CN110684744A - 一种表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因的重组火鸡疱疹病毒株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株的VP2基因重组火鸡疱疹病毒株，是在火鸡疱疹病毒基因组中插入IBDV VP2基因外源制备的。本发明以火鸡疱疹病毒(HVT)FC‑126疫苗毒株为载体，以其UL45‑UL46的间隔区为插入位点，将含有VP2基因的表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组中，获得重组病毒rHVT‑vVP2株。免疫保护评价结果表明本发明的rHVT‑vVP2株免疫鸡群后，针对IBDV强毒株及变异毒株的攻击，可以提供100％攻毒保护。

Description

一种表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病 毒株

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达鸡 传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒株，该重组病毒免疫家禽 可用于鸡传染性法氏囊病病毒的预防。

背景技术

马立克氏病(Marek’s disease，MD)和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursaldisease,IBD)是常见的两种影响家禽生产性能的免疫抑制病。20世纪60年代， 火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)FC-126株曾被作为疫苗用于控制 MD的发生，在全球范围内都得到了广泛应用，大大降低了MD致病所带来 的经济损失。随着MDV毒力的增强，原有疫苗己经不能对其进行有效防控， 新的更加有效的疫苗被不断地研发出来，但HVT疫苗仍得到广泛的使用，特 别是与其他疫苗联合使用，显示出很好的协同效果。而IBD是由鸡传染性法 氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽类急性、高度接触 性免疫抑制性传染病，该病主要感染3周龄～12周龄青年鸡，可通过导致鸡法 氏囊损伤、引起免疫抑制和雏鸡死亡等对家禽养殖造成巨大的经济损失。目 前IBDV超强毒株(vvIBDV)和变异株的出现给该病的防控带来巨大难度。

IBD的免疫预防已成为目前防控该病的主要措施，目前商品化的传染性 法氏囊病活疫苗分为弱毒、中等毒力和强毒三类。弱毒活疫苗对有母源抗体 鸡群的免疫保护效果不理想。与弱毒疫苗相比，中等毒力和强毒疫苗的免疫 保护力虽然高很多，但由于其具有一定的致病性，对法氏囊有一定的损伤。 同时，由于受母源抗体干扰及IBDV的特点，导致传统疫苗在实际应用中形 成不可避免的免疫空白期。因此，针对传染性法氏囊病新型疫苗研发重组活 载体疫苗研究就成为目前的热点之一。

影响外源基因表达水平的因素有很多，例如启动子的选择、密码子的偏 嗜性、表达抗原的类型以及调控元件的作用等。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达IBDV田间分离株的VP2基因重组火鸡疱 疹病毒株，该病毒株可用于家禽中诱导针对IBDV的保护性免疫应答。

本发明首先提供一种在火鸡疱疹病毒(HVT)基因组中插入外源基因的 方法，是将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的UL45区和UL46区的间隔区。

更具体的，所述的插入位点位于HVT基因组UL45-UL46间隔区的 95332nt-95342nt之间。

本发明再一方面提供一种重组火鸡疱疹病毒，是通过在火鸡疱疹病毒的 UL45-UL46间隔区插入表达IBDV VP2基因的表达盒所构建；

所述的VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；其编码的氨基酸序列 为SEQ IDNO:2。

所述的表达IBDV田间分离株VP2基因的表达盒，依次包括mcmv启动 子(鼠疱疹病毒Ⅰ型立即早期启动子)、VP2基因、单纯疱疹病毒TK基因聚 腺苷酸化终止信号TK polyA；其中由mcmv负责VP2基因的起始转录， TkployA终止子为VP2基因mRNA转录提供终止信号，同时mRNA 3’端添加 polyA尾巴。

所述的表达IBDV田间分离株VP2基因的表达盒，其一种具体的核苷酸 序列为SEQID NO:3。

所提供的重组火鸡疱疹病毒，其一种为重组火鸡疱疹病毒rHVT-vVP2株， 于2019年10月15日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为CCTCC NO:V201967。

本发明的rHVT-vVP2株用于表达田间分离株IBDV的VP2蛋白，

本发明的rHVT-vVP2株的另一方面的用途是用于制备疫苗。

本发明以火鸡疱疹病毒(HVT)FC-126疫苗毒株为载体，以其UL45-UL46 的间隔区为插入位点，将含有VP2基因的表达盒插入到火鸡疱疹病毒基因组 中，获得重组病毒rHVT-vVP2株。免疫保护评价结果表明本发明的rHVT-vVP2 株免疫鸡群后，针对IBDV强毒株及变异毒株的攻击，可以提供100％攻毒保 护。

附图说明

图1：转移的构建模式图；

图2：重组病毒rHVT-vVP2的构建示意图；

图3：VP2基因及其表达盒PCR电泳图；

图4：转移载体pFR-EGFP转染DF1的荧光图；

图5：Western-Blot试验鉴定转移载体pFR-VP2的蛋白表达；

图6：重组病毒rHVT-EGFP的荧光图；

图7：PCR鉴定重组病毒rHVT-vVP2

图8：Western-Blot试验鉴定重组病毒rHVT-vVP2中VP2蛋白的表达

图9：IFA鉴定重组病毒rHVT-vVP2。

具体实施方式

本发明首先利用同源重组原理，以HVT基因组的UL45-UL46间隔区、US2区、US10区为插入位点，分别构建在上述位点插入EGFP表达盒的重组 病毒rHVT-EGFP，rHVT-US2-EGFP，rHVT-US10-EGFP。

本发明选择田间分离的IBDV完整的VP2基因，在VP2基因上游串联 mcmv启动子序列，VP2基因下游串联TKployA终止信号，构建含 mcmv-VP2-TKpolyA的基因表达盒，分别以HVT基因组的UL45-UL46间隔 区、US2区、US10区为插入位点，将上述表达盒分别连接到对应的含同源臂 转移载体中，构建表达VP2基因的转移载体质粒(如图1所示)。再次，用 上述转移载体质粒分别替换重组病毒rHVT-EGFP、rHVT-US2-EGFP， rHVT-US10-EGFP的标记基因EGFP，筛选出表达VP2基因重组病毒 rHVT-vVP2、rHVT-US2-vVP2、rHVT-US10-vVP2(如图2所示)。

IBDV的VP2蛋白是主要的免疫保护性抗原，针对VP2蛋白的中和抗体 可抵御IBDV强毒株的攻击，因此构建表达IBDV VP2基因的重组活载体疫苗 具有潜在的应用价值

下面以构建rHVT-vVP2为例，对本发明进行详细的描述。

实施例1

1实验材料

1.1毒株、菌株和质粒

HVT FC-126疫苗株由青岛易邦生物工程有限公司保存。

IBDV由青岛易邦生物工程有限公司在田间分离获得。

感受态细胞Trans-T1购自北京全式金生物技术有限公司；鸡胚成纤维细 胞系(DF-1)由青岛易邦生物工程有限公司保藏。

质粒：pEASY-T3，pEASY-Blunt，pEASY-M1购自北京全式金生物科技 有限公司；PCR2.1、pT-EGFP由青岛易邦生物工程有限公司保存，其中 pT-EGFP包含表达绿色荧光蛋白(GFP)的表达盒，表达盒两端分别有Not Ⅰ和AvrⅡ酶切位点。

2实验方法

2.1中间转移载体pFR的构建

2.1.1同源臂引物的设计

选择HVT的UL45-UL46间隔区插入外源基因，参照GenBank中登录的 HVT FC126株(登录号：AF291866)的全基因序列，用Primer Premier 5.0引 物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增Fwd、Rev同源臂。Fwd同源臂上 游引入HindⅢ酶切位点，下游引入Sac Ⅰ和AvrⅡ酶切位点。Rev同源臂上 游引入Not Ⅰ酶切位点，下游引入Xba Ⅰ酶切位点。引物序列如下：

Fwd-F:5'-GAAAAGCTT TTTACTCCAAACGCGGTATTTAA-3'

Fwd-R:5'-AAA GAGCTCCCTAGGAGGTGCGTTTTTATTTACTCATCG-3'

Rev-F:AAAGCGGCCGCACTGTGTTTTATTTATCCAATCACA

Rev-R:GCCTCTAGATTGCTGATTAAGACGCGCGG

引物用超纯水稀释至10μM，-20℃保存备用。

2.1.2转移载体pFR的构建

以HVT FC-126株感染CEF病变细胞的总DNA为模板，分别以Fwd-F/ Fwd-R和Rev-F/Rev-R为引物扩增Fwd、Rev同源臂，回收目的片段。回收产 物与pEASY TM-T3克隆载体进行连接转化。测序鉴定正确的克隆，分别命 名为pT-Fwd和pT-Rev，提取质粒，置于-20℃冰箱保存备用。

将质粒pT-Fwd和pCR2.1用Kpn Ⅰ、Spe Ⅰ进行酶切，1％凝胶电泳后切 胶回收pT-Fwd载体中的Fwd片段和线性化pCR2.1载体。将回收后的Fwd片 段和线性化载体pCR2.1连接，构建质粒p-F。将质粒pT-Rev和p-F用NotⅠ 和ApaⅠ进行酶切，1％凝胶电泳后切胶回收pT-Rev载体中的Rev片段和线 性化载体p-F，将回收后的Rev片段和线性化载体p-F连接，构建质粒p-FR。

2.2真核表达载体pT-cmv-VP2的构建

2.2.1引物设计

参照GenBank中登录的IBDV毒株的基因序列，合成引物VP2-F/VP2-R。 参考载体pcDNA3.4载体序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物 mcmv-PA-F/mcmv-PA-R，该扩增片段包含完整的基因表达盒，由mcmv启动 子、VP2基因和TkpolyA终止子组成。设计的两对引物分别用于PCR扩增 VP2基因和其表达盒(如图3所示)。扩增表达盒的引物的5’端引入NotⅠ位 点，引物3’端引入AvrⅡ位点。

CMV-PA-F:5’-GTATAGCGGCCGC TCGACTCTAGAGGATCCG-3’

CMV-PA-R:5’-GAAATCCTAGG CACTAGTGGATCCCCCAACTCC-3’

VP2-F:5’-ATGGGGCCGTGCGGGGCGCTGG-3’

VP2-R:5’-TTAGATGGCGGGGTTGCTCC-3’

引物用超纯水稀释至10μM，-20℃保存备用。

2.2.2IBDV VP2基因的扩增

以提取的IBDV RNA为模版，VP2-F/VP2-R为引物，RT-PCR扩增VP2 基因，反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳(如图3所示)，回收目的条带， 回收产物放置-20℃冰箱保存备用；其中VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.2.3PCR产物连接与阳性克隆的鉴定

将上述回收的目的片段定向连接到真核表达载体pcDNA3.1中，PCR鉴 定阳性克隆送测序，测序正确的克隆命名为pM-VP2。

2.2.4克隆载体pT-cmv-M-VP2的构建

以质粒pM-VP2为模板，以mcmv-PA-F/mcmv-PA-R为引物，PCR扩增VP2 基因表达盒。反应结束后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收大小约 为3000bp左右目的条带(如图3所示)。回收产物连接pEASY ^TM-T3克隆 载体，鉴定正确的阳性克隆命名为pT-cmv-M-VP2。

2.3转移载体pFR-EGFP和pFR-M-VP2的构建

质粒pT-EGFP、pT-cmv-M-VP2和p-FR用Not Ⅰ、AvrⅡ进行双酶切。1％ 凝胶电泳后，回收Not Ⅰ-EGFP-Avr Ⅱ、Not Ⅰ-M-VP2-Avr Ⅱ片段，与同样经 Not Ⅰ、Avr Ⅱ酶切的线性化载体p-FR进行连接。构建的阳性克隆分别命名为 pFR-EGFP、pFR-M-VP2。

2.4转移载体的鉴定表达

2.4.1载体pFR-EGFP的鉴定

将构建成功的转移载体pFR-EGFP瞬时转染到长至80％的DF1细胞培养 皿中，继续培养18～24h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况(如 图4所示)。

2.4.2载体pFR-VP2的鉴定

①Western-blot试验

转移载体pFR-M-VP2转染DF1细胞，继续培养24h后收集细胞。 Western-blot试验鉴定蛋白表达,其中一抗选用传染性法氏囊病毒的阳性血清， 二抗选择HRP标记的羊抗鸡IgG(结果如图5所示)。

②间接免疫荧光试验(IFA)

转移载体pFR-M-VP2瞬时转染于铺有DF1细胞的96孔板中，24h后进 行间接免疫荧光试验，其中一抗选用传染性法氏囊病毒的阳性血清，二抗选 用异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鸡IgG，倒置荧光显微镜下观察转染细 胞的荧光情况。

2.5表达EGFP的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-EGFP)构建

2.5.1HVT FC-126株基因组的提取

按常规方法制备CEF，HVT FC-126毒株接种于长满单层CEF的细胞瓶 中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养60～84h，待80％的细胞产生典型蚀斑 病变后，收集细胞，用于提取病毒DNA。具体操作步骤如下：弃掉培养液， PBS洗三次，每T75细胞瓶加入5ml PK(20mMTris-Hcl，pH 8.0；0.5％SDS； 150mM NaCl；2mM EDTA，pH 8.0；0.2mg/mL胰蛋白酶)溶液，37℃培养 箱静置2h；细胞裂解物转移至50ml离心管中，加入1/2体积的饱和酚(使 蛋白变性)，轻轻颠倒混匀，作用1min；加入1/2体积的的氯仿/异戊醇(24:1) 溶液，轻轻混匀，8000r/min离心15min；吸取上清于新离心管中，再次加入 等体积的氯仿/异戊醇抽提杂蛋白，8000r/min离心5min；吸取上清于新离心 管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，-20 ℃静置30min；4500r/min离心5min，弃上清，加入10ml预冷的70％乙醇 清洗DNA沉淀物，4500r/min离心10min，弃上清，瞬离吸干上清；自然干 燥后，加适量TE缓冲液溶解DNA；紫外分光光度计测定DNA的浓度及纯度， 4℃保存备用。

2.5.2表达EGFP的重组病毒拯救

转染前制备次代CEF细胞，细胞生长于加入M199培养基(含5％新生 牛血清)的60mm培养皿中，待细胞长至铺满单层的80％时，配制转染体系， 进行转染。采用磷酸钙共沉淀法拯救重组病毒，配制体系如下：

上述体系混匀后，从管底缓慢加入2M CaCl₂ 31μl；缓慢加入2×HBSP溶 液(10mg/ml Herpes；0.74mg/ml KCl；16mg/ml NaCl；0.25mg/ml Na2HPO4； 2mg/ml葡萄糖，pH值调至6.96)250μl，轻轻颠倒混匀，室温静置30min； 向制备次代CEF的60mm培养皿中加入上述混合物，37℃，5％CO2条件下 继续培养。转染细胞培养4h后，配制甘油休克液，对细胞进行休克。配制2.5ml 体系如下：

取出细胞培养皿，弃掉培养基，用M199培养基洗涤细胞2～3次；加甘油休 克液静置1min；再次用M199培养基清洗细胞2～3次；加适量3％M199培 养基(含5％新生牛血清)；37℃，5％CO₂条件下培养5～7d，荧光显微镜下 观察，挑选带有绿色荧光的病毒蚀斑。

2.5.3重组病毒rHVT-EGFP的纯化

荧光显微镜下观察转染细胞，用记号笔标注出带有绿色荧光的病毒蚀斑， 胰酶消化法挑取标记的病变细胞，接种于次代CEF单层细胞上，37℃，5％CO₂条件下培养3～4d；重复上述步骤，至所有蚀斑均显示荧光，完全纯化的重组 病毒命名为rHVT-EGFP(如图6所示)。

2.6重组病毒(rHVT-vVP2株)的构建

将重组病毒rHVT-EGFP接种于原代CEF细胞上，待80％细胞出现特征 性病变时，提取细胞基因组，提取步骤同上。依据同源重组原理，将转移载 体pFR-M-VP2与rHVT-EGFP基因组磷酸钙法转染次代CEF细胞，转染方法 同上。若rHVT-EGFP基因组DNA与转移载体在细胞内发生同源重组，即转 移载体中M-VP2基因表达盒将重组病毒rHVT-EGFP基因组中的EGFP表达 盒替换，产生新的重组病毒蚀斑将不含有绿色荧光。筛选不带荧光的病毒蚀 斑，采用有限稀释法不断筛选纯化，直至培养皿中所有蚀斑均不带有荧光， 拯救成功重组病毒命名为rHVT-vVP2。

2.7重组病毒(rHVT-US2-vVP2株、rHVT-US10-vVP2株)的构建

按上述构建重组病毒的方法，本发明分别在HVT基因组的US2区、US10 区插入VP2基因表达盒。构建重组病毒rHVT-US2-vVP2株、rHVT-US10-vVP2 株时，所用到的含同源臂质粒p-US2和p-US10，其引物序列如下：

2.8重组病毒的传代及鉴定

2.8.1PCR鉴定

rHVT-vVP2株、rHVT-US2-vVP2株和rHVT-US10-vVP2株在CEF连续 传20代，每隔5代次，提取重组病毒的基因组，以提取的基因组为模板，以 VP2-F/VP2-R、mcmv-PA-F/mcmv-PA-R、Fwd-F/Rev-R为引物进行PCR，分别 可扩增出1300bp、3000bp、5000bp左右的目的条带，表明VP2基因成功插入 到HVT基因组中，并未出现基因丢失现象(如图7所示)。

2.8.2Western-Blot试验鉴定

重组病毒rHVT-vVP2株rHVT-US2-vVP2株、rHVT-US10-vVP2株和 rHVT-EGFP分别接种原代CEF细胞，3～4d后收集病变细胞制备蛋白样品。 western-blot检测蛋白表达情况，试验中用传染性法氏囊病毒阳性血清作为一 抗，用HRP标记的羊抗鸡IgG作为二抗。试验中设置阴性对照(用rHVT-EGFP 细胞毒制备蛋白样品)。增强型化学发光法(ECL)显色，结果表明，由接种 rHVT-vVP2株、rHVT-US2-vVP2株和rHVT-US10-vVP2株的CEF制备的蛋白 样品可以扩增出预期的特异性条带(如图8所示)。

2.8.3间接免疫荧光试验(IFA)鉴定

将重组病毒rHVT-vVP2株、rHVT-US2-vVP2株、rHVT-US10-vVP2株和 HVT亲本毒分别接种于长满单层CEF的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2 条件下培养，待细胞出现典型蚀斑后，将培养液弃掉，用80％丙酮固定10min， PBS洗3次，每个空中加入50μL(1:100稀释)Flag单抗，37℃恒温培养箱 中孵育1h，用PBS洗3次，每孔加50μL FITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置 37℃恒温培养箱中孵育1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察， rHVT-vVP2株、rHVT-US2-vVP2株、rHVT-US10-vVP2株感染孔均出现特异 性绿色荧光，而HVT感染孔无荧光，表明rHVT-vVP2株株、rHVT-US2-vVP2 株、rHVT-US10-vVP2株中VP2基因能够正确的表达(如图9所示)。

2.9重组病毒对IBDV强毒的免疫保护评价

将50只1日龄SPF鸡随机分成四组，分别为rHVT-vVP2组、 rHVT-US2-vVP2组、rHVT-US10-vVP2组和攻毒对照组；其中rHVT-vVP2 组、rHVT-US2-vVP2组、rHVT-US10-vVP2组于1日龄时通过颈部皮下接种 5000PFU/羽份(保藏编号为CCTCC NO:V201967)相应的重组疫苗，攻毒对 照组接种疫苗稀释液。各组于28日龄时，用IBDV强毒BC6/85株经点眼途 径进行攻毒，攻毒剂量为100LD₅₀/羽份。攻毒后每天观察并统计各组鸡的发 病和死亡情况，从表中可以看出rHVT-vVP2组鸡的攻毒保护率可达100％，， rHVT-US2-vVP2组的攻毒保护率为80％，rHVT-US10-vVP2组的攻毒保护率 为60％，而攻毒对照组的保护率为0％。

每组随机挑选10羽SPF鸡，从1日龄开始，每隔7天采血，分离血清用 Synbiotics公司的传染性法氏囊病抗体检测ELISA试剂盒，检测抗体效价；检 测主要步骤为：①血清样品做100倍稀释，②酶标仪所用波长为405-410nm， ③效价计算公式为log10Titer＝1.172(log10S/P)+3.614；④S/P值＞0.299； Titer值大于998.8，判定阳性。通过抗体效价的监测来揭示鸡群免疫重组疫苗 后外源基因在体内的表达水平，抗体检测结果见下表所示。

免疫评价结果表明，rHVT-US2-vVP2组和rHVT-US10-vVP2组相比，rHVT -vVP2组在相同时间段，诱导的抗体水平最高，rHVT-US2-vVP2组次之，而 rHVT-US10-vVP2组诱导的抗体水平最低。因此，鸡群免疫重组火鸡疱疹病毒 rHVT-vVP2株后，可以对IBDV强毒株提供良好的免疫保护。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒株

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggaa ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360

aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa tgtcctggta 480

ggggaagggg tcactgtcct cagcctaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540

ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagctacatg cgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660

caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc 720

agcattgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgccacc 780

atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc cgcagataat 840

gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960

gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080

tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga ttccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260

gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggagg 1359

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg

1 5 10 15

Asn Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr

20 25 30

Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro

50 55 60

Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr

65 70 75 80

Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr

85 90 95

Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr

100 105 110

Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr

115 120 125

Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu

130 135 140

Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val

145 150 155 160

Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly

165 170 175

Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys

180 185 190

Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile

195 200 205

Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Pro Gly Gly

210 215 220

Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

225 230 235 240

Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Val

245 250 255

Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile

260 265 270

Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn

275 280 285

Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gln Pro

290 295 300

Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln

305 310 315 320

Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr

325 330 335

Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val

340 345 350

Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val

355 360 365

Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val

370 375 380

Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu

385 390 395 400

Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr

405 410 415

Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu

420 425 430

Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Ile Arg Arg

450

<210> 3

<211> 3072

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgactcctat agggcgattg ggccctctag atgcatgctc gagcggccgc cagtgtgatg 60

gatatctgca gaattccact agtggatccc ccaactccgc ccgttttatg actagaacca 120

atagttttta atgccaaatg cactgaaatc ccctaatttg caaagccaaa cgccccctat 180

gtgagtaata cggggacttt ttacccaatt tcccaagcgg aaagccccct aatacactca 240

tatggcatat gaatcagcac ggtcatgcac tctaatggcg gcccataggg actttccaca 300

tagggggcgt tcaccatttc ccagcatagg ggtggtgact caatggcctt tacccaagta 360

cattgggtca atgggaggta agccaatggg tttttcccat tactggcaag cacactgagt 420

caaatgggac tttccactgg gttttgccca agtacattgg gtcaatggga ggtgagccaa 480

tgggaaaaac ccattgctgc caagtacact gactcaatag ggactttcca atgggttttt 540

ccattgttgg caagcatata aggtcaatgt gggtgagtca atagggactt tccattgtat 600

tctgcccagt acataaggtc aatagggggt gaatcaacag gaaagtccca ttggagccaa 660

gtacactgcg tcaataggga ctttccattg ggttttgccc agtacataag gtcaataggg 720

gatgagtcaa tgggaaaaac ccattggagc caagtacact gactcaatag ggactttcca 780

ttgggttttg cccagtacat aaggtcaata gggggtgagt caacaggaaa gtcccattgg 840

agccaagtac attgagtcaa tagggacttt ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca 900

atgggaggta agccaatggg tttttcccat tactggcacg tatactgagt cattagggac 960

tttccaatgg gttttgccca gtacataagg tcaatagggg tgaatcaaca ggaaagtccc 1020

attggagcca agtacactga gtcaataggg actttccatt gggttttgcc cagtacaaaa 1080

ggtcaatagg gggtgagtca atgggttttt cccattattg gcacgtacat aaggtcaata 1140

ggggtgagtc attgggtttt tccagccaat ttaattaaaa cgccatgtac tttcccacca 1200

ttgacgtcaa tgggctattg aaactaatgc aacgtgacct ttaaacggta ctttcccata 1260

gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag ccaatacacg tcaatgggaa gtgaaagggc 1320

agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc cctggaaatt ccatattggc acgcattcta 1380

ttggctgagc tgcgttctac gtgggtataa gaggcgcgac cagcgtcggt accgtcgcag 1440

tcttcggtct gaccaccgta gaacgcagac tcctcgctgc aggccaccat gacaaacctg 1500

caagatcaaa cccaacagat tgttccgttc atacggagcc ttctgatgcc aacaaccgga 1560

ccggcgtcca tcccggacga caccctggag aagcacactc tcaggtcaga gacctcgacc 1620

tacaatttga ctgtggggga cacagggtca gggctaattg tctttttccc tggcttccct 1680

ggttcaattg tgggtgctca ctacatactg cagagcgatg ggagctacaa gttcgatcag 1740

atgctcctga cggcccagaa cctacctgcc agctacaact actgcaggct agtgagtcgg 1800

agtctcacag taaggtcaag cacactccct ggtggcgttt atgcgctaaa cggcaccata 1860

aacgccgtga ccttccaagg gagcctgagt gagctgacag atgttagcta caacgggttg 1920

atgtctgcaa cagccaacat caacgataaa attgggaacg tcctagtagg ggaaggggta 1980

accgttctca gcttacccac atcatatgac ctcgggtatg tgaggcttgg tgaccctata 2040

cctgctgtag ggctcgaccc aaagatggta gcaacatgtg acagcagtga caggcccaga 2100

gtctacacca taactgcagc cgataattac caattctcat cacagtacaa gacaggtggg 2160

gtaacaatca cactgttctc agccaacatt gatgccatca ctagtctcag cgtcgggggg 2220

gagcttgtgt tcaaaaccag catccaaaac cttgtactgg gcgccacaat ctaccttata 2280

ggctttgatg ggactgcagt aatcaccaga gctgtagcgc aaacaatggg ctgacggccg 2340

gcatcgacaa cctcatgcca ttcaaccttg tgattccgac cagcgagata acccagccaa 2400

tcacgtccat caaattggag atagtgacct ccaaaagtga tggccaggca ggagaacaga 2460

tgtcgtggtc ggcaagtggg agtctagcag tgacgatcca tggtggcaac tatccaggag 2520

ccctccgtcc agtcacgcta gtggcctacg aacgagtggc aacaggatcc gtcgttacgg 2580

tcgccggggt gagcaacttc gagctgatcc cgaatcctga actagcaaag aacctggtca 2640

cagaatacgg ccgattcgac ccaggagcca tgaactacac gaaactgata ctgagtgaga 2700

gggaccgtct tggcattaag accgtctggc caacaaggga gtacaccgac tttcgcgagt 2760

acttcatgga ggtggccgac ctcaactctc ccctgaagat tgcaggagca tttggcttca 2820

aagacataat ccgggccata aggaggtaac ggggatccag acatgataag atacattgat 2880

gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 2940

gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat 3000

tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggttttttc ggatcctcta 3060

gagtcgacgt ag 3072

Claims (10)

1.一种在火鸡疱疹病毒基因组中插入外源基因的方法，其特征在于，所述的方法是将外源基因插入火鸡疱疹病毒基因组的UL45区和UL46区的间隔区。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的插入位点位于火鸡疱疹病毒HVT基因组UL45-UL46间隔区的95332nt-95342nt之间。

3.如如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因为鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因。

4.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的重组火鸡疱疹病毒是通过在火鸡疱疹病毒的UL45-UL46间隔区插入表达IBDV VP2基因的表达盒所构建的。

5.如权利要求4所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的VP2基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；其编码基因的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

6.如权利要求4所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的VP2基因的表达盒，依次包括mcmv启动子、VP2基因、单纯疱疹病毒TK基因聚腺苷酸化终止信号TK polyA；同时mRNA3’端添加polyA尾巴。

7.如权利要求6所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的VP2基因的表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

8.如权利要求4所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的重组火鸡疱疹病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201967。

9.权利要求4-8任一项所述的重组火鸡疱疹病毒在重组表达VP2蛋白中的应用。

10.权利要求4-8任一项所述的重组火鸡疱疹病毒在制备疫苗中的应用。

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