CN105641692A - 单纯疱疹病毒ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，包含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一个。本发明属于生物医药技术领域，通过敲除特定基因制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。

Description

单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法。
背景技术
单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV）是一种以人类为唯一自然宿主的双链包膜DNA病毒，血清学分为HSV-Ⅰ和HSV-2型。HSV-Ⅰ主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜、中枢神经系统以及外生殖器造成龈口炎、唇疱疹、角膜结膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎、生殖器疱疹等疾病；HSV-2主要引起生殖器疱疹；疱疹病毒严重威胁着人类健康。目前，临床上常使用疱疹净、阿糖腺苷、无环鸟苷、泛洛昔韦等抗毒药物治疗，虽能缓解临床症状，但不能彻底清除潜伏于体内的病毒，且存在药物毒副作用大、易出现耐药、容易复发等缺点。HSV感染性疾病常反复发作，迁延难愈，给病人造成极大痛苦，HSV疫苗的研究开发为预防和治愈HSV感染性疾病带来了希望。
病毒疫苗可分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗；新型疫苗是指利用基因工程技术构建的如基因缺失活疫苗、载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等，其在多种病毒感染性疾病的治疗中得到广泛应用并取得较好的疗效。减毒活疫苗基本包含病毒全部或大部分抗原，并具有和野生型病毒相同的感染及复制特性，基本无致病性，故减毒后的活疫苗可以有效地诱导机体免疫应答，相对于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好，在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了不可替代的作用。
中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因。该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的免疫应答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之处：（1）选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组成同源重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2）选择pShuttle-CMV载体，同源重组框整合到拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3）用荧光蛋白基因代替拟敲除病毒基因用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减毒活疫苗仍表达该蛋白。
因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，通过敲除特定基因制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。
本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，包含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一个。
优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL41和US8中的至少一个。
优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的US8基因。
相应地，本发明还提供单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1、BAC-HSV-1宿主菌的构建：扩大培养HSV-1病毒，提取HSV-1基因组，并与BAC质粒重组，构建得到BAC-HSV-1重组质粒，BAC-HSV-1重组质粒电转化至宿主菌，得到BAC-HSV-1宿主菌；
S2、BAC基因敲除系统的构建：将I-SceI插入到pREDI载体上，并将构建的pREDI重组质粒电转化至S1构建的BAC-HSV-1宿主菌，得到BAC基因敲除系统；
S3、同源重组片段替代拟敲除基因：以Kam-SacB全片段为模板，PCR扩增拟敲除基因的同源重组框，先进行第一次PCR扩增，再以第一次PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增，得到同源重组片段，电转化至S2构建的BAC基因敲除系统中进行第一次同源重组，由抗性基因和SacB基因共同取代BAC-HSV-1中的拟敲除基因；Kam-SacB全片段通过现有常规技术手段构建得到；
S4、基因敲除病毒株的筛选：抗性基因筛选同源重组成功菌，鼠李糖诱导I-SceI内切酶合成，切除抗性基因和SacB基因，发生第二次同源重组，得到含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌；扩大培养得到的含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌，提取△BAC-HSV-1质粒，并将该△BAC-HSV-1质粒电转至宿主细胞中，形成单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株；
S5、将S4得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗。
优选地，所述同源重组框包括拟敲除基因上下游各50bp同源序列、抗性基因和SacB基因。
优选地，所述拟敲除基因为UL5，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQIDNO.1)，下游引物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.2)；第二次PCR的上游引物为GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQIDNO.3)，下游引物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.4)。
优选地，所述拟敲除基因为US8，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为TAAGGCGCCCCATCCCGAGGCCCCACGTCGGTCGCCGAACTGGGCGACCGCGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQIDNO.5)，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGATAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.6)；第二次PCR的上游引物为TGTTGGGCTCCCATTTTACCCGAAGATCGGCTGCTATCCCCGGGACATGTAAGGCGCCCCATCCCGAGGC(SEQIDNO.7)，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGATAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.8)。
优选地，所述拟敲除基因为UL41，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CTACATGTCAGGTCAATTGTAACTGCGGATCGGCCTAACTAAGGCGTGGTTCGATTTATTCAACAAAGCC(SEQIDNO.9)，下游引物为CGTCATGTACACGTTGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.10)；第二次PCR的上游引物为TGGTGGGTCGTTTGTTCGGGGACAAGCGCGCTCGTCTGACGTTTGGGCTACATGTCAGGTCAATTGTAAC(SEQIDNO.11)，下游引物为CGTCATGTACACGTTGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQIDNO.12)。
优选地，所述拟敲除基因为UL18，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CTGGCAATTACCCTGTTATCCCTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTT(SEQIDNO.13)，下游引物为CATCGCGATACCCTCGGGCATCTCGCATCTTGCAAGAATGGGCCTCGTT(SEQIDNO.14)；第二次PCR的上游引物为TGGATGCCCACCCCCACCCCCCCGTGGGTCTAGCCGGGC(SEQIDNO.15)，下游引物为ATGCTGGCGGACGGCTTTGAAACTGACATCGCGATACCCTCGGGCATCTCG(SEQIDNO.16)。
Kam-SacB全片段可以通过PCR扩增得到，上游引物为CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAA(SEQIDNO.17)，下游引物为GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG(SEQIDNO.18)。
优选地，所述抗性基因选自kanamycine抗性基因、Ampicillin抗性基因、chloramphenicol抗性基因或荧光蛋白基因；所述宿主菌为DH5α大肠杆菌；所述宿主细胞为Vero细胞。
本发明以Genebank中的HSV-1基因组参考序列为蓝本，应用SiRNA干扰技术，对减毒活疫苗构建的拟敲除基因进行初步筛选，并通过毒力测定及安全性评价等，筛选并构建得到安全性高、免疫效果好的敲除型病毒株制备成减毒活疫苗。应用SiRNA干扰技术，大大提高了拟敲除基因的筛选效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
（1）相比传统疫苗而言，本发明制备的减毒活疫苗是经过基因重组后的获得的减毒活疫苗，不易发生毒力回复，其病毒度滴度和感染能力明显减弱，保留了较高的免疫原性，进入机体后仅能刺激机体产生免疫应答而无致病作用，安全有效。
（2）本发明提供的基因重组减毒活疫苗的制备方法合理、简单、高效，BAC载体上的red基因表达能够提高同源重组效率，鼠李糖诱导的I-SceI内切酶合成使基因组发生第二次同源重组，切除外源性抗性基因和SacB基因，在敲除目的基因的同时未引入外源基因，可控性强。
（3）通过应用SiRNA干扰技术进行初步筛选，大大提高了拟敲除基因的筛选效率，提高了减毒活疫苗制备成功机率，针对性强。
（4）选择BAC载体连接HSV-1全基因，相对于传统的pShuttle-CMV等载体，BAC序列中的red蛋白表达能大大增加同源重组效率。
附图说明
图1pREDI质粒的谱图。
图2pREDI重组质粒的电泳结果图。
图3BAC基因敲除系统的示意图和验证结果图。
图4同源重组敲除拟敲除基因的策略示意图。
图5PCR扩增△UL18基因敲除同源重组框的电泳图。
图6PCR扩增的△UL18基因同源重组框电转化至BAC基因敲除系统中的验证结果图。
图7PCR扩增△US8基因敲除同源重组框的电泳图。
图8PCR扩增的△US8基因同源重组框电转化至BAC基因敲除系统中的验证结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明技术方案中单纯疱疹病毒I型重组减毒活疫苗的总体构建策略参见图1至图4，其中图4为同源重组敲除拟敲除基因的策略示意图。具体包括：SiRNA干扰筛选HSV-1拟敲除基因；连接HSV-1全基因到BAC载体；BAC基因敲除系统的建立；PCR扩增拟敲除基因的同源序列电转化重组到BAC-HSV-1基因上；抗性筛选和糖诱导筛选敲除成功的病毒株，鉴定后空斑纯化；减毒活疫苗的毒力测定、安全性评价及免疫效果检测。
实施例一HSV-1减毒基因的初步筛选
应用SiRNA干扰技术，研究了HSV-1的UL5、UL39、UL40、UL41、US6、US8、US12、UL18、UL39、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因对病毒增殖和感染力的影响，对拟进行基因敲除的减毒基因进行初步筛选，结果如表1所示。针对拟敲除基因UL5、US8、UL41和UL18的PCR引物序列分别如SEQIDNO.1至SEQIDNO.16所示，针对其他拟敲除基因的引物序列在此不一一列举。两次PCR扩增所用酶为用PrimeSTARMaxDNAPolymerase（TAKARA，R045A），反应体系如下：PrimeSTARMaxPremix（2×）25μL、上游引物（10μM）1.5μL、下游引物（10μM）1.5μL、模板＜200ng、DMSO1.5μL、MgCl20.25μL、加去离子水至50μL。反应条件为：98℃10s、56℃5s、72℃5s/Kb，共30循环，然后72℃5min、4℃保温。
从表1可知，对UL18、UL40、UL5、UL41、ICP34.51等基因的RNA干扰效果较明显。在此基础上，进一步进行空斑抑制率的考察，具体方法如实施例六所示，结果显示：UL18、UL5、UL41和US8基因敲除后的空斑抑制率高，其中US8基因敲除后的空斑抑制率最高，而UL39和US6虽然RNA干扰效果较明显，但空斑抑制率较低。
实施例二HSV-1UL18基因敲除病毒株的构建
应用本发明基因敲除系统成功构建了HSV-1UL18基因敲除病毒株。其制备方法包括：
S1、BAC-HSV-1宿主菌的构建
S1.1扩大培养HSV-1病毒：培养vero细胞，用PBS洗涤细胞后，将HSV-1病毒（购自美国典型微生物菌种保藏中心）加入细胞培养瓶中，确保病毒液完全覆盖住细胞面，将加有病毒液的细胞培养瓶放在37℃、5%CO2的培养箱中孵育1.5h，期间每隔15min摇晃一次；孵育后，向细胞培养瓶中补充DMEM维持液，放入细胞培养箱中继续培养，观察细胞病变的情况。细胞病变率达到70~80%时，即可收病毒；将扩增的病毒放入-80℃反复冻融三次，细胞裂解，释放出病毒。
S1.2提取HSV-1基因组：参照HP病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书（货号：R6873，OMEGA）抽提HSV-1病毒基因组。
S1.3BAC-HSV-1重组质粒的构建与电转化：按照BAC/PACDNAKit(200)试剂盒（Omega，货号：D2156-02）说明书抽提BAC质粒，HSV-1基因组上连接酶切位点；同时双酶切HSV-1基因和BAC质粒，产生酶切后片段；T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜；双酶切再鉴定重组成功的BAC-HSV-1重组质粒，并用PCR扩增验证HSV-1基因；构建的BAC-HSV-1重组质粒电转至DH5α大肠杆菌。
S2、BAC基因敲除系统的构建
将I-SceI通过酶连接的方法插入到pREDI载体上。pREDI重组质粒的双酶切鉴定结果如图2-A所示，其中，泳道1指Ncol酶切的双片段，泳道2指pREDI质粒阳性对照；pREDI重组质粒的PCR验证结果如图2-B所示，泳道1指PhasB-I-SceI连接片段，泳道2指PhasB片段，泳道3指I-SceI片段。最后，将构建好的pREDI重组质粒电转至S1.3构建的含BAC-HSV-1重组质粒的DH5α大肠杆菌中。BAC基因敲除系统的示意图如图3-A所示，PCR验证结果图如图3-B所示，其中，泳道1-4指I-SceI片段，泳道6-9指PhasB片段，M指Marker。
S3、同源重组片段替代拟敲除基因
以外源性构建的Kam-SacB全片段为模板，使用引物（如SEQIDNO.13至SEQIDNO.16所示）PCR扩增拟敲除基因UL18的同源重组框，同源重组框包括拟敲除靶基因上下游各50bp同源序列、kanamycine基因和SacB基因，使kanamycine基因和SacB基因位于同源侧翼序列之间。PCR扩增△UL18基因敲除同源重组框的电泳图如图5所示，其中，图5-A指拟敲除基因UL18的下游同源序列的验证电泳图，图5-B指kanamycine基因片段的验证电泳图，图5-C指SacB基因片段的验证电泳图，图5-D指kanamycine+SacB重组片段的验证电泳图，图5-E指kanamycine+SacB+拟敲除基因UL18的下游同源序列的同源片段验证电泳图，图5-F指用于敲除UL18基因的同源重组框全序列的验证电泳图，M指Marker。将扩增的同源重组框电转化至BAC基因敲除系统中，阿拉伯糖诱导red重组酶合成，进行同源重组，kanamycine基因和SacB基因取代BAC-HSV-1上的拟敲除基因，验证结果如图6-A所示，其中，泳道3指拟敲除基因UL18片段，泳道5指SacB基因片段，泳道1-2指UL18片段的阳性对照，泳道7指SacB片段的阳性对照，M指Marker。
S4、基因敲除病毒株的筛选
kanamycine抗性筛选同源重组成功菌，鼠李糖诱导I-SceI内切酶合成，切除kanamycine基因和SacB基因，发生第二次同源重组，得到含单纯疱疹病毒Ⅰ型UL18基因敲除病毒株基因的宿主菌；扩大培养得到的含单纯疱疹病毒Ⅰ型UL18基因敲除病毒株基因的宿主菌，提取△BAC-HSV-1质粒，并将该△BAC-HSV-1质粒电转至宿主细胞中，形成HSV-1基因敲除病毒株，验证结果如图6-B所示，其中，泳道1-2指SacB基因的鉴定片段，泳道3-4指SacB片段的阳性对照，M指Marker。
S5、空斑纯化得到单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗
将S4得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗。
实施例三HSV-1US8基因敲除病毒株的构建
与实施例二类似，应用BAC基因敲除系统构建了HSV-1US8基因敲除病毒株。
使用引物（如SEQIDNO.5至SEQIDNO.8所示）PCR扩增拟敲除基因US8的同源重组框，同源重组框包括拟敲除靶基因上下游各50bp同源序列、kanamycine基因和SacB基因，使kanamycine基因和SacB基因位于同源侧翼序列之间。PCR扩增△US8基因敲除同源重组框的电泳图如图7所示，其中，图7-A指kanamycine+SacB重组片段的验证电泳图，图7-B指kanamycine+SacB+拟敲除基因US8的下游同源序列的同源片段验证电泳图，图7-C指用于敲除US8基因的同源重组框全序列验证电泳图，M指Marker。
将PCR重组成功的同源框片段电转至含有pREDI质粒的BAC-HASV-1宿主菌内。加入阿拉伯糖和鼠李糖诱导red重组酶表达，使得同源框片段与BAC-HSV-1的基因发生同源重组，验证结果如图8所示，其中图8-A指US8基因片段的验证电泳图，图8-B指kanamycine基因片段的验证电泳图，图8-C指SacB基因片段的验证电泳图，M指Marker，N指阴性对照，P指阳性对照；鼠李糖诱导I-SceI内切酶表达，切除kanamycine基因和SacB蔗糖抗性基因，完成US8基因的敲除，第二次同源重组成功得到含单纯疱疹病毒Ⅰ型US8基因敲除病毒株基因的宿主菌；扩大培养得到的含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌，提取△BAC-HSV-1质粒，并将该△BAC-HSV-1质粒电转至宿主细胞中，形成HSV-1US8基因敲除病毒株，PCR电泳图如图8-D、8-E和8-F所示，其中图8-D指US8基因片段的验证电泳图，图8-E指kanamycine基因片段的验证电泳图，图8-F指SacB基因片段的验证电泳图。
将得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型US8基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗。
实施例四HSV-1ICP8基因敲除病毒株的构建
与实施例二类似，应用BAC基因敲除系统构建了HSV-1ICP8基因敲除病毒株。
实施例五HSV-1UL41基因敲除病毒株的构建
与实施例二类似，应用BAC基因敲除系统构建了HSV-1UL41基因敲除病毒株。
实施例六HSV-1基因缺失减毒活疫苗的毒力测定
应用BAC基因敲除系统通过同源重组构建了一系列HSV基因缺失病毒株，检测HSV-1基因缺失病毒株与原始病毒株的病毒滴度，获得毒力减弱的HSV基因缺失减毒活疫苗。
、空斑减数实验检测病毒滴定
S1、用Vero细胞分别扩增野生型（F-HSV-1）、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五制备的基因敲除型重组菌，使用VP方法测定病毒滴度，病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。调整野生型和各基因敲除型重组菌到相同的OD值。
S2、将生长良好的vero细胞消化后，铺24孔板，密度约为1.5×105个/ml，每孔加入500ml细胞稀释液。至于37℃，CO2含量为5％的培养箱中培养。使第二天细胞汇合度达到80~90%。
S3、细胞长成单层后，弃培养液，清洗1次，每孔中分别加入相同OD值的野生型和各基因敲除型重组菌放置细胞培养箱中培养2h，这段时间是病毒吸附的过程。2h后，加入覆盖液继续培养。
S4、培养约72h后，取出24孔板，将孔内的液体吸出，并用PBS洗一遍，每孔加入500μl的10%甲醛溶液500μl固定15min；随后吸甲醛溶液，每孔加入400μl1%结晶紫染色，15min后，置入盆中用水冲洗。
空斑抑制率=（野生型空斑数-基因敲除型重组菌空斑数）/野生型空斑数*100%。
实验结果：HSV-1UL18基因敲除后，空斑抑制率达到79.39%；HSV-1US8基因敲除后，空斑抑制率达到83.23%；HSV-1UL41基因敲除后，空斑抑制率达到77.46%；HSV-1UL5基因敲除后，空斑抑制率达到76.29%。
UL18、UL5、UL41和US8等基因敲除后的减毒效果明显，由于它仅仅敲除HSV-1的个别基因，保留了其他的免疫原性，进入机体后仍能刺激机体产生免疫应答。
、动物实验检测病毒毒力
SPF级别实验小白鼠40只，雌性，体重25土3g，随机分为对照组和实验组，每组各20只。两组经鼻腔滴注途径分别给予野生型、实施例二的△UL18-HSV-1、实施例三的△US8-HSV-1、实施例五的△UL41-HSV-120μl。
实验结果：对照组小鼠在滴鼻后第7天开始出现死亡，第15天后全部死亡，死亡率为100％；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，这说明和野生型相比，△UL18-HSV-1、△US8-HSV-1和△UL41-HSV-1几乎没有致病能力。
、细胞DNA损伤检测及CHL细胞染色体畸变试验
在没有外界损伤的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于HSV基因缺失减毒活疫苗中，通过彗星电泳检测该减毒活疫苗对细胞的DNA损伤。
培养的哺乳动物细胞暴露于HSV基因缺失减毒活疫苗中，用中期分裂相阻断剂（秋水仙素）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变率，以评价受试物对生物体遗传物质的损伤效应。（同时设立空白对照和原始毒株对照）
实验结果：△UL18-HSV-1、△US8-HSV-1和△UL41-HSV-1几乎对细胞DNA没有损伤，说明其制备成减毒活疫苗以后安全，毒性小；而野生型HSV-1感染后，细胞的DNA受到了很大的损伤，明显可以看出其细胞毒性。
实施例七活疫苗△UL18-HSV-1对小鼠的免疫保护
购6周龄雄性小鼠，随机分为实验一组、实验二组、阴性对照一组、阴性对照二组、正常对照组。实验一组双侧股四头肌肉注射HSV-1UL18基因缺失减毒活疫苗免疫小鼠（100μg/只），分三次免疫，每一周免疫一次，共21天。末次免疫后1周后进行取样检测。实验二组：注射HSV-1US8基因缺失减毒活疫苗阴性对照一组：注射BAC免疫小鼠；阴性对照二组：注射BAC-HSV-1免疫小鼠；正常对照组：注射相同体积量的生理盐水。
病毒攻击保护实验：小鼠末次免疫1周后，在各组各取6只小鼠10LD50HSV-1病毒液0.5ml，每天观察小鼠的生存情况，共观察3周，记录各组小鼠存活率。
实验结果：小鼠遭病毒攻击后第5天开始出现死亡情况，第13天全部死亡，死亡率为100%；阳性组全部存活，死亡率为0。阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击，且几乎没有致病能力。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>暨南大学
<120>单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法
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Claims (10)

1.一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：包含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL41和US8中的至少一个。
3.根据权利要求2所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的US8基因。
4.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、BAC-HSV-1宿主菌的构建：扩大培养HSV-1病毒，提取HSV-1基因组，并与BAC质粒重组，构建得到BAC-HSV-1重组质粒，BAC-HSV-1重组质粒电转化至宿主菌，得到BAC-HSV-1宿主菌；
S2、BAC基因敲除系统的构建：将I-SceI插入到pREDI载体上，并将构建的pREDI重组质粒电转化至S1构建的BAC-HSV-1宿主菌，得到BAC基因敲除系统；
S3、同源重组片段替代拟敲除基因：以Kam-SacB全片段为模板，PCR扩增拟敲除基因的同源重组框，先进行第一次PCR扩增，再以第一次PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增，得到同源重组片段，电转化至S2构建的BAC基因敲除系统中进行第一次同源重组，由抗性基因和SacB基因共同取代BAC-HSV-1中的拟敲除基因；
S4、基因敲除病毒株的筛选：抗性基因筛选同源重组成功菌，鼠李糖诱导I-SceI内切酶合成，切除抗性基因和SacB基因，发生第二次同源重组，得到含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌；扩大培养得到的含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌，提取△BAC-HSV-1质粒，并将该△BAC-HSV-1质粒电转至宿主细胞中，形成单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株；
S5、将S4得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗。
5.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：
所述同源重组框包括拟敲除基因上下游各50bp同源序列、抗性基因和SacB基因。
6.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述拟敲除基因为UL5，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA，下游引物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC；第二次PCR的上游引物为GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC，下游引物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC。
7.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述拟敲除基因为US8，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为TAAGGCGCCCCATCCCGAGGCCCCACGTCGGTCGCCGAACTGGGCGACCGCGATTTATTCAACAAAGCCA，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGATAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAAGAATGGCGC；第二次PCR的上游引物为TGTTGGGCTCCCATTTTACCCGAAGATCGGCTGCTATCCCCGGGACATGTAAGGCGCCCCATCCCGAGGC，下游引物为ACGGAGCCGTTGGTGATAAGATCTCAAAGCCGGATCCATTGGTGGAGGGAGCATCTTGCAAGAATGGCGC。
8.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述拟敲除基因为UL41，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CTACATGTCAGGTCAATTGTAACTGCGGATCGGCCTAACTAAGGCGTGGTTCGATTTATTCAACAAAGCC，下游引物为CGTCATGTACACGTTGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAAGAATGGCGC；第二次PCR的上游引物为TGGTGGGTCGTTTGTTCGGGGACAAGCGCGCTCGTCTGACGTTTGGGCTACATGTCAGGTCAATTGTAAC，下游引物为CGTCATGTACACGTTGGTGGTCAAATATCAGCGCCGATACCCCAGTTACGGCATCTTGCAAGAATGGCGC。
9.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述拟敲除基因为UL18，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为CTGGCAATTACCCTGTTATCCCTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTT，下游引物为CATCGCGATACCCTCGGGCATCTCGCATCTTGCAAGAATGGGCCTCGTT；第二次PCR的上游引物为TGGATGCCCACCCCCACCCCCCCGTGGGTCTAGCCGGGC，下游引物为ATGCTGGCGGACGGCTTTGAAACTGACATCGCGATACCCTCGGGCATCTCG。
10.根据权利要求4或5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：所述抗性基因选自kanamycine抗性基因、Ampicillin抗性基因、chloramphenicol抗性基因或荧光蛋白基因；所述宿主菌为DH5α大肠杆菌；所述宿主细胞为Vero细胞。
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