CN117625688B - B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 - Google Patents
B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117625688B CN117625688B CN202410109544.5A CN202410109544A CN117625688B CN 117625688 B CN117625688 B CN 117625688B CN 202410109544 A CN202410109544 A CN 202410109544A CN 117625688 B CN117625688 B CN 117625688B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- subtype
- avian metapneumovirus
- avian
- strain
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001519465 Avian metapneumovirus Species 0.000 title claims abstract description 49
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 72
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 14
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 206010066226 Metapneumovirus infection Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 101150107578 SH gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 5
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 3
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- 206010024642 Listless Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000711904 Pneumoviridae Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001669 bursa of fabricius Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 208000023406 head swelling Diseases 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000017971 listlessness Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明公开了B亚型禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)反向遗传操作系统及其应用。所述的反向遗传操作系统包括B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒以及辅助质粒，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了该系统在研究B亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以B亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗中的应用。通过该反向遗传操作系统本发明制备得到了一种表达vvIBDV VP2蛋白的重组B亚型aMPV弱毒疫苗株，并对该疫苗株的免疫保护效果进行评价，结果发现该疫苗株可对vvIBDV和aMPV两种病毒提供100%的免疫保护。本发明为B亚型禽偏肺病毒致病机制的研究以及作为疫苗载体提供了技术手段，对家禽业健康发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒反向遗传操作系统及其应用，特别涉及一种B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus, aMPV)是一种高度传染性的病原体，可引起火鸡急性呼吸道疾病，也与鸡的"肿头综合征"有关。aMPV单一感染时死亡率较低，但易与新城疫病毒，传染性支气管炎病毒或大肠杆菌等病原体发生混合感染，从而导致更严重的呼吸道症状和较高死亡率。aMPV于1978年在南非被首次分离报道，之后在全球主要的家禽饲养区广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。
aMPV属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒属家族的成员。其基因组为不分节段的单股负链RNA，基因排列顺序为3'-leader-N-P-M-F-M2-SH-G-L-trailer-5'。基于G蛋白的抗原性差异，国际病毒分类委员会（ICTV）将aMPV分为A、B、C和D四个亚型。A亚型和B亚型aMPV在世界大多数国家均广泛流行，目前，B亚型aMPV已成为我国主要的优势流行毒株。
反向遗传操作系统是研究病毒致病机制与新型载体疫苗的理想工具，但目前针对B亚型aMPV的反向遗传操作系统尚不成熟。因此，本发明以本实验室获得的B亚型弱毒疫苗株LN16-A为研究对象，利用同源重组技术成功构建了病毒的全长cDNA感染性克隆，并进一步评价了其作为载体疫苗的潜力。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒；
本发明的目的之二在于提供一种含有上述质粒的B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其在研究病毒致病机制与新型疫苗中的应用；
本发明的目的之三在于提供一种利用上述反向遗传操作系统获得的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株及其在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒超强毒以及B亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒是以aMPV LN16-A株（记载在公开号为CN115287270A，发明名称为B亚型禽偏肺病毒传代致弱株及其应用的专利申请中）全长基因组为骨架，通过反转录和RT-PCR获得五个cDNA片段（A-E），每个片段之间含有15-20 bp的同源臂，五个片段的总长度覆盖了LN16-A株的完整序列。为与亲本病毒进行区分，在A片段（基因组第202核苷酸位点）引入一个可以与亲本病毒区分的遗传分子标记。将5个cDNA片段克隆至pMD18-T载体中，测序正确后置于-20℃保存备用。人工合成包括T7启动子、HdVRz核酶序列和T7终止子的序列，并在T7启动子和HdVRz核酶序列之间保留EcoR V酶切位点，将该片段与pOK12进行同源重组，得到修饰后的pOK12载体，命名为GpOK12。使用EcoR V将GpOK12线性化后，利用同源重组技术将A-E五个片段重组到GpOK12载体中，获得aMPV LN16A株的全长cDNA感染性克隆质粒，命名为pOK-LN16A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒在以下方面的应用：
（1）通过病毒拯救获得重组B亚型禽偏肺病毒中的应用；
（2）作为病毒载体的应用。
再进一步的，本发明还提出了一种B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，所述的反向遗传操作系统包括所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒以及辅助质粒，所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的辅助质粒包括pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-M21以及pCAGGS-L。
其中，优选的，所述的辅助质粒pCAGGS-N，pCAGGS-P，pCAGGS-M21，pCAGGS-L通过以下方法制备得到：
以提取得到的aMPV LN16-A株病毒的RNA进行反转录，以获得的cDNA为模板，使用引物对LN16-A株的N、P、M2-1及L基因的ORF进行PCR扩增，将扩增得到的PCR片段与pCAGGS载体采用EcoR I和Xho I双酶切后进行连接，挑取单克隆菌落并进行测序验证，将测序正确的四个辅助质粒分别命名为pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-M21、pCAGGS-L，引物序列如下：
再进一步的，本发明还提出了所述的B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统在研究B亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以B亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗中的应用。
其中，优选的，所述的疫苗为表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒（very virulentIBDV, vvIBDV）VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗。
更进一步的，本发明还提出了一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，所述的疫苗株是通过将包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒进行病毒拯救后获得的；所述的包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒是将vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒插入所述的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒的G和L基因之间得到的。
其中，优选的，所述的vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，插入位点位于SEQ ID NO.1所示序列的9015-9016 bp之间。
更进一步的，本发明还提出了所述的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒以及B亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
首先，本发明建立了B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统，本发明以aMPV LN16-A株全长基因组为骨架，通过反转录和RT-PCR获得五个cDNA片段（A-E），同时为与亲本病毒进行区分，在A片段（基因组第202核苷酸位点）引入一个可以与亲本病毒区分的遗传分子标记。将5个cDNA片段克隆重组到修饰后的pOK12载体中，获得aMPV LN16A株的全长cDNA感染性克隆质粒，命名为pOK-LN16A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验证明，遗传分子标记A→G的引入并不影响病毒的生长和复制，拯救病毒与亲本病毒在Vero细胞上具有相似的生长特性。
其次，本发明通过筛选适合外源基因表达的最佳插入位点，最终发现在aMPVLN16A株的全长cDNA感染性克隆质粒G和L基因之间的位点可以作为外源蛋白表达的插入位点，在该位点表达外源蛋白不影响病毒的复制，且外源蛋白表达水平最高。因此，该系统在研究B亚型禽偏肺病毒致病机制以及制备以B亚型禽偏肺病毒为载体的疫苗方面具有广阔的应用前景。
再次，为进一步评价aMPV LN16A株的全长cDNA感染性克隆质粒作为载体疫苗的潜力，本发明将vvIBDV-HLJ0504株的VP2蛋白插入基因组G和L基因之间，获得了一株可稳定表达vvIBDV VP2的B亚型禽偏肺病毒重组弱毒候选疫苗株，命名为rLN16A-vvVP2株，进一步对rLN16A-vvVP2株免疫保护效果进行评价，结果发现rLN16A-vvVP2株可对vvIBDV和aMPV两种病毒提供100%的免疫保护。本发明的提出为这两种病毒病的防控提供了新的技术手段，对家禽业健康发展具有重要意义。
附图说明
图1为细胞病变观察
其中，A：正常细胞对照；B：拯救病毒感染Vero细胞；C：亲本病毒感染Vero细胞；
图2为遗传分子标记测序结果；
图3为rLN16-A电镜观察结果；
图4为拯救病毒rLN16-A IFA鉴定结果；
图5为复制动力学测定结果；
图6为不同位点插入EGFP全长cDNA感染性克隆质粒的构建示意图；
图7为表达外源基因最佳位点的筛选结果；
其中，A：拯救病毒荧光图；B：拯救病毒荧光强度图；C：拯救病毒Western blotting鉴定结果；D：拯救病毒的复制动力学结果
图8为IFA鉴定结果；
图9为Western blotting鉴定结果；
图10为rLN16A-vvVP2在Vero细胞上复制动力学。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下方法中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下方法中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1 B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统的建立
1.材料与方法
1.1细胞、病毒、质粒和动物 Vero细胞和BSR-T7/5细胞（表达T7 RNA 聚合酶）由本实验室保存。pOK12和pCAGGS载体均由本实验室提供。
1.2 aMPV全长cDNA感染性克隆质粒的构建 以aMPV LN16-A株（记载在公开号为CN115287270A，发明名称为B亚型禽偏肺病毒传代致弱株及其应用的专利申请中）全长基因组为骨架，通过反转录和RT-PCR获得五个cDNA片段（A-E），每个片段之间含有15-20 bp同源臂，五个片段的总长度覆盖了LN16-A株的完整序列。为与亲本病毒进行区分，在A片段（基因组第202核苷酸位点）引入一个可以与亲本病毒区分的遗传分子标记。将5个cDNA片段克隆至pMD18-T载体中，测序正确后置于-20℃保存备用。人工合成包括T7启动子、HdVRz核酶序列和T7终止子的序列，并在T7启动子和HdVRz核酶序列之间保留EcoR V酶切位点，将该片段与pOK12进行同源重组，得到修饰后的pOK12载体，命名为GpOK12。使用EcoR V将GpOK12线性化后，利用同源重组技术将A-E五个片段重组到GpOK12载体中，获得 aMPV LN16A株的全长cDNA感染性克隆质粒，命名为 pOK-LN16A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。构建全长连接所需要的引物序列见下表1。
1.3辅助质粒的构建 提取aMPV LN16-A株病毒的RNA，使用HiScript II Q RTSuperMix for qPCR (R222-01)进行反转录。以获得的cDNA为模板，对LN16-A株的N、P、M2-1及L基因的ORF进行扩增，引物见表2。将扩增得到的PCR片段与pCAGGS载体均采用EcoR I和Xho I双酶切后进行连接，挑取单克隆菌落并进行测序验证，将测序正确的四个辅助质粒分别命名为pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-M21、pCAGGS-L。
1.4 病毒拯救 将全长cDNA感染性克隆质粒与辅助质粒（pCAGGS-N，pCAGGS-P，pCAGGS-M21，pCAGGS-L）按照4：1：1：1：1的比例共转染到BSR-T7/5细胞中。转染5天后收集上清感染Vero细胞，同时设置正常BSR-T7/5细胞上清感染组，用于排除野毒污染。将拯救病毒rLN16-A通过Vero细胞连续传代，观察有无病变产生。
1.5电镜观察 将出现细胞病变的细胞反复冻融三次，收集20 ml细胞培养液，12,000 g离心30分钟，去除细胞碎片，然后100,000 g离心1小时，用于浓缩病毒粒子，然后将病毒粒子进行负染，电镜观察。
1.6遗传标记检测 将拯救病毒rLN16-A与LN16-A通过Vero细胞进行传代，提取F3代病毒基因组，反转录后进行RT-PCR鉴定，将PCR产物送往公司进行测序，确定引入的遗传标记是否存在。
1.7间接免疫荧光（IFA）鉴定 将拯救病毒rLN16-A感染Vero细胞72小时后，用PBS洗细胞三遍，利用无水乙醇固定，以aMPV N蛋白阳性血清作为一抗，以FITC标记的IgG抗体作为二抗进行IFA检测，将检测完成的样品置于荧光倒置显微镜下观察、拍照。
1.8复制动力学测定 将病毒以MOI=0.01的感染剂量接种Vero细胞，置于37℃、5%细胞培养箱中培养。每隔12小时收取病毒培养液，测定病毒在不同时间段（12、24、48、72、96及120小时）病毒滴度，绘制病毒的复制动力学曲线。
2.结果
2.1 细胞病变观察
将含有aMPV LN16-A株的全长cDNA感染性克隆质粒转染BSR-T7/5细胞，转染5天后收集上清感染Vero细胞，然后对Vero细胞进行连续传代，在传至第二代时，拯救病毒rLN16-A与亲本病毒LN16-A均出现了严重的细胞病变，包括细胞变圆、皱缩及脱落等（图1），初步表明病毒拯救成功。
2.2遗传标记检测
为进一步验证病毒是否拯救成功，对F3代拯救病毒rLN16-A和亲本病毒LN16-A进行了测序鉴定，结果显示遗传分子标记A→G已成功引入（图2）。
2.3 电镜观察
将拯救病毒rLN16-A经负染后进行电镜观察，结果显示rLN16-A具有囊膜和纤突结构，形态不规则，直径范围为50-200 nm的包覆颗粒，符合副黏病毒的特征（图3）。
2.4 IFA鉴定结果
将rLN16-A与LN16-A株分别以MOI=0.01的感染剂量接种Vero细胞，然后使用兔源的抗aMPV N蛋白的多克隆抗体作为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗，对拯救病毒进行鉴定。结果显示，rLN16-A与LN16-A株感染组均出现了特异性绿色荧光，表明N蛋白已成功表达，而对照组（Mock组）均未出现绿色荧光，表明病毒拯救成功（图4）。
2.5拯救病毒生长特性
为确定拯救病毒rLN16-A的生长特性，将拯救病毒与亲本病毒以相同的感染剂量分别接种Vero细胞，测定不同时间的病毒滴度。结果显示，拯救病毒与亲本病毒在Vero细胞上具有相似的生长特性，两株病毒均在72小时时达到生长高峰，72小时后，病毒复制趋于稳定（图5）。
上述结果表明，本研究已成功建立了B亚型aMPV的反向遗传操作系统。
实施例2 B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统的应用
1.材料与方法
1.1细胞、病毒、质粒和动物 将aMPV LN16-F4株和vvIBDV HLJ0504株用作攻毒用毒。SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1.2 外源基因最佳表达位点的筛选
为进一步筛选适合外源基因表达的最佳插入位点，参考已有副粘病毒表达外源基因的方案，在rLN16-A基因组（SEQ ID NO.1所示）的不同位置进行了EGFP插入和置换。本研究包括三种方案，在前导序列和N基因之间（基因组12-13 bp之间）插入EGFP，在G和L基因之间（基因组9015-9016 bp之间）插入EGFP，以及将SH基因（基因组7182-7670 bp）替换EGFP基因（图6）。其中，在前导序列和N基因之间插入EGFP时，通过引物在EGFP上游添加N基因的基因起始（gene start, GS）信号序列，在EGFP下游添加N基因的基因终止（gene end，GE）信号序列，成功构建在前导序列和N基因之间插入EGFP基因转录表达盒；在G和L基因之间插入EGFP，通过引物在EGFP上游添加G基因的GS信号序列，在EGFP下游添加G基因的基因终止GE信号序列，成功构建在G和L基因之间插入EGFP的基因转录表达盒；在将SH基因替换EGFP基因时，通过引物在EGFP上游添加SH基因的GS信号序列，在EGFP下游添加SH基因的GE信号序列，成功构建替换SH基因为EGFP的基因转录表达盒，构建三种基因转录表达盒的引物见下表3。采用同源重组的方法，将上述三种不同的基因转录表达盒插入aMPV基因组的不同位点，构建三种不同表达EGFP的aMPV全长cDNA感染性克隆质粒，分别命名为pOK-LN16A-EGFP-LN、pOK-LN16A-EGFP-GL及pOK-LN16A-EGFP-SH。
1.3表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株的构建 为验证筛选到的插入位点的可用性，通过引物在将vvIBDV HLJ0504株VP2基因的开放阅读框（open reading flame, ORF）上游添加G基因起始信号序列，下游添加终止信号序列，构建表达VP2蛋白的基因转录表达盒（SEQ ID NO.2所示），引物序列见下表4。使用SpeI将全长质粒pOK-LN16A（SEQ ID NO.1所示）线性化后，将表达VP2蛋白的基因转录表达盒与线性化后的载体进行同源重组，将其插入到rLN16-A的G和L基因之间（基因组9015-9016 bp之间）构建了包含vvIBDV VP2基因的全长cDNA感染性克隆质粒，命名为pOK-LN16A-vvVP2。然后按照实施例1中1.4的方法拯救病毒。
1.4 IFA鉴定 将拯救病毒rLN16A-vvVP2感染Vero细胞72小时后，用PBS洗细胞三遍，利用无水乙醇固定，以IBDV VP2蛋白单抗作为一抗，以TRITC标记的IgG抗体作为二抗进行IFA检测，将检测完成的样品置于荧光倒置显微镜下观察、拍照。
1.5 Western blotting鉴定 取接种病毒后的细胞上清，加入适量SDS缓冲液后置于金属浴煮沸，100℃ 10分钟，将电泳后的样品转移至硝酸纤维素膜中，4℃过夜封闭。将封闭后的硝酸纤维素膜置于一抗稀释液中，摇床上孵育2小时后，PBST清洗三次。加入二抗稀释液孵育1小时，之后进行显色。
1.6免疫效力试验 将50只2周龄SPF鸡随机分成5组，每组10只，第1组与第2组通过滴鼻免疫0.2 mL rLN16A-vvVP2弱毒疫苗，免疫剂量为5000 TCID50/只，第3组与第4组免疫0.2 mL的PBS，第5组为空白对照组。免疫7、14及21天后，采集各组鸡的非抗凝血并分离血清。免疫21天后，第1组与第3组使用100 μL vvIBDV HLJ0504株进行攻毒，攻毒剂量为10TCID50/只，第2组与第4组使用200 μL aMPV LN16-F4株进行攻毒，攻毒剂量为5000TCID50/只。攻毒后1-7天，每日上下午观察记录各组鸡发病情况；实验结束后，称量记录鸡只体重和法氏囊重量。
1.7 中和抗体效价测定 将采集的非抗凝血于37℃温箱中静置1小时后，在4℃冰箱中放置1小时，3000 g离心5分钟分离血清。将分离的血清置于56℃水浴锅中30分钟以灭活补体，滤器过滤后保存备用。提前1天将Vero细胞与DF-1细胞铺于96孔板，将过滤后的血清连续进行2的倍比稀释，将不同稀释度的血清分别与200 TCID50 aMPV LN16-F4株或200TCID50 rGt-vvVP2株等量混匀后，分别铺于Vero细胞和DF-1细胞中，每孔100 μL，每个样品作6个重复，每日观察细胞状态，7天后统计各孔的病变情况，按照Reed-Muench方法计算针对vvIBDV及aMPV的中和抗体效价。
2. 结果
2.1 外源基因最佳表达位点的确定
为了筛选适合外源基因表达的最佳插入位点，构建了三种不同位点表达EGFP的全长cDNA感染性克隆，分别命名为pOKLN16A-EGFP-LN、pOKLN16A-EGFP-GL和pOKLN16A-EGFP-SH。参考实施例1中1.3节病毒拯救方法对三种荧光重组病毒进行拯救，结果显示，三种重组荧光病毒均拯救成功，感染细胞后均出现特异性绿色荧光，将三种重组病毒分别命名为rLN16A-EGFP-LN、rLN16A-EGFP-GL和rLN16A-EGFP-SH。将rLN16A-EGFP-LN、rLN16A-EGFP-GL和rLN16A-EGFP-SH（图7A）。以MOI = 0.01的感染剂量接种Vero细胞，通过流式细胞术分析不同时间点的荧光强度来评价EGFP的表达水平，结果表明，在感染24、48和72小时后，rLN16A-EGFP-GL感染Vero细胞后的荧光强度显著高于rLN16A-EGFP-LN和rLN16A-EGFP-SH感染的荧光强度（图7B）。Western blotting结果显示，rLN16A-EGFP-GL的表达水平显著高于rLN16A-EGFP-LN和rLN16A-EGFP-SH（7C）。此外，复制动力学结果显示，rLN16A-EGFP-GL在Vero细胞上的复制水平明显高于rLN16A-EGFP-LN和rLN16A-EGFP-SH；与rLN16A-EGFP-GL相比，rLN16A-EGFP-LN和rLN16A-EGFP-SH的病毒滴度分别降低了83倍和39倍（图7D）。这些结果表明，rLN16A的G和L基因之间的位点可以作为外源蛋白表达的插入位点，在该位点表达外源蛋白不影响病毒的复制，且外源蛋白表达水平最高。
2.2 IFA鉴定结果
将rLN16-A与rLN16A-vvVP2分别以MOI=0.1的感染剂量接种Vero细胞，待细胞出现轻微病变时，使用兔源的抗aMPV N蛋白的多克隆抗体和鼠源的抗IBDV VP2蛋白的单克隆抗体作为一抗，使用FITC标记的羊抗兔和TRITC标记的兔抗鼠抗体作为二抗，对拯救病毒进行鉴定，结果显示，rLN16-A与rLN16A-vvVP2感染组均出现了特异性绿色荧光，表明N蛋白已成功表达；rLN16A-vvVP2感染组出现了特异性的绿色和红色荧光，表明rLN16A-vvVP2感染组中的N蛋白及VP2蛋白均已成功表达（图8）；而Mock组均未出现绿色和红色荧光。以上结果表明两株病毒均拯救成功。
2.3 Western blotting鉴定结果
Western blotting检测结果显示，rLN16A-vvVP2感染组可以成功检测N蛋白及IBDV VP2蛋白的表达，Mock组未检测到蛋白的表达，这表明病毒拯救成功（图9）。
2.4复制动力学测定结果
为进一步验证VP2的插入是否会影响病毒的复制，将rLN16-A与rLN16A-vvVP2分别以MOI=0.01的感染剂量接种Vero细胞，测定两株病毒在Vero细胞上不同时间点的复制水平。结果显示，rLN16-A与rLN16A-vvVP2在Vero细胞上表现出相似的生长特性，此外，两株病毒的毒价均可达到107 TCID50/mL以上，这表明VP2的插入并不会影响rLN16-A的复制（图10）。
2.5中和抗体测定结果
测定免疫后21天内vvIBDV和aMPV中和抗体的水平，结果显示，免疫后的21天内，免疫组的中和抗体水平均呈现逐渐上升的趋势，在21天时的中和抗体阳性率均为100%，针对rGt-vvVP2的中和抗体水平为8.2 log2，针对B亚型aMPV的中和抗体水平为8.6 log2（表5）。这些结果表明，rLN16A-vvVP2株免疫后可同时诱导机体产生针对vvIBDV和aMPV的中和抗体。
2.6 攻毒保护率
攻毒后观察记录各组鸡的发病情况，结果显示，vvIBDV攻毒对照组鸡在攻毒后2天出现精神萎靡和羽毛蓬乱，攻毒后5天鸡只全部死亡。rLN16A-vvVP2免疫组和空白对照组的鸡攻毒后均未出现任何临床症状，保护率为100%。此外，aMPV攻毒对照组鸡在第3天开始出现鼻液混浊和粘稠，6天时发病率达到100%。rLN16A-vvVP2免疫组的鸡攻毒后均未出现任何临床症状，发病率为0。这些结果表明，rLN16A-vvVP2株可对vvIBDV和aMPV两种病毒提供100%的免疫保护。
Claims (3)
1.一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒进行病毒拯救后获得的；所述的包含vvIBDV VP2基因的B亚型禽偏肺病毒全长cDNA感染性克隆质粒是将vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒插入SEQ ID NO.1所示序列的9015-9016 bp之间得到的。
2.如权利要求1所述的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述的vvIBDV-HLJ0504株VP2基因的转录表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒VP2蛋白的重组B亚型禽偏肺病毒弱毒疫苗株在制备同时预防鸡传染性法氏囊病病毒超强毒以及B亚型禽偏肺病毒感染的疫苗中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410109544.5A CN117625688B (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410109544.5A CN117625688B (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117625688A CN117625688A (zh) | 2024-03-01 |
| CN117625688B true CN117625688B (zh) | 2024-04-30 |
Family
ID=90025590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410109544.5A Active CN117625688B (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117625688B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303426A (zh) * | 1998-06-03 | 2001-07-11 | 美国氰胺公司 | Rna病毒拯救的新颖方法 |
| CN102741399A (zh) * | 2009-10-20 | 2012-10-17 | 诺华有限公司 | 用于病毒拯救的改良反向遗传方法 |
| KR20210035676A (ko) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 주식회사 바이오포아 | 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 |
| CN114107226A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用 |
| CN115287270A (zh) * | 2022-10-09 | 2022-11-04 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | B亚型禽偏肺病毒传代致弱株及其应用 |
| CN117417904A (zh) * | 2023-10-27 | 2024-01-19 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 |
-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410109544.5A patent/CN117625688B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1303426A (zh) * | 1998-06-03 | 2001-07-11 | 美国氰胺公司 | Rna病毒拯救的新颖方法 |
| CN102741399A (zh) * | 2009-10-20 | 2012-10-17 | 诺华有限公司 | 用于病毒拯救的改良反向遗传方法 |
| KR20210035676A (ko) * | 2019-09-24 | 2021-04-01 | 주식회사 바이오포아 | 뉴캐슬병 바이러스 벡터를 이용한 고역가 조류메타뉴모바이러스 백신 |
| CN114107226A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-03-01 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用 |
| CN115287270A (zh) * | 2022-10-09 | 2022-11-04 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | B亚型禽偏肺病毒传代致弱株及其应用 |
| CN117417904A (zh) * | 2023-10-27 | 2024-01-19 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A comparison of AMPV subtypes A and B full genomes, gene transcripts and proteins led to reverse-genetics systems rescuing both subtypes;Andrea Laconi et al.;《Journal of General Virology》;20161231;第97卷;第1324-1332页 * |
| Meng,L. et al..Avian metapneumovirus isolate LN16-A, complete genome，GenBank: PP069785.1.《genbank》.2024,第1-6页. * |
| Vieira,J. et al..Cloning vector pOK12, complete sequence，GenBank: AF223639.1.《genbank》.2000,第1-2页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117625688A (zh) | 2024-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110759973B (zh) | 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用 | |
| CN111019910B (zh) | F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用 | |
| WO2022218325A1 (zh) | 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用 | |
| CN110218706B (zh) | 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用 | |
| CN114164184B (zh) | 一种新城疫病毒基因ⅵ型疫苗株及其应用 | |
| WO2003064595A2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof | |
| CN113817753B (zh) | 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用 | |
| CN117417904A (zh) | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 | |
| CN107142280A (zh) | 一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株 | |
| CN113980912A (zh) | 可复制ibv病毒qx亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用 | |
| WO2021098521A1 (zh) | 一种快速制备流行性传染性支气管炎疫苗的方法 | |
| CN107158369B (zh) | 一种使用构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株制备的疫苗 | |
| CN106085970B (zh) | 表达信号肽替换的h5亚型禽流感ha蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法 | |
| CN109633173B (zh) | 一种用于检测ibdv抗体的免疫磁珠间接elisa试剂盒及其应用 | |
| CN117625688B (zh) | B亚型禽偏肺病毒反向遗传操作系统及其应用 | |
| CN107058244B (zh) | 一种p蛋白突变构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株 | |
| CN115948343A (zh) | 表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用 | |
| CN115094045A (zh) | 耐热的嵌合型基因vii型新城疫弱毒株及其应用 | |
| CN112079905B (zh) | 一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN114292823A (zh) | 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用 | |
| CN108060141B (zh) | Vp2基因和np基因重组腺病毒及其应用 | |
| CN110013547B (zh) | 一株重组小反刍兽疫病毒h基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法 | |
| CN114457042A (zh) | 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型 | |
| CN110684744A (zh) | 一种表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组火鸡疱疹病毒株 | |
| CN117625689B (zh) | 表达ibdv vp2蛋白的b亚型禽偏肺病毒疫苗株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |