CN101926992B

CN101926992B - 单纯疱疹病毒i型基因重组减毒活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101926992B
Application number: CN 201010253601
Authority: CN
Inventors: 刘景伟
Original assignee: ZHENGZHOU JINSEN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Fan Kewei
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2010-08-16
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2030-08-16
Also published as: CN101926992A

Abstract

本发明公开了一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗及其制备方法，它可以获得敲除了其基因组中UL43到UL47基因的HSV-1重组株；可以获得联合敲除了其基因组中的UL43到UL4之间的基因片段和其它复制或感染非必需基因片段US9和US10、US11和US12基因片段的HSV-1重组株。本疫苗保留了单纯疱疹病毒I型大部分抗原，具有较高的免疫原性，能很好地模拟野生型HSV-1，有效地诱导机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防线，降低人群发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，有可能清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。

Description

单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够防治单纯疱疹病毒I型感染所致疾病的基因重组减毒活疫苗及其制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一种经皮肤和粘膜密切接触传播的病毒，包括单纯疱疹病毒I型(简称HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(简称HSV-2)，两种病毒具有83％以上的共同基因特征，50％以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可高达80％以上，并长期潜伏于感觉神经节内，虽然大多数HSV-1感染者没有明显症状，但少数感染者可产生终生的反复发作的面口疱疹、致盲性很高的眼内眼炎以及致命性的疱疹性肺炎和疱疹脑炎。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，占生殖器疱疹原发感染的90％以上。II单纯疱疹病毒感染人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在神经节内，在机体免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其中60％-70％的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。研究表明安全套并不能有效预防疱疹病毒感染，世界范围内生殖器疱疹发病率在逐年上升，据美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病率已经上升到了16％以上，在纽约已经上升至25％以上，目前并无单纯疱疹病毒感染，尤其是复发性感染的特效治疗方法，抗病毒药物常规用药虽能缓解一些临床症状，但不能彻底清除体内潜伏的病毒，也不能减少复发次数，因此迫切需要开发能有效防治单纯疱疹病毒感染的疫苗。

近数十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。

病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，这种类型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗等在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了不可替代的作用，为人类的健康做出了不可磨灭的贡献。减毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一样的感染和复制特性，但没有致病作用，此类疫苗可以有效地诱导机体产生全面的免疫应答，相对于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好。

传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。近年来，研究者开始采用现代分子生物学技术，将HSV基因组的特定基因进行敲除以获得重组株。本发明则是利用现代分子生物学技术，以Genebank中的HSV-1和HSV-2基因组参考序列(HSV-1登录号：NC_001806，HSV-2登录号：NC_001798)为蓝本，通过联合敲除多个基因，筛选出了HSV-1型和HSV-2型重组减毒株，它们的致病能力均发生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-1和HSV-2感染所致疾病。

发明内容

本发明的目的是提供能够预防和治疗单纯疱疹病毒I型感染所致疾病的重组减毒活疫苗及所述疫苗的制备方法。

本发明涉及的单纯疱疹病毒I型重组株均由野生型HSV-1经过重组、筛选和纯化得来的。

所采用的技术方案是取水泡较为明显的口唇疱疹和生殖器疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型HSV-1；扩大培养后提取病毒完整基因组；和含有荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列的穿梭载体共同转染Vero细胞；在荧光显微镜下使用荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒，经过空斑纯化后可获得所需要的重组减毒活疫苗。

可以获得一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组中UL43到UL47基因的HSV-1重组株。

可以获得一种其上所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲除了其基因组中的UL43到UL4之间的基因片段和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-1重组株；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、US11和US12基因片段。

用类似的方法在上述重组株的基础上可进一步敲除其它如基因获得致病性进一步减低的重组株。

作用在小鼠身上可证明，上述的重组株病毒致病能力均有不同程度的减弱，可以保护小鼠免受致死量单纯疱疹病毒I型攻击；作用在豚鼠身上证明重组株可以预防和治疗豚鼠生殖器疱疹。上述重组株可以作为重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗以防治单纯疱疹病毒感染所致相关疾病。

本发明用以构建同源重组穿梭质粒的pShuttle-CMV质粒购自Stragene公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。

本发明所用荧光标记基因是绿色荧光蛋白表达盒和红色荧光蛋白表达盒。

本发明的有益效果：相比传统疫苗而言，本发明制备的减毒活疫苗均是经过基因工程重组后的减毒活疫苗，不易发生毒力回复，其它生物学特性和野生型单纯疱疹病毒相似，但进入机体后仅能刺激机体产生免疫应答而无致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保留了单纯疱疹病毒I型大部分抗原，具有较高的免疫原性，能很好地模拟野生型HSV-1，有效地诱导机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防线，降低人群发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，有可能清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。

附图说明

图1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗的构建策略示意图

图2重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01L结构示意图

图3重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01LS结构示意图

具体实施方式

本发明技术方案中单纯疱疹病毒I型重组减毒活疫苗的总体构建策略参见附图1。提取野生型HSV-1完整基因组；构建含有绿色或红色荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的侧翼序列的同源重组穿梭载体，共同转染Vero细胞，在荧光显微镜下挑选表现相应颜色荧光的重组病毒，经过空斑纯化后可获得敲除了HSV-1重组减毒活疫苗。其中：

敲除了HSV-1 UL43到UL47基因的HSV-1重组株，命名为JSH01L；

敲除了HSV-1 UL43到UL47和US9到US12基因的HSV-1重组株，命名为JSH01LS。

实施例1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01L构建

1.分离野生型HSV-1

(1)取临床HSV感染的病人疱疹液和分泌物，加入1mlPBS缓冲液后用0.45微米滤器过滤。

(2)取一个六孔板，每孔传2×10⁵个Vero细胞，在5个孔内每孔加入200微升病毒过滤液，一个孔留作对照。

(3)放入37℃二氧化碳培养箱中培养48-72小时后观察孔内细胞病变效应(CPE)。

(4)待六孔板孔内细胞出现完全CPE后将培养基和细胞一起收入离心管中。

(5)将离心管在37℃-负80℃下冻融3次，5000转离心10分钟后将上清转入2ml EP管中，放入负80℃冰箱中备用。

(6)自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鉴定引物分型，分离一株HSV-1。

2.提取HSV-1基因组

(1)感染前一天，胰酶消化并计数vero细胞，每个10cm平皿接种3×10⁶细胞，补足10mL含血清正常细胞生长培养液。

(2)感染当天，确认细胞达到80-90％融合。加原始HSV-1病毒粗体液100微升(如果已知滴度则按MOI＝10)到细胞中，蜗旋平皿轻轻混匀。

(3)在37℃ CO2培养箱培养，直到80-90％的细胞出现圆缩(一般感染后2-3天)。

(4)用吸管轻轻吹打平皿，将细胞和培养基一起转移至无菌15mL离心管中，于-80℃ 30分钟，然后在37℃水浴15分钟解冻。重复此步骤三次，3000转离心15min。

(5)收集上清液于-80℃保存。

(6)0.45微米过滤后加保护剂保存于-80℃。若需要长期保存，则加入10％甘油，置于-80℃。HSV-1在4℃保存时滴度下降比较快，所以HSV-1应该分装保存在一80℃，每次使用时取出实验所需量，一次用完，无需反复冻溶，既能保证每次使用的滴度，又能大大降低HSV-1被污染的机率。

(7)取300微升病毒液加入700微升高纯水，加入10微升蛋白酶K、10％的SDS50微升(使终浓度分别稀释为蛋白酶K的100倍稀释、SDS的50倍稀释)混匀。37℃水浴过夜。

(8)加入同体积的酚12000rpm离心5min。收集上层液体。一般情况下抽提2-3次，至无蛋白析出。

(9)加入同体积的酚氯仿异戊醇(即500微升氯仿异戊醇、500微升酚)12000rpm离心5min抽提2-3次，收集上层液体。

(10)加入4℃预冷的十分之一体积的乙酸钠、2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，-20℃沉淀30min或过夜。

(11)12000rpm 4℃离心15min。弃上清。

(12)1ml4℃预冷的70％乙醇洗1-2遍，12000rpm 4℃离心5min。

(13)弃上清，自然干燥或37℃干燥。

3.构建同源重组穿梭载体pShuttle-01L-GFP。

(1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-1基因组UL区UL43～UL47的序列，分别设计UL43基因的左侧侧翼序列和UL47基因的右侧侧翼序列的扩增引物。

(2)UL43侧翼序列的引物设计

在UL43左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在UL43左侧翼序列下游引物的5’末端添加PmeI、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。

(3)UL47侧翼序列的引物设计

UL47右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，UL47右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。

(4)PCR扩增GFP表达质粒pLKO-GFP(由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。

(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。

(6)用NotI和PmeI酶切UL43侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切UL47侧翼序列PCR产物，回收酶切产物。

(7)分两步将步骤(5)和(6)中回收的产物克隆至pShuttle-CMV载体上后即构建成功pShuttle-01L-GFP。

4.同源重组生产HSV-1重组株JSH01L

(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-01L-GFP质粒。

(2)用脂质体2000将HSV-1基因组和pShuttle-01L-GFP质粒共转染至vero细胞。

(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有1ML培养基的EP管中。

(4)将EP管在-80℃和37℃反复冻融三次。

(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-1敲除株JSH01L，参见附图2。

(6)用Vero细胞增殖后用TCID50法测定滴度：

实验操作：

(6.1)收集一瓶Vero细胞，计数。

(6.2)用DMEM 2％准备20ml 10⁵/ml细胞。

(6.3)用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。

(6.4)稀释病毒液，在第1管中加入0.9ml DMEM 2％，其余加入1.8ml。

(6.5)在第1管中再加入0.1ml病毒保存液。

(6.6)换用新枪头，上下吸打5次混匀。

(6.7)从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。

(6.8)反复稀释至最高稀释度。

(6.9)用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。

(6.10)最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2％监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。

(6.11)37℃培养10天。

(6.12)10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。

(6.13)计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本测试即为有效。按照下述公式计算滴度：T＝101+d(S-0.5)IU/ml，其中d＝Log10稀释倍数，S＝从第一次稀释起的阳性比率之和，2次平行实验得到的滴度值应相差≤10^0.7。

实施例2重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01L的致病能力减低

1.实验材料：

野生型单纯疱疹病毒I型：用Vero细胞扩增后测定滴度，滴度约为1×10⁹IU/ml；

重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01L：用Vero细胞扩增后滴度约为1×10⁹IU/ml；

普通级别实验小白鼠：30只，雌性，体重20土2g，每一只都在其身体的不同部位做好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为对照组、正常剂量组和高剂量组三组。

2.实验操作：

经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01L，高剂量组给予100微升JSH01L，观察小鼠情况。

3.结果：对组组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死亡率为100％；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，这说明和野生型相比，JSH01L几乎没有致病能力。

实施例3活疫苗JSH01L对小鼠的免疫保护实验

1.实验材料：

野生型单纯疱疹病毒I型：用Vero细胞扩增HSV-1后测定滴度，滴度约为1×10⁹IU/ml；

正常细胞裂解液：培养皿中正常培养的Vero细胞刮下后在-80℃和37℃反复冻融后过滤。

普通级别实验小白鼠：30只，雌性，体重20土2g，每一只都在其身体的不同部位做好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为15只/组，分为阴性组和阳性组共两组。

2.免疫及攻毒方案

免疫剂量：10⁷TCID₅₀重组病毒；途径：鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-1进行攻击试验，计算小鼠死亡率，确定保护效果。

3.操作步骤：

(1)小鼠随机分组后阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升正常细胞裂解液；阳性组同样方法给于50微升JSH01L，观察小鼠情况。

(2)第5周，攻毒实验；

1)用lmL注射器吸取0.1ml HSV-1病毒(含10⁸IU)。

2)小鼠腹腔内注射HSV-10.1ml。

3)观察小鼠情况

结果：小鼠攻毒后阴性组死亡情况。攻毒后第5d开始出现死亡情况，第13后全部死亡，阳性组存活。阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量单纯疱疹病毒I型攻击。

实施例4重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS构建

JSH01LS的构建策略和方法类似实施例1，具体详述如下：

1.构建US9到US12基因联合敲除的HSV-1敲除株JSH01S。

(1)构建同源重组穿梭载体pShuttle-01-RED。

1.1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-1基因组的US区US9～US12的序列，分别设计US9基因的左侧侧翼序列和US12基因的右侧侧翼序列的扩增引物。

1.2)US9侧翼序列的引物设计

在US9左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US9左侧翼序列下游引物的5’末端添加PmeI、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。

1.3)US12侧翼序列的引物设计

US12右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US12右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。

1.4)用BglII和BamHI双酶切pDsred1-c1，连接，转化，得pDsredbb质粒。

1.5)用AseI和MluI切pDsredbb质粒，电泳回收1.5kb片段

1.6)用NotI和PmeI酶切US9侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US12侧翼序列PCR产物，回收酶切产物。

1.7)将步骤1.5)和1.6)中回收的产物分两步克隆至pShuttle-CMV载体后即构建成功pShuttle-01-RED。

(2)同源重组生产HSV-1敲除株JSH01S

2.1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-01-RED质粒。

2.2)用脂质体2000将HSV-1基因组和pShuttle-01-RED质粒共转染至vero细胞。

2.3)在倒置荧光显微镜下将红色CPE处的细胞吸出，转移至含有1ML培养基的EP管中。

2.4)将EP管在-80℃-37℃反复冻融三次。

2.5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出红色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-1重组株JSH01S。

2.6)用Vero细胞扩增JSH01S后提取基因组备用。

2.联合应用红色和绿色荧光标记构建HSV-1重组减毒活疫苗JSH01LS----同源重组生产HSV-1敲除株JSH01LS

(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-01L-GFP质粒。

(2)用脂质体2000将表达红色荧光JSH01S基因组和pShuttle-01L-GFP质粒共转染至vero细胞。

(3)在倒置荧光显微镜下将同时表现红色和绿色荧光的CPE处的细胞吸出，转移至含有1ML培养基的EP管中。

(4)将EP管在-80℃-37℃反复冻融三次。

(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-1重组株JSH01LS，参见附图3。

实施例5重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS的致病能力减低

1.实验材料：

重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS：用Vero细胞扩增后滴度约为1×10⁹IU/ml；

2.实验操作：

经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01LS，高剂量组给予100微升JSH01LS，观察小鼠情况。

3.结果：对照组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死亡率为100％；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，这说明和野生型相比，JSH01LS几乎没有致病能力。

实施例6活疫苗JSH01LS对小鼠的免疫保护实验

1.实验材料：

普通级别实验小白鼠：30只，雌性，体重20土2g，每一只都在其身体的不同部位做好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为15只/组，分为阴性组和阳性组。

2.免疫及攻毒方案

免疫剂量：10⁷TCID50重组病毒；途径：鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-1进行攻击试验，计算小鼠死亡率，确定保护效果。

3.操作步骤：

(1)小鼠随机分组后，阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升正常细胞裂解液；阳性组同样方法给于50微升JSH01LS，观察小鼠情况。

(2)第5周，攻毒实验；

1)用1mL注射器吸取0.1ml HSV-1病毒(含10⁸IU)。

2)小鼠腹腔内注射HSV-10.1ml。

3)观察小鼠情况

4.结果：小鼠攻毒后阴性组死亡情况。攻毒后第5天开始出现死亡情况，第13后全部死亡，死亡率为100％；阳性组全部存活，死亡率是0。阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。

Claims

1.一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因。

2.一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联合敲除了其基因组中的UL43到UL47的基因片段和其它复制或感染非必需基因片段；

所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、US11和US12基因片段。

3.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：

步骤一：取疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型单纯疱疹病毒I型；

步骤二：扩大培养后提取病毒完整基因组，设计引物扩增出单纯疱疹病毒I型病毒基因组的UL43基因左侧700bp至2000bp的同源侧翼序列和单纯疱疹病毒I型病毒基因组的UL47基因右侧700bp至2000bp的同源侧翼序列；

步骤三：将步骤二所述同源侧翼序列和荧光蛋白基因克隆至pShuttle-CMV载体，使荧光蛋白基因位于同源侧翼序列之间，再和单纯疱疹病毒I型基因组共转染至Vero细胞中，进行同源重组；

步骤四：在荧光显微镜下使用荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒；经过空斑纯化后可获得单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗。