CN111867637B - 新ehv插入位点ul43 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及(载体)疫苗领域，且尤其涉及新型EHV插入位点UL43。本发明还涉及相关的表达盒和载体，其适于表达感兴趣的基因，尤其是抗原编码序列。本发明的病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。

Description

新EHV插入位点UL43
序列表
本申请包含符合37C.F.R.1.821–1.825的序列表。本申请所附的序列表通过引用全部并入本文中。
发明背景
A.发明领域
二本发明涉及(载体)疫苗领域，且尤其涉及新型EHV插入位点UL43。本发明还涉及相关的表达盒和载体，其适于表达感兴趣的基因，尤其是抗原编码序列。本发明的病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。
B.相关领域的背景和描述
马(horse)病原体马α疱疹病毒1(Equid Alphaherpesvirus 1)(马流产病毒(Equine abortion virus)，EHV-1)属于疱疹病毒目(order Herpesvirales)中的疱疹病毒科(family Herpesvirale)中的甲型疱疹病毒亚科(subfamily Alphaherpesvirinae)中的水痘病毒属(genus Varicellovirus)。它是一种大型的包膜病毒，具有约150,000个碱基对的双链DNA基因组。水痘病毒属亚属的其它重要成员是人α疱疹病毒3(HumanAlphaherpesvirus 3(水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus))、猪α疱疹病毒1(Suid Alphaherpesvirus 1(假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus))、牛α疱疹病毒1(Bovine Alphaherpesvirus 1(传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus))和马α疱疹病毒4(Equid Alphaherpesvirus 4(马鼻肺炎病毒(Equine RhinopneumitisVirus)，EHV-4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015Release EC 47,London,UK,July 2015；Email ratification 2016(MSL#30))。EHV-1和EHV-4是地方病，并影响全世界的马匹。EHV-4引起最多的轻微上呼吸道感染，而EHV-1则可能引起全身感染，其包括多种疾病，从呼吸道症状到流产和致死性脑脊髓病，取决于宿主的毒株和免疫状态。目前在美国和欧洲分别有两种针对EHV-1的得到许可的经修饰的活疫苗(MLV)，分别是(Boehringer Ingelheim)和/>(MSD)。二者均含有经典的EHV-1RacH减毒株，其在猪(porcine)上皮细胞中传代256次以进行减毒(Ma等，2013)。已经在分子水平上研究了减毒机制。Osterrieder等(1996)示出，RacH缺少orf67(IR6)的两个基因组拷贝，并且一个拷贝的恢复足以恢复毒力。此外，RacH携带一个1283bp的缺失，除去了编码免疫抑制病毒蛋白的orf1(UL56)的超过90％的编码序列。其它突变也可能影响减毒，但到目前为止尚未进行详细研究。所有这些使RacH成为非常安全的疫苗株，因为即使有可能，也极不可能通过在疫苗接种的动物中传代而使其回复毒力。
含有马α疱疹病毒1(EHV-1)疫苗株RacH的整个基因组的大肠杆菌(E.coli)细菌人工染色体(BAC)的两个变体：pRacH和pRacH-SE，被称为载体疫苗开发的平台。BAC pRacH-SE是在pRacH的基础上创建的，其是最初在FU Berlin的Klaus Osterrieder实验室中克隆的BAC。pRacH具有orf71(US5)的缺失，所述orf71(US5)编码糖蛋白II(gpII；Wellington等，1996)。在此位置引入了BAC载体序列和GFP表达盒。为了从pRacH中拯救未修饰的EHV-1RacH，必须将其与包含整个orf71(US5)加上侧翼区的质粒共转染，以便在病毒复制过程中通过同源重组将BAC-载体序列部分和GFP表达盒替换为orf71(US5)，以便恢复原始的RacH基因组。在本发明中对pRacH进行了修饰，使得BAC-载体序列/GFP表达盒在细胞培养物中转染后变得可自我切除(SE)(Tischer等，2007)。该改进的BAC称为pRacH-SE。pRacH和pRacH-SE都可以用作用于载体疫苗开发的平台，唯一的不同是pRacH-SE显著促进了orf71(US5)修复病毒的拯救。
已经表明，基于EHV-1RacH的载体疫苗能够在包括猪(pig)、牛(cattle)和狗(dog)的几种哺乳动物物种中引发免疫力(Rosas等2007，Rosas等2008，Trapp等2005，Said等2013)。编码病原体抗原蛋白的基因可以通过重组EHV-1RacH表达。EHV-1-RacH基因组在大肠杆菌中以其BAC形式进行操作，且通常通过插入转基因表达盒进行调整，以表达其它蛋白质(Tischer等，2010)。在培养的允许细胞中转染pRacH-SE DNA后，EHV-1复制由细胞转录因子启动。病毒DNA聚合酶的活性导致所有BAC载体相关序列的缺失以及EHV-1RacH基因组恢复到其原始状态。产生了与RacH难以区分的感染性病毒。
当在大肠杆菌中操作pRacH-SE，例如，通过插入转基因表达盒时，在允许细胞中转染后重建的病毒将携带该修饰，并将表达其它基因。重组EHV-1RacH可用作载体疫苗。
野生型EHV-1毒株在其基因组独特长区段的一端具有三个称为orf1(UL56)、orf 2和orf3的开放阅读框(orf)(序列坐标1298-3614；图1)。Orf1(UL56)和orf3顺序排列在DNA的一条链上，而orf 2由互补链编码。疫苗株RacH在影响orf 1和2的区域中具有1283bp的缺失，表明这些基因对于病毒复制不是必需的。因此，该位点用作转基因插入位点。该插入位点叫作ORF1/3(UL56)。
然而，可插入ORF1/3(UL56)插入位点的转基因的大小和数量通常是有限的。因此，为了增强EHV载体的能力，存在新的且可选的(alternative)方式来从EHV载体(特别是重组EHV-1RacH载体)插入和表达转基因的未满足的需要。
发明内容
为了增强EHV载体的能力，本发明提供了新的且可选的方式来从EHV载体主链插入和表达转基因。
本发明涉及一种新的可选的转基因插入位点UL43，其可用于从EHV载体(特别是重组EHV-1RacH)插入转基因序列并表达转基因蛋白。
该EHV载体中的新型“UL43插入位点”的特征在于与UL43(ORF17)有关的部分缺失、截短、取代、修饰等。完整UL43的缺失对于病毒复制预期是不利的，因此对疫苗的生产和功效是不利的，因为完全缺失UL43可能会影响编码糖蛋白C的UL44的启动子。在功能上定义了新型UL43插入位点和/或(表达盒的)插入UL43，使得UL44保持功能性或完整。
在一个具体方面，UL43插入位点包括RacH的UL43内(SEQ ID NO:18)约870bp部分(SEQ ID NO:21)或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源序列的缺失。RacH基因组序列中的缺失部分显示为SEQ ID NO:21(无核苷酸编号，因为完整的RacH基因组序列是未知的)。在另一个具体方面，UL43插入位点包含野生型EHV-1毒株V592(Genbank登录号AY464052.1)(SEQ ID NO:23)的UL43内的理论870bp缺失(nt 23021–24226反向互补)。缺失的部分对应于野生型V592(Genbank登录号AY464052.1基因组序列核苷酸23353和24226反向互补(SEQ ID NO:24))。
在本发明中，“侧翼区”将包含感兴趣的序列或基因(优选抗原编码序列)的表达盒重组到EHV基因组中。这些侧翼区天然存在于EHV中。选择Up UL43侧翼区(226bp，SEQ IDNO:19)和Up UL44侧翼区(305bp，SEQ ID NO:20)用于UL43位点的所有转移载体/质粒的经典同源重组。在野生型EHV-1毒株V592(Genbank登录号AY464052.1)中，相应的序列位于核苷酸24227-24452反向互补(侧翼区up UL43，SEQ ID NO:26)和23049-23354反向互补(侧翼区up UL44，SEQ ID NO:27)。
图21中用于转移质粒pU-mC70-BGH(SEQ ID NO:37)的质粒/载体图谱、图22中用于转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO:28)的质粒/载体图谱和图3中用于转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO:29)的质粒/载体图谱是包含表达盒(包括新型ORF70插入位点)的载体的实例。图23中用于转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)的质粒/载体图谱和图4中用于转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO:31)的质粒/载体图谱是包含表达盒(包括ORF1/3(UL56)插入位点)的载体的实例。
图24中用于转移载体pUUL43-p422-18K18(SEQ ID NO:34)的质粒/载体图谱、图14中用于转移质粒pUUL43-422-mC-18K18(SEQ ID NO:35)的质粒/载体图谱和图16中用于转移质粒pUUL43-422-H1pdm-18K18(SEQ ID NO:36)的质粒/载体图谱是包含表达盒(包括新型UL43插入位点)的载体的实例。
本发明还涉及一种EHV载体，其从一个载体主链表达两个不同的转基因，而不通过RNA病毒衍生功能(2a肽，IRES位点)在一个启动子的控制下偶联两个转基因。
本发明还涉及一种EHV载体，其从一个载体主链表达两个或三个不同的转基因，而不通过RNA病毒衍生功能(2a肽，IRES位点)在一个启动子的控制下偶联两个或三个转基因。
本发明还涉及一种马α疱疹病毒(EHV)载体，优选为EHV-1、RacH或RacH-SE，其包含插入到新的UL43插入位点中的第一感兴趣的序列或基因，和插入到已建立的插入位点诸如ORF1/3(UL56)或其它插入位点ORF70(US4)中的第二感兴趣的序列或基因。此外，本发明还涉及基于其它疱疹病毒的载体，特别是α疱疹病毒，尤其是水痘病毒属，包括马α疱疹病毒3(EHV-3)、马α疱疹病毒4(EHV-4)、马α疱疹病毒8(EHV-8)、马α疱疹病毒9(EHV-9)、牛α疱疹病毒1(BHV-1)、牛α疱疹病毒5(BHV-5)、犬α疱疹病毒1和猫α疱疹病毒1。
本发明还涉及一种马α疱疹病毒(EHV)载体，优选为EHV-1、RacH或RacH-SE，其包含插入到新的UL43插入位点中的第一感兴趣的序列或基因、插入到其它插入位点ORF70(US4)中的第二感兴趣的序列或基因，以及插入到已建立的插入位点诸如ORF1/3(UL56)中的第三感兴趣的序列或基因。此外，本发明还涉及基于其它疱疹病毒的载体，特别是α疱疹病毒，尤其是水痘病毒属，包括马α疱疹病毒3(EHV-3)、马α疱疹病毒4(EHV-4)、马α疱疹病毒8(EHV-8)、马α疱疹病毒9(EHV-9)、牛α疱疹病毒1(BHV-1)、牛α疱疹病毒5(BHV-5)、犬α疱疹病毒1和猫α疱疹病毒1。。
本发明还涉及包含此类载体的哺乳动物宿主细胞，和使用此类宿主细胞产生载体疫苗的方法，以及包含本发明的马α疱疹病毒(EHV)载体的免疫原性组合物和疫苗。
本发明还涉及包含p422(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列或其功能片段或其互补核苷酸序列的启动子序列，其中所述启动子序列导致感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列的表达。本发明还涉及启动子序列的功能片段，该启动子序列具有70％、80％、85％，优选90％、91％、92％、93％、94％，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的序列相同性和/或同源性。
因此，通过说明书和以权利要求为特征的实施方案实现了上述技术问题的解决方案，并且根据权利要求实现了本发明的不同方面。
这些特性允许基于EHV，优选EHV-1RacH创建重组载体疫苗，其从新近描述的UL43插入位点表达至少一种抗原，或以相似的效率从新近描述的UL43插入位点和另外的插入位点如ORF1/3(UL56)和/或其他插入位点ORF70(US4)并行表达至少两种不同抗原。如果疫苗靶由两种不同的病原体组成，则并行应用新的UL43插入位点与已建立的插入位点如ORF1/3(UL56)和/或其他插入位点ORF70(US4)，可以显著降低商品成本，并且与仅表达一种抗原组分的载体相比代表了明显的优势。
这些特性允许基于EHV，优选EHV-1RacH创建重组载体疫苗，其从新近描述的UL43插入位点表达至少一种抗原，或以相似的效率从新近描述的UL43插入位点和另外的插入位点如ORF1/3(UL56)或其他插入位点ORF70(US4)并行表达至少两种不同抗原，或从新近描述的UL43插入位点和其他插入位点ORF70(US4)和另外的插入位点如ORF1/3(UL56)并行表达至少三种不同抗原。如果疫苗靶由两种不同的病原体组成，则并行应用新的UL43插入位点与已建立的插入位点如ORF1/3(UL56)或其他插入位点ORF70(US4)，可以显著降低商品成本，并且与仅表达一种抗原组分的载体相比代表了明显的优势。如果疫苗靶由三种不同的病原体组成，则并行应用新的UL43插入位点与已建立的插入位点如ORF1/3(UL56)和其他插入位点ORF70(US4)，可以显著降低商品成本，并且与仅表达一种或两种抗原组分的载体相比代表了明显的优势。
具体实施方式
本发明解决了现有技术中固有的问题，为本领域提供显著的改进。
通常，本发明提供了一种表达盒，其包含：
(i)至少一个外源感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列可操作地连接启动子序列，以及
(ii)至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列、SEQ IDNO:26及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
(iii)至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列、SEQ IDNO:27及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
本发明还提供了马疱疹病毒(EHV)，具体地是马α疱疹病毒诸如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9，更具体地是马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地是包含本发明的表达盒的毒株RacH。
本发明提供了一种马α疱疹病毒(EHV)载体，优选地为EHV-1或毒株RacH，其包含本发明的表达盒。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，具体地是马α疱疹病毒诸如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9，更具体地是马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地是毒株RacH，其包含：
(i)至少一个外源感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
(ii)至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列、SEQ IDNO:26及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
(iii)至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列、SEQ IDNO:27及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
有利地，本发明提供的实验数据公开了已经提供了在EHV载体内的新的插入位点，其可用于插入和表达抗原。此外，现在提供新的插入位点允许从不同的插入位点插入和表达抗原，以及分别表达多于一种的抗原。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，具体的是马α疱疹病毒诸如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9，更具体地是马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地是毒株RacH，其包含插入UL43的感兴趣的核苷酸序列，优选地为感兴趣的基因，更优选地抗原编码序列。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，具体地为马α疱疹病毒诸如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9，更具体地为马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地为毒株RacH，其包含插入UL43的第一感兴趣的核苷酸序列或基因，优选地为抗原编码序列；以及插入第二插入位点(优选地为UL56(orf1/3)或US4(orf70))的第二感兴趣的核苷酸序列或基因，优选地为另一个抗原编码序列。在本发明的所述EHV载体的具体方面，至少两个感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选地为启动子序列。
在本发明的载体的具体方面，插入UL43的特征在于UL43中的部分缺失、截短、取代、修饰等，其中，UL44保持功能性。
在本发明的载体的另一个具体方面，插入UL43的特征在于RacH的UL43内约870bp部分(SEQ ID NO:21)或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列的缺失。
在本发明的载体的另一个具体方面，插入UL43的特征在于RacH的UL43内约870bp部分(SEQ ID NO:21)的缺失或其在任何其他毒株中70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列缺失。
在本发明载体的另一个具体方面，插入UL43的特征在于野生型EHV-1毒株V592(Genbank登录号AY464052.1)的UL43内约870bp缺失的缺失，其中野生型V592基因组序列中缺失的部分位于核苷酸23353和24226之间(SEQ ID NO:24)或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
在本发明载体的另一个具体方面，EHV载体，具体地是EHV-1载体，包含(i)至少一个选自以下的上游UL43侧翼区：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26；以及(ii)至少一个选自以下的上游UL44侧翼区：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，是非天然存在的和/或重组的。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述感兴趣的核苷酸序列是重组的和/或异源的和/或外源的。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述抗原编码序列涉及一种感染动物(例如，产食动物诸如猪(swine)、家禽(poultry)或牛(cattle)，或伴侣动物诸如猫(cat)、狗(dog)或马(horse))的病原体。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述载体或表达盒还包含至少一个其它调节序列，例如终止信号或多聚腺苷酸化序列。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述载体或表达盒还包含至少一个其它调节序列，例如终止信号或多聚腺苷酸化序列。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述载体或表达盒还包含至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选为另一种感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列。一方面，至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选为另一种感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列，例如经由(一个或多个)IRES/2a肽插入相同的插入位点UL43。另一方面，所述载体或表达盒包含至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选为另一种感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列，插入另一个插入位点，优选地插入UL56和/或US4。
在本发明的载体或表达盒的另一个方面，至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选为另一种感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列，插入UL56。现有技术已经描述了UL56(ORF1/3)插入位点。
在本发明的载体或表达盒的另一个方面，至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选为另一种感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列，插入US4(ORF70)。
可选的转基因插入位点US4(ORF70)可用于从EHV载体，特别是重组EHV-1或EHV-1RacH，插入转基因序列并表达转基因蛋白。
EHV载体中的“US4(ORF70)插入位点”的特征在于与US4(ORF70)有关的部分缺失、截短、取代、修饰等。完整US4(ORF70)的缺失对于病毒复制是不利的，因此对疫苗的生产和功效是不利的，因为完全缺失US4(ORF70)会影响编码gpII的US5(ORF71)的启动子。在功能上定义了US4(ORF70)插入位点和/或(表达盒)插入US4(ORF70)，使得US5(ORF71)保持功能性或完整。
在一个具体方面，US4(ORF70)插入位点包括RacH的US4(ORF70)(SEQ ID NO:17)内约801bp部分或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源的序列的缺失。RacH基因组序列中的缺失部分显示为SEQ ID NO:17(无核苷酸编号，因为完整的RacH基因组序列是未知的)。在另一个具体方面，ORF70插入位点包含野生型EHV-1毒株ab4(GenBank登录号AY665713.1，SEQ ID NO:16)的ORF70内理论801bp缺失。该缺失的部分位于野生型ab4(GenBank登录号AY665713.1)基因组序列核苷酸127681和128482之间(SEQ ID NO:16)。
在本发明中，“侧翼区”将包含感兴趣的序列或基因，优选抗原编码序列的表达盒重组到EHV基因组中。这些侧翼区天然存在于EHV中。选择Up70侧翼区(417bp，SEQ ID NO:9)和Up71侧翼区(431bp，SEQ ID NO:10)用于orf70位点所用的所有转移载体/质粒的经典同源重组。在野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中，相应的序列位于核苷酸127264-127680(侧翼区up orf70，SEQ ID NO:11)和128483-128913(侧翼区up orf71，SEQID NO:12)。对于RED重组而言，由于XbaI限制消化，侧翼区被截短。这些截短的侧翼区与如上所述的417bp“经典”侧翼区(Up70侧翼区，SEQ ID NO:9)的3’的283bp和如上所述的431bp“经典”侧翼区(Up71侧翼区，SEQ ID NO:10)的5’的144bp相同。这些截短的侧翼区被命名为Up70侧翼区(283bp)，包括于SEQ ID NO:13，和Up71侧翼区(144bp)，包括于SEQ ID NO:14。这些不同的侧翼区定义了相同的ORF70插入位点。侧翼区总是成对使用，一个“左”侧翼区，例如SEQ ID NO:9、11、13，和一个“右”侧翼区，例如SEQ ID NO:10、12、14。
在本发明的载体的另一个方面，该载体还包括：
(i)至少一个外源感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
(ii)至少一个左US4(ORF70)侧翼区，其选自：SEQ ID NO:9及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:11及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，及SEQ ID NO:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
(iii)至少一个右US4(ORF70)侧翼区，其选自：SEQ ID NO:10及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQID NO:12及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，及SEQ ID NO:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，具体为马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地为毒株RacH，其包含：
(i)第一外源感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ ID NO:26及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ ID NO:27及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列；以及
(ii)第二外源感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列、优选感兴趣的基因、更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
至少一个左US4(ORF70)侧翼区，其选自：SEQ ID NO:9及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ ID NO:11及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，及SEQ ID NO:13及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
至少一个右US4(ORF70)侧翼区，其选自：SEQ ID NO:10及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:12及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，及SEQ ID NO:14及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
在本发明的载体的另一个方面，插入US4(ORF70)的特征在于RacH的US4(ORF70)(SEQ ID NO:17)内约801bp部分或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列的缺失。
在本发明载体的另一个方面，该载体包含至少一个侧翼区，其选自：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，以及这些序列中任一序列的70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
在本发明载体的另一个方面，该载体包含(i)至少一个左US4(ORF70)侧翼区，其选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13，以及(ii)至少一个右US4(ORF70)侧翼区，其选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
在本发明的载体或表达盒的另一个方面，第二其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入US4，以及其中第三其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入UL56。
在本发明的载体的具体方面，感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选为启动子序列。
在本发明载体或表达盒的另一个方面，感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选启动子序列或如本文所述的EHV载体，其中至少两个感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选启动子序列。
在本发明载体或表达盒的另一个方面，可操作地连接一个或两个或更多个感兴趣的序列或基因的(一个或多个)启动子序列选自：SV40大T、HCMV和MCMV立即早期基因1、人延长因子α启动子、杆状病毒多角体启动子、4pgG600的功能片段(SEQ ID NO:1)，优选地所述功能片段是p430(SEQ ID NO:3)、4pgG600的互补核苷酸序列的功能片段(SEQ ID NO:1)、4pMCP600的功能片段(SEQ ID NO:2)，优选地所述功能片段是p455(SEQ ID NO:4)、4pMCP600的互补核苷酸序列的功能片段(SEQ ID NO:2)，或p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或其互补核苷酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个方面，可操作地连接至少一个感兴趣的基因的启动子序列是p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段，或其互补核苷酸序列。
在本发明载体或表达盒的具体方面，至少两个感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选地为启动子序列。
在本发明载体或表达盒的具体方面，可操作地连接该至少两个感兴趣的基因的启动子序列是不同的。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，可操作地连接至少一个感兴趣的基因的启动子序列是p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或其衍生物或其互补核苷酸序列，而可操作地连接另一个感兴趣的基因的启动子序列是p430(SEQ ID NO:3)或其功能片段或其衍生物或其互补核苷酸序列，而可操作地连接另一个感兴趣的基因的启动子序列是p455(SEQ ID NO:4)或其功能片段或其衍生物或其互补核苷酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，多聚腺苷酸化序列是BGHpA、71pA(SEQID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，EHV载体或表达盒是重组的。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，所述序列或外源感兴趣的核苷酸序列或感兴趣的基因是抗原编码序列。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，抗原编码序列是来自选自以下列表的病原体：Schmallenberg病毒、甲型流感病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒(PorcineRespiratory and Reproductive Syndrome Virus)、猪环状病毒(Porcine Circovirus)、古典猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)、非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral DiarrheaVirus)、狂犬病病毒(Rabies Virus)、Feline Morbillivirus、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，抗原编码序列是血凝素编码序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，血凝素流感抗原编码序列来自猪甲型流感病毒。
欧洲最流行的四种甲型流感毒株是H1N2、H3N2和H1N1(H1N1禽和H1N1大流行)亚型。因此，需要一种对H1N2、H3N2和H1N1(H1N1禽和H1N1大流行)亚型高度有效的疫苗，从而为这些猪IAV野毒株(field strain)提供非常广泛的保护。
此外，具有多价疫苗是有利的，因为与单价疫苗相比，多价疫苗通常更具成本效益并更具时间效益。
本文所述的基于EHV载体的疫苗由于不是经修饰的活疫苗(MLV)，就猪IAV而言提供了最终的安全性，因为没有产生活IAV或将其提供给动物，从而防止了潜在的(一种或多种)疫苗株毒力返强(reversion)，以及与来自猪或人的野毒株进行遗传重组或重配。此外，与被杀死的疫苗(现行标准)相反，期望载体疫苗不仅诱导猪IAV中和抗体，而且还通过I类和II类MHC途径强烈刺激针对猪IAV的细胞免疫。因此，需要基于载体的SIAV疫苗。此外，表达IAV血凝素的载体疫苗允许在感染的动物和疫苗接种的动物(DIVA)之间进行区分，因为其他流感病毒的抗体诱导蛋白不是载体疫苗的一部分。因此，疫苗接种不会诱导任何对NP(核蛋白)或N(神经氨酸酶)具有特异性的抗体，NP和N都是病毒结构蛋白，并包含在标准的死疫苗中。
在本发明的载体或表达盒的另一个具体方面，外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感亚型选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感抗原编码序列选自以下毒株：A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、A/swine/Gent/132/2005(H1N1)、A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)、A/swine/Italy/259543/2003(H1N2)、A/swine/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/swine/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/swine/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/swine/Italy/13962/95(H3N2)、A/swine/Cotes d’Armor/1121/00(H1N1)、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d’Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/985、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感抗原编码序列选自以下毒株：A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、A/swine/Gent/132/2005(H1N1)和A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感亚型是H1和/或H3。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感抗原编码序列包括编码与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQID NO:47所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，EHV载体或表达盒不包含NP(核蛋白)或N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列。
UL43中的H1pdm(带有p422)：
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接编码与SEQ ID NO:44(H1pdm)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，EHV载体包含两个或更多个血凝素流感抗原编码序列。
UL56中的H1av(带有p430)：
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，其它血凝素流感抗原编码序列是编码与SEQ ID NO:46(H1av)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，所述其它血凝素流感抗原编码序列插入UL56中。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，本文所述的血凝素流感抗原编码序列可操作地连接启动子序列p430(SEQ ID NO:3)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列。
US4中的H3(带有p455)：
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，其它血凝素流感抗原编码序列是编码与SEQ ID NO:45(H3)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，所述其它血凝素流感抗原编码序列插入US4中。
在本发明载体或表达盒的另一个具体方面，本文所述的血凝素流感抗原编码序列可操作地连接启动子序列p455(SEQ ID NO:4)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列。
组合
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，其包含启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与插入UL43的SEQ ID NO:44(H1pdm)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性，以及进一步地
可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列的启动子序列p430(SEQ ID NO:3)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，所述氨基酸序列与插入UL56的SEQ ID NO:46(H1av)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，其包含启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与插入UL43的SEQ ID NO:44(H1pdm)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性，以及进一步地
可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列的启动子序列p455(SEQ ID NO:4)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，所述氨基酸序列与插入US4的SEQ ID NO:45(H3)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。
本发明还涉及一种马疱疹病毒(EHV)，其包含启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与插入UL43的SEQ ID NO:44(H1pdm)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性，以及进一步地
可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列的启动子序列p430(SEQ ID NO:3)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，所述氨基酸序列与插入UL56的SEQ ID NO:46(H1av)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性，以及进一步地
可操作地连接编码氨基酸序列的核酸序列的启动子序列p455(SEQ ID NO:4)或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，所述氨基酸序列与插入US4的SEQ ID NO:45(H3)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的相同性。
在本发明的载体的另一个方面，该EHV载体选自EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9。
在本发明的载体的另一个方面，该EHV载体是EHV-1或EHV-4。
在本发明的载体的另一个方面，该EHV载体是EHV-1，优选地为RacH。
本发明还涉及一种载体或马疱疹病毒(EHV)，其包含：
a.到UL43中的第一感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如，抗原编码序列，
b.所述第一感兴趣的核苷酸序列任选地与调节核酸序列/启动子序列(优选p455、p430或p422)可操作地连接，
c.所述第一感兴趣的核苷酸序列任选地与(其它)调节核酸(例如，多聚腺苷酸化序列，优选BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)可操作地连接。
在一个具体方面，该载体或EHV还包含
a.到第二插入位点(优选地为UL56或US4)中的第二感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列，
b.所述第二感兴趣的核苷酸序列任选地与调节核酸序列/启动子序列(优选地为p455、p430或p422)可操作地连接，
c.所述第二感兴趣的核苷酸序列任选地与(其它)调节核酸(例如，多聚腺苷酸化序列，优选地为BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)可操作地连接。
在一个具体方面，该载体或EHV还包含
a.到第三插入位点(优选地为UL56或US4)中的第三感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列，
b.所述第三感兴趣的核苷酸序列任选地与调节核酸序列/启动子序列(优选地为p455、p430或p422)可操作地连接，
c.所述第三感兴趣的核苷酸序列任选地与调节核酸序列(例如多聚腺苷酸化序列，优选地为71pA、BGHpA或18pA)可操作地连接。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的orf70(US4)位点中，例如，转移质粒pU-mC70-BGH(SEQ ID NO:37)和/或转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO:28)，和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO:29)和/或转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71(SEQ ID NO:32)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的UL43位点中，例如，转移质粒pUUL43-422-18K18(SEQ ID NO:34)或pUUL43-422-H1pdm-18K18(SEQ ID NO:36)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的orf1/3(UL56)位点中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选p430)，例如，转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO:31)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1hu-BGHKBGH(SEQ ID NO:33)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的UL43位点中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选p422)，例如，转移载体pUUL43-422-18K18(SEQ ID:34)或转移质粒pUUL43-422-mC-18K18(SEQ ID NO:35)或pUUL43-422-H1pdm-18K18(SEQ ID NO:36)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的orf70(US4)位点中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选p455)，例如，转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO:28)和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ ID NO:29)和/或转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71(SEQ ID NO:32)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的UL56(orf1/3)位点中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选p430)，例如，转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO:31)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1hu-BGHKBGH(SEQ ID NO:33)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的UL56(orf1/3位点)中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选为p430)，以及第二调节核酸(优选为多聚腺苷酸化序列，优选BGH多聚腺苷酸化序列)，例如，转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(SEQ ID NO:31)和/或转移质粒pU1-3-p430-H1hu-BGHKBGH(SEQ ID NO:33)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点的侧翼区，优选地为重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的US4(orf70位点)中，和调节核酸序列(优选地为启动子，优选为p455)，以及第二调节核酸(优选为多聚腺苷酸化序列，优选71pA多聚腺苷酸化序列)，例如，转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO:28)，和/或转移质粒pU70-p455-H3-71K71(SEQ IDNO:29)，和/或转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71(SEQ ID NO:32)。
本发明还涉及一种质粒，其包含用于同源重组或RED介导重组(二者均参见上文所述)到病毒载体基因组中的特定靶位点中的侧翼区，优选地重组到EHV载体(具体为EHV-1，更具体地为RacH载体)的UL43位点中，和调节核酸序列(优选为启动子，优选为p422)，以及第二调节核酸(优选为多聚腺苷酸化序列，优选为18pA多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:7))，例如，转移载体pUUL43-422-18K18(SEQ ID NO:34)和/或转移质粒pUUL43-422-H1pdm-18K18(SEQ ID NO:36)和/或转移质粒pUUL43-422-mC-18K18(SEQ ID NO:35)。
本发明还涉及一种产生根据本发明的载体的方法，其包括：
a.将第一个感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如，抗原编码序列，插入到UL43中，
b.任选地将所述第一感兴趣的核苷酸序列与调节核酸序列/启动子序列(优选地为p455、p430或p422)可操作地连接，
c.任选地将所述第一感兴趣的核苷酸序列与(其它)调节核酸(例如，多聚腺苷酸化序列，优选地为BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)可操作地连接。
在具体方面，该方法还包括：
a.将第二感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列，插入到第二插入位点(优选地为UL56或US4)中，
b.任选地将所述第二感兴趣的核苷酸序列与调节核酸序列/启动子序列(优选地为p455、p430或p422)可操作地连接，
c.任选地将所述第二感兴趣的核苷酸序列与调节核酸(例如，多聚腺苷酸化序列，优选地为BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)可操作地连接。
在具体方面，该方法还包括：
a.将第三感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列，插入到第三插入位点(优选地为UL56或US4)中，
b.任选地将所述第三感兴趣的核苷酸序列与调节核酸序列/启动子序列(优选地为p455、p430或p422)可操作地连接，
c.任选地将所述第三感兴趣的核苷酸序列与调节核酸(例如，多聚腺苷酸化序列，优选地为BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)可操作地连接。
本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒由根据本发明的载体、任选地(一种或多种)转染试剂和说明书组成。
本发明还涉及一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于，其包含根据本发明的载体。
本发明还涉及一种制备宿主细胞的方法，其特征在于以下步骤：
a.用根据本发明的载体感染根据本发明的哺乳动物宿主细胞，
b.在合适的条件下培养该感染的细胞，
c.任选地收获所述宿主细胞。
本发明还涉及UL43在马疱疹病毒(EHV)载体中，具体是在马α疱疹病毒诸如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9，更具体地在马α疱疹病毒1(EHV-1)载体，最具体地在RacH中，作为所述马疱疹病毒(EHV)载体中的插入位点的用途，其中所述插入位点支持/促进感兴趣的核苷酸序列(优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列)的表达，其中所述UL43插入位点在UL43中包含部分缺失、截短、取代、修饰等，并且其中UL44保持功能性。
本发明还涉及根据本发明的载体或根据本发明的哺乳动物宿主细胞在制备免疫原性组合物或疫苗中的用途。
本发明还涉及一种免疫原性组合物，其包含：
a.根据本发明的载体，和/或
b.多肽，其由根据本发明的载体表达，例如，病毒、经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，以及
c.任选地药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，优选地，所述载剂适于口服、皮内、肌内或鼻内施用，
优选地，所述免疫原性组合物包含病毒。在具体方面，所述病毒是感染性病毒。
本发明还涉及一种疫苗或药物组合物，其包含：
a.根据本发明的载体，和/或
b.多肽，其由根据本发明的载体表达，例如，经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，以及
c.药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，优选地，所述载剂适于口服、皮内、肌内或鼻内施用，
d.任选地，所述疫苗还包含佐剂。
优选地，该疫苗包含本文所述的EHV载体。优选地，该免疫原性组合物包含药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂。
在本发明的一个方面，所述药学上可接受的载剂是细胞培养基或生理重悬缓冲剂。
在本发明的一个方面，所述重悬缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水。
在具体方面，所述免疫原性组合物或疫苗或药物组合物包含本发明的载体或表达盒，其中所述抗原编码序列涉及感染猪的病原体。在另一个具体方面，所述病原体是猪甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)。在另一个具体方面，所述抗原是血凝素(HA)抗原，特别地，所述血凝素抗原衍生自甲型流感病毒。例如，甲型流感病毒是甲型流感病毒(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2))、甲型流感病毒(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))、甲型流感病毒(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))和/或甲型流感病毒(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2))。在另一个具体方面，所述抗原包含以下或由以下组成：由选自SEQ ID NO:44、45、46和47的SEQ ID NO编码的序列。在另一个具体方面，所述抗原包含以下或由以下组成：编码与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的序列。
本发明还涉及一种疫苗或DIVA疫苗，其包含一种或多种本文所述的EHV载体。
本发明还涉及包含p422(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列或其功能片段或其互补核苷酸序列的启动子序列，其中所述启动子序列导致感兴趣的核苷酸序列(优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列)的表达。
本发明还涉及一种表达盒，其包含启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列或功能片段及其互补核苷酸序列，
其中，该启动子序列可操作地连接感兴趣的序列，优选感兴趣的基因，例如抗原编码序列，更优选异源和/或外源感兴趣的序列、感兴趣的基因或感兴趣的抗原编码序列，
其中，所述启动子序列导致感兴趣的核苷酸序列(优选为感兴趣的基因，更优选为抗原编码序列)的表达，
其中，所述启动子序列优选为异源启动子序列，更优选为外源启动子序列。
本发明还涉及一种包含本文所述的启动子序列或表达盒的载体。
在本发明的启动子或表达盒或载体的另一个具体方面，启动子序列的功能片段与p422的序列(SEQ ID NO:5)具有70％、80％、85％，优选90％、91％、92％、93％、94％，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的序列相同性和/或同源性。
在本发明的启动子或表达盒或载体的另一个具体方面，所述启动子序列的功能片段的长度为100个核苷酸，优选为125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400个核苷酸，最优选为410或420个核苷酸，或者其中该启动子序列的功能片段的长度在100至422个核苷酸、200至422个核苷酸、300到422个核苷酸或350至422个核苷酸之间。
在本发明的表达盒或载体的另一个具体方面，所述表达盒或载体包含一个或多个其它调节序列，例如终止信号、聚腺苷酸化信号或调节元件(例如IRES和/或2a肽)。
在本发明的表达盒或载体的另一个具体方面，该表达盒或该载体还包含多聚腺苷酸化序列，优选为BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)。
在本发明的载体的另一个具体方面，所述载体是重组和/或异源和/或外源载体。
在本发明的载体的另一个具体方面，所述载体是病毒载体，优选选自：疱疹病毒科(herpes viridae)，诸如马α疱疹病毒1(EHV-1)、马α疱疹病毒4(EHV-4)和其它水痘病毒属如PrV(假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus))和BHV-1(牛疱疹病毒1)、腺病毒科(Adenoviridae，AdV)诸如CAdV(Canine Adenovirus)、腺相关病毒科(Adeno-associatedviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、慢病毒科(Lentiviridae)诸如反转录病毒(Retroviruses)，以及痘病毒科(Poxviridae)。
在本发明的载体的另一个具体方面，所述载体是疱疹病毒科(familyHerpesviridae)的成员，优选地为甲型疱疹病毒亚科属(genus Alphaherpesvirinae)，更优选地为水痘病毒属亚属(subgenus Varicellovirus)，最优选地，所述载体是马α疱疹病毒1(EHV-1)。
DIVA
有效DIVA疫苗的主要优势在于，它可以在被疫苗接种的动物种群中取样之前检测出被急性感染或感染了一段时间(至少约3周)的产食动物(优选为猪)，从而提供监测病原体(优选为猪流感病毒)在动物种群中的扩散或重新引入的可能性。因此，可以根据实验室检验结果，以一定的置信度宣布已疫苗接种的猪群不含猪甲型流感病毒。
标记疫苗便于快速和有效的施用，并允许区分感染野生病毒(与疾病相关)的动物和疫苗接种的动物。
本发明的免疫原性组合物或DIVA疫苗不包含任何编码N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列和/或NP(核蛋白)流感抗原编码序列的抗原编码序列。
相反，在动物感染野生型猪甲型流感病毒或疫苗接种经修饰的活疫苗或疫苗接种灭活全病毒疫苗或具有残留的母体衍生抗体后，被感染/疫苗接种的动物产生/具有针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特异性抗体。然而，在疫苗接种有根据本发明的免疫原性组合物的动物中，不能检测到这种针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特异性抗体。
通过示例性的免疫测试和/或基因组分析测试，可以将仅疫苗接种本发明的免疫原性组合物的动物与感染野生型猪流感病毒或疫苗接种经修饰的活疫苗或疫苗接种灭活全病毒疫苗或具有残留的母体衍生抗体的动物区分开，其中，仅疫苗接种本发明的免疫原性组合物的动物不具有针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的任何特异性抗体以及分别编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的任何猪甲型流感病毒特异性序列。
本发明提供了一种区分感染猪甲型流感病毒的产食动物与接种本文所述的免疫原性组合物或DIVA疫苗的方法，其包括：
a)从产食动物获得样品，以及
b)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析所述样品。
在本发明的一个方面，免疫测试包括测样品品是否包含特异性识别猪流感的N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白的抗体。
在本发明的一个方面，如果已经检测到特异性识别猪流感的N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白的抗体，则该产食动物被猪甲型流感病毒感染。
在本发明的一个方面，基因组分析测试包括测样品品是否包含编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪甲型流感病毒特异性序列。
在本发明的一个方面，如果已经检测到编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪甲型流感病毒特异性序列，则该产食动物被猪甲型流感病毒感染。
在本发明的一个方面，免疫测试是EIA(酶免疫测定)或ELISA(酶联免疫吸附测定)，或者，其中基因组分析测试是PCR(聚合酶链式反应)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)或实时PCR(聚合酶链式反应)。
在本发明的一个方面，该产食动物是猪。
在本发明的一个方面，该样品是血清样品。
优选地，对野生型SIAV的N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)具有特异性的抗体用于检测猪(怀疑感染了SIAV或已疫苗接种根据本发明的疫苗)呼吸道各部分中的抗原。在这种情况下，只有感染的猪或疫苗接种经修饰的活疫苗或疫苗接种灭活全病毒疫苗或具有残留的母体衍生抗体的样品会显示出所述N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)特异性抗体的阳性结果。相反，由于本发明的疫苗中缺少此类抗原(仅有血凝素)，因此疫苗接种了本发明疫苗的猪的样品不会显示出所述N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的结果。
然而，N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的表位在进化上是保守的，并且对于SIAV是特异性的且是中和抗体的靶。
因此，测试可以例如包含具有与微孔测定板交联的野生型SIAV的N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的孔。所述交联优选通过锚定蛋白诸如例如聚-L-赖氨酸进行。用于获得野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的表达系统是本领域技术人员熟知的。或者，可以化学合成所述N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位。
仅疫苗接种根据本发明的疫苗的动物没有产生针对野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的抗体。但是，根据本发明，这些动物已经产生了针对HA(血凝素)表位的抗体。结果是，没有抗体与被野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位包被的孔结合。相反，如果孔已经被根据本发明的HA表位包被，则抗体与所述取代的HA表位结合。
在本发明的一个方面，ELISA是间接ELISA、夹心ELISA、竞争型ELISA或阻断式ELISA。
然而，不同的ELISA技术对于本领域技术人员而言是熟知的。ELlSA已经在以下文献中进行了示例性描述：Wensvoort G.等，1988(Vet.Microbiol.17(2):129-140)，RobioloB.等，2010(J.Virol.Methods.166(1-2):21-27)，和Colijn,E.O.等，1997(Vet.Microbiology 59:15-25)。
优选地，通过呼吸道细胞的RNA分离和逆转录酶，然后扩增cDNA提供用于区分感染野SIAV或疫苗接种经修饰的活疫苗或疫苗接种灭活全病毒疫苗或具有残留的母体衍生抗体的动物以及仅疫苗接种本发明的疫苗的动物的测试。使用针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特异性引物，可以进行PCR。在这种情况下，如果有PCR阳性信号，则猪感染野生型SIAV。但是，如果不能扩增N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)特异性序列，则该动物已经疫苗接种本发明的疫苗。
此外，可以使用基于实时的技术引物和/或探针来识别N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)和/或特异性HA(血凝素)。然而，此类方法在本领域中是熟知的。
在本发明的另一个方面，基因组分析测试是PCR(聚合酶链式反应)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)或实时PCR(聚合酶链式反应)。
本发明还涉及一种用于制备用于降低与感染相关或由感染引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括以下步骤：
a.用根据本发明的载体感染根据本发明的哺乳动物宿主细胞，
b.在合适的条件下培养感染的细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.任选地纯化步骤c)所收集的感染的细胞培养物，
e.任选地将所述收集的感染的细胞培养物与药学上可接受的载剂混合。
医学用途：
本发明还涉及一种用于免疫动物的方法，其包括向该动物施用本文所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
本发明还涉及一种用于在有需要的动物中减少或预防由病原体引起的临床体征的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的本文所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
本发明还涉及一种用于在有需要的动物中减少或预防由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的本文所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，所述动物是猪(swine)、仔猪(piglet)或母猪(sow)、家禽(poultry)、牛(cattle)、马(horse)、狗(dog)或猫(cat)。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗施用一次。
应当理解，单剂量仅施用一次。优选地，单剂量的总体积在约0.2ml至2.5ml之间，更优选在约0.2ml至2.0ml之间，甚至更优选在约0.2ml至1.75ml之间，还更优选在约0.2ml至1.5ml之间，甚至更优选在约0.4ml至1.25ml之间，甚至更优选在约0.4ml至1.0ml之间，其中最优选为单次0.5ml的剂量或1.0ml的剂量。最优选地，该单剂量的总体积为0.5ml、1ml、1.5ml或2ml。
优选地，在仔猪达到三周龄前，向其施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。优选地，在1日龄至21日龄，更优选在1日龄至10日龄之间，甚至更优选在1日龄至9日龄之间，甚至更优选在1日龄至8日龄之间，甚至更优选在1日龄至7日龄之间，甚至更优选在1日龄至6日龄之间，甚至更优选在1日龄至5日龄之间，甚至更优选在1日龄至4日龄之间，甚至更优选在1日龄至3日龄之间，甚至更优选为1或2日龄，最优选为1日龄，对每只仔猪施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，在动物第一个三周龄内、在第一个两周龄内、在第一个一周龄内或在第一个一日龄内，对动物施用该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗以两剂量施用。
然而，该免疫原性组合物可以以两或更多剂量施用于动物，在施用第二(加强)剂量之前，施用第一剂量。优选地，在第一个两周龄内，更优选在第一个一周龄内，甚至更优选在第一个一日龄内施用第一剂量。优选地，在第一剂量之后至少15天施用第二剂量。优选地，在第一剂量之后15至40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少17天施用第二剂量。又更优选地，在第一剂量之后17至30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少19天施用第二剂量。又更优选地，在第一剂量之后19至25天施用第二剂量。最优选地，在第一剂量之后至少21天施用第二剂量。在两次施用方案的一个优选方面，免疫原性组合物的第一和第二剂量均以相同的量施用。优选地，每剂量均以上述指定的优选量，最优选地是第一剂量和第二剂量均为1ml的剂量。除了第一和第二剂量方案外，替代实施方案包括其他后续剂量。例如，可以在这些方面中施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四或第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上述第一和第二剂量之间的时间一致。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，在第一周龄内向动物施用该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，并且第二次在第二、第三或第四周龄内。
优选地，局部或全身施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。通常使用的合适的施用途径是口服或肠胃外施用，例如，鼻内、静脉内、肌内、腹膜内、皮下以及吸入。然而，根据化合物的性质和作用方式，该免疫原性组合物或DIVA疫苗也可以通过其它途径施用。然而，最优选地，肌内或鼻内施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，肌内或鼻内施用所述免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，所述免疫原性组合物或DIVA疫苗包含1x104至1x109组织培养感染剂量50(TCID50)，优选1x104至1x108TCID50，甚至更优选1x104至1x107TCID50的EHV载体。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗包含1x104至1x107TCID50的EHV载体。
在本发明的医学用途或方法的另一个具体方面，所述方法导致与相同物种的未免疫的对照组的动物相比，选自以下的功效参数的改善：体重减轻减少、直肠温度降低、临床症状减轻、(中和)抗体诱导增加或其组合。
在上述本发明的医学用途或如上所述的免疫动物的方法的一个具体方面，所述抗原编码序列涉及感染猪的病原体。在另一个具体方面，所述病原体是猪甲型流感病毒(IAV)。在另一个具体方面，所述抗原是血凝素(HA)抗原，特别是，所述血凝素抗原衍生自甲型流感病毒。例如，甲型流感病毒是甲型流感病毒(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2))、甲型流感病毒(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))、甲型流感病毒(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))和/或甲型流感病毒(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2))。在另一个具体方面，所述抗原包含序列或由序列组成，所述序列由选自SEQ ID NO:44、45、46和47的SEQ ID NO编码。在另一个具体方面，所述抗原包含序列或由序列组成，所述序列编码与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。
本发明还涉及一种用于在动物中针对与病原体相关的疾病和/或减少或与病原体相关或由病原体引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性对动物(优选产食动物诸如猪、家禽或牛或伴侣动物诸如猫、狗或马)进行疫苗接种的试剂盒，其包含：
a)能够给所述动物施用疫苗的分配装置；以及
b)根据本发明的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，以及
c)任选地使用说明书。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与提交时本发明所属技术领域技术人员通常所理解含义相同的含义。术语的含义及范围应明确；然而，倘若存在任何潜在歧义，则本文所提供的定义优先于任一字典或非固有定义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数形式且复数术语应包含单数。在本文中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。另外，术语“包括(including)”以及其他形式(例如“包含(includes)”及“被包括(included)”)的使用不具有限制性。本文所提及的所有专利及公开均以引用方式并入本文中。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学和免疫学的常规技术。文献中对此类技术进行了全面的阐述。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Vols.I,II and III,Second Edition(1989)；DNA Cloning,Vols.I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series,Methods InEnzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Proteinpurification methods–a practical approach(E.L.V.Harris and S.Angal,eds.,IRLPress at Oxford University Press)；和Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.,1986,Blackwell ScientificPublications)。
在详细描本发明之前，应理解，本发明并不限于特定DNA、多肽序列或方法参数，因为这些当然可有所变化。也应理解，本文所用的术语仅是出于描述本发明的特定实施方案的目的，而并非意欲为限制性。必须指出，除非内容另外明确说明，否则如本说明书及随附权利要求中所用的单数形式“一(a、an)”及“该(the)”均包含复数个指示物。因此，举例而言，所提及“抗原”包含两种或更多种抗原的混合物，所提及“赋形剂”包含两种或更多种赋形剂的混合物，等。
分子生物学定义
如本领域已知的术语“载体”是指用于将遗传材料传递至宿主细胞的多核苷酸构建体、通常质粒或细菌人工染色体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、粘粒或质粒。本文所用的载体可由DNA或RNA组成或含有DNA或RNA。在一些实施方案中，载体由DNA组成。在一些实施方案中，载体是感染性病毒。此病毒载体含有病毒基因组，该病毒基因组以以下方式处理：其携载外来基因，该外来基因在细胞培养物或宿主动物中在该病毒载体的复制中皆无作用。根据本公开的具体方面，载体可用于各种方面，例如仅传递遗传材料、用于转染宿主细胞或生物体、用作疫苗(例如DNA疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是描述蛋白质在细胞中的生物合成(如由称为基因的特定多核苷酸序列所引导)的术语。在一具体方面中，载体可为“表达载体”，其是在存在于适当环境中时能够引导表达由通过载体携载的一或多种基因编码的蛋白质的载体。
载体及制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可尤其由以下文献揭示或类似于以下文献中所揭示的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors tovaccination:An update,“PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Geneticallyengineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,andsafety,”PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日提交的美国申请第920,197号；欧洲专利公开第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex virus genes:Aprimer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineered herpessimplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,”PNAS USA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for genedelivery to B lymphocytes”,PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,”PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；1996年7月3日提交的授权的美国申请系列第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus ascloning vectors,”Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,inducesprotective immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease”,PNASUSA 93:11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry，尤其涉及DNA表达载体。也参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminarsin Immunology，第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(致细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文件。
术语“病毒载体”描述通过重组DNA技术以其进入宿主细胞中会产生特定生物活性(例如表达由载体携载的转基因)的方式处理的遗传修饰的病毒。在一具体方面中，转基因是抗原。病毒载体可或可不在靶细胞、组织或生物体中为复制胜任(competent)的。
可使用本领域熟知的任何适合的遗传工程化技术来完成病毒载体的生成，包含(但不限于)细胞培养物中的限制性内核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、转染的标准技术，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,N.Y.(1989))或K.Maramorosch及H.Koprowski(Methods inVirology Volume VIII,Academic Press Inc.London,UK(2014))中所描述。
病毒载体可掺入来自任一已知生物体的基因组的序列。所述序列可以其天然形式掺入或可以任一方式进行修饰以获得期望活性。举例而言，所述序列可包括插入、缺失或取代。
病毒载体可包含感兴趣的两种或更多种蛋白质的编码区。举例而言，病毒载体可包含第一感兴趣的蛋白的编码区及第二感兴趣的蛋白的编码区。第一感兴趣的蛋白及第二感兴趣的蛋白可相同或不同。在一些实施方案中，病毒载体可包含感兴趣的第三蛋白或第四蛋白的(一个或多个)编码区。感兴趣的第三蛋白及第四蛋白可相同或不同。由一种病毒载体编码的感兴趣的两种或更多种蛋白的总长度可有所变化。举例而言，两种或更多种蛋白的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
优选病毒载体包含疱疹病毒载体，例如衍生自EHV-1或EHV-4或其他水痘病毒属如PrV(假性狂犬病病毒)和BHV-1(牛疱疹病毒1)。
根据本发明的具体方面，术语“病毒载体”或替代地“病毒构建体”是指衍生自病毒(其选自疱疹病毒科，例如EHV-1、EHV-4)的重组病毒构建体。优选病毒载体包含诸如衍生自EHV-1或EHV-4的疱疹病毒载体。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
本文所用的术语“构建体”是指重组核酸(例如质粒、BAC)或人工生成的重组病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌宿主细胞内的细菌染色体复制的细胞质DNA。在本发明的一具体方面中，术语“质粒”和/或“转移质粒”是指可用于构建(例如)用于插入病毒载体中的表达盒的重组DNA技术的元件。在另一具体方面中，术语“质粒”可用于指示可用于DNA疫苗接种目的的质粒。
本文所用术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。
本文所用的术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“RNA序列”、cDNA序列或“DNA序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分，且是指基因组或合成起源的DNA或RNA，其可为单链或双链且代表有义或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明的核酸序列可使用本领域技术人员熟知的标准技术制备。
术语“核酸”及“多核苷酸”也具体而言包含由除5种生物存在碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基组成的核酸。
术语“调节核酸”、“调节元件”及“表达控制元件”可互换使用且是指可影响可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的核酸分子。这些术语可广泛使用且涵盖促进或调节转录的所有元件，包含启动子、启动子序列、RNA聚合酶与转录因子的碱性相互作用的核心元件、上游元件、增强子及反应元件。原核生物中的示例性调节元件包含启动子、操纵子序列及核糖体结合位点。用于真核细胞中的调节元件可包含(但不限于)提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生的转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内核糖体进入位点(IRES)、小核糖核酸病毒2A序列等。
“内核糖体进入位点”或“IRES”描述在动物细胞中功能上促进独立于IRES的基因5’进行翻译起始且允许两个顺反子(开放阅读框)自单一转录物翻译的序列。IRES提供用于翻译紧接其下游的开放阅读框的独立核糖体进入位点。不同于可为多顺反子(即编码若干自mRNA依序翻译的不同多肽)的细菌mRNA，动物细胞的大部分mRNA是单顺反子且编码仅一种多肽的合成。在真核细胞中使用多顺反子转录物，自最5’翻译起始位点开始翻译，并终止于第一终止密码子，且自核糖体释放转录物，从而使得仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有可操作地连接转录物中的第二或后续开放阅读框的IRES的多顺反子转录物允许依序翻译该下游开放阅读框以产生由相同转录物编码的两种或更多种多肽。IRES可具有不同长度且来自各种来源(例如脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)(FMDV)或小儿麻痹病毒(Polio virus)(PV)或丙型肝炎病毒(HCV))。已描述各种IRES序列及其在载体构建中的用途且在本领域已熟知。下游编码序列以任一并不不利地影响下游基因的表达的距离可操作地连接IRES的3’端。可容易地通过改变距离且测量随距离而变化的表达来测定IRES与下游基因的开始之间的最优选或允许距离。
术语“2a”或“2a肽”意指描述为2a及“2a样”的短寡肽序列，其用作能够通过定义为核糖体跳跃的过程来介导蛋白质之间的共翻译切割的接头。可使用该2a及“2a样”序列(来自小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)及其他病毒或细胞序列)来将多个基因序列串联成单一基因，从而确保其共表达于相同细胞内(参见Luke及Ryan,2013)。
如本文中所使用，术语“启动子”或“启动子序列”意指允许结合RNA聚合酶且引导转录基因的核苷酸序列。通常，启动子位于基因邻近基因的转录开始位点的5’非编码区中。启动子内用于引发转录的序列元件的特征通常在于共有核苷酸序列。启动子的实例包含(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包含马、猪、牛、家禽、狗、猫及人类)、鸟或昆虫)的启动子。启动子可为可诱导、可抑制和/或组成型。可诱导启动子引发在其控制下因响应于培养条件的一定变化(例如温度变化)增加来自DNA的转录水平(Ptashne,2014)。本领域技术人员熟知的启动子的实例是(例如)SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子。
如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指功能片段(例如4pgG600(SEQID NO:1)的截短物或其互补核苷酸序列)，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)72％(或更高)。另外，如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指功能片段(例如4pMCP600(SEQ ID NO:2)的截短物或其互补核苷酸序列)，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)78％(或更高)。此外，如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指p422(SEQID NO:5)或其功能片段或其互补核苷酸序列)。最优选地，“启动子”是指p430(SEQ ID NO:3)、p455(SEQ ID NO:4)或p422(SEQ ID NO:5)。另外，如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指p430(SEQ ID NO:3)或p455(SEQ ID NO:4)或4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能衍生物，其具有例如小的取代、突变或倒位，使得序列相同性为70％、80％、85％、90％、95％、99％相同或同源。
遍及说明书、图、序列表等的术语“4pgG430”、“p430”、“gG 430”及“430”同义且互换使用。遍及说明书、图、序列表等的术语“4pMCP455”、“p455”、“MCP 455”及“455”同义且互换使用。遍及说明书、图、序列表等的术语p422及422同义且互换使用。
术语“增强子”表示在顺位作用于启动子的活性且由此刺激转录在功能上连接此启动子的基因或编码序列的多核苷酸序列。不像启动子，增强子的作用与位置及定向无关且其可由此定位于转录单元之前或后面、内含子内或甚至编码区内。增强子可位于紧邻转录单元处及距启动子相当距离处。其也可与启动子具有物理及功能重迭。本领域技术人员将知晓诸多来自各种来源的增强子(且寄存于数据库(例如Genbank)中，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤增强子、腺病毒增强子)，所述增强子可用作独立元件或克隆于多核苷酸序列内的元件(例如保藏于ATCC或来自商业及个别来源)。诸多启动子序列也含有增强子序列，例如常用CMV启动子。人类CMV增强子是迄今所鉴别的最强增强子之一。可诱导增强子的一种实例是金属硫蛋白增强子，其可由糖皮质激素或重金属刺激。
术语“互补核苷酸序列”描述多核苷酸(例如DNA或RNA)的两条配对链的一条链。互补链的核苷酸序列反映其配对链的核苷酸序列，从而对于每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或对于RNA而言含有尿嘧啶)，对于每一鸟嘌呤而言其含有胞嘧啶，且反之亦然。举例而言，5’-GCATAC-3’的互补核苷酸序列是3’-CGTATG-5’或对于RNA而言是3’-CGUAUG-5’。
本文所用的术语“基因”、“感兴趣的基因”具有相同含义且是指编码感兴趣的产物的任何长度的多核苷酸序列。基因可进一步包括编码序列之前的调节序列(5’非编码或未翻译序列)及之后的调节序列(3’非编码或未翻译序列)。所选序列可为全长或截短、融合或加标签基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段。通常应理解，编码多肽或RNA的基因组DNA可包含自成熟信使RNA(mRNA)剪接且由此不存在于编码相同多肽或RNA的cDNA中的非编码区(也即内含子)。其可为天然序列，即(一种或多种)天然存在形式，或可为突变的，或包括衍生自不同来源的序列或另外视需要经修饰。所述修饰包含密码子优化以在所选宿主细胞中优化密码子使用或加标签。另外，其可包含去除或添加顺式作用位点(例如(隐性)剪接供体、受体位点及分支点、多腺苷酸化信号、TATA-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、用于转录因子或其他调节因子的结合位点、限制酶位点等)以得到仅少数(但不限于)实例。所选序列可编码分泌、细胞质、细胞核、膜结合或细胞表面多肽。
本文所用的术语“感兴趣的核苷酸序列”是较感兴趣的基因而言更普遍的术语，这是因为其未必包括基因，但可包括基因的元件或部分或其他遗传信息(例如ori(复制起点))。感兴趣的核苷酸序列可为任何DNA或RNA序列，独立于其是否包括编码序列。
“开放阅读框”或“ORF”是指核酸序列(DNA或RNA)中包括翻译开始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)及终止密码子且可潜在翻译成多肽序列的长度。
术语“UL(独特长)”是描述EHV(优选EHV-1基因组)的独特长区段的缩写。
术语“US(独特短)”是描述EHV(优选EHV-1基因组)的独特短区段的缩写。
术语“转录”描述mRNA在细胞中的生物合成。
本文所用的术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译核酸序列。根据本发明的具体方面，术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译异源和/或外源核酸序列。可基于存在于细胞中的相应RNA或mRNA的量或由所选序列所编码的期望多肽的量来测定期望产物在宿主细胞中的表达水平。举例而言，可通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、原位杂交至细胞RNA或通过RTqPCR(逆转录且随后定量PCR)来量化自所选序列转录的mRNA。可通过各种方法来量化自所选序列表达的蛋白质，例如通过ELISA、通过蛋白质免疫印迹、通过放射免疫分析、通过免疫沉淀、通过分析蛋白质的生物活性或通过免疫染色蛋白质且随后进行FACS分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义载体、构建体或多核苷酸序列内含有一或多种待转录基因的区域，其中含于表达盒内的编码(一个或多个)转录基因的核苷酸序列以及含有调节元件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。其自启动子转录且通过至少一个多腺苷酸化信号终止转录。在一个具体方面中，其自单一启动子转录。因此，不同基因至少以转录方式连接。多于一种蛋白质或产物可自各转录单元(多顺反子转录单元)转录及表达。各转录单元将包括对于转录及翻译含于该单元内的任何所选序列所需的调节元件。而且，各转录单元可含有相同或不同的调节元件。举例而言，各转录单元可含有相同终止子，IRES元件或内含子可用于转录单元内基因的功能连接。载体或多核苷酸序列可含有多于一个的转录单元。
术语“增加的表达”、“增加的效价或生产力”或“改良的表达或生产力”意指与合适的对照相比(例如由cDNA编码的蛋白质相对于由含内含子基因编码的蛋白质)，引入宿主细胞中的异源和/或外源序列(例如编码治疗蛋白的基因)的表达、合成或分泌增加。若根据本文所描述的本发明方法培养本发明的细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍，则有增加的效价或生产力。若根据本文所描述的本发明方法培养本发明细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍，则也有增加的效价或生产力。若根据本文所描述的本发明方法培养本发明细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍至5倍、优选地1.5倍至5倍、更优选地2倍至5倍、尤其优选地3倍至5倍，则也尤其有增加的效价或生产力。“增加的表达”也可意指更多细胞实际上表达感兴趣的的基因/序列。举例而言，增加的表达可意指本发明的新启动子在病毒复制周期期间相对于其他启动子有活性较长时间段。
可通过使用本发明的异源载体来获得增加的表达、效价或生产力。此可与其他方式加以组合，例如FACS辅助性选择含有一或多种荧光蛋白(例如GFP)或细胞表面标记物作为其他可选标记物的重组宿主细胞。也可使用获得增加的表达的其他方法及不同方法的组合，所述方法是(例如)基于以下方式：使用用于处理染色质结构的顺式活性元件(例如LCR、UCOE、EASE、分离子、S/MAR、STAR元件)、使用(人工)转录因子、使用用于上调内源或异源和/或外源基因表达的天然或合成物质处理细胞、改良mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)、改良mRNA翻译的起始、通过使用游离型质粒来增加基因剂量(基于使用病毒序列作为复制起点，例如SV40、多瘤、腺病毒、EBV或BPV)、使用促进扩增的序列或基于DNA多联体的体外扩增系统。
测量“增加的表达”的分析是基于LC-MS/MS的蛋白质测量，例如多反应监测(MRM)；基于抗体的检测方法，例如蛋白质免疫印迹、点印迹或免疫扩散及流式细胞术；及通过血凝集分析测量生物活性。
通过量化在各启动子控制下的mRNA转录来间接测量“启动子活性”。通过RTqPCR相对于内源标准来量化mRNA。
术语“病毒效价”是每体积病毒制备物的感染性单位的量度。病毒效价是生物程序中的终点且定义为显示作用时的平行实施的测试的某一比例稀释度(Reed及Muench,1938)。具体而言，组织培养感染剂量50/毫升(TCID50/ml)给出病毒制备物的如下稀释度：以该稀释度平行接种的诸多细胞培养物中的50％发生感染。
“转录调节元件”通常包括待表达基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于掺入一级转录物(即mRNA前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多腺苷酸化信号”或“polyA”或“转录终止位点”或“转录终止元件”是如下信号序列：其在真核mRNA的3’端的特定位点处引起切割且在经切割的3’端转录后掺入约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(polyA尾)，且由此使得RNA聚合酶终止转录。多腺苷酸化信号包括切割位点上游的约10-30个核苷酸的序列AATAAA及位于下游的序列。已知各种多腺苷酸化元件，例如tk polyA、SV40晚期及早期polyA、BGH polyA(例如描述于美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素polyA(WO2010010107)。
“翻译调节元件”包括用于每一待表达个别多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子及polyA信号。内核糖体进入位点(IRES)可包含于一些构建体中。为优化表达，可建议去除、添加或改变待表达核酸序列的5’-和/或3’-未翻译区以消除任何潜在额外不适当替代翻译起始密码子或其他可在转录或翻译层面上干扰或减小表达的序列。可将共有核糖体结合位点(Kozak序列)插入紧邻起始密码子的上游处以增强翻译且由此增强表达。增加此核糖体结合位点周围的A/U含量可增进更有效的核糖体结合。
根据定义，当来自不同(病毒)物种时，插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各蛋白质或RNA对于宿主细胞而言称为“外源”、“外源序列”、“外源基因”、“外源编码序列”。因此，本发明的基于EHV-4的启动子就EHV-1病毒载体而言是外源的。如本文针对感兴趣的序列或基因(例如抗原)所使用，术语“外源”意指所述感兴趣的序列或基因、具体而言该所述抗原表达于其天然物种背景之外。因此，来自猪IAV的H3、H1av或H1pdm抗原是就EHV-1载体而言外源抗原的实例。衍生自除EHV-1之外不同病原体的任何序列因此是感兴趣的外源序列或基因或根据本发明的具体方面的抗原。
根据定义，插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各蛋白质或RNA对于宿主细胞而言称为“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白”。即使待引入的序列或待引入的基因与宿主细胞的内源序列或内源基因相同，此定义也适用。举例而言，根据定义，在不同位点引入EHV-4病毒载体中或相对于EHV-4野生型病毒为经修饰形式的EHV-4启动子序列是异源序列。如本文针对感兴趣的序列或基因(例如抗原)所使用，术语“异源”意指，所述感兴趣的序列或基因、具体而言所述抗原表达于其天然亚物种背景之外。因此，感兴趣的任何非EHV-1特异性序列或基因(例如抗原，例如来自任何马α疱疹病毒的除EHV-1外的抗原，例如EHV-3、EHV-8)由此是感兴趣的异源序列或基因或根据本发明的具体方面的抗原。
术语“非天然存在”意指并不天然存在于此背景中的任何感兴趣的序列或基因(例如抗原)，例如来自不同物种的杂种序列或感兴趣的序列或基因(例如抗原)，或因人工突变、插入、缺失或诸如此类而并非天然产物的感兴趣的序列或基因(例如抗原)。
在本发明的整个说明书中，术语“重组”可与术语“非天然存在”、“异源、”及“外源”互换使用。因此，“重组”蛋白是自异源或外源多核苷酸序列表达的蛋白质。如针对病毒所用的术语重组意指通过人工处理病毒基因组产生的病毒。包括异源或外源序列(例如外源抗原编码序列)的病毒是重组病毒。术语重组病毒及术语非天然存在病毒可互换使用。
因此，术语“异源载体”意指包括异源或外源多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包括异源或重组多核苷酸序列的载体。
如本文中所使用，术语“可操作地连接”用于描述调节元件与基因或其编码区之间的连接。通常，基因表达是置于一或多种调节元件(例如(但不限于)组成型或可诱导启动子、组织特异性调节元件及增强子)的控制下进行。基因或编码区被视为与调节元件“可操作地连接”或“可操作性地连接”或“可操作地缔合”，这意味着该基因或编码区由调节元件控制或影响。举例而言，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接编码序列。
另外，在本说明范围内，术语“功能连接”、“在功能上连接”或“可操作地连接”意指，两个或更多个核酸序列或序列元件以允许其以其预期方式发挥作用的方式进行定位。举例而言，若启动子/增强子或终止子能够控制或调节所连接的基因序列在顺位的转录，则其在功能上连接编码基因序列。通常但未必，在功能上连接的DNA序列是邻接的且在需要时接合两个多肽编码区，或在分泌信号肽的情形下邻接且位于阅读框中。然而，尽管可操作地连接的启动子通常位于编码序列的上游或可操作地连接的终止子通常位于编码序列的下游，但其未必邻接。增强子并不必须邻接，只要其增加编码序列的转录即可。为此，其可位于编码序列的上游或下游且甚至相距一定距离。若多腺苷酸化位点以转录继续通过编码序列至多腺苷酸化信号的方式位于编码序列的3’端，则其可操作地连接编码序列。通过本领域已知的重组方法来达成连接，例如通过在合适的限制位点处或钝端连接或通过使用融合PCR方法。若不存在合适的限制位点，则可根据常规实践使用合成寡核苷酸接头或适配体。
因此，术语启动子序列的“功能片段”或“功能衍生物”意指，片段或衍生物仍实现启动子活性。本领域技术人员熟知如何评价启动子活性的功能分析(Bustin 2000,Nolan等人，2006)。此功能分析的示例性实施方案包含(例如)启动子动力学实验。将被携载表达盒(其中启动子或其片段引导转录报告基因转基因)的载体病毒感染的细胞孵育不同时间。从感染之后于不同时间收集的样品制备总RNA。通过DNAse I消化破坏污染的DNA之后，逆转录RNA。在添加逆转录酶(RT)的情况下处理一种复制样品，在不添加RT的情况下处理第二复制物以证实污染DNA自RNA制备物的成功去除。纯化所得cDNA并用作常规PCR中的模板。仅在添加RT的情况下处理的样品应产生PCR产物。然后可将这些cDNA用于使用报告基因转基因的引物的qPCR及平行使用病毒载体的必需基因(内部标准基因，其转录提供感染及复制的效率的内部标准)的引物的qPCR。使用内部标准基因的qPCR值归一化不同构建体与感染后时间之间的报告基因的qPCR值。这允许诠释不同启动子及其片段的启动子活性。
本文所用的“序列同源性”是指测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，最佳地比对两个或更多个序列，且视需要引入空位。然而，与“序列相同性”不同，在测定序列同源性时，保守氨基酸取代可视为匹配。
换言之，为获得与参考序列具有95％序列同源性的相当的多肽或多核苷酸，参考序列中的85％、优选90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包括另一氨基酸或核苷酸的保守取代。或者，可将占参考序列中的总氨基酸残基或核苷酸(不包含保守取代)的最高15％、优选最高10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选最高5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数量的氨基酸或核苷酸插入参考序列中。优选地，同源物序列包括至少50、甚至更优选地100、甚至更优选地250、甚至更优选地500个核苷酸的段。
本领域已知的“序列相同性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、即参考序列与待与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。通过在将序列最佳选地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如通过所述序列串之间的匹配所测定。在该比对后，基于逐个位置来确定序列相同性，举例而言，若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则所述序列在该位置处“相同”。然后将所述位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可容易地通过已知方法来计算，包含(但不限于)描述于以下文献中的方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,NewYork(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教导以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编码成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。所述程序的实例包含(但不限于)GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教导以引用方式并入本文中)。这些程序最佳地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性水平。作为阐释，对于具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“序列相同性”的核苷酸序列的多核苷酸而言，除了给定多核苷酸序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的核苷酸可缺失或被另一核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定氨基酸序列的多肽而言，除了给定多肽序列可包含最高15、优选地最高10、9、8、7、6、甚至更优选地最高5、4、3、2、1个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定多肽序列，参考序列中最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸残基可缺失或被另一氨基酸取代，或参考序列中的总氨基酸残基数量最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的数量的氨基酸可插入参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不相同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包含保守取代作为匹配。
术语“序列相同性”或“百分比相同性”可在本文中互换使用。出于本发明目的，在本文中应明确，为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比相同性，出于最佳比较目的，比对所述序列(举例而言，可将空位引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则所述分子在该位置相同。两个序列之间的百分比相同性是序列所共享的相同位置数的函数(即，相同性％＝相同位置数/总位置(即重迭位置)数×100)。优选地，两个序列具有相同长度。
可在两个所比较序列的整个长度中或在两个序列的片段中进行序列比较。通常，在两个所比较序列的全长中进行比较。然而，序列相同性可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区域中进行。
本领域技术人员应知晓，实际上，可利用若干不同计算机程序来测定两个序列之间的同源性。举例而言，两个序列之间的序列比较及百分比相同性的测定可使用数学算法来达成。在一优选实施方案中，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(其已掺入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的GAP程序中)、使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个氨基酸或核酸序列之间的百分比相同性。本领域技术人员应了解，所有这些不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时两个序列的整体百分比相同性并不显著改变。
可进一步使用本发明的蛋白质序列及核酸序列作为“询问序列”来进行公共数据库的检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程序(2.0版)进行这些检索。可使用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所描述来利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程序时，可使用各程序(例如BLASTP及BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的主页。EHV-1及EHV-4/重组载体技术定义
术语“马科动物(equid)”或“马的(equine)”或“马(equin)”意指马科(familyEquidae)或属于马科，其包含马、驴及斑马，优选马。另外，术语“马科动物”或“马的”或“马”也涵盖马科的杂种(例如骡子、駃騠等)。
“疱疹病毒”或“疱疹病毒载体”是指疱疹病毒目的疱疹病毒科中的物种。
术语“马疱疹病毒载体”或“马疱疹病毒”或“EHV”意指影响马的疱疹病毒科的成员。迄今为止，已经鉴别了八种不同物种的马疱疹病毒，其中五种属于甲型疱疹病毒亚科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三种属于丙型疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp VirusTaxonomy:2015年发布，EC 47,London,UK，2015年7月；Email ratification 2016(MSL#30)。
术语“EHV-1”意指马α疱疹病毒1，其是疱疹病毒科的甲型疱疹病毒亚科属中的水痘病毒属亚属的成员。EHV-1的非限制性参考序列是(例如)野生型EHV-1毒株ab4(Genbank登录号AY665713.1)或RacH(Hübert 1996)。
术语EHV-4意指马α疱疹病毒4，其是疱疹病毒科的甲型疱疹病毒亚科属中的水痘病毒属亚属的成员。
术语“插入ORF70中”是指，在编码马α疱疹病毒1开放阅读框70的位置处将DNA片段插入基因组DNA中。在本发明的具体方面，所述插入导致ORF70的801个5’碱基对被缺失，3’端剩下的423bp保持完整，但使ORF70基因产物糖蛋白G的表达消失。已证明包括EHV-1在内的几种α疱疹病毒的糖蛋白G从感染的细胞中分泌出来，并通过结合促炎细胞因子起免疫调节蛋白的作用。与具有完整糖蛋白G表达的野生型EHV-1相比，取消其在病毒载体中的表达应会提高病毒感染的免疫原性。
术语“插入UL43中”是指，在编码马α疱疹病毒1开放阅读框UL43(ORF17)的位置处将DNA片段插入基因组DNA中。在本发明的一个具体方面，所述插入导致UL43的870个5′碱基对缺失，3′端剩下的336bp保持完整，但使UL43基因产物pUL43的表达消失。EHV-1的pUL43通过干扰MHC-I呈递与pUL56一起起免疫调节蛋白的作用。
术语“插入ORF1/3中”是指，将DNA片段插入病毒基因组中的位置，所述位置是在疫苗株EHV-1RacH的减毒过程中由于传代的意外缺失而导致的包含90％ORF1和全部ORF2的1283bp片段的丧失。选择该插入位点是因为预期从该位置表达转基因会干扰病毒复制的可能性极低。
疫苗定义
“免疫原性或免疫学组合物”是指包含至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物，其在细胞的宿主中引起对该组合物的免疫学应答，或引起对该组合物的抗体介导的免疫应答。
本文所用的术语“抗原”在本领域中是熟知的，并且包括免疫原性物质(即，免疫原)以及诱导免疫无应答性或无反应性(即，人体的防御机制对外来物质缺乏反应)物质。如本文所使用的，术语“抗原”旨在表示含有或包含表位的全长蛋白及其肽片段。
术语“产食动物”是指用于人类消费的动物，例如，猪、牛、家禽、鱼等，优选地，产食动物是指猪和牛，最优选为猪。
本文所用的“免疫原性组合物”可指多肽或蛋白质，例如引发如本文所描述的免疫学应答的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式，其包含一或多个表位且由此引发本文所描述的免疫学应答。一般而言，所述截短和/或取代的形式或片段将包括来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。所述片段可使用任何数量的本领域熟知的表位定位技术来鉴别。例如参见Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可通过在固体支持物上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)且使肽与抗体反应同时肽仍附接至支持物来测定。这些技术是本领域已知且描述的，例如参见美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，诸如通过(例如)x射线结晶学及二维核磁共振通过测定氨基酸的空间构象来容易地鉴别构象表位。参见Epitope Mapping Protocols(见上文)。该定义内也包含合成抗原，例如多表位、侧翼表位及其他重组或合成源抗原。例如参见Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人，(1998)12thWorld AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教导及内容皆以引用方式并入本文中。)
术语“免疫”涉及通过向待免疫的产食动物施用免疫原性组合物，由此引起针对该免疫原性组合物中所包含的抗原的免疫学反应的主动免疫。
本文所用的术语“有需要(in need或of need)”意指，施用/治疗与加强或改良健康或临床体征或对于接受根据本发明的免疫原性组合物的动物的健康的任何其他阳性医学作用有关。
本文所用的术语“疫苗”是指包括至少一种在动物中诱导免疫学应答的免疫活性组分且可能但不一定包括一或多种增强活性组分的免疫学活性的额外组分的药物组合物。疫苗可另外包括药物组合物的其他典型组分。通过区别，疫苗的免疫学活性组分可包括是其原始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰的活疫苗(MLV)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓死疫苗(KV)中灭活的颗粒。在另一形式中，疫苗的免疫学活性组分可包括生物体的适当元件(亚单位疫苗)，其中这些元件通过以下方式生成：通过破坏整个颗粒或含有这些颗粒的生长培养物及任选随后的纯化步骤以产生(一种或多种)期望结构，或通过合成方法，包含使用基于(例如)细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的合适的系统的适当处理加上任选随后的分离及纯化程序，或通过使用合适的药物组合物直接掺入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸疫苗接种)。疫苗可包括一种或同时多于一种的上述元件。如在本发明的具体方面中所使用，“疫苗”是指活疫苗或活病毒，也称为重组疫苗。在本发明的另一具体方面中，“疫苗”是指包含病毒样颗粒(VLP)的灭活或死病毒。因此，疫苗可为亚单位疫苗或死(KV)或灭活疫苗。
术语“感染复数(M.O.I.)”描述了每个细胞使用多少个病毒制备物的感染单位(例如TCID50)来感染培养的细胞。例如，0.01的M.O.I.意味着，培养容器中每100个细胞接种一个感染单位。
术语“DNA疫苗接种”或“多核苷酸疫苗接种”意指使用合适的药物组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为本领域已知。术语“灭活”是指先前有毒力或无毒力的病毒或细菌经辐照(紫外线(UV)、X射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理使该病毒或细菌灭活或杀死该病毒或细菌，同时保留其免疫原性。合适的灭活剂包含β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇防止灭活过程中的降解或交叉反应。一实施方案使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来使病毒或细菌灭活。至关重要的是，调节福尔马林的量以确保材料灭活，但不会多至发生高剂量的副作用。
更特别地，在病毒的上下文中，术语“灭活”分别是指该病毒不能在体内或体外复制，并且在细菌的上下文中，术语“灭活”分别是指该细菌不能在体内或体外繁殖。例如，术语“灭活”可以指已经在体外繁殖并且然后已经使用化学或物理手段灭活的病毒，从而使其不再能够复制。在另一个实例中，术语“灭活”可以指已经繁殖的细菌，然后使用化学或物理手段使其灭活，从而导致细菌、细菌的片段或组分的悬浮液，例如导致可用作疫苗的成分的细菌。
如本文中所使用，术语“灭活”、“杀死”或“KV”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包括活生物体或复制胜任病毒或病毒载体的疫苗。
“药物组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理学(例如免疫学)功能的成分组成。该术语包含(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于处理性状、不孕性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如口服、鼻内、静脉内、肌内、皮下、真皮内或其他合适的途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或受控释放性质)的其他成分。该药物组合物的一个非限制性实例(仅仅是用于说明目的给出)可如下所述来制备：将感染的细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在疫苗接种之前，然后将混合物在水溶液(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文中所使用，“药药上或兽医学上可接受的载剂”包含任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。在一些优选实施方案及尤其包含冻干的免疫原性组合物的那些中，用于本发明的稳定剂包含用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。具体而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(具体而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，具体而言异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂，具体而言是以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其任选经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具体而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory andPractical Application of Adjuvants(Stewart-Tull编辑，D.E.S.),JohnWiley andSons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上描述的SPT乳液及同一本书第183页上描述的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参照美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的所述丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯的不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基，例如甲基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选是使用971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其是共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐与乙烯的共聚物。所述聚合物在水中的溶解产生酸溶液，其将被中和、优选地中和至生理pH以产生将被掺入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
其他合适的佐剂尤其包含(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽或其天然存在或重组细胞因子或其类似物或内源细胞因子释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选地以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选地以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选地以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量及最优选地以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可尤其包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离”意指自其天然状态“由人手”改变，即若其在自然界中存在，则其已经改变或自其初始环境中取出，或两者兼而有之。举例而言，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但自其天然状态的共存物质分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒力。在本发明中，“减毒”与“无毒”同义。在本发明中，减毒病毒是毒力已降低从而不会引起感染的临床体征但能够在靶哺乳动物中诱导免疫应答，但也可意指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比，在感染减毒病毒、尤其所要求保护的EHV-1RacH病毒载体的动物中临床体征的发生率或严重性有所降低。在此上下文中，术语“减小(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比减小至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、仍更优选地60％、甚至更优选地70％、仍更优选地80％、甚至更优选地90％及最优选地100％。因此，减毒的无毒病原体(例如所要求保护的减毒的病毒载体、尤其是所要求保护的EHV-1(优选地RacH)病毒载体)适于产生经修饰的活疫苗(MLV)或经修饰的活免疫原性组合物。
术语“治疗和/或预防”是指减小畜群中感染(具体而言是猪甲型流感病毒感染)的发生率或减小由特定感染(具体而言是猪甲型流感病毒感染)引起或与其有关的临床体征的严重性。因此，术语“治疗和/或预防”也是指与尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物的动物的动物群相比，在已接受有效量的所述免疫原性组合物的动物的动物群中，减小畜群中感染病原体(具体而言是猪甲型流感病毒)的动物数量(＝减小特定猪甲型流感病毒感染的发生率)或减小通常与感染(具体而言是猪甲型流感病毒感染)有关或由其引起的临床体征的严重性。
“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用给需要该治疗/预防或可自该治疗/预防受益的动物或动物畜群。术语“治疗”是指在动物或畜群的至少一些动物已感染该病原体(具体而言是猪甲型流感病毒)且其中这些动物已展示一些由该病原体感染(具体而言是猪甲型流感病毒)引起或与其相关的临床体征后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在该动物感染任何病原体(具体而言是猪甲型流感病毒)或至少该动物或动物群中动物均不展示任何由该病原体(具体而言是猪甲型流感病毒)感染引起或与其相关的临床体征之前，施用给动物。术语“预防(prophylaxis及preventing)”在本申请可互换使用。
本文所用的术语“临床体征”是指感染病原体(具体而言是猪甲型流感病毒)的动物的体征。感染的临床体征取决于所选病原体。该临床体征的实例包含(但不限于)呼吸窘迫、耳炎、被毛粗乱、微热、抑郁症及食欲减小。然而，临床体征也包含(但不限于)可自活动物直接观察到的临床体征。可自活动物直接观察到的临床体征的实例包含流鼻涕与眼泪、嗜睡、咳嗽、哮鸣、重击、高热、体重减少、失水、跛行、消瘦、皮肤苍白、羸弱等。
在本文中，“有效剂量”意指(但不限于)引发或能够引发免疫应答的抗原的量，其在施用抗原的动物中减轻临床症状。
如本文中所使用，术语“有效量”在组合物的背景中意指能够诱导免疫应答的免疫原性组合物的量，其降低动物的疾病的感染或发生的发生率或其严重性。特别地，有效量是指每剂量的群落形成单位(CFU)。或者，在疗法的背景中，术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重性或持续时间、防止疾病或病症进展、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或进展，或增强或改良另一疗法的预防或治疗剂的预防或治疗的疗法的量。
“免疫应答”或“免疫学应答”意指(但不限于)对感兴趣的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫或免疫学应答包含(但不限于)以下作用中的一或多者：产生或活化特异性针对感兴趣的组合物中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将展示治疗性或保护性免疫(记忆)应答，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重性的降低或缺乏与病原体感染相关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷的降低和/或病毒分泌的降低来展现。
“抵抗疾病”、“保护性免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状减轻”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似短语意指通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或状况的部分或完全应答，其导致比已暴露于疾病或感染的未经免疫对象所预计的较不有害的作用。即，在疫苗接种的对象中，感染的有害作用的严重性减轻。在疫苗接种的对象中，感染可被减轻、减缓或可能完全预防。在本文中，若意指完全预防感染，则对其进行具体陈述。若未陈述完全预防，则该术语包含部分预防。
在本文中，“临床体征的发生率和/或严重性的降低”或“临床症状减轻”意指(但不限于)与野生型感染相比，减少组中感染对象的数量、减少或消除展现感染的临床体征的对象的数量，或降低一或多个对象中存在的任何临床体征的严重性。举例而言，其应是指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾的症状的任何临床体征减少。优选地，与未接受组合物且被感染的对象相比，接受本发明的治疗性组合物的一或多个对象的这些临床体征减少至少10％。更优选地，接受本发明的组合物的动物的临床体征减少至少20％、优选地至少30％、更优选地至少40％及甚至更优选地至少50％。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未疫苗接种的对象对照组，经疫苗接种的对象组的一或多种与由传染原感染有关的临床症状在统计学上显著减少。术语“临床症状的统计学显著减少”意指(但不限于)经疫苗接种的对象组的至少一种临床症状的发生率频率比在传染原攻毒后未疫苗接种的对照组低至少10％、优选地20％、更优选地30％、甚至更优选地50％及甚至更优选地70％。
“持久保护”是指持续至少3周，但更优选为至少3个月，还更优选为至少6个月的“改善功效”。对于牲畜而言，最优选的是，持久保护应持续到动物可以出栏售肉的平均年龄。
术语由病毒诱导的“病毒血症的减少”是指但不限于，减少进入动物血流的病毒，其中，接受本发明组合物的动物血清中的病毒血症水平(即，每毫升血清的病毒DNA或RNA拷贝数，或每分升血清中噬斑形成群落数量)与未接受该组合物并且可能感染的动物相比，降低了至少50％。更优选地，在接受本发明组合物的动物中病毒血症水平降低至少90％，优选降低至少99.9％，更优选降低至少99.99％，甚至更优选降低至少99.999％。
术语“病原体”是本领域技术人员熟知的。但术语“病原体”包含细菌和病毒。术语“病原体”包含病原体诸如Schmallenberg病毒、甲型流感病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus)、猪环状病毒(PorcineCircovirus)、古典猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus)、非洲猪瘟病毒(AfricanSwine Fever Virus)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus)、牛病毒性腹泻病毒(BovineViral Diarrhea Virus)、狂犬病病毒(Rabies Virus)、Feline Morbillivirus、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)。
术语“产食动物”是指用于人类消费的动物，例如，猪、牛、家禽、鱼等，优选猪。
如本文所用，属于“病毒血症”尤其被理解为病毒颗粒在动物(特别是哺乳动物、鸟或昆虫)的血流中复制和/或循环的状况。
“安全性”是指在疫苗接种后，在经疫苗接种的动物中不存在不良后果，包含(但不限于)：潜在的基于病毒疫苗的毒力返强、临床上显著的副作用，例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的炎症。
本文所用的术语“疫苗接种(vaccination或vaccinating)”或其变化形式意指(但不限于)包含施用本发明的免疫原性组合物的过程，在施用给动物时，其引发或能够引发(直接或间接)所述动物的免疫应答。
在本发明的上下文中，“死亡率”是指由感染引起的死亡，且包含感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
制剂
施用该组合物的对象优选动物，包括但不限于，牛、马、绵羊、猪、家禽(例如，鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠，最优选地，该哺乳动物是猪。
本发明的制剂包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。制剂应适用于施用方式。
免疫原性组合物(若需要)也可含有极少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂。口服制剂可包含标准载剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
治疗方法
优选施用途径包含(但不限于)鼻内、口服、真皮内及肌内。期望在饮用水中、最优选以单一剂量施用。本领域技术人员将认识到，本发明组合物也可以一、两或更多剂量通过其他施用途径来施用。举例而言，所述其他途径包含皮下、皮内、腹膜内、皮内，且根据治疗的期望持续时间及有效性，根据本发明的组合物可以(例如)每日计一次或若干次、也可间歇地，以不同剂量(例如约1×103至1×108TCID50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的一具体方面中，剂量约为1×103至1×108TCID50。
如果需要，则可以将该组合物存在于可包含一种或多种含有活性成分的单位剂型的包装或分配装置中。该包装可例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。该包装或分配装置可附有优选用于哺乳动物(尤其是猪)的施用说明。此类容器还附有政府机构出示的通告，其中规范了药品或生物制品生产、使用或销售的相关事宜，这份通告反映了政府机构对人施用的制造、使用、或销售的批准。
抗原定义
本领域技术人员已知术语“猪流感病毒”。术语猪流感病毒是指来自引起猪流感的正粘液病毒科(orthomyxovirus)的A型或C型流感病毒。尽管正粘液病毒科具有三组：A型、B型及C型，但仅A型及C型流感病毒感染猪。优选地，猪流感病毒是猪甲型流感病毒。猪流感病毒的亚型包含H1N1、H1N2、H3N2及H3N1。H9N2及H5N1也可发现于猪中。优选地，猪流感病毒是自猪分离的流感病毒。
本领域技术人员已知术语“HA”或“H”、“NA”或“N”及“NP”。然而，一般而言，A型流感病毒细分成17H(血凝素)及10N(神经氨酸酶)亚型，其可产生许多可能组合(指定为H1N1、H1N2……、H2N1、H2N2……、H5N1、H5N2……等)。H(血凝素)及N(神经氨酸酶)是甲型流感病毒(例如SIAV)中的表面糖蛋白。另外，N是中和抗体的主要抗原性靶。另外，NP(核蛋白)形成核衣壳。
DIVA定义
术语“DIVA(区分感染的动物与疫苗接种的动物)“是指可使用疫苗来区分疫苗接种的动物与天然感染的动物。
术语“样品”是指体液样品、经分开细胞样品或来自组织或器官的样品。可通过熟知技术来获得体液样品且优选地包含血液、血浆、血清或尿的样品，更优选地血液、血浆或血清的样品。可通过(例如活检)自任何组织或器官获得组织或器官样品。可通过分开技术(例如离心或细胞分选)自体液或组织或器官来获得经分开细胞。
术语“获得”可包括本领域技术人员已知的分离和/或纯化步骤，优选地使用沉淀、柱等。
术语“免疫测试”及“基因组分析测试”是区分使用根据本发明的免疫原性组合物疫苗接种的动物与感染天然存在(疾病相关)的猪流感病毒的动物的基础。免疫测试的实例包含任何酶-免疫学或免疫化学检测方法，例如ELISA(酶联吸附分析)、EIA(酶免疫分析)、RIA(放射免疫分析)、夹心式酶免疫测试、荧光抗体测试(FAT)、电化学发光夹心式免疫分析(ECLIA)、解离增强的镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)或固相免疫测试、免疫荧光测试(IFT)、免疫组织学染色、蛋白质免疫印迹分析或本领域技术人员可获得的任何其他合适的方法。取决于所用分析，可通过酶、荧光团或放射性同位素标记抗原或抗体。例如参见Coligan等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons Inc.,New York,N.Y.(1994)；及Frye等人，Oncogen 4:1153-1157,1987。
术语“基因组分析测试”是指基于以下的基因组分析方法：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时PCR(r-PCR)或实时逆转录PCR(rRT-PCR)、Templex-PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)及使用聚合酶及特异性寡核苷酸作为引物的等温扩增方法。上文所提及的扩增方法在本领域已熟知。
条款
本文描述了以下条款：
本发明提供了以下条款：
1.一种表达盒，其包含：
(i)至少一个外源感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
(ii)至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:26及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
(iii)至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:27及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
2.一种包含条款1所述的表达盒的马α疱疹病毒(EHV)载体。
3.一种马α疱疹病毒(EHV)载体，其包含：
(i)至少一个外源感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，其中所述感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，可操作地连接启动子序列，以及
(ii)至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:26及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，以及
(iii)至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列，SEQ IDNO:27及其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
4.一种马α疱疹病毒(EHV)载体，其包含插入UL43的感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列。
5.一种马α疱疹病毒(EHV)载体，其包含插入UL43的第一感兴趣的核苷酸序列或基因，优选抗原编码序列；以及插入第二插入位点(优选UL56或US4)的第二感兴趣的核苷酸序列或基因，优选为另一个抗原编码序列。
6.根据条款2至5中任一项所述的EHV载体，其中该插入UL43中的特征在于UL43中的部分缺失、截短、取代、修饰等，其中UL44保持功能性。
7.根据条款2至6中任一项所述的EHV载体，其中该插入UL43中的特征在于RacH的UL43内约870bp部分(SEQ ID NO:21)或其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列的缺失。
8.根据条款2至7中任一项所述的EHV载体，其中该EHV载体包含至少一个侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27，以及这些序列中任一序列的70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同的序列。
9.根据条款2至8中任一项所述的EH载体，其中该EHV载体包含(i)至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:26；以及(ii)至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27。
10.根据条款2至9中任一项所述的EHV载体或条款1所述的表达盒，其中所述感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，是天然存在的或重组的。
11.根据条款2至10中任一项所述的EHV载体或条款1或10所述的表达盒，其中所述感兴趣的核苷酸序列是重组的和/或异源的和/或外源的。
12.根据条款2至11中任一项所述的EHV载体或条款1或10至11中任一项所述的表达盒，其中所述抗原编码序列涉及一种感染动物的病原体，所述动物例如产食动物(例如猪、家禽或牛)或伴侣动物(例如猫、狗或马)。
13.根据条款2至12中任一项所述的EHV载体或条款1或10至12中任一项所述的表达盒，其还包含其它调节序列，例如终止信号或多聚腺苷酸化序列。
14.根据条款2至13中任一项所述的EHV载体，其还包含可操作地插入另一插入位点例如UL56和/或US4的至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列。
15.根据条款2至14中任一项所述的EHV载体，其中该至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入UL56中。
16.根据条款2至15中任一项所述的EHV载体，其中该至少一个其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入US4中。
17.根据条款2至14中任一项所述的EHV载体，其中第二其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入US4中，并且其中第三其它感兴趣的核苷酸序列，优选另一个感兴趣的基因，更优选抗原编码序列，插入UL56中。
18.根据条款2至17中任一项所述的EHV载体，其中该感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选启动子序列或根据条款5至17所述的EHV载体，其中该至少两个感兴趣的基因可操作地连接调节序列，优选启动子序列。
19.根据条款2至18中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13中任一项所述的表达盒，其中可操作地连接一个或两个或更多个感兴趣的序列或基因的(一个或多个)启动子序列选自：SV40大T、HCMV和MCMV立即早期基因1、人延长因子α启动子、杆状病毒多角体启动子、4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段，优选地，所述功能片段是p430(SEQ ID NO:3)、4pgG600(SEQ ID NO:1)的互补核苷酸序列的功能片段、4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段，优选地，所述功能片段是p455(SEQ ID NO:4)、4pMCP600(SEQ ID NO:2)的互补核苷酸序列的功能片段，或p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或其互补核苷酸序列。
20.根据条款2至19中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13或19中任一项所述的表达盒，其中可操作地连接至少一个感兴趣的基因的启动子序列是p422(SEQ ID NO:5)或其功能片段或其互补核苷酸序列。
21.根据条款5至20中任一项所述的EHV载体，其中可操作地连接至少两个感兴趣的基因的启动子序列是不同的。
22.根据条款2至21中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13或19至20中任一项所述的表达盒，其中该EHV载体或表达盒是重组的。
23.根据条款2至22中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13或19至20或22中任一项所述的表达盒，其中所述感兴趣的序列或外源核苷酸序列或感兴趣的基因是抗原编码序列。
24.根据条款2至23中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13或19至20或22至23中任一项所述的表达盒，其中该抗原编码序列来自选自以下列表的病原体：Schmallenberg病毒、甲型流感病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪环状病毒、古典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、戊型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、狂犬病病毒、Feline Morbillivirus、破伤风梭菌、结核分枝杆菌、胸膜炎肺炎放线杆菌。
25.根据条款2至24中任一项所述的EHV载体或条款1或10至13或19至20或22至24中任一项所述的表达盒，其中该抗原编码序列是血凝素编码序列。
26.根据条款25所述的EHV载体或表达盒，其中该血凝素流感抗原编码序列来自猪甲型流感病毒。
27.根据条款25或26所述的EHV载体或表达盒，其中该外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且该血凝素流感亚型选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17和H18。
28.根据条款25至27中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中该外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感抗原编码序列选自以下毒株：A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、A/swine/Gent/132/2005(H1N1)、A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)、A/swine/Italy/259543/2003(H1N2)、A/swine/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/swine/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/swine/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/swine/Italy/13962/95(H3N2)、A/swine/Cotes d’Armor/1121/00(H1N1)、A/Swine/Colorado/1/77、A/Swine/Colorado/23619/99、A/Swine/Cote d’Armor/3633/84、A/Swine/England/195852/92、A/Swine/Finistere/2899/82、A/Swine/Hong Kong/10/98、A/Swine/Hong Kong/9/98、A/Swine/Hong Kong/81/78、A/Swine/Illinois/100084/01、A/Swine/Illinois/100085A/01、A/Swine/Illinois/21587/99、A/Swine/Indiana/1726/88、A/Swine/Indiana/9K035/99、A/Swine/Indiana/P12439/00、A/Swine/Iowa/30、A/Swine/Iowa/15/30、A/Swine/Iowa/533/99、A/Swine/Iowa/569/99、A/Swine/Iowa/3421/90、A/Swine/Iowa/8548-1/98、A/Swine/Iowa/930/01、A/Swine/Iowa/17672/88、A/Swine/Italy/1513-1/98、A/Swine/Italy/1523/98、A/Swine/Korea/CY02/02、A/Swine/Minnesota/55551/00、A/Swine/Minnesota/593/99、A/Swine/Minnesota/9088-2/98、A/Swine/Nebraska/1/92、A/Swine/Nebraska/209/98、A/Swine/Netherlands/12/85、A/Swine/NorthCarolina/16497/99、A/Swine/North Carolina/35922/98、A/Swine/North Carolina/93523/01、A/Swine/North Carolina/98225/01、A/Swine/Oedenrode/7C/96、A/Swine/Ohio/891/01、A/Swine/Oklahoma/18717/99、A/Swine/Oklahoma/18089/99、A/Swine/Ontario/01911-1/99、A/Swine/Ontario/01911-2/99、A/Swine/Ontario/41848/97、A/Swine/Ontario/97、A/Swine/Quebec/192/81、A/Swine/Quebec/192/91、A/Swine/Quebec/5393/91、A/Swine/Taiwan/7310/70、A/Swine/Tennessee/24/77、A/Swine/Texas/4199-2/98、A/Swine/Wisconsin/125/97、A/Swine/Wisconsin/136/97、A/Swine/Wisconsin/163/97、A/Swine/Wisconsin/164/97、A/Swine/Wisconsin/166/97、A/Swine/Wisconsin/168/97、A/Swine/Wisconsin/235/97、A/Swine/Wisconsin/238/97、A/Swine/Wisconsin/457/985、A/Swine/Wisconsin/458/98、A/Swine/Wisconsin/464/98和A/Swine/Wisconsin/14094/99。
29.根据条款25至28中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中该外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且血凝素流感抗原编码序列选自以下毒株：A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、A/swine/Gent/132/2005(H1N1)和A/swine/Italy/4675/2003(H1N2)。
30.根据条款25至29中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中该外源抗原编码序列是血凝素编码序列，并且该血凝素流感亚型是H1和/或H3。
31.根据条款25至30中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中该抗原编码序列是血凝素编码序列，并且该血凝素流感抗原编码序列包含编码与SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
32.根据条款25至31中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中该EHV载体或该表达盒不包含NP(核蛋白)或N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列。
33.根据条款25至32中任一项所述的EHV载体或表达盒，其中启动子序列p422(SEQID NO:5)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接编码与SEQ IDNO:44(H1pdm)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
34.根据条款2至33中任一项所述的EHV载体，其中该EHV载体包含两个或更多个血凝素流感抗原编码序列。
35.根据条款34所述的EHV载体，其中该另一个血凝素流感抗原编码序列是编码与SEQ ID NO:46(H1av)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
36.根据条款35所述的EHV载体，其中所述另一个血凝素流感抗原编码序列插入UL56中。
37.根据条款35或36所述的EHV载体，其中条款35的血凝素流感抗原编码序列可操作地连接启动子序列p430(SEQ ID NO:3)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列。
38.根据条款34至37中任一项所述的EHV载体，其中该另一个血凝素流感抗原编码序列是编码与SEQ ID NO:45(H3)所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
39.根据条款38所述的EHV载体，其中所述另一个血凝素流感抗原编码序列插入US4中。
40.根据条款38或39所述的EHV载体，其中条款38的血凝素流感抗原编码序列可操作地连接启动子序列p455(SEQ ID NO:4)或其功能片段或其功能衍生物或其互补核苷酸序列。
41.根据条款2至40中任一项所述的EHV载体，其中该EHV载体选自EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9。
42.根据条款2至41中任一项所述的EHV载体，其中该EHV载体是EHV-1或EHV-4。
43.根据条款2至42中任一项所述的EHV载体，其中该EHV载体是EHV-1，优选为RacH。
44.一种哺乳动物宿主细胞，其特征在于其包含根据条款2至43所述的载体。
45.根据条款2至43中任一项所述的载体或根据条款44所述的哺乳动物宿主细胞用于制备免疫原性组合物或疫苗的用途。
46.一种免疫原性组合物，其包含：
a.根据条款2至43所述的载体，和/或
b.由根据条款2至43所述的载体表达的多肽，例如病毒、经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，以及
c.任选地药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，优选地，所述载剂适于口服、皮内、肌内或鼻内施用，
优选地，所述免疫原性组合物包含病毒，例如感染性病毒。
47.一种疫苗或药物组合物，其包含：
a.根据条款2至43所述的载体，和/或
b.由根据条款2至43所述的载体表达的多肽，例如经修饰的活病毒、病毒样颗粒(VLP)等，以及
c.药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，优选地，所述载剂适于口服、皮内、肌内或鼻内施用，
任选地，所述疫苗还包含佐剂。
48.一种疫苗或DIVA疫苗，其包含根据条款2至43中任一项所述的一个或多个EHV载体。
49.一种用于制备用于降低与感染相关或由感染引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包括以下步骤：
a.用根据条款2至43所述的载体感染根据条款41所述的哺乳动物宿主细胞，
b.在合适的条件下培养该感染的细胞，
c.收集感染的细胞培养物，
d.任选地纯化步骤c)所收集的感染的细胞培养物，
任选地将所述收集的感染的细胞培养物与药学上可接受的载剂混合。
50.根据条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，其用于免疫动物的方法，其包括向所述动物施用所述免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
51.根据条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，其用于减少或预防有需要的动物中由病原体引起的临床体征的方法，其包括向该动物施用治疗有效量的所述免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
52.根据条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，其用于减少或预防有需要的动物中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，其包括向该动物施用治疗有效量的所述免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
53.一种用于免疫动物的方法，其包括向此动物施用条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
54.一种用于减少或预防有需要的动物中由病原体引起的临床体征的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
55.一种用于减少或预防有需要的动物中由猪流感病毒引起的临床体征的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的条款46至48中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
56.根据条款50至55中任一项所述的方法或用途，其中该动物是猪、仔猪或母猪、牛、马、狗或猫。
57.根据条款50至56中任一项所述的方法或用途，其中该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗施用一次。
58.根据条款50至57中任一项所述的方法或用途，其中在第一个六周龄内、在第一个二周龄内、在第一周龄内或在第一日龄内，向动物施用该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
59.根据条款50至58中任一项所述的方法或用途，其中该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗以两次剂量施用。
60.根据条款59所述的方法或用途，其中在动物第一周龄内施用该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗，在第二、第三或第四周龄内施用第二次该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗。
61.根据条款50至60中任一项所述的方法或用途，其中所述免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗肌内或鼻内施用。
62.根据条款50至61中任一项所述的方法或用途，其中该免疫原性组合物、疫苗或DIVA疫苗包含1x104至1x107TCID50的EHV载体。
63.根据条款50至62中任一项所述的方法或用途，其中与相同物种的未免疫的对照组的动物相比，所述方法导致选自以下的功效参数的改善：体重减轻、直肠温度降低、临床症状减轻、(中和)抗体诱导增加或其组合。
64.一种用于在动物中针对与病原体相关的疾病和/或减少或与病原体相关或由病原体引起的一种或多种临床体征的发生率或严重性对动物(优选产食动物诸如猪、家禽或牛或伴侣动物诸如猫、狗或马)进行疫苗接种的试剂盒，其包含：
a)能够给所述动物施用疫苗的分配装置，以及
b)根据条款46的免疫原性组合物、根据条款47的疫苗或根据条款48的DIVA疫苗，以及
c)任选地使用说明书。
65.一种启动子序列，其包含p422(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列或其功能片段或其互补核苷酸序列，其中所述启动子序列导致感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列的表达。
66.一种表达盒，其包含启动子序列p422(SEQ ID NO:5)或其互补核苷酸序列或功能片段及其互补核苷酸序列，
其中该启动子序列可操作地连接感兴趣的序列，优选感兴趣的基因例如抗原编码序列，更优选异源和/或外源感兴趣的序列、感兴趣的基因或感兴趣的抗原编码序列，
其中所述启动子序列导致感兴趣的核苷酸序列，优选感兴趣的基因，更优选抗原编码序列的表达，
其中所述启动子序列优选为异源启动子序列，更优选外源启动子序列。
67.一种载体，其包含条款65或66所述的启动子序列或表达盒。
68.根据条款65至67中任一项所述的启动子或表达盒或载体，其中该启动子序列的功能片段与p422的序列(SEQ ID NO:5)具有70％、80％、85％，优选90％、91％、92％、93％、94％，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的序列相同性和/或同源性。
69.根据条款65至68中任一项所述的启动子或表达盒或载体，其中所述启动子序列的功能片段的长度为100个核苷酸，优选125、150、175、200、225、250、275、300，325、350、375、400个核苷酸，最优选为410或420个核苷酸，或者其中该启动子序列的功能片段的长度在100至422个核苷酸、200至422个核苷酸、300到422个核苷酸或350至422个核苷酸之间。
70.根据条款66至69中任一项所述的表达盒或载体，其中该表达盒或该载体还包含多聚腺苷酸化序列，优选BGHpA、71pA(SEQ ID NO:6)或18pA(SEQ ID NO:7)。
71.根据条款66至70中任一项所述的表达盒或载体，其中所述表达盒或载体包含一个或多个其它调节序列，例如终止信号、多聚腺苷酸化信号或调节元件，例如，IRES和/或2a肽。
72.根据条款67至71中任一项所述的载体，其中所述载体是重组的和/或异源和/或外源的载体。
73.根据条款67至72中的任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体，优选选自疱疹病毒科(herpes viridae)，例如马α疱疹病毒1(EHV-1)、马α疱疹病毒4(EHV-4)和其它水痘病毒属如PrV(假性狂犬病病毒(Pseudorabies virus))和BHV-1(牛疱疹病毒1)、腺病毒科(Adenoviridae，AdV)例如CAdV(Canine Adenovirus)、腺相关病毒科(Adeno-associated viridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、慢病毒科(Lentiviridae)例如反转录病毒(Retroviruses)、以及痘病毒科(Poxviridae)。
74.根据条款67至73中任一项所述的载体，其中所述载体是疱疹病毒科(familyHerpesviridae)的成员，优选为甲型疱疹病毒亚科属(genus Alphaherpesvirinae)，更优选为水痘病毒属亚属(subgenus Varicellovirus)，最优选所述载体是马α疱疹病毒1(EHV-1)。序列概述:
在本发明中，详细说明并公开了以下序列：
启动子和polyA序列
(SEQ ID NO:1)600bp DNA片段4pgG600
(SEQ ID NO:2)600bp DNA片段4pMCP600：
(SEQ ID NO:3)特别地，对于4pgG，600bp的启动子被截短为430bp，新名称：p430
(SEQ ID NO:4)对于4pMCP，截短为449bp，新名称：p455
(SEQ ID NO:5)p422启动子的序列
(SEQ ID NO:6)71pA多聚腺苷酸化序列的序列
(SEQ ID NO:7)18pA多聚腺苷酸化序列的序列
插入区序列
(SEQ ID NO:8)RacH的US4(orf70)序列
(SEQ ID NO:9)Up70侧翼区(417bp)
(SEQ ID NO:10)Up71侧翼区(431bp)
(SEQ ID NO:11)127264–127680(侧翼区up orf70)
(SEQ ID NO:12)128484–128913(侧翼区up orf71)
(SEQ ID NO:13)Up70侧翼区(283bp)＝与417bp“经典”侧翼区的3’283bp相同
(SEQ ID NO:14)Up71侧翼区(144bp)＝与431bp“经典”侧翼区的5’144bp相同
(SEQ ID NO:15)wt毒株ab4 nt 127681-128916的US4(orf70)序列
(SEQ ID NO:16)野生型ab4(GenBank登录号：AY665713.1)基因组序列中orf70(US4)的缺失部分：nt 127681–128482
(SEQ ID NO:17)RacH基因组序列中orf70(US4)的缺失部分(无nt号，因为完整的基因组序列是未知的)
(SEQ ID NO:18)RacH的UL43的序列
(SEQ ID NO:19)上游重组区Up UL43的序列
(SEQ ID NO:20)下游重组区Up UL44的序列
(SEQ ID NO:21)RacH中UL43缺失部分的序列
(SEQ ID NO:22)RacH中UL43保留的3’端的序列
(SEQ ID NO:23)wt EHV-1V592中的UL43序列(nt 23021-24226反向互补)
(SEQ ID NO:24)wt EHV-1V592中UL43的缺失部分(870bp)(nt 23353-24226反向互补)
(SEQ ID NO:25)wt EHV-1V592中UL43阅读框的保留部分(nt 23021-23354反向互补)
(SEQ ID NO:26)wt EHV-1V592中相应上游重组区Up UL43的序列(nt 24227-24452反向互补)
(SEQ ID NO:27)wt EHV-1V592(nt 23049-23354反向互补)中对应的下游重组区Up UL44的序列
质粒序列
(SEQ ID NO:28)转移载体pU70-p455-71K71的核苷酸序列
(SEQ ID NO:29)转移质粒pU70-p455-H3-71K71的核苷酸序列
(SEQ ID NO:30)转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH的核苷酸序列
(SEQ ID NO:31)转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH的核苷酸序列
(SEQ ID NO:32)转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71的核苷酸序列
(SEQ ID NO:33)转移质粒pU1-3-p430-H1hu-BGHKBGH的核苷酸序列
(SEQ ID NO:34)转移载体pUUL43-p422-18K18的核苷酸序列
(SEQ ID NO:35)转移质粒pUUL43-p422-mC-18K18的核苷酸序列
(SEQ ID NO:36)转移质粒pUUL43-p422-H1pdm-18K18的核苷酸序列
(SEQ ID NO:37)转移质粒pUmC70的核苷酸序列
引物序列
对于orf70/US4插入区
(SEQ ID NO:38)正向引物AGGCTCGTGCGCGGATACATCG
(SEQ ID NO:39)反向引物TTCGGGGCTGTTAGACTCCTCC
对于orf1/3/UL56插入区
(SEQ ID NO:40)正向引物CCAACTCGCCGCCATGAGACCC
(SEQ ID NO:41)反向引物AGCGCGCCCCGTACCCAGTGGG
对于UL43插入区
(SEQ ID NO:42)正向引物CGACGCGCGTCGGAGG
(SEQ ID NO:43)反向引物CGACGCGCGTCGGAGG
甲型流感病毒血凝素的氨基酸序列
(SEQ ID NO:44)血凝素[甲型流感病毒(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2))]；GenBank：ADR01746.1 H1pdm
(SEQ ID NO:45)血凝素[甲型流感病毒(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))]；GenBank：ABS50302.2 H3
(SEQ ID NO:46)血凝素[甲型流感病毒(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))；GenBank：AFR76623.1 H1av
(SEQ ID NO:47)血凝素[甲型流感病毒(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2))]；GenBank：ADK98476.1*H1hu
附图说明
以下附图组成了本说明书的一部分，并且包括附图以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1.野生型(wt)EHV-1毒株ab4的UL56(orf1/3)区与减毒疫苗株EHV-1RacH的比较的示意图。
orf1、orf2、orf3＝EHV-1基因组中的前三个开放阅读框，orf1在其它α疱疹病毒中具有同源物，命名为UL56。
侧翼A、侧翼B＝用于将转基因表达盒插入orf1/3(UL56)位点的重组区(现有技术)
图2.US4(orf70)插入位点的示意图
UL＝独特长区段
US＝独特短区段
IR＝内部反向重复序列
TR＝末端反向重复序列
gG＝糖蛋白G
pA＝编码序列末端的多聚腺苷酸化序列
gpII＝糖蛋白II
orf＝开放阅读框
orf69、orf70、orf71＝US3、US4、US5(与orf70/US4插入位点相关的开放阅读框)
Δorf1/3＝orf1/3(UL56)插入位点(现有技术)
bp＝碱基对
图3.转移质粒pU-p455-H3-71K71的质粒图谱
H3＝编码甲型流感病毒血凝素H3的开放阅读框
71pA＝如本发明公开EM P2016-022所述的新polyA序列
I-SceI＝限制性核酸内切酶I-SceI的切割位点
启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
3’端ORF70＝插入位点下游重组区
ORI＝质粒复制起点
APr＝质粒的氨苄西林抗性基因
上游orf70＝插入位点上游重组区
p455＝新启动子p455
bp＝碱基对
图4.转移载体pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH的质粒图谱
H1av＝编码甲型流感病毒血凝素H1av的开放阅读框
BGHpA＝牛生长激素基因的polyA序列
I-SceI＝限制性核酸内切酶I-SceI的切割位点
启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
侧翼A＝插入位点上游重组区
ORI＝质粒复制起点
APr＝质粒的氨苄西林抗性基因
侧翼B＝插入位点下游重组区
p430＝新启动子p430
bp＝碱基对
图5.US4(orf70)插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3的基因组的示意图
orf69/US3：orf70(US4)中插入位点上游的开放阅读框编号69(US3)
p455：本文所述的新启动子
H3：转基因流感病毒血凝素
71pA：新多聚腺苷酸化序列
Δorf70(US4)：orf70(US4)的其余部分，包含orf71(US5)的启动子，其编码结构性病毒糖蛋白II(gpII)
bp＝碱基对
图6.UL56(orf1/3)插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av的基因组的示意图
p430：本文所述的新启动子
H1av：转基因流感病毒血凝素
BGHpA：牛生长激素多聚腺苷酸化序列
Δorf1/UL56：orf1(UL56)的其余部分
Orf3：EHV-1开放阅读框orf3(其它α-疱疹病毒科中无同源物)
bp＝碱基对
图7.两个插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(rEHV-1-RacH-SE B)的基因组的示意图
p430：本文所述的新启动子
H1av：转基因流感病毒血凝素
BGHpA：牛生长激素多聚腺苷酸化序列
Δorf1/UL56：orf1(UL56)的其余部分
Orf3：EHV-1开放阅读框orf3(其它α-疱疹病毒科中无同源物)
orf69/US3：orf70(US4)中插入位点上游的开放阅读框编号69(US3)
p455：本文所述的新启动子
H3：转基因流感病毒血凝素
71pA：新多聚腺苷酸化序列
Δorf70(US4)：orf70(US4)的其余部分，其包含orf71(US5)的启动子，其编码结构性病毒糖蛋白II(gpII)
bp＝碱基对
图8.转移质粒pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH的质粒图谱
p430：新启动子p430
H1hu＝编码甲型流感病毒血凝素H1hu的开放阅读框
BGHpA＝牛生长激素基因的polyA序列
I-SceI＝限制性核酸内切酶I-SceI的切割位点
启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
侧翼A＝插入位点上游重组区
ORI＝质粒复制起点
侧翼B＝插入位点下游重组区
I-Ceu＝归巢内切酶，用于释放片段以进行RED重组
bp＝碱基对
图9.转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71的质粒图谱
上游orf70＝插入位点上游的重组序列
p455＝本文所述的新启动子
H1pdm＝转基因流感病毒血凝素H1pdm
71pA＝新多聚腺苷酸化序列
3’端orf70＝插入位点下游的重组序列
启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
bp＝碱基对
ScaI、EcoRI、SalI、NotI、KpnI、BamHI、XbaI＝限制性核酸内切酶切割位点
图10.US4(orf70)插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-70-p455-H1pdm的基因组的示意图
orf69/US3＝orf70(US4)中插入位点上游的开放阅读框编号69(US3)
p455＝本文所述的新启动子
H1pdm＝转基因流感病毒血凝素H1pdm
71pA＝新多聚腺苷酸化序列
Δorf70(US4)：orf70(US4)的其余部分，其包含orf71(US5)的启动子，其编码结构性病毒糖蛋白II(gpII)
bp＝碱基对
图4.UL56(orf1/3)插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1h的基因组的示意图
p430＝本文所述的新启动子
H1hu＝转基因流感病毒血凝素H1hu
BGHpA＝牛生长激素多聚腺苷酸化序列
Δorf1/UL56＝orf1(UL56)的其余部分
Orf3＝EHV-1开放阅读框orf3(其它α-疱疹病毒科中无同源物)
bp＝碱基对
图12.插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm(病毒D)的基因组的示意图
p430＝本文所述的新启动子
H1hu＝转基因流感病毒血凝素H1hu
BGHpA＝牛生长激素多聚腺苷酸化序列
Δorf1/UL56＝orf1(UL56)的其余部分
Orf3＝EHV-1开放阅读框orf3(其它α-疱疹病毒科中无同源物)
orf69/US3＝orf70(US4)中插入位点上游的开放阅读框编号69(US3)
p455＝本文所述的新启动子
H1pdm＝转基因流感病毒血凝素H1pdm
71pA＝新多聚腺苷酸化序列
Δorf70(US4)：orf70(US4)的其余部分，其包含orf71(US5)的启动子，其编码结构性病毒糖蛋白II(gpII)
bp＝碱基对
图13.构建新的转基因插入位点UL43的示意图
插入位点中的UL44、UL43、UL42开放阅读框
18pA：新多聚腺苷酸化位点
422启动子：新p422启动子
bp：碱基对
图14.转移质粒pUUL43-422-mC-18K18的质粒图谱
UpUL43＝上游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
UpUL44＝下游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
422启动子＝驱动转基因表达的启动子
mC＝转基因(自体荧光蛋白mCherry)
18pA＝新多聚腺苷酸化序列
I-Sce1＝I-Sce1的切割位点
启动子aph＝驱动卡那霉素抗性基因表达的原核启动子
Kana＝卡那霉素抗性orf
P(BLA)＝驱动氨苄西林抗性基因表达的原核启动子
AP(R)＝氨苄西林抗性基因
ORI＝质粒复制起点
P(LAC)＝编码β-半乳糖苷酶的LacZ的原核启动子
I-Ceu＝归巢核酸内切酶I-Ceu的识别位点
图15.UL43插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-UL43-422-mC的基因组的示意图
UL＝EHV基因组的独特长区段
US＝EHV基因组的独特短区段
IRS和TRS＝框定独特短区段的内部和末端重复区
UL44、UL43、UL42＝插入位点中的开放阅读框
ΔUL43＝UL43的其余部分
18pA＝新多聚腺苷酸化位点
422启动子＝新p422启动子
bp＝碱基对
图16.转移质粒pUUL43-422-H1pdm-18K18的质粒图谱
UpUL43＝上游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
UpUL44＝下游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
422启动子＝驱动转基因表达的启动子
H1pdm＝转基因(甲型流感血凝素H1pdm)
18pA＝新多聚腺苷酸化序列
I-Sce1＝I-Sce1的切割位点
启动子aph＝驱动卡那霉素抗性基因表达的原核启动子
Kana＝卡那霉素抗性orf
P(BLA)＝驱动氨苄西林抗性基因表达的原核启动子
AP(R)＝氨苄西林抗性基因
ORI＝质粒复制起点
P(LAC)＝编码β-半乳糖苷酶的LacZ的原核启动子
I-Ceu＝归巢核酸内切酶I-Ceu的识别位点
图17.UL43插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-UL43-422-H1pd的基因组的示意图
UL＝EHV基因组的独特长区段
US＝EHV基因组的独特短区段
IRS和TRS＝框定独特短区段的内部和末端重复区
UL44、UL43、UL42＝插入位点中的开放阅读框
ΔUL43＝UL43的其余部分
18pA＝新多聚腺苷酸化位点
H1pdm＝转基因(甲型流感血凝素H1pdm)
p422＝新p422启动子
bp＝碱基对
图18.插入区扩大的rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av-UL43-422-H1pdm-70-p455-H3的基因组的示意图
Δorf1/UL56：UL56的其余部分(位于表达盒的边界)
p430：新启动子p430
BGHpA：牛生长激素多聚腺苷酸化序列
H1av、H3、H1pdm：转基因(甲型流感血凝素)
Δorf70/US4：US4的其余部分(位于表达盒的边界)
orf69(US3)和orf71(US5)：US4插入位点中的开放阅读框
71pA：新多聚腺苷酸化序列
UL44、UL43、UL42：UL43插入位点中的开放阅读框
18pA：新多聚腺苷酸化位点
p422：新p422启动子
bp：碱基对
图19.蛋白质免疫印迹
用四种不同的抗体孵育四份印记
a：用针对流感HA H1av的专用单克隆抗体孵育印迹
b：用对流感HA H3具有特异性的商购兔抗血清孵育印迹
c：用针对流感HA H1pdm的专用单克隆抗体孵育印迹
d：用针对EHV-1gpII的专用单克隆抗体孵育印迹
M＝分子量标记(kDa＝千道尔顿，250、150、100、75、50、37、25、20)
图20：小鼠血清甲型流感病毒中和试验的结果
根据小鼠血清的可用量，一式两份或一式三份进行病毒中和试验。中和效价标准化为100TCID50，并显示为相互中和能力。*误差条表示标准偏差
图21：转移质粒pUmC70的质粒图谱
3’端orf69＝转移载体中包含的orf69(US3)部分
up70＝插入位点上游重组序列
mCherry＝转基因(自体荧光蛋白mCherry)
BGHpA＝牛生长激素多聚腺苷酸化序列
up71＝插入位点下游重组序列
3’orf70＝插入物下游orf70(US4)的其余部分
bp＝碱基对
ScaI、EcoRI、SalI、NotI、KpnI、BamHI、XbaI＝限制性核酸内切酶切割位点
图22：转移载体pU70-p455-71K71的质粒图谱
Up70＝上游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
Up71＝下游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
4pMCP455＝驱动转基因表达的启动子
EHV-4orf71pApA：新多聚腺苷酸化序列71pA
I-Sce1＝I-Sce1的切割位点
启动子aph＝驱动卡那霉素抗性基因表达的原核启动子
Kana＝卡那霉素抗性orf
P(BLA)＝驱动氨苄西林抗性基因表达的原核启动子
AP(R)＝氨苄西林抗性基因
ORI＝质粒复制起点
P(LAC)＝编码β-半乳糖苷酶的LacZ的原核启动子
I-Ceu＝归巢核酸内切酶I-Ceu的识别位点
KpnI、NotI、XbaI＝限制性核酸内切酶切割位点
bp＝碱基对
图23：转移载体pU1/3-p430-BGHKBGH的质粒图谱
侧翼A＝上游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
侧翼B＝下游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
4pgG430＝驱动转基因表达的启动子
BGHpA＝牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列
I-Sce1＝I-Sce1的切割位点
启动子aph＝驱动卡那霉素抗性基因表达的原核启动子
Kana＝卡那霉素抗性orf
I-Ceu＝归巢核酸内切酶I-Ceu的识别位点
KpnI、NotI＝限制性核酸内切酶切割位点
bp＝碱基对
图24：转移质粒pUUL43-422-H1pdm-18K18的质粒图谱
UpUL43＝上游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
UpUL44＝下游插入位点侧翼的病毒基因组DNA序列
p422＝驱动转基因表达的启动子
18pA：新多聚腺苷酸化序列
I-Sce1＝I-Sce1的切割位点
启动子aph＝驱动卡那霉素抗性基因表达的原核启动子
Kana＝卡那霉素抗性orf
P(BLA)＝驱动氨苄西林抗性基因表达的原核启动子
AP(R)＝氨苄西林抗性基因
ORI＝质粒复制起点
P(LAC)＝编码β-半乳糖苷酶的LacZ的原核启动子
I-Ceu＝归巢核酸内切酶I-Ceu的识别位点
bp＝碱基对
实施例
包括以下的实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在随后的实施例中公开的技术表示本发明人发现可以用于实施本发明的技术，因此可被认为组成实施本发明的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍会获得相同或相似的结果。
实施例1:新插入位点ORF70/US4的建立
为了增强EHV-1载体的能力，本发明人试图找到一种从一个载体主链表达两个不同转基因而不通过RNA病毒衍生功能在一个启动子的控制下偶联两个转基因的方法。发明人假设，疱疹病毒基因组将允许并行使用两个独立的转基因插入位点。为了确定EHV-1ORF70/US4是否是合适的转基因插入位点，通过经典同源重组用编码自体荧光mCherry蛋白的表达盒替换了orf70/US4(1236bp)的5’端的801个碱基对(Shaner等，2004)。质粒pU-mC70-BGH的图谱在图21中示出(SEQUENCE ID NO:37)。用XbaI从pU-mC70-BGH中切除用于同源重组的DNA片段。将凝胶纯化的片段与EHV-1RacH的病毒基因组DNA共转染到RK13细胞中。通过实时荧光和病毒滴定(未示出)显示重组载体病毒的有效拯救和在培养细胞中的有效复制。缺失三分之二的orf70/US4的额外好处是，取消了由orf70/US4编码的糖蛋白G的表达。EHV-1的糖蛋白G显示是一种非结构性、分泌型趋化因子结合蛋白，抵消宿主的免疫应答(Drummer等，1998；Bryant等，2003)。由于载体疫苗旨在刺激被疫苗接种者的免疫应答，因此去除病毒载体的这种特定免疫抑制功能可能会进一步提高病毒载体平台EHV-1RacH-SE的性能。
实施例2:具有p455启动子的新ORF70/US4插入位点在重组EHV-1载体疫苗中的用途以及重组病毒的构建
p455启动子：
在第一个动物实验中，使用来自猪源甲型流感病毒(Influenza A virus)的血凝素流感(Influenza hemagglutinin)亚型H3(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)，GenBank登录号：ABS50302.2)。合成其编码序列，并将编码序列亚克隆到转移载体pU70-p455-71K71(SEQ ID NO:28)中，生成转移质粒pU70-p455-H3-71K71，将H3置于新p455启动子和新71pA多聚腺苷酸化信号的控制下，并用重组区框定表达盒以插入orf70(图3，SEQ ID NO:29)。
通过使用RED重组系统的en-passant诱变(Tischer等，2006)，将表达盒p455-H3-71插入pRacH-SE的orf70/US4中以产生pRacH-SE70-p455-H3。
用pRacH-SE70-p455-H3转染PK/WRL细胞，拯救重组病毒rEHV-1RacH-SE70-p455-H3(图5)并进行噬斑纯化两次。通过对插入区的高保真PCR产物进行测序，验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光测定法分析感染细胞中转基因的表达。
使用单克隆抗体Ai2G7(BI拥有的)通过IFA(未示出)和蛋白质免疫印迹(图19)确认了编码EHV-1gpII的orf71的恢复。通过使用鸡红细胞(chicken erythrozyte)进行血细胞吸附试验，而测定被感染细胞的质膜上出现的H3三聚体。在PK/WRL细胞中确定为TCID50/ml的峰效价与亲代病毒rEHV-1RacH-SE的效价在同一范围内，这表明转基因表达对病毒复制没有有害作用(未示出)。这一点可以通过在拯救后在PK/WRL细胞中传代rEHV-1RacH-SE70-p455-H3直到20代(P20)来确认。在P5、P10、P15和P20时，通过滴定、测序和蛋白质免疫印迹表征病毒，另外在P10和P20时通过IFA表征病毒，并且HA表达和HA编码插入物以及启动子和polyA序列的遗传稳定性得到确认。
通过使用单克隆抗H3抗体和马抗EHV抗血清对被P20感染的细胞中的病毒噬斑进行双重免疫荧光测定(dIFA)，证实了几乎所有的EHV-1诱导的噬斑也表达H3(未显示)。所有测试均证实了重组EHV-1RacH-SE-70-p455-H3的稳定性。
实施例3:新p430启动子在重组EHV-1载体疫苗中的用途和重组病毒的构建
p430启动子：
新鉴定的p430启动子用于驱动来自H1N1病毒的另一个血凝素流感((A/swine/Gent/132/2005(H1N1)，GenBank登录号：AFR76623.1)的表达。由于该病毒分离物中的血凝素基因源自鸟类(avian)IAV，因此将其称为H1av。合成H1av，并将其亚克隆到用于orf1/3/UL56插入区的转移载体pU1/3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)中，以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH(图4，SEQ ID NO:31)。H1av的表达置于p430启动子和牛生长激素(bovinegrowth hormone，BGH)polyA信号的控制下。
通过使用RED重组系统的en-passant诱变(Tischer等，2006)，将表达盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE的orf1/3/UL56中，以产生pRacH-SE1/3-p430-H1av。
用pRacH-SE1/3-p430-H1av转染PK/WRL细胞，拯救重组病毒rEHV-1RacH-SE1/3-p430-H1av(图6)并进行噬斑纯化两次。通过对插入区的高保真PCR产物进行测序，验证表达盒的正确插入。使用单克隆和多克隆抗体通过间接免疫荧光测定法(IFA)和蛋白质免疫印迹，分析被感染细胞中转基因的表达(图19)。通过抗体PA-34929特异性检测75kDa处的宽带迁移与根据其序列预测的重组HA糖蛋白的预期外观一致。
使用单克隆抗体Ai2G7(BI拥有的)通过IFA和蛋白质免疫印迹确认编码EHV-1gpII的orf71/US5的恢复(图19)。在PK/WRL细胞中确定为TCID50/ml的峰效价与亲代病毒RacH-SE的效价在同一范围内，这表明转基因表达对病毒复制没有有害作用(未示出)。
为了测试表达的重组血凝素是否按照预期进行加工和转运，使VERO细胞以m.o.i.为0.01感染rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE(亲代)或者保持未感染。24h p.i.将感染和未感染的活细胞与鸡红细胞(erythrocyte)的悬浮液一起在PBS中孵育，用PBS洗涤，并用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。由于鸟的红细胞含有细胞核，因此它们可以用Hoechst33342进行染色，并在荧光显微镜下显示为微小的蓝色斑点，与感染了不表达血凝素的rEHV-1RacH-SE的细胞相比，感染rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3的细胞上鸡红细胞的吸附显著增加(未示出)。由此可以得出结论，血凝素被翻译、加工并以某种方式转运到载体病毒感染的细胞的质膜上，就像它们是由真实的流感病毒感染产生的一样。
感染的细胞的血细胞吸附的清晰表型支持了蛋白质免疫印迹和免疫荧光测定的发现，示出转基因蛋白的有效表达，并表明EHV-1载体感染的细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
实施例4:新ORF70插入位点和ORF1/3(UL56)插入位点并行在重组EHV-1载体疫苗中的用途
为了显示两个新启动子可以并行使用，生成了表达两种不同的甲型流感病毒亚型的两种不同的血凝素的重组EHV-1RacH。
如图19所示，从感染的细胞的蛋白质免疫印迹可以明显地看出针对H3的多克隆商业抗体(PA5-34930)和针对H1av和H1pdm的专用单克隆抗体的特异性和缺少交叉反应性。相同的样品在四份SDS-PAGE中运行，并转移到尼龙膜上，然后与四种不同的抗体一起孵育。
合成编码甲型流感病毒(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))的血凝素的开放阅读框，并将其克隆到转移载体pU1-3-p430-BGHKBGH(SEQ ID NO:30)中，得到pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH(图4，SEQ ID NO:31)。从重组BAC pRacH-SE-70-p455-H3开始，通过两步RED重组将在pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH(图4，SEQ ID NO:31)中组装的表达盒p430-H1av-BGH插入orf1/3/UL56插入位点，以产生pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3转染PK/WRL细胞，并拯救重组病毒rEHV-1RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3(图7)并进行两次噬斑纯化。
该重组病毒的简称为rEHV-1RacH-SE_B。通过对插入区的高保真PCR产物与侧翼序列一起进行测序，验证了表达盒的正确插入。使用单克隆和多克隆抗体，通过间接免疫荧光测定法(IFA，未示出)和蛋白质免疫印迹，分析感染的细胞中转基因的表达(图19)。使用单克隆抗体Ai2G7(BI拥有的)通过IFA(未示出)和蛋白质免疫印迹(图19)，确认了编码EHV-1gpII的orf71/US5的恢复。
如图19所示，转基因H3和H1av在感染双插入重组rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3的细胞培养物中并行表达(B)。转基因表达稳定，并且不会损害在AI-STA1细胞(BI专用猪睾丸细胞系，表3)中直至传代11代的病毒效价。
两个新启动子p430和p455在细胞培养物中的rEHV1-RacH-SE复制背景下起作用。病毒复制周期中的活性水平似乎非常相似，这是根据对单个转基因具有特异性的蛋白质免疫印迹中可比较的信号强度推断得出的。这些特性允许创建基于EHV-1RacH或以相似效率并行表达两种不同抗原的其它载体平台的重组载体疫苗。如果疫苗靶由两种不同的病原体组成，则在两个插入位点应用这两个新启动子联合两个多聚腺苷酸化序列，可以显著降低商品成本，并且与仅表达一个抗原组分的载体相比代表了明显的优势。
实施例5:二价EHV-1载体化(vectored)的甲型流感病毒疫苗的产生、体外表征和体内测试
如下所述，在所描述的本发明中，衍生自H3N2和H1N1鸟猪IAV亚型/血清型的四种上述猪IAV血凝素(HA)抗原中的两种由一种重组EHV-1载体病毒表达。这种针对猪IAV的新型二价疫苗提供了DIVA功能，例如，通过在感染了猪IAV野毒株的动物中检测针对猪IAV蛋白NP或NA的抗体，而不是在仅疫苗接种了本文所述疫苗的动物中，因为其仅表达猪IAV HA蛋白。
该新型二价猪IAV疫苗在体外进行了表征，并在体内测试了其在小鼠中诱导甲型流感病毒中和抗体的能力。
为了测试表达的重组血凝素是否按照预期进行加工和转运，使VERO细胞以m.o.i.为0.01感染rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1RacH-SE(亲本)，或者保持未感染。24h p.i.将感染和未感染的活细胞与鸡红细胞的悬浮液一起在PBS中孵育，用PBS洗涤，并用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。由于鸟的红细胞含有细胞核，因此它们可以用Hoechst33342进行染色，并在荧光显微镜下显示为微小的蓝色斑点，与感染了不表达血凝素的rEHV-1RacH-SE的细胞相比，感染rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3的细胞上鸡红细胞的吸附显著增加(未示出)。由此可以得出结论，血凝素被翻译、加工并以某种方式转运到载体病毒感染的细胞的质膜上，就像它们是由真实的流感病毒复制产生的一样。感染的细胞的血细胞吸附的表型支持了蛋白质免疫印迹(图19)和免疫荧光测定(未示出)的发现，示出转基因蛋白的有效表达，并表明EHV-1载体感染的细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
具有两个插入位点和两个新启动子的增强型EHV-1载体示出并行表达两个流感病毒血凝素。通过IFA确定的亚细胞定位和通过蛋白质免疫印迹确定的在SDS-PAGE中的迁移(图19)对应于在文献中已知的在甲型流感病毒感染的细胞中表达的实际未切割的血凝素。
通过在细胞培养物中传代，每5代确定病毒效价，显示出重组rEHV-1的遗传和表型稳定性。每十代验证插入区的序列，以及通过蛋白质免疫印迹验证转基因表达(未示出)。表达保真度通过Metocel覆盖下的噬斑的双重IFA来评估，计数用抗EHV抗体和转基因特异性抗体染色的噬斑(未示出)。
实施例6:在疫苗接种了二价rEHV-1RacH载体疫苗的小鼠中诱导针对两种抗原的中和抗体应答。
使用rEHV-1RacH SE B(rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3，见图7)免疫Balb/c小鼠，以证明所表达的转基因在猪以外的其它物种中具有免疫原性，并且通过鼻内应用诱导针对两种抗原中的任一种的中和抗体。
详细地，三组每组五只Balb/c小鼠(3-5周龄)在研究的第0天和第21天，分别经鼻内接种40μl的rEHV-1RacH SE B(rEHV-1RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3，第1组)，或40μl的空载体(rEHV-1RacH-SE，第2组，载体对照)，或40μl的组织培养基(第3组，阴性对照)。对于第1组和第2组，感染性重组EHV-1的剂量分别为1x 10^5TCID50/40μl。在研究第0天(第1次接种之前)、第7天、第14天、第21天(第2次接种之前)、第28天和第35天对小鼠放血。从该血液样品制备血清，并在-80℃下冷冻保存。
免疫荧光测定法用于检测针对载体病毒的抗体
以感染复数(MOI)为0.001用从空载体BAC pRacH-SE1.2拯救的病毒rEHV-1RacH-SE1212感染AI-ST细胞。24小时p.i.观察到不同的噬斑，并对细胞进行处理，以进行间接免疫荧光测定(IFA)。测试了在PBS中以1:50稀释的所有三组的最终放血(第二次疫苗接种后14天获得)的血清。以1:500的稀释度使用来自EHV-1疫苗接种的马的血清作为阳性对照。二抗是用于小鼠血清的可商购的FITC偶联的兔抗小鼠IgG和用于马血清的Cy5偶联的山羊抗马IgG，并以1:200的稀释度使用。通过荧光显微镜评价抗体结合。所有疫苗接种的小鼠均产生了在IFA中与rEHV-1RacH-SE感染的细胞发生反应的抗体。未感染的细胞不被任何测试的血清结合。来自阴性对照组的小鼠的血清没有显示出与感染的细胞或未感染的细胞的任何特异性结合。数据总结于下表中。
表4.IFA的抗EHV-1抗体的荧光显微镜结果
由此可以得出结论，将rEHV-1接种到小鼠的鼻孔中导致感染和病毒复制，因此刺激小鼠免疫系统以产生抗EHV-1抗体。
病毒中和测试(VNT)
为了显示出诱导针对表达的转基因(源自甲型流感病毒(IAV)(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))或(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))的保护性免疫，测试了小鼠血清对相应病毒的中和活性(Allwinn等，2010；Trombetta等，2014)。用于中和测试的IAV是来自2014年德国猪的分离物，特别是A/swine/Germany/AR452/2014(H3N2)和A/swine/Germany/AR1181/2014(H1N1)。由于这些与疫苗靶衍生的毒株异源，因此小鼠血清对这些病毒的任何中和作用都将表明通过rEHV-1疫苗接种的广泛且有效的保护性免疫诱导。作为阴性对照血清，使用来自已显示对流感病毒抗体呈阴性的猪的血清。
甲型流感病毒中和测试：
在使用前，将用于病毒中和以及在96孔板上反滴定的MDCK细胞在37℃/5％CO2孵育两天。将相应地IAV原液H3N2和H1avN1在冰上融化，并在含有庆大霉素(Gentamycin)和两倍浓度胰蛋白酶的MEM(MEM/Genta/2x胰蛋白酶)中稀释。
测试的血清来自第1组(rEHV-1RacH SE B)、第2组(空载体)、阳性对照(来自疫苗接种了灭活多价IAV疫苗的猪的血清)和阴性对照的最终放血。
血清被热灭活，分别在两个和三个独立的测试中，从1:16连续1:2稀释到1:4096。将IAV稀释至约100TCID 50/中和反应。中和反应物在37℃、5％CO2孵育2小时。对所用病毒进行四次反滴定。除去生长培养基，并在添加中和反应物或反滴定的病毒稀释液之前，用含有庆大霉素和胰蛋白酶的培养基洗涤MDCK细胞。将中和反应物或病毒稀释液分别添加至MDCK细胞后，将VNT和滴定板在37℃/5％CO2孵育1小时。之后，除去接种物，并用含有庆大霉素和胰蛋白酶的新鲜培养基覆盖细胞。五天p.i.，对CPE进行监控和记录。测试中实际使用的病毒效价根据Reed和Münch以TCID50/ml计算，并且报道了被测血清阻止流感病毒典型CPE诱导的稀释度，参见下表。
表5.流感H1avN1 VNT结果
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表6.流感H3N2 VNT的结果
为了比较独立测试的结果，通过相互血清稀释度乘以被其中和的各个效价来计算中和能力。然后将三个测试的平均值除以100，以反映100TCID50的中和(表4、5和6)。数据汇总并以图形的方式在图20中示出。
疫苗接种rEHV-1RacH SE B的所有小鼠均已发展出针对各个IAV(亚型H3N2和H1avN1的异源毒株)的中和抗体。因此，两倍鼻内施用在p455启动子的控制下从orf70插入位点表达IAV的血凝素(H3)以及并行地在p430启动子的控制下从orf1/3插入位点表达IAV的血凝素(H1av)的rEHV-1RacH-SE，成功刺激了BALB/c小鼠的保护性免疫应答。
可以得出结论，在鼻内接种疫苗后，载体rEHV-1RacH-SE可用于两个不同转基因的并行表达，以刺激免疫应答。
蛋白质免疫印迹
1.感染：通过直接向生长培养基中添加10μl的解冻病毒原液，以约为1的M.O.I.使6孔板中的AI-ST细胞的汇合单层的三个孔的每个感染重组病毒。三个孔未感染。将感染的和未感染的细胞孵育两天，然后进行蛋白质免疫印迹分析。下表(表2)总结了用于感染的病毒。
表2.蛋白质免疫印迹中测试的病毒
2.裂解物的制备：如下制备补充有蛋白酶抑制备物混合物(RIPA+PI)的RIPA缓冲剂：将0.7ml的10x RIPA裂解缓冲剂Millipore Cat#20-188添加至6.3ml的H20，FisherScientific Cat#BP2470-1中，将1片CompleteTM迷你蛋白酶抑制备物混合物(Roche cat#11836 153 001)在7ml 1xRIPA缓冲剂中溶解。将未感染的对照刮至培养基中，并将来自三个重复孔的悬浮液合并在15ml离心管中，并置于冰上。将感染的细胞在培养基中冲洗下来，并将来自三个重复孔的悬浮液合并在15ml离心管中，并置于冰上。通过在1000xg 4℃离心5分钟来沉淀细胞。小心地吸取上清液，将细胞沉淀重悬于RIPA+PI中(未感染的细胞于300μl，感染的细胞于150μl)。悬浮液在冰上孵育30分钟，每10分钟涡旋一次。将悬浮液转移至1.5ml微量离心管中，并通过在微量离心机中以15000rpm，在4℃离心10分钟来沉淀未溶解的物质。将澄清的上清液转移至新的1.5ml微量离心管中，并在-80℃下储存备用。
3.SDS-PAGE并在尼龙膜上转移：材料：BioRad Criterion TGX Stain FreePrecast Gel、4-20％、26孔Cat#_567-8095；Bio Rad Precision Plus Dual ColourMarker，Cat#161-0374；Bio Rad Precision Plus All Blue Marker，Cat#161-0373；BioRad Trans Blot Turbo转移试剂盒，Midi format Cat#170-4159；Bio Rad 4x LaemmliSample Buffer(Cat no.161-0747)(Bio Rad Laboratories GmbH,Heidemannstrasse164,D-80939 München)；TGS运行缓冲剂(Sambrook等)，封闭溶液1：PBST中的5％FBS(Sambrook等)；PBST。在不添加还原剂的情况下制备样品。将样品在冰上解冻，并与1体积的4x缓冲剂混合，在96℃煮沸6分钟，并保持在室温直至凝胶上样。凝胶在230mA运行30分钟，然后使用BioRad Trans Blot Turbo系统组装，进行电转移。转移设置为2,5A 25V，10分钟。将膜在无菌蒸馏H2O中漂洗，并与25mL PBST中的5％FBS封闭溶液在4℃孵育30分钟。/>
抗体孵育和检测
材料：Immun-Star Western Chemiluminecent Kit(Bio Rad LaboratoriesGmbH,Heidemannstrasse 164,D-80939München)Cat#170-5070
一抗参见图例19a至19d。
二抗：过氧化酶偶联的山羊抗小鼠(Jackson Immune Research#115-035-146)1:5000。
在恒定搅拌下以足够的体积进行所有孵育。抗体在5％FBS/TBST中稀释。一抗在4℃孵育过夜。去除抗体溶液，用TBST洗涤印迹3次，持续5至10分钟。将稀释的二抗与印迹在室温孵育1小时，之后将其去除，并用TBST将印迹洗涤3次，持续5至10分钟。将印迹放置在透明的塑料薄板保护器上。将过氧化物和Lumino/Enhancer溶液混合1ml+1ml(对于每个印迹总共2ml)，吸取到印迹上，并孵育3至5分钟。之后，将膜置于ChemiDocXRS成像系统(Bio RadLaboratories GmbH,Heidemannstrasse 164,D-80939München)中，并使用Image Lab软件记录信号。
病毒滴定
将AI-ST细胞以2x104细胞/孔接种在96孔板(Corning Incorporated–LifeSciences,One Becton Circle,Durham,NC 27712,USA；REF 353072)，感染前一天在MEM中补充10％FBS。病毒原液迅速融化并置于冰上。在MEM中制备了10种1:10系列稀释液，每种稀释液的体积为1.2ml。将100 1/孔的病毒稀释液添加到细胞中，每种稀释液在一垂直行中添加8孔。通过添加100 l/孔MEM，每个板的垂直行11和12均作为培养基对照。进行三次滴定，并将细胞在37℃/5％CO2孵育5天。显微镜检查细胞培养物，并记录观察到EHV-1RacH典型CPE的孔。根据Reed和Muench(1938)的方法，效价以TCID50/ml计算。
实施例7
建立新的UL43插入位点
使用如先前实施例中所述的EHV-载体平台，仅两种抗原可以其真实形式并行表达。如果不同重组病毒之间的复制效率发生变化，两种载体疫苗的混合物将增加商品成本，并可能导致转基因倾向性表达(biased expression)，这并非不可能。尽管存在通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过小RNA病毒(picornavirus)2a肽(2a)在一个插入位点偶联两种抗原的方法，但这些技术不足以完成这项任务。如果两个转基因由2a肽偶联，这会触发核糖体跳跃，从而导致合成离散的下游翻译产物(Donnelly等，2001)，2a肽会在结构上改变表达的蛋白的第一个蛋白，该蛋白将在2a肽的C末端添加19个氨基酸残基。一个氨基酸残基脯氨酸将被添加到第二蛋白的N末端(Ryan等，1994)。由于这一额外的氨基酸将被HA的信号肽切割掉，因此很可能不会产生任何后果。尽管如此，第一HA上的19个氨基酸尾可能会干扰三聚化，并阻止足够的功效。为了找到克服所述障碍的解决方案，本发明人在pRacH-SE中建立了第三转基因表达位点。
使用统一的α疱疹病毒命名法
利用各种α疱疹病毒的第一基因组序列，根据它们在各自基因组中的位置，对每种病毒在计算机内识别的开放阅读框(orf)分别编号。后来发现，大多数α疱疹病毒基因是存在于不同物种中的同源物。为了促进数据的比较，现在常见的做法是在人类疱疹病毒-1基因组中为基因和基因产物分配它们的同源物。因此，我们根据表1中列出的新命名法更改了EHV orf的旧名称。
表1
但是对于插入位点的构建，必须注意不要破坏编码DNA聚合酶持续性因子的上游和下游基因UL42和编码糖蛋白C的UL44的推定启动子和poly A信号。
图13中示出了该新型UL43插入位点的构建。
因此，通过BAC pRacH-SE的RED重组，将UL43(SEQ ID NO:18)的5’端的870个碱基对(SEQ ID NO:21)替换为编码自体荧光mCherry蛋白的表达盒。将mCherry的开放阅读框(orf)置于编码衣壳三联体亚基2(capsid triplex subunit 2)的EHV-4UL18的推定启动子(p422，SEQ ID NO:5)和polyA序列(SEQ ID NO:7)的控制之下。
将18pA多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:7)引入卡那霉素抗性表达盒(Kana)上游和下游的RED重组转移载体中，以实现双重功能：1.在第二步en-passant诱变(第2次RED)期间，其用作缺失Kana的同源区域，2.其充当转基因的多聚腺苷酸信号。转移载体pUUL43-422-mC-18K18的图谱参见图14。
使用归巢限制性内切酶I-CeuI，将包含用于在病毒基因组重组的侧翼区的pUUL43-422-mC-18K18的片段(图14；SEQ ID NO:35)、表达盒和卡那霉素抗性表达盒从转移载体上切下，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。然后将纯化的DNA片段通过en-passant RED重组插入BAC pRacH-SE中(Tischer等，2006)。确认序列完整性后，在转染允许的细胞培养物后拯救重组EHV-1RacH-SE-UL43-422-mCherry(图15)，并纯化噬斑。通过荧光显微镜研究的荧光mCherry蛋白的表达表明，新插入位点中的新表达盒是有功能的(未示出)。
为了测试第三插入位点作为载体疫苗的性能，来自猪源甲型流感病毒(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)，GenBank登录号：ADR01746)的血凝素流感亚型H1pdm(SEQ IDNO:44)插入pRacH-SE的新位点中。
为此，从转移载体pUUL43-422-mC-18K18(图14；SEQ ID NO:35)中切下编码mCherry的orf，并插入编码H1pdm的orf。所得的转移质粒相应地命名为pUUL43-422-H1pdm-18K18(图16，SEQ ID NO:36)。使用归巢限制性核酸内切酶I-CeuI，将包含用于在病毒基因组中重组的侧翼区的pUUL43-422-H1pdm-18K18的片段、表达盒和卡那霉素抗性表达盒从转移载体上切下，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。然后将纯化的DNA片段通过en-passantRED重组插入BAC pRacH-SE中(Tischer等，2006)。确认序列完整性后，在转染允许的细胞培养物后拯救重组的EHV-1RacH-SE-UL43-422-H1pdm(图17)，并纯化噬斑。
使用相同的流程，产生基于rEHV-1RacH-SE-B(rEHV-1RacH-SE-orf1/3-p430-H1av-70-p455-H3，图7)的重组EHV-1RacH-SE。所产生的三插入重组体(triple-insertrecombinant)被命名为rEHV-1RacH-SE-UL56-430-H1av-UL43-422-H1pdm-US4-455-H3(缩写为rEHV-1RacH-SE-E，图18)。
图18中示出了该三插入rEHV-1RacH-SE-UL56-430-H1av-UL43-422-H1pdm-US4-455-H3(缩写为rEHV-1-E)基因组的示意图。虽然前代构建体的名称使用原始的EHV-orf命名法，但新的三插入病毒名称基于α疱疹病毒的统一命名法，其中基因是根据它们人疱疹病毒1中的同源物来命名的。
重组噬斑纯化的病毒通过对插入位点区测序(未示出)、蛋白质免疫印迹(图19)和病毒滴定(表3)来表征。
使用双插入重组体EHV-1、rEHV-1RacH-SE-UL56-430-H1hu-US4-455-H1pdm(缩写为rEHV-1RacH-SE-D，图12)，来比较转基因的表达强度。此外，测试中包括单插入的rEHV-1RacH-SE、rEHV-1RacH-SE-orf70-p455-H1pdm(图10)，其可在p455启动子的控制下从新的orf70/US4表达位点表达IAV HA H1pdm。
为了评估新的重组EHV-1RacH-SE-UL43-422-H1pdm和EHV-1RacH-SE-E的表达强度与表达H1pdm的另外两个rEHV-1RacH-SE的表达强度的比较，进行了蛋白质免疫印迹分析。此外，还包括表达不同IAV HA的所有单插入rEHV-1RacH-SE和两个双插入rEHV-1RacH-SE B和D。有关使用的病毒的列表，请参阅表2。
表2:通过蛋白质免疫印迹分析的病毒列表(图19)
使用了三种针对血凝素H1av或H1pdm或针对EHV-1糖蛋白II的专用单特异性单克隆抗体，以及市售的多克隆抗H3抗体。该方法允许对用不同的测试重组病毒感染的细胞中表达的转基因量进行半定量评估。当细胞培养对照细胞未受到感染时，使用已从“空”载体主链BAC(SE)中拯救并噬斑纯化的rEHV-1RacH-SE作为背景病毒对照。感染重组EHV-1B、D、E、SE、av、hu、H3、4p、43p(参见表2)或未被感染的AI-ST细胞培养物30小时p.i.收集，并在还原条件下进行SDS-PAGE处理。电泳后，将蛋白质电转移到尼龙膜上，并与针对HA H1av、H1pdm或EHV-1糖蛋白II的单克隆抗体或针对HA H3的市售兔多克隆抗体一起孵育。蛋白质免疫印迹(图19d)证实了所有9种病毒的成功感染和复制。在B、D、av、hu、H3、4p、43p和SE感染的细胞中表达的gpII的数量似乎相似，这表明复制效率相当。与其他细胞相比，E感染细胞中的gpII量略有减少。蛋白质免疫印迹(图19a和19b)证实了新重组E分别对血凝素H1av和H3的表达。与B相比，其数量似乎相当。相比之下，当与D和4p相比时，由新重组EHV-1RacH-SE-E和-43p表达的血凝素H1pdm的量大大减少(蛋白质免疫印迹(图19c))，其中在455启动子的控制下在US4(orf70)插入位点表达相同的蛋白质。
为了评估并行表达三种血凝素是否会损害病毒复制效率，在AI-ST细胞中传代rEHV-1RacH-SE-B、-D和-E，直到第11代传代并一式三份并行测定效价(表3)。所有效价都在相当的范围内，这表明第三转基因表达盒在细胞培养条件下对病毒适应性没有明显的负面影响。
表3:第11代病毒效价的比较
病毒ID 传代数 TCID50/ml 标准偏差
rEHV-1RacH-SE-B 11 2,01E+08 1,09E+07
rEHV-1RacH-SE-D 11 1,76E+08 8,59E+07
rEHV-1RacH-SE-E 11 1,67E+08 8,88E+07
综上所述，重组EHV-1从三个不同的表达位点并行表达三种不同的甲型血凝素流感。虽然在430和455启动子控制下分别从UL56(orf1/3)和US4(orf70)插入位点的表达具有相当的强度，但在新422启动子控制下，从新位点UL43的表达较弱。此外，在重组的EHV-1RacH-SE中，在p422启动子的控制下，仅从UL43中的新插入位点表达血凝素H1pdm，与在p455启动子的控制下从US4(orf70)插入位点表达的相同蛋白质相比，其量出现减少。因此，如果该感兴趣的除了需要从UL56位点和US4位点表达的转基因之外，还要求第三转基因的较低强度的表达，那么该新的表达系统本身将作为一种选择。当已知存在大量表达的蛋白质在细胞培养物中发挥毒性作用时，UL43位点的较低表达是有利的。此外，如果出于目的需要某种比率的蛋白质，例如为了以特定比率形成由不同的病毒结构蛋白组成的病毒样颗粒，可使用较强和较弱表达位点的组合。此外，如果表达的蛋白质具有使重组载体病毒不稳定的趋势，则可能需要较弱的转基因表达。
增强型EHV-1载体BAC pRacH-SE可用作生成针对哺乳动物物种(包括马、狗和猪)的多种病原体的载体疫苗的平台(Trapp等，2005；Rosas等，2007a、2007b、2008)。增强型载体病毒可以以其真实的形式并行表达三种不同的转基因。三种不同的抗原可代表一种病原体的三种血清型，或源自疫苗设计所针对的物种的不同病原体。此外，基于表达马病原体的抗原的增强型EHV-1载体pRacH-SE产生的载体疫苗具有四价的推定潜力，因为它也可以针对EHV-1感染进行疫苗接种。
关于增强型EHV-1载体BAC pRacH-SE的信息尚未在BI之外发表或展示。
根据本公开内容，无需进行过度实验即可制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但这对于本领域技术人员而言明显的是，在不偏离本发明概念、精神和范围的情况下，本领域技术人员可以将变型应用于组合物和方法以及步骤或步骤的顺序中。更具体地，明显的是，化学和生理相关的某些物质可以代替本文所述的物质，会获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改都应被认为落入如所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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以下参考文献在一定水平上通过引用方式并入本文，在一定水平上它们提供了对本文描述的示例性程序或其他细节的补充。
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cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta tccttgcttc 360
cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct agcgttcaat 420
gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat gaatctgtag 480
gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag ttgtactact 540
taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata agctgcagtt 600
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 2
agctggggga gtttgtacta tagtgtatta catgcggctt gcaataactg cctggtttat 60
gtttcgcaac attcaagcag acatgctacc gctaaacact ttgcaacaat tttttattgg 120
gtgtttggcc tttggtagaa ctgtcgcgtt tttggtggta gcatatacta ccttatttat 180
acgctccgag ctgtttttca gcatgctagc acccaacgcc gagcgagagt atataactcc 240
catcattgcc cacaagctta tgccacttat tagcgtccgc tctgccgttt gcttagtcat 300
aatatctacc gccgtttacg cagcagacgc tatctgcgac acaattggat ttgcgatacc 360
gcgcatgtgg atgtgtattt taatgagatc aacctccatg aagcgtaact agggggcctc 420
ccactgaggc actaccggct tagcagctga ctaacacagt ataaaacgtg agaagaaatc 480
agtctcatgc gccattagcg ctaggctagt tagcgtggag gaccggagcg ctaccgccag 540
cagtttcatc cgcctggtta cgggtttgtt aacacctacc ggtgttttac cgctaccata 600
<210> 3
<211> 430
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 3
tctatttgag gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact 60
actgagaata atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc 120
taggctcgtg cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta 180
tccttgcttc cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct 240
agcgttcaat gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat 300
gaatctgtag gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag 360
ttgtactact taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata 420
agctgcagtt 430
<210> 4
<211> 449
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 4
ttggtggtag catatactac cttatttata cgctccgagc tgtttttcag catgctagca 60
cccaacgccg agcgagagta tataactccc atcattgccc acaagcttat gccacttatt 120
agcgtccgct ctgccgtttg cttagtcata atatctaccg ccgtttacgc agcagacgct 180
atctgcgaca caattggatt tgcgataccg cgcatgtgga tgtgtatttt aatgagatca 240
acctccatga agcgtaacta gggggcctcc cactgaggca ctaccggctt agcagctgac 300
taacacagta taaaacgtga gaagaaatca gtctcatgcg ccattagcgc taggctagtt 360
agcgtggagg accggagcgc taccgccagc agtttcatcc gcctggttac gggtttgtta 420
acacctaccg gtgttttacc gctaccata 449
<210> 5
<211> 422
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 5
ccatggatcg tcagacttgg tggaagaccc atgttcgttg tttcaagaag cgtatcctct 60
actcagctcc actgatacag cattgctacg cacgcctcac gttggcgaaa ttggcgcaga 120
tgaaggacat tttgcccagt acctaattcg cgacgaatcc cccctgaaag gctgttttcc 180
acgaatttag gttgtgcccg cctacaactt ttcacttgca aactcaataa aacgcacagt 240
ttgtatattc agttgtcagt ttgctctact cgagcgtcgg cgctttgtct agccctctta 300
gtgggtattg ttaccggctg gggttttatt ggcgttgtta ttggggagat tttagttgat 360
agaaagcata ccgaggtttt gggggtgtcg cttaatttcg gtgtctgtaa acgtaaaaag 420
ag 422
<210> 6
<211> 125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of the 71pA polyadenylation sequence
<400> 6
aataaacgcg gtatgtctac cttcaagcct atgatgaacg gatgtttggt gtttgcggct 60
attataacgc tcttgagttt tatgctatct ctgggaacat gcgaaaatta caggcgtgtg 120
gttcg 125
<210> 7
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of the 18pA polyadenylation sequence
<400> 7
ataaaaactg agactgttat attcatttca gtgtgtttaa taagaattgt gaacataact 60
tattctatat ctcattgcgt ggaaagactg gaaaacgcat tggtggtagg tggaaggctc 120
gcc 123
<210> 8
<211> 1235
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 8
atgttgactg tcttagcagc tctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc ccagaccctg ttggtgggtg cggttggact cagaatcttg 840
gcgcaggcat ggaagtttgt cggtgacgaa acatacgaca ccatccgcgc agaagcaaag 900
aatttagaga cccacgtacc ctcaagtgct gcagagtcgt ctctagaaaa ccaatcgaca 960
caggaggagt ctaacagccc cgaagttgcc cacctgcgaa gcgtcaacag cgatgacagt 1020
acacacacgg gggtgcgtcg aacggcatcc aggactgtga cagtcagctc aaaactgtgt 1080
atgcctgctt ggctctaatt ggactcggca catgtgccat gatagggttg atagtttaca 1140
tttgtgtatt aaggtcaaaa ctgtcctctc ggaatttttc gcgcgcgcaa aatgtaaaac 1200
atagaaatta ccagcgactt gagtacgttg cttaa 1235
<210> 9
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 9
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgctcaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 10
<211> 431
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 10
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct t 431
<210> 11
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 11
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgcacaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 12
<211> 530
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 12
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct taacacctgt caaataaaag tttcaaatca aaaacattgt tgtctgtaat 480
aactgagtgt ggttttaaaa atactaaatc gcggcaattc cggaaatagc 530
<210> 13
<211> 283
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 13
tctagactcg agcgcaagcc ctacacgcgc tacccctgct ttcaacgcgt caacctgcac 60
attgacgggg agtttctggt tcacaagatg ctagcgttca atgccgcgat gcgcccatcg 120
gccgaggagc tgctgtcata cccaatgttt gctcaacttt aggatgacta acctgtttct 180
gggaggagac agcgtgggcg acggtgtata aagttggtct gctttcaagc cctgccactg 240
cgctacagtg ccaccaactg taaagcggta gtaagctgca gtg 283
<210> 14
<211> 144
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 14
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc taga 144
<210> 15
<211> 1236
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 15
atgttgactg tcttagcagc cctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc ccagaccctg ttggtgggtg cggttggact cagaatcttg 840
gcgcaggcat ggaagtttgt cggtgacgaa acatacgaca ccatccgcgc agaagcaaag 900
aatttagaga cccacgtacc ctcaagtgct gcagagtcgt ctctagaaaa ccaatcgaca 960
caggaggagt ctaacagccc cgaagttgcc cacctgcgaa gcgtcaacag cgatgacagt 1020
acacacacgg ggggtgcgtc gaacggcatc caggactgtg acagtcagct caaaactgtg 1080
tatgcctgct tggctctaat tggactcggc acatgtgcca tgatagggtt gatagtttac 1140
atttgtgtat taaggtcaaa actgtcctct cggaattttt cgcgcgcgca aaatgtaaaa 1200
catagaaatt accagcgact tgagtacgtt gcttaa 1236
<210> 16
<211> 801
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 16
atgttgactg tcttagcagc cctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc c 801
<210> 17
<211> 803
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 17
atgttgactg tcttagcagc tctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc cca 803
<210> 18
<211> 1206
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 18
atgatgtacc agccagatag agagcccggt gaagactcgt gtctggtgct aagctcatct 60
tcggtccaac gctgcaccgg ctcccagagg ggctgcatgc catgtacctg ggcggcctcc 120
aaagctttcg ttggaatcgg actacaagct tgcgtcctca cttcatcgat cttacacatt 180
gacctgctaa cccggaactc aacatgtctg attctgatga tcatctcgat gtatgtgttg 240
agcctgatcc gcgtacccat atctaagatg gaaactatag taaccgtatg tcgatcgata 300
caggcgctgg ccactctagt ggcagccagt gtctgggtcg cgggatctgc agtcaaaaag 360
gaacatttac ttatagttgt taccgtttgc attttgtttg tgtttatagc cggaactcaa 420
atttccctat tttacgtcat atgctcagcc aatggaacgg ggactcactt tagagcgagc 480
ctattggcta ttatcggtgg atgtgtgcta ggggtttccg taaagctcgt tgagctgaaa 540
gatgtaccca tagggatagg gatagctatc gctattatag cttcctgtca agactttggg 600
cttgctcttc gagacacatg ccactatcga atcggacggt atgcgtgcat gcgcaccttt 660
acggaccttg gccggggtat taactacaga tgggtgacgg acgttgaagc cgtccccaag 720
atcgaagaag tcgcggaaga aaaggtttcg ctgttcaagt ttttcaagga gatgccgggg 780
gtgattttct ccccagcggt cggaactcac gcaaccccca taatatggat cgtcctacgc 840
ttggtctacg gaatttccaa cgtgtggcaa accccggcgt atgttgtctt ctgtctgact 900
gttggacacg tctctgcgat gctgctggag cagcttgtca tcagagtaaa ctacacggca 960
gaggcgagtt ccggcatcca ctccacggcc cacgctgtct gcatggtgct tgccgccttt 1020
gggtacggcg tggccggtcc cctctcgctc gcatttactg tatccggggg tatactgggg 1080
gcgctatacc ttcgcaagcg cgcaacgggc gcgcgccgcc tggcggcaac tcacatttcg 1140
aggtggctta ttgtttgtgt atatgttgcc gccggtttgt gttatgcaac tataatcaca 1200
cattaa 1206
<210> 19
<211> 226
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 19
gtataccatg cttgctatac tgaaaataaa aacgcatatt gtaaacgaca gacgcggaaa 60
tgtttattgc ttagtttcac tatttggtta aaactattta cacttgtaga aacacgccca 120
ctaagtattt gttttatgac taatacctgg tgcataaaac catcctcttg ggtccctgta 180
cctcaaactc tccaaaggtt ggcttgctac atcaaggtta tcaatc 226
<210> 20
<211> 305
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 20
accccggcgt atgttgtctt ctgtctgact gttggacacg tctctgcgat gctgctggag 60
cagcttgtca tcagagtaaa ctacacggca gaggcgagtt ccggcatcca ctccacggcc 120
cacgctgtct gcatggtgct tgccgccttt gggtacggcg tggccggtcc cctctcgctc 180
gcatttactg tatccggggg tatactgggg gcgctatacc ttcgcaagcg cgcaacgggc 240
gcgcgccgcc tggcggcaac tcacatttcg aggtggctta ttgtttgtgt atatgttgcc 300
gccgg 305
<210> 21
<211> 870
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 21
atgatgtacc agccagatag agagcccggt gaagactcgt gtctggtgct aagctcatct 60
tcggtccaac gctgcaccgg ctcccagagg ggctgcatgc catgtacctg ggcggcctcc 120
aaagctttcg ttggaatcgg actacaagct tgcgtcctca cttcatcgat cttacacatt 180
gacctgctaa cccggaactc aacatgtctg attctgatga tcatctcgat gtatgtgttg 240
agcctgatcc gcgtacccat atctaagatg gaaactatag taaccgtatg tcgatcgata 300
caggcgctgg ccactctagt ggcagccagt gtctgggtcg cgggatctgc agtcaaaaag 360
gaacatttac ttatagttgt taccgtttgc attttgtttg tgtttatagc cggaactcaa 420
atttccctat tttacgtcat atgctcagcc aatggaacgg ggactcactt tagagcgagc 480
ctattggcta ttatcggtgg atgtgtgcta ggggtttccg taaagctcgt tgagctgaaa 540
gatgtaccca tagggatagg gatagctatc gctattatag cttcctgtca agactttggg 600
cttgctcttc gagacacatg ccactatcga atcggacggt atgcgtgcat gcgcaccttt 660
acggaccttg gccggggtat taactacaga tgggtgacgg acgttgaagc cgtccccaag 720
atcgaagaag tcgcggaaga aaaggtttcg ctgttcaagt ttttcaagga gatgccgggg 780
gtgattttct ccccagcggt cggaactcac gcaaccccca taatatggat cgtcctacgc 840
ttggtctacg gaatttccaa cgtgtggcaa 870
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 22
accccggcgt atgttgtctt ctgtctgact gttggacacg tctctgcgat gctgctggag 60
cagcttgtca tcagagtaaa ctacacggca gaggcgagtt ccggcatcca ctccacggcc 120
cacgctgtct gcatggtgct tgccgccttt gggtacggcg tggccggtcc cctctcgctc 180
gcatttactg tatccggggg tatactgggg gcgctatacc ttcgcaagcg cgcaacgggc 240
gcgcgccgcc tggcggcaac tcacatttcg aggtggctta ttgtttgtgt atatgttgcc 300
gccggtttgt gttatgcaac tataatcaca cattaa 336
<210> 23
<211> 1206
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 23
atgatgtacc agccagatag agagcccggt gaagactcgt gtctggtgct aagctcatct 60
tcggtccaac gctgcaccgg ctcccagagg ggctgcatgc catgtacctg ggcggcctcc 120
aaagctttcg ttggaatcgg actacaagct tgcgtcctca cttcatcgat cttacacatt 180
gacctgctaa cccggaactc aacatgtctg attctgatga tcatctcgat gtatgtgttg 240
agcctgatcc gcgtacccat atctaagatg gaaactatag taaccgtatg tcgatcgata 300
caggcgctgg ccactctagt ggcagccagt gtctgggtcg cgggatctgc agtcaaaaag 360
gaacatttac ttatagttgt taccgtttgc attttgtttg tgtttatagc cggaactcaa 420
atttccctat tttacgtcat atgctcagcc aatggaacgg ggactcactt tagagcgagc 480
ctattggcta ttatcggtgg atgtgtgcta ggggtttccg taaagctcgt tgagctgaaa 540
gatgtaccca tagggatagg gatagctatc gctattatag cttcctgtca agactttggg 600
cttgctcttc gagacacatg ccactatcga atcggacggt atgcgtgcat gcgcaccttt 660
acggaccttg gccggggtat taactacaga tgggtgacgg acgttgaagc cgtccccaag 720
atcgaagaag tcgcggaaga aaaggtttcg ctgttcaagt ttttcaagga gatgccgggg 780
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cattaa 1206
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<211> 870
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
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tcggtccaac gctgcaccgg ctcccagagg ggctgcatgc catgtacctg ggcggcctcc 120
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<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
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<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
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<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> (Nucleotide sequence of transfer vector pU70-p455-71K71
<400> 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU70-p455-H3-71K71
<400> 29
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU70-p455-H1pdm-71K71
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accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4980
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5040
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5100
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5160
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5220
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5280
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5340
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5400
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5460
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5520
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5580
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 5640
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 5700
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 5760
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 5820
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 5880
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 5940
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6000
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6060
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6120
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 6180
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 6240
ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 6300
gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg 6360
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 6420
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 6480
aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 6540
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 6600
aaaacgacgg ccagtg 6616
<210> 37
<211> 4435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pUmC70
<400> 37
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cctccgagta ccccagagga 420
gtatgtgaaa agctgccact cgcaactact gaagataatt tcaacgctca agataaatcc 480
ggaggagttt cctcgagacc ccgggtcgag gctcgtgcgc ggatacatcg agtattctag 540
actcgagcgc aagccctaca cgcgctaccc ctgctttcaa cgcgtcaacc tgcacattga 600
cggggagttt ctggttcaca agatgctagc gttcaatgcc gcgatgcgcc catcggccga 660
ggagctgctg tcatacccaa tgtttgctca actttaggat gactaacctg tttctgggag 720
gagacagcgt gggcgacggt gtataaagtt ggtctgcttt caagccctgc cactgcgcta 780
cagtgccacc aactgtaaag cggtagtaag ctgcagtggt cgacatggtg agcaagggcg 840
aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 900
ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 960
cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 1020
tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 1080
actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 1140
acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 1200
aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 1260
tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 1320
tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 1380
acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 1440
tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 1500
actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtaactgtg ccttctagtt gccagccatc 1560
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 1620
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 1680
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 1740
ggatgcggtg ggctctatgg atccgaccct gttggtgggt gcggttggac tcagaatctt 1800
ggcgcaggca tggaagtttg tcggtgacga aacatacgac accatccgcg cagaagcaaa 1860
gaatttagag acccacgtac cctcaagtgc tgcagagtcg tctctagaaa accaatcgac 1920
acaggaggag tctaacagcc ccgaagttgc ccacctgcga agcgtcaaca gcgatgacag 1980
tacacacacg gggggtgcgt cgaacggcat ccaggactgt gacagtcagc tcaaaactgt 2040
gtatgcctgc ttggctctaa ttggactcgg cacatgtgcc atgatagggt tgatagttta 2100
catttgtgta ttaaggtcaa aactgtcctc tcggaatttt tcgcgcgcgc aaaatgtaaa 2160
acatagaaat taccagcgac ttgagtacgt tgcttaagct tggcgtaatc atggtcatag 2220
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 2280
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 2340
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 2400
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 2460
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 2520
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2580
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2640
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2700
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2760
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 2820
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2880
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2940
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 3000
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 3060
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3120
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 3180
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3240
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 3300
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 3360
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 3420
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 3480
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 3540
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 3600
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 3660
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 3720
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 3780
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 3840
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 3900
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 3960
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 4020
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 4080
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 4140
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 4200
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 4260
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 4320
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 4380
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 4435
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 38
aggctcgtgc gcggatacat cg 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 39
ttcggggctg ttagactcct cc 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 40
ccaactcgcc gccatgagac cc 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 41
agcgcgcccc gtacccagtg gg 22
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 42
cgacgcgcgt cggagg 16
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 43
gttataaaca taccatgcac c 21
<210> 44
<211> 566
<212> PRT
<213> swine influenza virus
<400> 44
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Lys Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 460
Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ile
530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 45
<211> 566
<212> PRT
<213> swine influenza virus
<400> 45
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Gly
1 5 10 15
Gln Asp Leu Pro Gly Lys Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Asn Phe Ser Met
50 55 60
Gly Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Ala Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu Ile Asp Ser Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Glu Tyr Thr Ser Leu Arg Ser Leu Ile
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Asn Glu Asn Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Ser Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Lys Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr
165 170 175
Tyr Pro Met Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Ser Asp Asp Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gln Ile
195 200 205
Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Lys Ile Ile Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg
225 230 235 240
Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Met Gln Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro Ile Asp Thr Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Lys Tyr Ile Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Ile Pro Glu Arg Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asn Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Ile Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
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450 455 460
Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ser Cys Met Glu Ser
485 490 495
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500 505 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Ser Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
515 520 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys
530 535 540
Ala Val Trp Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 46
<211> 566
<212> PRT
<213> swine influenza virus
<400> 46
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Ile Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Asn Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Asn Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
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100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Ala Thr Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Thr Thr Lys Gly Thr Thr Val Ser Cys Ser His Ser Gly Ala Asn Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Ile Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Ile Trp Gly Val His His Pro Pro Thr Asp Ser Asp Gln Gln Thr Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Asn His Thr Tyr Val Ser Val Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr
210 215 220
Gln Arg Phe Thr Pro Glu Ile Val Ala Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln
225 230 235 240
Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Asp Gln Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp His Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Asn Lys Gly Ser Asn Ser Gly Ile Met Met Ser Asp Ala His
275 280 285
Val His Asn Cys Thr Thr Lys Cys Gln Thr Pro His Gly Ala Leu Lys
290 295 300
Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Ile Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Gln Leu Arg Met Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ile Ala Ile Asp Gly Ile Ser Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ser Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn
435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
545 550 555 560
Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 47
<211> 564
<212> PRT
<213> swine influenza virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (531)..(531)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 47
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1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Ser
130 135 140
Ile Gly Ala Thr Ala Ser Cys Ser Lys Gln Gly Arg Ser Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro Asn Leu
165 170 175
Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asp Lys Glu Arg Glu Val Leu Val Leu Trp
180 185 190
Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Arg Ala Ile Tyr Arg
195 200 205
Lys Glu Thr Ala Tyr Val Ser Val Met Ser Ser Leu Tyr Asn Arg Arg
210 215 220
Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Ile Arg Asn Gln Glu Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Lys Asp Thr Ile Ile
245 250 255
Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu
260 265 270
Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Val Ser Asn Ala Ser Met Asp
275 280 285
Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Lys Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile
325 330 335
Pro Ser Ile Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln
370 375 380
Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu
405 410 415
Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Ser Leu Tyr Glu Lys Val
450 455 460
Lys Gly Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Asp Ser Val Lys Asn
485 490 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg
500 505 510
Glu Lys Ile Asp Gly Val Glu Leu Lys Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile
515 520 525
Leu Ala Xaa Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser
530 535 540
Leu Gly Ala Thr Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile

Claims (14)

1. 一种马α疱疹病毒1载体，其包含：(i) 至少一个抗原编码序列，所述抗原编码序列插入到所述马α疱疹病毒1载体的UL43中且可操作地连接启动子序列，以及(ii) 至少一个上游UL43侧翼区，其选自：SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 26，以及(iii) 至少一个上游UL44侧翼区，其选自：SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 27。
2.权利要求1的马α疱疹病毒1载体，其进一步包括插入到UL56或US4的另一个抗原编码序列。
3.权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述插入UL43中的特征在于UL43中的部分缺失或取代，其中UL44保持功能性。
4. 权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述启动子序列选自：SV40大T、HCMV和MCMV立即早期基因1、人延长因子α启动子、杆状病毒多角体启动子、SEQ ID NO: 1所示的4pgG600及其互补核苷酸序列、SEQ ID NO: 3所示的p430、SEQ ID NO: 2所示的4pMCP600及其互补核苷酸序列、SEQ ID NO: 4所示的p455、或SEQ ID NO: 5所示的p422及其互补核苷酸序列。
5.权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述抗原编码序列涉及感染动物的病原体，所述动物为猪、家禽、牛、猫、狗或马。
6. 权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述抗原编码序列来自选自以下列表的病原体：Schmallenberg病毒、甲型流感病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪环状病毒、古典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、戊型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、狂犬病病毒、猫麻疹病毒、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、胸膜炎肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)。
7.权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述抗原编码序列是血凝素编码序列。
8.权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述抗原编码序列是来自猪甲型流感病毒的血凝素流感抗原编码序列。
9. 权利要求8的马α疱疹病毒1载体，其中所述血凝素流感抗原编码序列包含编码SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列的核酸序列。
10.权利要求1至2任一项的马α疱疹病毒1载体，其中所述马α疱疹病毒1载体为毒株RacH。
11.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1至10任一项的马α疱疹病毒1载体。
12.权利要求1至10任一项的马α疱疹病毒1载体在制备一种用于免疫动物的免疫原性组合物中的用途。
13.权利要求1至10任一项的马α疱疹病毒1载体在制备一种用于减少或预防有需要的动物中由病原体引起的临床体征的免疫原性组合物中的用途。
14.权利要求12或13的用途，其中所述动物是猪、家禽、牛、马、狗或猫。
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