泳動させてナイロン膜に転写した。
図19に示されているように、導入遺伝子H3とH1avの両方が、二重挿入組換えrEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(B)で感染させた細胞培養物において並行して発現された。導入遺伝子発現は、安定しており、AI-ST A1細胞(BI社の自社ブタ精巣細胞株、表3)において第11継代まで試験してウイルス力価を損なわせなかった。
二価EHV-1ベクターを利用したA型インフルエンザウイルスワクチンの生成、in vitro特徴づけおよびin vivo試験
下で説明するように、本明細書に記載の本発明では、H3N2およびH1N1血清亜型/血清型トリブタIAVに由来する上記4つのブタIAVヘマグルチニン(HA)抗原のうちの2つが1つの組換えEHV-1ベクターウイルスにより発現される。ブタIAVに対するこの新しい二価ワクチンは、例えば、本明細書に記載のワクチンでのワクチン接種のみを受けた動物はブタIAV HAタンパク質しか発現しないのでこれらの動物ではブタIAVタンパク質NPまたはNAに対する抗体が検出されず、しかし、ブタIAV野外株によって感染した動物ではブタIAVタンパク質NPまたはNAに対する抗体が検出されることにより、DIVA特徴をもたらす。
新しい二価ブタIAVワクチンをin vitroで特徴づけ、マウスにおいてA型インフルエンザウイルス中和抗体を誘導するその能力についてin vivoで試験した。
組換えrEHV-1の遺伝的安定性および表現型安定性を、細胞培養で継代させることにより、5継代ごとにウイルス力価を判定して証明した。挿入領域の配列を10継代ごとに確認し、ウェスタンブロットにより導入遺伝子発現も確認した(図示なし)。発現の忠実度は、メトセル-オーバーレイ下のプラークの二重IFAにより、抗EHV抗体および導入遺伝子特異的抗体で染色したプラークをカウントして評価した。
二価rEHV-1 RacHベクターワクチンでのワクチン接種を受けたマウスにおける2つの抗原に対する中和抗体応答の誘導
rEHV-1 RacH SE B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3、図7参照)をBalb/cマウスの免疫化に使用して、発現された導入遺伝子がブタ以外の別の種において免疫原性であること、および鼻腔内適用により中和抗体が2つの抗原のいずれに対しても誘導されることを実証した。
空のベクターBAC pRacH-SE1.2からレスキューしたウイルスであるrEHV-1 RacH-SE1212を0.001の感染多重度(MOI)でAI-ST細胞に感染させた。感染後24時間、特有のプラークを観察し、細胞を間接免疫蛍光アッセイ(IFA)用に処理した。PBSで1:50希釈した3群全ての最終採血の血清(2回目のワクチン接種の14日後に得た)を試験した。陽性対照として、EHV-1でのワクチン接種を受けたウマからの血清を1:500希釈物で使用した。二次抗体は、マウス血清については市販のFITC結合ウサギ抗マウスIgGであり、ウマ血清についてはCy5結合ヤギ抗ウマIgGであり、これらの抗体を1:200希釈で使用した。抗体結合を蛍光顕微鏡観察により評価した。ワクチン接種を受けた全てのマウスは、IFAにおいてrEHV-1 RacH-SE感染細胞と反応する抗体を生じさせた。未感染細胞にはいずれの被験血清も結合しなかった。マウスの陰性対照群からの血清は、感染細胞とも、未感染細胞とも、いかなる特異的結合も示さなかった。データを下記の表に要約する。
A型インフルエンザウイルス(IAV)(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))または(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))のどちらかに由来する発現導入遺伝子に対する防御免疫の誘導を明らかにするために、マウス血清をそれぞれのウイルスに対する中和活性ついて試験した(Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014)。中和試験に使用したIAVは、2014年以降のドイツのブタからの分離株、具体的には、A/swine/Germany/AR452/2014(H3N2)およびA/swine/Germany/AR1181/2014(H1N1)であった。これらは、ワクチン標的を得た株とは異種であるので、マウス血清によるこれらのウイルスの一切の中和が、rEHV-1ワクチン接種による防御免疫の広範かつ効率的な誘導を示すことになる。陰性対象血清として、インフルエンザウイルス抗体に対して陰性であることが分かっていたブタからの血清を使用した。
ウイルス中和および96ウェルプレートでの逆滴定のためのMDCK細胞を使用前に2日間、37℃/5%CO2でインキュベートした。それぞれのIAVストックH3N2およびH1avN1を氷上で解凍し、ゲンタマイシンと2倍濃度のトリプシンとを含有するMEM(MEM/Genta/2xトリプシン)で希釈した。
試験した血清は、第1群(rEHV-1 RacH SE B)、第2群(空のベクター)、陽性対照(不活性化多価IAVワクチンでのワクチン接種を受けたブタからの血清)、および陰性対照についての最終採血からのものであった。
ベクターrEHV-1 RacH-SEを2つの異なる導入遺伝子の並行発現に使用して、鼻腔内ワクチン接種後に免疫応答を刺激することができると、結論づけることができる。
1.感染:10μlの解凍ウイルスストックを増殖培地に直接添加することにより、6ウェルプレートにおける3つのウェル各々のAI-ST細胞の融合性単層に組換えウイルスをおよそ1のM.O.Iで感染させた。3つのウェルは、未感染のままにしておいた。感染および未感染細胞を2日間インキュベートし、次いで、ウェスタンブロット用に処理した。感染に使用したウイルスを下記の表(表2)に要約する。
材料:Immun-Star WesternC Chemiluminecent Kit(Bio Rad Laboratories GmbH、Heidemannstrasse 164、D-80939 Munich)カタログ番号170-5070
一次抗体:図19の説明文のa~dを参照されたい。
二次抗体:ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス、(Jackson Immune Research #115-035-146) 1:5000。
全てのインキュベーションは、絶えず攪拌しながら十分な体積で行った。抗体を5%FBS/TBSTで希釈した。一次抗体を終夜4℃でインキュベートした。抗体溶液を除去し、ブロットを3回、TBSTで5~10分間洗浄した。希釈二次抗体をブロットとともに1時間、RTでインキュベートし、除去し、ブロットを3回、TBSTで5~10分間洗浄した。ブロットを透明プラスチックシートプロテクター上に配置した。過酸化水素とLumino/Enhancer溶液を混合し(1ml+1ml(ブロットごとに合計2ml))、ピペットでブロット上に移し、3~5分間インキュベートした。その後、膜をChemiDocXRSイメージングシステム(Bio Rad Laboratories GmbH、Heidemannstrasse 164、D-80939 Munich)内に配置し、Image Labソフトウェアを使用してシグナルを記録した。
感染前日に、AI-ST細胞を、96ウェルプレート(Corning Incorporated-Life Sciences、One Becton Circle、Durham、NC 27712、USA;REF 353072)の10%FBSを補充したMEMに、2×104細胞/ウェルで播種した。ウイルスストックを急速解凍し、氷上に置いた。段階1:10希釈物を、MEMで、希釈度ごとに1.2mlの体積で調製した。100μl/ウェルのウイルス希釈物を細胞、希釈度ごとに1つの縦列で8ウェル、に添加した。各プレートの縦列11および12は、100μl/ウェルのMEMの添加により培地対照としての役割を果たした。滴定を3回反復で行い、細胞を5日間、37℃/5%CO2でインキュベートした。細胞培養物を顕微鏡で検査し、EHV-1 RacHの典型的なCPEが観察されたウェルを記録した。Reed and Muench (1938)による方法に従ってTCID50/mlとして力価を算出した。
新しいUL43挿入部位の確立
前の実施例に記載のEHV-ベクタープラットフォームを使用して、2つだけの抗原をそれらの本物の形態で並行して発現させることができる。2つのベクターワクチンのブレンドは、商品原価を増加させ、そしてまた複製効率が組換えウイルスによって異なる場合(この可能性は高い)には導入遺伝子の偏った発現をもたらす可能性がある。配列内リボソーム進入部位(IRES)またはピコルナウイルス2aペプチド(2a)のどちらかにより1つの挿入部位内で2つの抗原を結合させる方法があるが、これらの技術は、この課題に十分なものではない。別個の下流翻訳産物の合成をもたらすリボソームスキップを誘発する2aペプチド(Donnelly et al., 2001)によって2つの導入遺伝子を結合させた場合、発現されるタンパク質うちの第1のタンパク質がそのC末端に付加された2aペプチドからの19個のアミノ酸残基を有することになるので、2aペプチドは、この第1のタンパク質を構造的に変化させることになる。第2のタンパク質のN末端には、プロリンである1つのアミノ酸残基が付加されることになる(Ryan et al., 1994)。この1つの追加のアミノ酸は、HAのシグナルペプチドで切断除去されることになるので、全く重要でない可能性が非常に高いとはいえ、第1のHAの19アミノ酸テールの方は、三量体化に干渉し、十分な有効性を妨げる可能性がある。記載した障害を克服するための解決法を見つけるために、本発明者らは、pRacH-SEにおける第3の導入遺伝子発現部位を確立した。
様々なアルファヘルペスウイルスの第1のゲノム配列が利用可能であることから、コンピューターで同定したオープンリーディングフレーム(orf)に、ウイルスごとにそれぞれのゲノム内のそれらの位置に従って個々に番号をつけた。その後、アルファヘルペスウイルス遺伝子の大多数が異なる種に存在するホモログであることが判明した。データの比較を容易にするために、遺伝子および遺伝子産物にヒトヘルペスウイルス1型のゲノムにおけるそれらのホモログの名称を割り当てることは、今では一般的な方法である。したがって、本発明者らは、表1に収載するような新しい命名法に従ってEHV orfの旧名を変更した。
挿入部位の構築については、やはり、DNAポリメラーゼ処理能力因子をコードする遺伝子UL42および糖タンパク質CをコードするUL44の上流および下流の推定プロモーターおよびポリAシグナルを破壊しないように注意しなければならなかった。
新しいUL43挿入部位の構築を図13に示す。
18pAポリアデニル化配列(配列番号7)を、1.en-passant変異誘発の第2のステップ(第2のRED)中にKanaの欠損のための相同領域として役立つ、2.導入遺伝子のポリアデニル化シグナルとして機能する、2重機能を果たすように、カナマイシン耐性発現カセット(Kana)の上流および下流でのRED組換えのためにトランスファーベクターに導入した。トランスファーベクターpUUL43-422-mC-18K18のマップについては、図14を参照されたい。
ベクターワクチンとしての第3の挿入部位の性能を試験するために、ブタ由来A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2) GenBank受入番号ADR01746)からのインフルエンザヘマグルチニンH1pdm亜型(配列番号44)をpRacH-SEの新しい部位に挿入した。
組換えプラーク精製ウイルスを、挿入部位領域のシーケンシング(図示なし)、ウェスタンブロット(図19)およびウイルス滴定(表3)によって特徴づけた。
二重挿入組換えEHV-1であるrEHV-1 RacH-SE-UL56-430-H1hu-US4-455-H1pdm(略記rEHV-1 RacH-SE-D、図12)を使用して、導入遺伝子の発現強度を比較した。単一挿入rEHV-1 RacH-SEに加えて、p455プロモーターの調節下にある新しいorf70/US4発現部位からIAV HA H1pdmを発現するrEHV-1 RacH-SE-orf70-p455-H1pdm(図10)を試験に含めた。
増強EHV-1ベクターBAC pRacH-SEに関する情報は、BI社を除けば、発表も提示もされていない。
Claims (19)
- UL43に挿入された発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクターであって、前記発現カセットが、
(i)プロモーター配列に作動可能に連結されている少なくとも1つの抗原コード配列と、
(ii)(i)の上流に位置する、配列番号19ならびにそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列、配列番号26ならびにそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL43隣接領域と、
(iii)(i)の下流に位置する、配列番号20ならびにそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列、配列番号27ならびにそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなる群から選択される、少なくとも1つの上流UL44隣接領域と
を含む、前記ウマアルファヘルペスウイルス(EHV)ベクター。 - 第2の挿入部位に挿入された別の抗原コード配列を更に含む、請求項1に記載のEHVベクター。
- UL43への挿入が、UL43における部分欠損、トランケーション、置換、改変によって特徴づけられ、UL44が機能性を維持する、請求項1または2に記載のEHVベクター。
- UL43への挿入が、RacHのUL43内の配列番号21で示される配列またはそれと少なくとも90%の配列同一性を有する配列の欠損によって特徴づけられる、請求項1~3のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 前記抗原コード配列が、動物に感染する病原体に関する、請求項1~4のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 別の挿入部位に挿入されていてもよい、少なくとも1つのさらなる抗原コード配列をさらに含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 1つまたは2つもしくはそれ以上の抗原コード配列に作動可能に連結されているプロモーター配列が、SV40ラージT、HCMVおよびMCMV最初期遺伝子1、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、4pgG600(配列番号1)の機能的断片、4pgG600(配列番号1)の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、4pMCP600(配列番号2)の機能的断片、4pMCP600(配列番号2)の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、またはp422(配列番号5)もしくはその機能的断片もしくはその相補的ヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 抗原コード配列が、リスト:シュマレンベルクウイルス、A型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、E型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、請求項1~7のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であるか、または抗原コード配列が、ブタA型インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列である、請求項1~8のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択される配列番号に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項9に記載のEHVベクター。
- EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8およびEHV-9からなる群から選択される、請求項1~10のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- EHV-1またはEHV-4である、請求項1~11のいずれか1項に記載のEHVベクター。
- 請求項1~12のいずれか1項に記載のEHV-1ベクターを含む免疫原性組成物。
- 非ヒト動物を免疫するための方法であって、請求項13に記載の免疫原性組成物を非ヒト動物に投与するステップを含む方法。
- 必要とする非ヒト動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止するための方法であって、治療有効量の請求項13に記載の免疫原性組成物を非ヒト動物に投与するステップを含む方法。
- 非ヒト動物が、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである、請求項14または15に記載の方法。
- 非ヒト動物を免疫するための方法で使用するための、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 必要とする非ヒト動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止するための方法で使用するための、請求項13に記載の免疫原性組成物。
- 非ヒト動物が、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである、請求項17または18に記載の免疫原性組成物。
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