CN114457042A - 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小反刍兽疫强毒的反向遗传系统，一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)(还有一种表达GFP的示踪重组小反刍兽疫强毒)。以及一种rPPRV动物感染模型，采用重组拯救病毒rPPRV对反刍兽进行攻毒。通过联合采用滴鼻和皮下注射两种途径对反刍兽进行攻毒，成功获得了小反刍兽疫的动物感染模型，为小反刍兽疫的疫苗研制、致病机制等研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及小反刍兽疫强毒的反向遗传系统及小反刍兽疫病毒感染的动物模型的建立。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是一种由PPR病毒(PPRV)引起的急性、高度接触性传染病。PPR主要感染小反刍兽，如绵羊和山羊，其中山羊比绵羊更容易感染该疾病，新生和幼小动物比成年动物更易受到影响。因此疫苗的使用不可或缺，尤其是新型DIVA疫苗的开发将对我国 PPR的消灭具有重要意义。然而，小反刍兽疫疫苗研制离不开有效性评价，目前我国小反刍兽疫不管是目前正在全国范围内使用的Nigeria75/1弱毒苗(HAMMOUCHI et al.,2012)，还是正在研究的重组山羊痘病毒载体苗，其攻毒保护评价都在国外完成(哈萨克斯坦和摩洛哥)，因此PPRV的动物感染模型是制约我国小反刍兽疫疫苗研制的重大瓶颈。
这主要是由于小反刍兽疫病毒基因组全长15954bp，在麻疹病毒属中最长，很难获得真实cDNA序列。序列的完整性和真实性是构建感染性克隆的先决条件，如果人为的引入某些碱基突变，将使病毒cDNA的感染性受到影响，甚至丧失感染性(BOYER and HAENNI,1994)。随着片段长度的增加，在PCR以及构建质粒的过程中发生突变的几率也在增加，获得真实全长cDNA和辅助质粒的几率也在降低。
为了构建我国自主的PPRV的动物感染模型，保证获得PPRV的cDNA的真实性，本发明采用黑龙江株(PPRV/CN/HLJ/13)及依据该流行株在体外拯救的rPPRV/CN/HLJ/13病毒，对山羊进行攻毒，构建rPPRV动物感染模型。
发明内容
首先，本发明提供一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)。进一步，本发明优选提供小反刍兽疫黑龙江株PPRV/CN/HLJ13株(以下简写为PPRV/CN/HLJ/13) 拯救的重组拯救病毒rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。
根据对PPRV序列的测序，设计并合成了特定的PCR扩增引物及鉴定引物，扩增了多个可以覆盖全长基因的重叠片段，并分别连接到相应载体中去，将各片段扩增后依次连接成全长cDNA，得到感染性克隆质粒pCN13，并在此基础上设计引物在N和P之间插入GFP 表达框架，获得感染性克隆质粒pCN13-GFP。为了保证感染性克隆中全长cDNA在其转录时5’和3’端准确和完整，分别在5’和3’端两端分别引入锤头状核酶序列和丁肝核酶(HDV) 序列。将感染性克隆质粒pCN13和pCN13-GFP分别和辅助质粒pCI-N共转染Vero-gSLAM 细胞，待细胞出现CPE和荧光时，收获病毒悬液，冻于-70℃保存。将救获病毒分别命名为 rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。
其次，本发明提供一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救方法，所述方法包括如下步骤：
(1)、PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13的构建，根据对PPRV序列的测序，将PPRV CN/HLJ/13序列分成互相重叠的多个部分，设计并合成特定的PCR扩增引物及鉴定引物，以使扩增的多个重叠片段的目的基因可以覆盖PPRV全长基因，将各段目的基因克隆至载体上构建出相应的中间质粒，然后根据特定的引物将相应中间质粒扩增克隆到PCI载体上，经酶切后构建出PPRV CN/HLJ/13株全长cDNA质粒pCN13；
(2)、表达GFP基因的PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13GFP的构建，将GFP 基因克隆至处理好的纯化的线性化的pCN13中，获得pCN13-GFP质粒。
(3)、重组病毒的拯救，将感染性克隆质粒pCN13和pCN13-GFP分别和辅助质粒pCI-N 共转染Vero-gSLAM细胞，待细胞出现CPE和荧光时，收获病毒悬液，将救获病毒分别命名为rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。
其中，优选将PPRV CN/HLJ/13序列分成互相重叠的3个部分。
进一步，本发明提供一种rPPRV动物感染模型，优选提供小反刍兽疫黑龙江株PPRV/CN/HLJ/13株(以下简写为PPRV/CN/HLJ/13)拯救的重组拯救病毒rPPRV/CN/HLJ/13的动物感染模型，采用重组拯救病毒rPPRV/CN/HLJ/13对山羊进行攻毒。通过联合采用滴鼻和皮下注射两种途径对山羊进行攻毒，成功获得了小反刍兽疫黑龙江株的动物感染模型，为小反刍兽疫的疫苗研制、致病机制等研究奠定了基础。
本发明涉及的重组小反刍兽疫黑龙江13株rPPRV/CN/HLJ/13已于2021年05月25日提交中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，保藏号：CCTCC No:V202135；绿色荧光蛋白重组小反刍兽疫黑龙江13株rPPRV/CN/HLJ/13/GFP已于2021年05月25日提交中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，保藏号：CCTCC No:V202136。
附图说明
图1：pCN13质粒和pCN13-GFP质粒构建示意图
图2：重组质粒的酶切鉴定
图3：拯救强毒感染Vero-gSLAM和Vero细胞
图4：PPRV感染Vero-gSLAM并表达
图5：重组病毒动力学生长曲线
图6：感染羊的临床症状和肺脏病变
图7：rPPRV/CN/HLJ/13攻毒后体温变化情况
图8：PPRV/CN/HLJ/13攻毒后体温变化情况
图9：存活率曲线
图10：攻毒后组织中的病毒载量：MN：肠系膜淋巴结；S：脾；L：肺；2、3、5、6号羊接种rPPRV/CN/HLJ/13， 1、4号羊为对照；7、8、10、12号羊接种PPRV/CN/HLJ/13，9、11号羊为对照
具体实施方式
通过如下实施例对本发明进行说明。
用于实验的材料来源：
小反刍兽疫黑龙江株PPRV/CN/HLJ/13株(以下简写为PPRV/CN/HLJ/13)是在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家动物疫病防控高级别生物安全实验室生物安全三级防护条件下分离和保存；
pN75/1-GFP质粒由本实验室构建并保存；
DH5α大肠杆菌感受态细胞、DNA片段纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、
MaxSuper-Fidelity DNA聚合酶、反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
PMSF、RIPA强效裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；
pBlueScript质粒由本实验室保存。
细胞培养液均为含10％FBS的DMEM。
实施例1：引物的设计
对PPRV CN/HLJ/13的核酸进行测序，根据结果，将其分成互相重叠的3部分，利用Oligo 软件设计特异性引物扩增PPRV CN/HLJ/13全长cDNA(表1)，构建全长cDNA感染性克隆，并在此基础上设计引物GFP引物将GFP基因插入(表2)。试验中克隆所使用的引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。
实施例2：PPRV病毒基因组全长cDNA克隆的构建与鉴定
将PPRV CN/HLJ/13分成互相重叠的3部分，以PPRV CN/HLJ/13株病毒提取RNA，利用特异引物(表1)进行反转录成cDNA，以cDNA为模板，将各段目的基因克隆至pBlueScript载体上，转化至DH5α，每个挑取3个克隆送测序。构建出3个中间质粒，然后用表2设计的引物将3个质粒扩增克隆到PCI载体上，并在此基础上将GFP片段插入到P和M基因之间。挑选3个克隆，经过EcoRⅠ和SmaⅠ分别酶切，切出图2条带，与预期相符；基因组5’端和3’端引入锤头状核酶序列和丁肝核酶序列，构建出PPRV CN/HLJ/13株全长cDNA 质粒，具体操作顺序按照图1。质粒构建完成后用表4-1的引物进行PCR扩增，产物经胶回收后测序，结果表明成功构建了pCN13和pCN13GFP感染性克隆。
实施例3：表达GFP基因的PPRV病毒基因组全长cDNA克隆的构建与鉴定
以pN75/1-GFP质粒为模板扩增GFP基因，使用引物GFP-F/R(表2)通过PCR方法扩增该基因并纯化，并将GFP基因克隆至处理好的纯化的线性化的pCN13中，具体操作顺序按照图1。质粒构建完成后用表1的引物进行PCR扩增，产物经胶回收后测定序列，再分别用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切该质粒，将正确质粒命名为pCN13-GFP。具体构建示意图见图 1。
实施例4：重组病毒的拯救及扩增
将Vero-gSLAM细胞提前24h铺于6孔板中，待细胞密度为90-100％时，利用Lipofectamine 3000(Invitrogen)将感染性克隆质粒pCN13和pCN13-GFP分别和辅助质粒pCI-N共转染Vero-gSLAM细胞，37℃、5％CO2培养箱培养。转染后4-6h弃去含有转染混合物的培养液，加入含2％DMEM培养液；5-7天后冻融2次，分别刮下细胞吹匀，取300 μl接种至生长过夜、状态良好、密度约90％的Vero-gSLAM细胞，37℃感作1h，弃上清，加入2ml含有2％FBS的DMEM培养约3-5d，显微镜下观察是否出现病变(cytopathic effect， CPE)和荧光；待细胞出现CPE和荧光时，收获病毒悬液，冻于-70℃保存。将救获病毒分别命名为rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。
在Vero-gSLAM细胞系上感染rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP，结果显示，在可见光下两种重组病毒感染细胞均有明显的细胞融合和CPE出现；在红色荧光下显示明显的细胞融合；在绿色荧光下，rPPRV/CN/HLJ/13/GFP感染细胞显示出明显的于红色荧光下相同的细胞融合现象，而rPPRV/CN/HLJ/13感染细胞则无绿色荧光。(见图3，箭头所指为细胞融合和CPE)。亲本毒PPRV/HLJ/13株与rPPRV/CN/HLJ/13一样，仅可感染 Vero-gSLAM形成明显细胞融合。结果表明可以从全长cDNA拯救出有感染性的病毒，该病毒可以表达外源基因，并可以复制产生子代病毒。
实施例5：重组病毒基因序列的鉴定
取野生毒株PPRV/CN/HLJ/13、救获的重组病毒rPPRV/CN/HLJ/13及表达GFP的重组病毒rPPRV/CN/HLJ/13/GFP悬液各200μl，提取RNA，利用鉴定引物(表1)将提取的RNA 进行反转录，反转录出来的cDNA用鉴定引物(表1)并用Phanta Max Super-Felidety DNA 聚合酶进行PCR扩增，扩增后的PCR片段经胶回收纯化后测序。
实施例6：种毒的制备及滴定
将鉴定正确的重组病毒rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP分别在 Vero-gSLAM上扩增，按MOI 0.1接种病毒，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞出现80％CPE或荧光时，将细胞及上清冻融2次吹匀，5000rpm离心5min，取上清分装在 1.5ml的无菌EP管中，冻存于-70℃。
Vero-gSLAM细胞接种于96孔细胞培养板，过夜生长，细胞密度70-90％时使用。将待滴定病毒连续10倍梯度稀释后，96孔细胞培养板中每孔加入20μl稀释好的病毒液，每个稀释度做8个平行重复。将96孔细胞培养板置于5％CO2、37℃温箱中，15min晃动一次细胞培养板，1h后每孔加入180μl含2％FBS的DMEM培养液，置于温箱中继续培养。于显微镜下或者荧光显微镜下观察细胞病变和荧光并计算病毒滴度，方法为Reed-Muench 法，病毒滴度单位为TCID50/ml。
实施例7：免疫印迹试验检测重组病毒在Vero-gSLAM细胞中的感染情况
PPRV/CN/HLJ/13、rPPRV/CN/HLJ/13、rPPRV/CN/HLJ/13/GFP分别按MOI 0.1接种于Vero-gSLAM细胞，病变约70-90％时，收获细胞，5000rpm离心5min，弃去上清并加入适量PMSF、RIPA强效裂解液混匀后置于冰上作用30min，加入5×SDS混匀后于沸水中煮10min；将裂解的样品进行SDS-PAGE电泳，转印于PVDF膜上；5％脱脂乳封闭，PBST(含有0.05％Tween的PBS)洗涤两次，加入1:200稀释的针对PPRVN蛋白的单克隆抗体，于室温孵育1h后， PBST洗3遍；加入IgG孵育1h，PBST洗涤3遍；最后用增强化学发光显影试剂显色，Azure c300成像系统拍照。
结果显示，在约55kDa附近出现PPRV N蛋白条带(图4)，符合预期，说明PPRV在Vero-gSLAM上能够感染复制。另外，三种病毒的N蛋白表达量相似，表明建立的PPRV强毒反向遗传系统对体外拯救病毒的感染复制无明显影响。
实施例8：重组病毒在Vero-gSLAM细胞上的生长动力学
将Vero-gSLAM接种12孔细胞培养板，待细胞密度为90％时按照MOI为0.01接种病毒，4℃孵育1h，弃去病毒液，用1×PBS洗3遍，加入含有2％FBS的DMEM培养液，感染后24h，48h，72h，96h，120h收集细胞及上清，反复冻融3次后提取RNA进行qPCR，绘制病毒动力学生长曲线。结果显示，三者具有相似的生长曲线，且病毒核酸拷贝数均在感染后3-4d达到高峰，然后进入平台期(图5)。
实施例9：动物感染模型的建立
材料：1.5ml一次性无菌注射器，1.5ml离心管，酒精棉球，密封袋，消毒液，PPRV/CN/HLJ/13 和rPPRV/CN/HLJ/13病毒。
方法：
攻毒：选用5-12月龄健康山羊共12只，将其随机分为两组，1-6号为第1组 (rPPRV/CN/HLJ/13攻毒组，其中1号、4号为同居对照)，7-12号为第2组(PPRV/CN/HLJ/13 攻毒组，其中9号、11号为同居对照)。两组羊移至P3实验室后，适应环境5天。每组羊单独安排于一个独立实验室。
将PPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13病毒分别用无血清培养液稀释成1×106TCID50/ml，各准备4ml备用；实验羊同时采取滴鼻和皮下注射联合接种方式进行攻毒。具体方法如下：2、3、5、6号羊分别通过滴鼻和皮下注射两种方式各接种0.5ml rPPRV/CN/HLJ/13病毒；7、8、10、12号羊分别通过滴鼻和皮下注射两种方式各接种0.5ml PPRV/CN/HLJ/13 病毒；1、4、9、11号羊分别通过滴鼻和皮下注射两种方式各接种0.5ml无菌PBS。
攻毒后每天观察动物状态及临床症状，并做好记录。于攻毒前和攻毒后每2天采EDTA 抗凝血及非抗凝血，于攻毒前和攻毒后每2天采集一次鼻拭子并测量肛门温度。动物严重临床症状或濒死时采取安乐死；攻毒后观察20天，至20天时未死亡动物实行安乐死，所有羊死后均进行解剖，采集肺脏、脾脏、以及肠系膜淋巴结等样品。
所有攻毒羊均在3～4天后出现大量鼻腔分泌物、眼角分泌物(图6)。所有攻毒羊均在4 天后出现急性呼吸症状，包括呼吸困难、咳嗽、打喷嚏等，均出现食欲下降，精神状况不佳，严重者食欲废绝、精神沉郁；而同居羊出现上述症状要晚4-6天。在10天内死亡的羊(2、3、5、6、8、12号)均严重腹泻，其它羊均出现轻微腹泻症状。在攻毒后第20天， PPRV/CN/HLJ/13组7和10号(攻毒)羊虽然未出现濒死状态，但仍然存在呼吸困难、咳嗽、打喷嚏、鼻腔和眼角大量分泌物、采食较少、精神沉郁等中度临床症状，预后极差，极有可能在随后几天死亡。
将所有试验羊经安乐死后剖检，所有羊的肺脏均出现不同程度的肺炎和病变，以2号羊为例(图6)，左尖叶整体实变，左尖叶实变面积约95％，右侧尖叶整体实变，且表面有凸起、不光滑，支气管淋巴结充血、肿大。另外，肠系膜淋巴结均出现肿大，其它脏器病变不一致或不典型。
采用PPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13攻毒后，每两天测量攻毒羊的体温，结果如图7、图8所示，在攻毒后8天内，PPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13攻毒组羊整体体温均有所升高约0.5～1℃(即38.5～39.5℃，而基础体温在37.0～38.5之间波动)。 rPPRV/CN/13攻毒组在攻毒后6～8天部分羊由于濒死状态而出现体温降低(2、5、6号羊)， PPRV/CN/HLJ/13攻毒组在攻毒后10天部分羊也由于濒死状态而出现体温降低(12号羊)。在攻毒8～10天后，除10号羊外，未死亡羊(1、4、7、9、11)均出现体温进一步一过性升高(40～41.5℃)情况。同居羊体温升高推迟4-6天。
攻毒后，试验羊只存活情况，如图9所示，rPPRV/CN/HLJ/13组所有攻毒羊均在10天内死亡，而同居羊也在第14和16天死亡。而PPRV/CN/HLJ/13组在攻毒后20天内近50％攻毒羊死亡(8和12号)，而其同居羊分别在第14和19天死亡，但未死亡的攻毒羊(7和 10号)在攻毒后第20天也状态不佳，预后极差。
所有攻毒羊均出现和同居羊的鼻拭子在攻毒2天后(除11号同居羊)均能检测到高载量的PPRV核酸(ct≤30)，攻毒羊在攻毒后4～10天均检测到极高载量的PPRV核酸(ct≤20)，而同居羊在8-14天后(rPPRV/CN/HLJ/13组为8、12天；PPRV/CN/HLJ/13组为10、14天)检测到极高载量的病毒核酸(ct≤20)，落后攻毒组4～10天；病毒载量与临床症状症正相关，尤其是PPRV/CN/HLJ/13组的7和10号羊(症状较轻且20天内未死亡)，病毒载量出现了先升高(0～8天)后降低的情况(10～20天)。
攻毒后，所有攻毒羊的血液中均可检测到高载量的PPRV核酸(ct≤30)，但其水平与鼻拭子相比较低，仅rPPRV/CN/HLJ/13组5号羊出现极高水平的病毒核酸(ct≤20)，其变化规律与拭子中的病毒载量较为一致。详见表5-1和5-2。
对所有攻毒后羊的肠系膜淋巴结、肺和脾进行PPRV核酸检测，结果(图10)显示，在所有攻毒羊的上述组织中均检测到高载量的病毒核酸(ct≤30)，三种脏器病毒载量无明显差异。其中，rPPRV/CN/HLJ/13组的攻毒羊脏器中的病毒载量均高于同居羊，PPRV/CN/HLJ/13组的攻毒羊脏器病毒载量与同居羊的差距无明显规律，rPPRV/CN/HLJ/13 组的病毒载量明显高于PPRV/CN/HLJ/13组，两组羊的脏器病毒载量与临床症状呈正相关。
将攻毒后羊的不同时间采集的血清进行病毒中和实验，结果显示感染所有攻毒羊的中和抗体均在病毒感染后6～8天转阳(≥1:10)，而同居羊(除11号)的中和抗体均在12～16天转阳(≥1:10)，落后攻毒组6～8天(表5)。
表1扩增PPRV CN/HLJ/13全长cDNA的引物
表2构建PPRV CN/HLJ/13全长的引物
表3 qPCR检测1-6号羊血液和拭子中病毒含量
注：Ns表示鼻拭子；WB表示全血；MN表示肠系膜淋巴结；S表示脾；L表示肺；ND表示未检测到；NEG表示Negative。
表4 qPCR检测7-12号羊血液和拭子中病毒含量
注：Ns表示鼻拭子；WB表示全血；MN表示肠系膜淋巴结；S表示脾；L表示肺；ND表示未检测到；NEG表示Negative。
表5攻毒后PPRV中和抗体检测
Claims (10)
1.一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救病毒(rPPRV)，保藏号为CCTCC No:V202135。
2.如权利要求1所述的重组拯救病毒，所述PPRV是中国流行株PPRV/CN/HLJ/13株。
3.如权利要求2所述的重组拯救病毒，是通过对PPRV CN/HLJ/13的核酸进行测序，根据结果，将其分成互相重叠的3部分，利用Oligo软件设计特异性引物扩增PPRV CN/HLJ/13全长cDNA。
4.如权利要求3所述的重组拯救病毒，通过在基因组5’端和3’端引入锤头状核酶序列和丁肝核酶序列，构建出PPRV CN/HLJ/13株全长cDNA质粒。
5.一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的重组拯救方法，所述方法包括如下步骤：
(1)、PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13的构建，根据对PPRV序列的测序，将PPRV CN/HLJ/13序列分成互相重叠的多个部分，设计并合成特定的PCR扩增引物及鉴定引物，以使扩增的多个重叠片段的目的基因可以覆盖PPRV全长基因，将各段目的基因克隆至相应载体上，构建出相应的中间质粒，然后根据特定的引物将相应质粒扩增克隆到PCI载体上，经酶切后构建出PPRV CN/HLJ/13株全长cDNA质粒pCN13；
(2)、表达GFP基因的PPRV病毒基因组全长cDNA克隆pCN13GFP的构建，将GFP基因克隆至处理好的纯化的线性化的pCN13中，获得pCN13-GFP质粒。
(3)、重组病毒的拯救，将感染性克隆质粒pCN13和pCN13-GFP分别和辅助质粒pCI-N共转染Vero-gSLAM细胞，待细胞出现CPE和荧光时，收获病毒悬液，将救获病毒分别命名为rPPRV/CN/HLJ/13和rPPRV/CN/HLJ/13/GFP。
6.如权利要求5所述的重组拯救方法，其中将PPRV CN/HLJ/13序列分成互相重叠的3个部分。
7.一种重组拯救病毒(rPPRV)的动物感染模型，将重组拯救病毒rPPRV/CN/HLJ/13病毒施用于反刍兽，获得的感染后的反刍兽，作为动物感染模型。
8.如权利要求5所述的动物感染模型，所述的反刍兽包括骆驼、鹿、长颈鹿、羊驼、羚羊、牛、羊、山羊、绵羊。
9.如权利要求6所述的动物感染模型，所述的反刍兽是指山羊。
10.如权利要求6所述的动物感染模型，所述的反刍兽是指绵羊。
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