CN114107226A - 表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用 - Google Patents

表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达vvIBDV‑VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用。本发明在血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20的基础上，在FAdV‑4基因组开放阅读框42和43之间的长度为1966‑bp天然核苷酸缺失位点插入传染性法氏囊病病毒超强毒的VP2基因，获得了一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)活载体疫苗株，命名为rHN20‑vvIBDV‑VP2。免疫保护实验证明，免疫rHN20‑vvIBDV‑VP2的SPF鸡可以完全抵抗FAdV‑4强毒株以及IBDV超强毒株的攻毒感染，说明rHN20‑vvIBDV‑VP2具有非常好的免疫原性，可以作为防治鸡心包积液‑肝炎综合征以及鸡传染性法氏囊病的活载体疫苗毒株。

Description

表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其 构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一株表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
禽腺病毒(FAdVs)在全世界广泛流行，流行毒株主要有FAdV-4、FAdV-11、FAdV-1、FAdV-8a、FAdV-8b等血清型，给家禽养殖业造成了严重的经济损失。FAdVs感染最早于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发现，因此该病也称为“安卡拉病”，之后在中国、日本、韩国、印度、美国、加拿大等不同国家和地区都有相关的报道。FAdVs根据群特异性抗原的不同可以分为3个群：I群包括传统的从鸡、火鸡、鹅及其他禽类获得的腺病毒；II群主要是和火鸡出血性肠炎、大理石脾病相关的腺病毒；III群主要是与减蛋综合征病毒有关的一类病毒。I群腺病毒根据分子结构可以进一步分为5个种(A-E)，根据血清型不同分为12个血清型(1-7、8a、8b、9-11)。I群禽腺病毒致病性差异很大，致病毒株主要导致心包积液、包涵体肝炎、肌胃糜烂等症状；非致病毒株可以在家禽体内持续感染复制，具有开发疫苗载体的潜力。
2015年06月以来，由高致病性血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的鸡心包积液-肝炎综合征(HHS)在我国的江苏、山东、黑龙江、湖北等省份突发流行，死亡率高达30％-100％，给我国家禽养殖产业造成巨大的经济损失，对我国家禽绿色健康养殖构成巨大的威胁和挑战。FAdV-4感染的家禽出现急性死亡，死亡高峰集中在1周之内，死亡家禽出现典型的心包积液以及包涵体肝炎症状。此外，FAdV-4感染能够导致宿主的免疫抑制，由此导致的免疫失败、继发感染、混合感染进一步加剧了HHS的危害。FAdV-4的感染宿主非常广泛，不仅感染规模养殖的蛋鸡、肉鸡、肉种鸡，也可以感染鸭、鹅及多种野生鸟类，FAdV-4感染宿主多样性增加了跨宿主传播的潜在风险，给该病的科学防控增加了难度。此外，FAdV-4不仅可以通过呼吸道等途径进行水平传播，还可以通过鸡胚进行垂直传播，对鸡胚源兽用疫苗的生产构成威胁，部分人用疫苗也是通过鸡胚进行生产，这也给人类公共卫生安全构成一定的潜在威胁。
传染性法氏囊病(IBD)是一种由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、高度接触性传染病。该病于1957年发现于美国特拉华州甘布罗地区，因此又被称作为甘布罗病。该病可以导致感染鸡群出现组织损伤及免疫抑制，影响病鸡生长发育、生产性能，及疫苗免疫效果，使鸡群容易并发或继发其它疾病，导致死亡率上升，肉品下降，从而造成严重经济损失。直至目前，IBDV已被世界动物卫生组织(OIE)列为重要家禽疫病之一。IBDV根据致病性及抗原变异分析，又可分为经典毒株、抗原变异株及超强毒株。IBDV主要感染3～8周龄幼鸡，感染鸡只后多呈现急性发病，病程较短，一般感染后2～3d出现衰竭和死亡，感染后5～7d达到死亡高峰，之后感染鸡只产生耐受，体内产生抗体，恢复表观健康，但出现免疫抑制。该病主要临床表现为精神沉郁、食欲减退、羽毛不整、白色下痢等。典型病理剖检症状可见感染早期法氏囊肿大充血，严重时呈现紫黑色，感染后期法氏囊萎缩。肾脏肿大，腺胃乳头出血，胸肌、腿肌条带状出血。病理检测可见法氏囊结构破坏，法氏囊滤泡及脾脏血管周围桥鞘内B淋巴细胞崩解、坏死，法氏囊异嗜性细胞浸润。IBDV是一种无囊膜，单层衣壳，正二十面体的病毒，直径在55～60nm之间，在感染细胞中呈晶格状排列。该病毒属于双RNA病毒科，双RNA病毒属。病毒基因组由A、B节段组成，其中的A节段(3.2kb)主要编码结构蛋白VP2、VP3、VP4以及非结构蛋白VP5。VP2是IBDV唯一衣壳蛋白，是主要保护性抗原。
FAdV-4与IBDV在临床中易感年龄重合，时有发生混合感染，发病更加严重。开发有效的多联疫苗对FAdV-4和IBDV防控有重要意义。本发明发明人利用我国新发流行的高致病性FAdV-4HLJFAd15毒株改造而来的疫苗候选株rHN20，构建表达IBDV超强毒株HLJ-0504VP2蛋白的重组毒rHN20-vvIBDV-VP2。免疫保护实验证明，接种rHN20-vvIBDV-VP2的SPF鸡可以完全抵抗FAdV-4强毒株以及IBDV超强毒的攻毒感染，证明rHN20-vvIBDV-VP2具有非常好的免疫原性，可以作为疫苗候选毒株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株，所述的疫苗株是在血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20的基础上，在FAdV-4基因组开放阅读框42和43之间的长度为1966-bp天然核苷酸缺失位点(Pan Q,Wang J,Gao Y,Cui H,Liu C,Qi X,Zhang Y,Wang Y,Wang X.The Natural LargeGenomic Deletion Is Unrelated to the Increased Virulence ofthe Novel GenotypeFowl Adenovirus 4Recently Emerged in China.Viruses.2018Sep 13；10(9):494.doi:10.3390/v10090494.PMID:30217040；PMCID:PMC6165077.)插入传染性法氏囊病病毒超强毒的VP2基因获得的，其中所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20是通过反向遗传技术将我国FAdV-4新发毒株HLJFAd15的Hexon基因替换为天然弱毒株ON1的Hexon基因而获得。
其中，优选的，所述的传染性法氏囊病病毒超强毒为传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504，其NCBI登录号为GQ451330.1。
其中，优选的，传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504VP2基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
其中，优选的，所述的疫苗株是通过以下方法构建得到的：
(1)vvIBDV-VP2表达盒质粒(CMV-VP2)的构建
以传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504cDNA为模板，使用引物VP2 F:ttagtgaaccgtcagatccgctagcgccaccATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和VP2 R:ctgattatgatctagagtcgcggccgctttaCCTTAAGGCCCGAATTATGTC扩增VP2基因编码区，回收PCR产物；将pEGFP-N1用NheI和NotI限制性内切酶进行双酶切，回收较大片段；将PCR产物与酶切后的载体大片段用ClonExpress II One Step Cloning Kit进行重组连接，转化至DH5α感受态中，涂板，获得重组质粒，将测序正确的质粒命名为CMV-VP2；
(2)Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒的构建
使用Counter-Selection BAC Modification Kit构建Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒，方法如下：首先将Fos-rHN20电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rHN20的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物1966-rpslneo F和1966-rpslneo R扩增带有FAdV-4天然缺失1966-bp片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rHN20和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rHN20-1966-rpslneo；再以相同方式，以CMV-VP2质粒为模板，使用引物CMV-VP2 F和CMV-VP2 R扩增vvIBDV VP2基因表达盒，将PCR产物电转进上一步制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rHN20-1966-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到阳性克隆，命名为Fos-rHN20-vvIBDV-VP2；引物序列如下：
1966-rpslneo F：
AACATAAGAATCAGGGGTGGCCCGTATACTAATCCCGTCACTGACGACACGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG
1966-rpslneo R：
CACTCGAGAAGGAGCCTCTGAGCCGTACTCTATGCATTGCGTGATTGTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
CMV-VP2 F：
AACATAAGAATCAGGGGTGGCCCGTATACTAATCCCGTCACTGACGACACCGTTACATAACTTACGGTAAATGG
CMV-VP2 R：
CACTCGAGAAGGAGCCTCTGAGCCGTACTCTATGCATTGCGTGATTGTGGTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC
(3)病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rHN20-vvIBDV-VP2粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNATransfection Reagent Kit转染线性化的Fos-rHN20-vvIBDV-VP2，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rHN20-vvIBDV-VP2重组毒。
更进一步的，本发明还提出了所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株在制备防治由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HHS)以及鸡传染性法氏囊病(IBD)药物中的应用。
其中，优选的，所述的药物为疫苗。更优选的，所述的疫苗为活载体疫苗。
一种重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗，其含有本发明所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明发明人利用我国新发流行的高致病性FAdV-4HLJFAd15毒株改造而来的疫苗候选株rHN20，构建表达IBDV超强毒株HLJ-0504VP2蛋白的重组毒rHN20-vvIBDV-VP2。免疫保护实验证明，接种rHN20-vvIBDV-VP2的SPF鸡可以完全抵抗FAdV-4强毒株以及IBDV超强毒的攻毒感染，说明rHN20-vvIBDV-VP2具有非常好的免疫原性，可以作为防治鸡心包积液-肝炎综合征以及鸡传染性法氏囊病的疫苗毒株。
附图说明
图1为Fos-rHN20-vvIBDV-VP2粘粒构建示意图；
图2为Fos-rHN20-vvIBDV-VP2粘粒构建菌落PCR鉴定；
图3为rHN20-vvIBDV-VP2重组毒病变；
图4为rHN20-vvIBDV-VP2重组毒VP2表达盒PCR产物测序；
图5为rHN20-vvIBDV-VP2重组毒VP2蛋白表达间接免疫荧光鉴定；
图6为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后血清抗FAdV-4中和抗体测定结果；
图7为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后对FAdV-4的保护生存曲线；
图8为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后攻毒7天后的组织FAdV-4病毒残留检测结果；
图9为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后血清抗IBDV中和抗体测定结果；
图10为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后对IBDV的保护生存曲线；
图11为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后攻毒7天后的组织IBDV病毒残留检测结果；
图12为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后攻毒7天后的法氏囊大体病变；
图13为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后攻毒7天后的法氏囊BBIX；
图14为鸡免疫rHN20-vvIBDV-VP2重组毒后攻毒7天后的法氏囊组织病变。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株rHN20-vvIBDV-VP2的构建
1.材料和方法
1.1病毒、质粒、细胞和菌株
将新发血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)HLJFAd15毒株(NCBI登录号：KU991797)Hexon基因替换为无致病性毒株ON1的Heoxn基因所获得得rHN20感染性克隆粘粒Fos-rHN20以及通过病毒拯救后获得的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20及其构建方法已记载在申请号为202011419903.5，发明名称为“血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20及其构建方法和应用”的专利申请中，该申请已于2021年3月23日在专利公报上进行公布，该申请以全文引入的形式并入本发明说明书中，pEGFP-N1质粒，鸡肝癌细胞(ChickenLeghorn Male Hepatocellular Cell,LMH)、DH10B感受态菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。
1.2主要试剂
CopyControlTM Fosmid Library Production Kit购自EpicentreBiotechnologies公司；ZR BAC DNA miniprep Kit购自ZYMO公司；Counter-Selection BACModification Kit购自Gene Bridges公司；FseI、NheI和NotI限制性内切酶购自NEB公司；PrimeSTARHS DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司。EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；DMEM/F12、Opti-MEM、FBS购自gibico公司；转染试剂X-tremeGene HPDNA Transfection Reagent Kit购自Roche公司。
1.3引物的合成
本实施例涉及到的引物如表1，由吉林省库美生物科技有限公司合成。
表1引物
Figure BDA0003322101850000071
1.4 vvIBDV-VP2表达盒质粒(CMV-VP2)的构建
以传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504(NCBI登录号为GQ451330.1)cDNA为模板，使用引物VP2 F和VP2 R扩增VP2基因编码区，回收PCR产物。将pEGFP-N1用NheI和NotI限制性内切酶进行双酶切，回收较大片段。将PCR产物与酶切后的载体大片段用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit进行重组连接，转化至DH5α感受态中，涂板，获得重组质粒。将测序正确的质粒命名为CMV-VP2。
1.5 Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒的构建
使用Counter-Selection BAC Modification Kit构建Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒，方法如下：首先将Fos-rHN20电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC ModificationKit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rHN20的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物1966-rpslneo F和1966-rpslneo R扩增带有FAdV-4天然缺失1966-bp片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rHN20和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rHN20-1966-rpslneo；再以相同方式，以CMV-VP2质粒为模板，使用引物CMV-VP2 F和CMV-VP2 R扩增vvIBDVVP2基因表达盒，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rHN20-1966-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到阳性克隆，使用Det-1966-F和Det-1966-R做菌落PCR鉴定，提取fosmid测序确认正确，命名为Fos-rHN20-vvIBDV-VP2，构建示意图如图1所示。
1.6病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rHN20-vvIBDV-VP2粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNATransfection Reagent Kit转染线性化的Fos-rHN20-vvIBDV-VP2，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rHN20-vvIBDV-VP2重组毒。
1.7重组毒鉴定
取第五代重组毒，提取DNA后，用引物Det-1966-F和Det-1966-R做PCR扩增和测序。
1.8 VP2表达的IFA鉴定
将拯救的rHN20-vvIBDV-VP2重组毒接种LMH细胞，48h后吸净细胞培养液，将细胞用PBS洗涤3次，用4％甲醛固定30分钟，然后与抗IBDV VP2的单克隆抗体(1：200稀释)于37℃孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞3次，然后与异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠抗体(1：200)37℃避光孵育1小时。最后将细胞洗涤3次，利用荧光显微镜观察。
2、结果
2.1 Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒的构建
挑取的5个克隆中，经PCR鉴定和测序鉴定，获得1个构建成功的粘粒Fos-rFAdV4-vvIBDV-VP2(图2)。
2.2重组毒的拯救及鉴定
线性化的粘粒Fos-rHN20-vvIBDV-VP2转染LMH出现典型的FAdV-4病变(图3)，并且能稳定传代，成功拯救重组毒rHN20-vvIBDV-VP2。提取病毒DNA后，用Det-1966-F和Det-1966-R为引物，以重组毒DNA作为模板进行PCR扩增，将PCR产物送测序，结果显示成功插入vvIBDV VP2基因表达盒(图4)。IFA检测结果显示，IBDVVP2单抗可以识别该病毒，可检测到绿色荧光(图5)
实施例2表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株rHN20-vvIBDV-VP2对FAdV-4免疫效果初步评估
1材料和方法
1.1主要试剂、耗材
胎牛血清、DMEM、DMEM/F12为Sigma产品；EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗为哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；细胞培养瓶、细胞培养板为Thermo Scientific公司产品；DNA提取试剂盒为Axygen公司产品；qPCR试剂为Takara产品。
本实施例涉及到的引物如表2，由上海英俊公司合成。
表2检测FAdV-4荧光定量PCR引物和探针
引物、探针名称 序列(5’-3‘)
qPCR-FAdV4F CACTGCCACTGGGCTCTGT
qPCR-FAdV4R GCAATGGCAATAAACCTCCAA
qPCR-FAdV4probe ROX-AGTCTGGAGAAGTCTGTGCAGCCTCCA-BHQ2
qPCR-OVOF CAGTTCATTTCCGCCACC
qPCR-OVOR GCAGCCGTTGAGCCTTTT
qPCR-OVOprobe FAM-TCTGTCGTGACATTTCGGGTGGG-TAMRA
1.2细胞和病毒
鸡肝癌细胞(Chicken Leghorn Male Hepatocellular Cell,LMH)，新发血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)HLJFAd15毒株，以HLJFAd15毒株为骨架表达绿色荧光蛋白的重组毒rFAdV4-EGFP由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。
表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株rHN20-vvIBDV-VP2由实施例1构建。
1.3试验动物
无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心，饲养在该中心的负压隔离器内。
1.4病毒和疫苗培养
将LMH细胞培养于细胞培养瓶中，待细胞铺满时，用无血清培养基按0.01MOI的量接种rHN20-vvIBDV-VP2。在37℃细胞培养箱吸附1h，之后更换细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM/F12培养基)，继续置于37℃细胞培养箱培养，逐日观察细胞病变(CPE)情况。接毒后72h，将细胞反复冻融三次，3300g离心5min，收集细胞悬液即为病毒或疫苗。本研究培养的HLJFAd15滴度1.36×107PFU/ml，rHN20-vvIBDV-VP2滴度为1×107PFU/ml；经检测无支原体、无细菌、无外源病毒，纯净性良好。分装并置于负80℃冰箱备用。
1.5动物试验
将25只2周龄的SPF鸡随机分成3组，第1、2组每组10只，第3组5只，其中第1组10只按rHN20-vvIBDV-VP22×106PFU/羽剂量肌肉注射免疫作为免疫组，第2组10只不做任何处理作为攻毒对照组，第3组5只作为健康对照组。分别于免疫后1周、免疫后2周、免疫后3周采集免疫组和健康对照组鸡血分离血清，检测中和抗体。免疫后3周采血后，用HLJFAd15按2×103PFU/羽攻毒免疫组和攻毒对照组，健康对照不做任何处理。攻毒后每天观察鸡的发病和死亡情况，持续观察1周。攻毒后1周，取3只免疫组鸡肝脏、脾脏和肾脏检测FAdV-4病毒拷贝数，同时取3只健康对照组鸡作为阴性对照，取3只攻毒对照组发病死亡鸡作为阳性对照。
1.5.1中和抗体检测
在LMH细胞上检测免疫鸡血清抗体对FAdV-4的中和能力。将待检血清置于56℃水浴作用30min进行灭活，然后进行过滤除菌。将灭活除菌的待检血清用无血清的DMEM培养液进行2倍倍比稀释。将rFAdV4-EGFP病毒用含2％血清的DMEM/F12培养液稀释成200TCID50病毒液。将上述稀释的200个TCID50的病毒液与2倍倍比稀释的血清等体积分别混合，然后将其置于37℃培养箱中培养1h，期间每隔15min轻柔震荡混匀一次，使病毒粒子与血清中抗体充分接触。将饲养有LMH细胞的96孔培养板中培养液全部吸出，然后将上述混合感作的血清与病毒混合物分别加于每个孔中，每孔加入100μl，然后将其置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养6天，通过倒置荧光显微镜检测rFAdV4-EGFP被中和的情况，计算血清对FAdV-4的中和效价。同时设置阴、阳性血清对照。
1.5.2病毒载量检测
攻毒后1周，取免疫组3只鸡肝脏、脾脏和肾脏，同时取健康对照组3只鸡作为阴性对照，取攻毒对照组发病死亡3只鸡肝脏、脾脏和肾脏作为阳性对照。提取DNA，用荧光定量PCR检测各组鸡肝脏、脾脏和肾脏中的病毒拷贝数。以FAdV-4hexon基因为扩增序列，宿主OVO基因为内参计算病毒拷贝数。
2、结果
2.1中和抗体滴度测定结果
在rHN20-vvIBDV-VP2活载体疫苗免疫后1周，免疫组检测到了较高的FAdV-4血清抗体；免疫后2周，免疫组全部鸡只中和抗体转阳并出现更高滴度(图6)。
2.2攻毒保护结果
攻毒保护试验结果表明，免疫rHN20-vvIBDV-VP2活载体疫苗能实现对FAdV-4的100％死亡保护，无明显异常(图7)。
2.3组织病毒残留检测
免疫组和健康对照组相似，显著低于攻毒对照组FAdV-4病毒拷贝数(图8)。
实施例3表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株rHN20-vvIBDV-VP2对IBDV免疫效果初步评估
1材料和方法
1.1主要试剂、耗材
胎牛血清、DMEM、DMEM/F12为Sigma产品；EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗为哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；细胞培养瓶、细胞培养板为Thermo Scientific公司产品；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR试剂盒为Takara公司产品。
本实施例涉及到的引物如表3，由上海英俊公司合成。
表3检测FAdV-4荧光定量PCR引物和探针
引物、探针名称 序列(5’-3‘)
qPCR-IBDVF GAGCCTTCTGATGCCAACAAC
qPCR-IBDVR CAAATTGTAGGTCGAGGTCTCTGA
qPCR-IBDVprobe FAM-CGGCGTCCATTCCGGACGAC-TAMRA
qPCR-28SF GGCGAAGCCAGAGGAAACT
qPCR-28SR GACGACCGATTTGCACGTC
qPCR-28Sprobe FAM-AGGACCGCTACGGACCTCCACCA-TAMRA
1.2细胞和病毒
DF1细胞，鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504，鸡传染性法氏囊病病毒细胞适应毒株rGtHLJVP2，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。
表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株rHN20-vvIBDV-VP2由实施例1构建。
1.3试验动物
无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心，饲养在该中心的负压隔离器内。
1.4病毒和疫苗培养
将LMH细胞培养于细胞培养瓶中，待细胞铺满时，用无血清培养基按0.01MOI的量接种rHN20-vvIBDV-VP2。在37℃细胞培养箱吸附1h，之后更换细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM/F12培养基)，继续置于37℃细胞培养箱培养，逐日观察细胞病变(CPE)情况。接毒后72h，将细胞反复冻融三次，3300g离心5min，收集细胞悬液即为病毒或疫苗。本研究培养的HN20-vvIBDV-VP2滴度为1×107PFU/ml；经检测无支原体、无细菌、无外源病毒，纯净性良好。分装并置于负80℃冰箱备用。
1.5动物试验
将25只2周龄的SPF鸡随机分成3组，第1、2组每组10只，第3组5只，其中第1组10只按rHN20-vvIBDV-VP22×106PFU/羽剂量肌肉注射免疫作为免疫组，第2组10只不做任何处理作为攻毒对照组，第3组5只作为健康对照组。分别于免疫后1周、免疫后2周、免疫后3周采集免疫组和健康对照组鸡血分离血清，检测中和抗体。免疫后3周采血后，用HLJ-0504按105EID50/羽攻毒免疫组和攻毒对照组，健康对照不做任何处理。攻毒后每天观察鸡的发病和死亡情况，持续观察1周。攻毒后1周，取3只免疫组鸡脾脏、肾脏和法氏囊检测IBDV病毒拷贝数，同时取3只健康对照组鸡作为阴性对照，取3只攻毒对照组发病死亡鸡作为阳性对照。
1.5.1中和抗体检测
在DF1细胞上检测免疫鸡血清抗体对rGtHLJVP2的中和能力。将待检血清置于56℃水浴作用30min进行灭活，然后进行过滤除菌。将灭活除菌的待检血清用无血清的DMEM培养液进行2倍倍比稀释。将rGtHLJVP2病毒用含2％血清的DMEM培养液稀释成200TCID50病毒液。将上述稀释的200个TCID50的病毒液与2倍倍比稀释的血清等体积分别混合，然后将其置于37℃培养箱中培养1h，期间每隔15min轻柔震荡混匀一次，使病毒粒子与血清中抗体充分接触。将饲养有DF1细胞的96孔培养板中培养液全部吸出，然后将上述混合感作的血清与病毒混合物分别加于每个孔中，每孔加入100μl，然后将其置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养4天，通过显微镜观察病变，检测rGtHLJVP2被中和的情况，计算血清对IBDV的中和效价。同时设置阴、阳性血清对照。
1.5.2病毒载量检测
攻毒后1周，取免疫组3只鸡脾脏、肾脏和法氏囊，同时取健康对照组3只鸡作为阴性对照，取攻毒对照组发病死亡3只鸡法氏囊作为阳性对照。用荧光定量PCR检测各组鸡脾脏、肾脏和法氏囊中的病毒拷贝数。以FAdV-4VP5基因为扩增序列，宿主28S基因为内参计算病毒拷贝数。
1.5.3对法氏囊损伤保护的评价
攻毒后1周，剖杀全部幸存鸡，取法氏囊拍照，称量体重和法氏囊重量，计算囊重比(Bursal offabricius weight/Body weightratio,F/B)和囊指数(Bursa:body weightindex,BBIX)。F/B＝(法氏囊重/体重)X 1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比。根据BBIX评价法氏囊的萎缩程度，当IBBX低于0.7时，说明法氏囊萎缩。同时，利用10％甲醛溶液固定部分法氏囊制备病理切片，进行病理组织学分析。
2、结果
2.1中和抗体滴度测定结果
在rHN20-vvIBDV-VP2活载体疫苗免疫后1周，免疫组检测到了较高的IBDV血清抗体；免疫后3周，免疫组全部鸡只中和抗体转阳并出现更高滴度(图9)。
2.2攻毒保护结果
攻毒保护试验结果表明，免疫rHN20-vvIBDV-VP2活载体疫苗能实现对vvIBDV的100％死亡保护，无明显异常(图10)
2.3病毒载量检测
免疫组和健康对照组相似，显著低于攻毒对照组IBDV病毒拷贝数(图11)。
2.4法氏囊损伤评价
免疫组鸡法氏囊无肉眼可见损伤和萎缩(图12)，与健康对照组一样，rHN20-vvIBDV-VP2活载体疫苗免疫组法氏囊BBIX值均大于0.7(图13)，并且免疫组无病理组织变化(图14)。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 表达IBDV VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用
<130> klpi210587
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1356
<212> DNA
<213> HLJ-0504
<400> 1
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240
aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300
ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcatta 360
aacggaacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacggccaac atcaacgaca agatcgggaa cgtcctagta 480
ggggaagggg taactgtcct cagcttaccc acatcatatg atctggggta tgtgagactc 540
ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaagatgg tagcgacatg tgacagcagt 600
gacaggccca gagtctacac cataactgca gccaatgatt accaattctc atcacagtac 660
caagcaggtg gagtgacaat cacactgttc tcagcaaaca tcgatgccat cacaagcctc 720
agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggcgctacc 780
atctacctta taggcttcga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840
gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag 960
gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020
aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggctacagga 1080
tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctga tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtgt ggccaacaag ggagtacacc 1260
gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gcatttggct tcaaagacat aattcgggcc ttaagg 1356

Claims (8)

1.表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是在血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20的基础上，在FAdV-4基因组开放阅读框42和43之间的长度为1966-bp天然核苷酸缺失位点插入传染性法氏囊病病毒超强毒的VP2基因获得的，其中所述的FAdV-4反向遗传疫苗株rHN20是通过反向遗传技术将我国新发毒株HLJFAd15的Hexon基因替换为天然弱毒株ON1的Hexon基因而获得。
2.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株，其特征在于，所述的传染性法氏囊病病毒超强毒为传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504，其NCBI登录号为GQ451330.1。
3.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株，其特征在于，传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1-4任一项所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过以下方法构建得到的：
(1)vvIBDV-VP2表达盒质粒(CMV-VP2)的构建
以传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ-0504cDNA为模板，使用引物VP2 F:ttagtgaaccgtcagatccgctagcgccaccATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和VP2 R:ctgattatgatctagagtcgcggccgctttaCCTTAAGGCCCGAATTATGTC扩增VP2基因编码区，回收PCR产物；将pEGFP-N1用NheI和NotI限制性内切酶进行双酶切，回收较大片段；将PCR产物与酶切后的载体大片段用ClonExpress II One Step Cloning Kit进行重组连接，转化至DH5α感受态中，涂板，获得重组质粒，将测序正确的质粒命名为CMV-VP2；
(2)Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒的构建
使用Counter-Selection BAC Modification Kit构建Fos-rHN20-vvIBDV-VP2感染性克隆粘粒，方法如下：首先将Fos-rHN20电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rHN20的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物1966-rpslneo F和1966-rpslneo R扩增带有FAdV-4天然缺失1966-bp片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rHN20和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rHN20-1966-rpslneo；再以相同方式，以CMV-VP2质粒为模板，使用引物CMV-VP2 F和CMV-VP2 R扩增vvIBDVVP2基因表达盒，将PCR产物电转进上一步制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rHN20-1966-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到阳性克隆，命名为Fos-rHN20-vvIBDV-VP2；引物序列如下：
1966-rpslneo F：
AACATAAGAATCAGGGGTGGCCCGTATACTAATCCCGTCACTGACGACACGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG
1966-rpslneo R：
CACTCGAGAAGGAGCCTCTGAGCCGTACTCTATGCATTGCGTGATTGTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
CMV-VP2 F：
AACATAAGAATCAGGGGTGGCCCGTATACTAATCCCGTCACTGACGACACCGTTACATAACTTACGGTAAATGG
CMV-VP2 R：
CACTCGAGAAGGAGCCTCTGAGCCGTACTCTATGCATTGCGTGATTGTGGTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC
(3)病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rHN20-vvIBDV-VP2粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNATransfection Reagent Kit转染线性化的Fos-rHN20-vvIBDV-VP2，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rHN20-vvIBDV-VP2重组毒。
5.权利要求1-4任一项所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株在制备防治由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的鸡心包积液-肝炎综合征(HHS)以及鸡传染性法氏囊病(IBD)药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为活载体疫苗。
8.一种重组血清4型禽腺病毒活载体疫苗，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗株。
CN202111249164.4A 2021-10-26 2021-10-26 表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用 Pending CN114107226A (zh)

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