CN115948343A - 表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用，属于生物技术领域。本发明针对复制缺陷型RABV由于缺乏合成跨膜糖蛋白的能力，在未经改造的宿主细胞中只能进行单轮感染而不能组装子代病毒的问题，提供了一种表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株，该稳转细胞株的具体构建方法为利用PiggyBac转座子真核表达载体构建了表达RABV‑G的表达质粒，并利用与辅助质粒PiggyBac转座酶的共转染实现将RABV‑G插入BSR细胞基因组，通过筛选单克隆的方法最终获得稳定表达RABV‑G蛋白的细胞株。构建获得的稳转细胞株可应用于拯救培养复制缺陷型病毒，这为制备新型复制缺陷型狂犬病病毒疫苗的研究奠定了基础。

Description

表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株及其构建方法与应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabiesvirus，RABV)感染引起的中枢神经系统人兽共患传染病，对宠物健康和公共卫生安全构成重大威胁。发达国家的成功经验表明，动物疫苗免疫是控制人间狂犬病最经济有效的方法。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)呼吁全球在2030年前消灭由犬传播的人间狂犬病。

狂犬病病毒的跨膜糖蛋白(Glycoprotein，G)是唯一存在于RABV粒子表面的蛋白，它既是RABV的主要保护性抗原，能诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，又可介导RABV与细胞受体结合，在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用，与病毒毒力直接相关。缺失G基因的RABV因缺乏病毒传播或感染需要的元件，被称为“复制缺陷型”RABV。复制缺陷型RABV在细胞内能完成一次生命周期，但不能产生子代病毒，因此安全性要优于其他疫苗。此外，复制缺陷型RABV可作为疫苗载体，为研制安全、高效的复制缺陷型活载体疫苗提供了新的思路。

复制缺陷型病毒缺乏合成某个病毒蛋白的能力，仅限于在能够为其提供所缺乏的蛋白产物的转基因细胞株中进行复制，且需要在外源相关蛋白的帮助下才能够包装成为成熟具有感染性的病毒粒子；对于在未经改造的宿主细胞中只能进行单轮感染而不能组装子代病毒。如上面提及到的缺失G基因的复制缺陷型RABV需要在能够表达G蛋白的细胞株中进行复制。

发明内容

本发明针对复制缺陷型RABV由于缺乏合成跨膜糖蛋白的能力，在未经改造的宿主细胞中只能进行单轮感染而不能组装子代病毒的问题，提供了一种表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株，具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株的构建方法，所述构建方法是基于脂质体转染法将表达狂犬病病毒SRV9病毒株跨膜糖蛋白(G蛋白)的重组质粒与PiggyBac转座子酶辅助质粒共转染BSR细胞。

在本发明的一种实施方式中，BSR细胞株是BHK-21细胞株经过改造后获得的，能够表达T7RNA聚合酶，有助于RABV反向遗传系统的操作。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法还包括对转染后的BSR细胞进行药物筛选。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法还包括对转染后的BSR细胞进行克隆培养。

在本发明的一种实施方式中，所述跨膜糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述跨膜糖蛋白由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码获得。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法中用于扩增跨膜糖蛋白编码基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒构建过程中使用的载体为YHM-Cas9-SP。

本发明的第二个目的是提供上述构建方法获得的表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株。

本发明的第三个目的是提供上述构建方法获得的表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株在生产狂犬病疫苗中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述狂犬病疫苗以复制缺陷型RABV作为疫苗载体。

本发明的有益效果：

本发明利用PiggyBac转座子系统将狂犬病病毒G蛋白的编码基因整合至BSR细胞基因序列中，并通过筛选单克隆的方法最终获得一株稳定表达RABV-G蛋白的细胞株。该细胞株为复制缺陷型RABV的复制和增殖提供基本条件，可以应用于拯救培养复制缺陷型重组狂犬病病毒，为制备新型复制缺陷型狂犬病病毒疫苗的研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的重组质粒YHM-SRV9-G双酶切鉴定图；其中，图1中的M为DL15KMarker，图1中的1为YHM-SRV9-G质粒双酶切产物；

图2为本发明实施例1提供的间接免疫荧光鉴定RABV-G蛋白表达结果图；其中，图2中的A为转染重组质粒YHM-SRV9-G，图2中的B为转染空载体质粒YHM-spCas9载体质粒；

图3为本发明实施例2提供的最适灭瘟素S盐酸盐浓度筛选结果图；其中，图3中的A为给药浓度0μg/mL，图3中的B为给药浓度5μg/mL，图3中的C为给药浓度10μg/mL，图3中的D为给药浓度20μg/mL，图3中的E为给药浓度30μg/mL；

图4为本发明实施例2提供的稳转细胞株PCR鉴定结果图；其中图4中的M为DL2000Marker，图4中的1为阳性对照，图4中的2为BSR-GF8代基因组PCR结果，图4中的3为BSR-GF1代基因组PCR结果，图4中的4为阴性对照；

图5为本发明实施例2提供的稳转细胞株间接免疫荧光鉴定结果图；其中，图5中的A为BSR-G细胞株观察结果，图5中的B为正常BSR细胞株观察结果；

图6为本发明实施例2提供的稳转细胞株RABV-G蛋白表达位置的激光共聚焦鉴定结果图；

图7为本发明实施例2提供的稳转细胞株的WesternBlot鉴定结果图；其中，M为蛋白质Marker，1为BSR-G细胞膜蛋白，2为BSR细胞膜蛋白；

图8为本发明实施例2提供的稳转细胞株遗传稳定性鉴定结果；其中，图8中的A为F2代BSR-G细胞，图8中的B为F8代BSR-G细胞，图8中的C为F15代BSR-G细胞；

图9为本发明实施例2提供的复制缺陷型狂犬病病毒rSRV9-△G-eGFP的增殖情况；

图10为本发明实施例2提供的复制缺陷型重组狂犬病病毒rSRV9-△G-eGFP在BSR-G细胞和BSR细胞上的生长曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

以下实施例涉及的材料和主要试剂如下：

质粒、细胞及抗体：

转座子YHM-spCas载体质粒购买自淼灵质粒平台(货号：P45208)，由实验室将药物筛选标记替换为BSD基因(核苷酸序列见SEQ ID NO.5)；PiggyBac转座子酶辅助质粒购买自淼灵质粒平台(货号为P0179)；pcDNA3.1-SRV9-G质粒已在专利(犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法，专利号：201210271485.9)中公开；BSR细胞为金黄仓鼠肾细胞，可在中国微生物菌种官网(https://www.biobw.org/)查询到，平台编号为：Bio-133108。细胞膜染料DIO和鼠源抗RABV-G单克隆抗体购自Merck公司；TRITC标记的山羊抗小鼠IgG购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购自BioWorld公司。

SEQ ID NO.5：

atggccaagcctttgtctcaagaagaatccaccctcattgaaagagcaacggctacaatcaacagcatccccatctctgaagactacagcgtcgccagcgcagctctctctagcgacggccgcatcttcactggtgtcaatgtatatcattttactgggggaccttgtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgctgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcgatcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgccgacaggtgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagccatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattgctgccctctggttatgtgtgggagggctaa

主要试剂：

AgeⅠ、BsrGⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自NEB公司；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司；PrimerSTARMaxDNAPolymerase购自北京宝日医生物技术公司；DH5α感受态细胞、DNAMarker、SOC培养基均购自TaKaRa公司；去内毒素质粒小量提取试剂盒为QIAGEN公司产品；DMEM培养液、0.25％胰酶和胎牛血清均为Giboco公司产品；Polyjet脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自Thermo公司；细胞膜染料DIO购自Merck公司；灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)购自大连美仑生物技术有限公司；Minute^TM质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒购自invent公司。

实施例1：表达RABV-G蛋白重组质粒的构建及鉴定

(1)RABV-G基因的扩增

从GenBank获得RABV-G基因序列，跨膜糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用PrimerPremier软件设计扩增RABV-G基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。以pcDNA3.1-SRV9-G质粒为模板，PCR扩增体系为：正、反向引物各2μL，模板200ng，PrimerSTAR25μL，加ddH₂O补充到50μL。PCR反应条件为：98℃1min，98℃10s，55℃10s，72℃20s，35个循环，72℃7min。扩增完成后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。RABV-G的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到1575bp特异性条带，与预期大小一致。

SEQ ID NO.1：

MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEECTNLSGFSYMELKVGHILAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVSMQTSNETKWCPPDKLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMATKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVSTWNEVLPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFEDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL

SEQ ID NO.2：

atggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttccattgtgttttgggaaattccctatttacacgataccagacaagcttggtccctggagtccgattgacatacatcacctcagctgcccaaacaatttggtagtggaggacgaagaatgcaccaacctgtcagggttctcctacatggaacttaaagttggacacatcttagccataaaagtgaacgggttcacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttggttatgtcacaaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagccgcgtacaactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgtaccctgactaccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatctccaagtgtggcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctagcgggaagtgctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccacgattacaccatttggatgcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttaccaatagtagagggaagagagcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctatataagtctttaaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttatggatggaacatgggtctcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgataagttggtgaacctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagttggtcaggaagagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatggcaaccaagtcagtgagtttcagacgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatataccatattcaacaagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcagcacttggaatgaggtcctcccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaacggggtgtttttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagatgcaatcatccctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgtgcaccccctggcagacccgtctaccgttttcgaggacggtgacgaggctgaggattttgttgaagttcaccttcccgatgtgcacaatcaggtctcaggagttgacttgggtctcccgaactgggggaagtatgtattactgagtgcaggggccctgactgccttgatgttgataattttcctgatgacatgttgtagaagagtcaatcgatcagaacctacgcaacacaatctcagagggacagggagggaggtgtcagtcactccccaaagcgggaagatcatatcttcatgggaatcacacaagagtgggggtgagaccagactgtaa

SEQ ID NO.3：5'-ATAACCGGTATGGTTCCTCAGGCTCTCC-3'

SEQ ID NO.4：5'-ATATGTACATTACAGTCTGGTCTCACCCCC-3'

(2)重组载体的构建

将YHM-Cas9-SP载体和目的基因RABV-G用AgeⅠ/BsrGⅠ内切酶酶切，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带(酶切后YHM载体)与RABV-G目的基因按一定比例进行连接，16℃连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆，经双酶切鉴定正确后送生工测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒命名为YHM-SRV9-G。

YHM载体以及扩增后目的片段用AgeⅠ/BsrGⅠ内切酶酶切后利用T4连接酶连接构建重组质粒，经转化后提质粒，用AgeⅠ/BsrGⅠ内切酶酶切进行鉴定。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后，得到7173bp载体片段和1575bp的目的基因条带，与预期大小一致(见图1)。测序结果显示，基因片段与目的基因序列一致，表明成功构建了含有RABV-G基因的重组质粒，命名为YHM-SRV9-G。

(3)RABV-G基因的表达

转染前12h，将BSR细胞以合适的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，待细胞密度达70％-80％时，向无菌离心管中加入15μLDMEM细胞培养液、0.5μLPolyjet脂质体转染试剂以及0.2μg重组质粒YHM-SRV9-G后轻轻混匀，在室温下孵育15-20min，然后将上述混合液缓慢加至BSR细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，6h后换新鲜培养基。转染后48h弃掉细胞上清，用80％冷丙酮室温固定30min；弃去液体用PBST清洗3次；用含1％BSA的PBST1:500倍稀释鼠抗RABV-G蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h；弃去液体用PBST清洗3次；用含1％BSA的PBST1:200倍稀释FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体(含1:500倍稀释的伊文思蓝)，37℃孵育1h；弃去液体用PBST清洗3次；置倒置荧光显微镜下观察荧光信号。

为鉴定目的G蛋白是否表达，将重组质粒YHM-SRV9-G、空载体质粒分别转染BSR细胞，48h后以鼠源抗RABV-G蛋白单克隆抗体作为一抗进行IFA鉴定。结果显示，转染YHM-SRV9-G质粒后细胞可检到G蛋白的表达，说明重组质粒YHM-SRV9-G可在细胞中成功表达G蛋白(见图2)。

实施例2：稳转细胞株的建立及鉴定

(1)BSR细胞灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)毒性测定

将处于对数生长期的正常BSR细胞经胰酶消化，按照每孔3×10⁵个细胞的密度接种至六孔板中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养12h，12h后弃掉细胞培养上清，分别换成含10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)的培养基，每天观察细胞死亡情况，适时更换含有Blasticidin的10％BI的DMEM培养基每日监测细胞生长状态。连续培养1周后，选择能使细胞密度达到70-80％的浓度作为最适筛选浓度。

使用含不同浓度灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)的培养液培养BSR细胞，通过显微镜下观察细胞的生长状态，见图3，经过一周培养后，灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)浓度20μg/mL时细胞仍可达到70-80％密度，且细胞形态未发生改变。因此确定药物筛选最适浓度为20μg/mL。

(2)稳转细胞株的建立

转染前12h，将BSR细胞以合适的密度接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度达70％-80％时，向无菌离心管中加入50μLDMEM细胞培养液、5μLPolyjet脂质体转染试剂、1μg表达RABV-G基因的重组质粒以及1μgPiggyBac转座子酶质粒后轻轻混匀，在室温下孵育15-20min，然后将上述混合液缓慢加至BSR细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，6h后换新鲜培养基。转染24h后，加入20μg/mL的灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)进行阳性细胞筛选。培养2周后，对细胞板中的细胞进行有限稀释，接种于96孔细胞培养板，添加20μg/mL的灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)继续对细胞进行扩增筛选，直至部分细胞生长成簇，再次利用有限稀释法进行单克隆筛选，如此经2次单克隆纯化后，获得能在灭瘟素S盐酸盐(Blasticidin)作用下稳定生长的单克隆细胞株，鉴定正确后扩大培养并冻存细胞。

(3)稳转细胞株的PCR鉴定

分别收集稳转细胞株BSR-G细胞和正常BSR细胞，按照试剂盒说明提取基因组，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：正、反向引物(同实施例1)各2μL，模板200ng，PrimerSTAR25μL，加ddH₂O补充到50μL。PCR反应条件为：98℃1min，98℃10s，55℃10s，72℃20s，35个循环，72℃7min。

分别选取单克隆传代1、8代次，同时提取细胞基因组后进行PCR鉴定，结果显示，筛选细胞株在大约1575bp处出现目的条带，对照组无此目的条带，证明RABV-G基因成功插入BSR细胞基因组中(见图4)。

(4)间接免疫荧光(IndirectImmunofluorescenceAssay)鉴定

将BSR-G细胞以合适的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，48h后用80％冷丙酮室温固定30min；弃去液体用PBST清洗3次；用含1％BSA的PBST1:500倍稀释鼠抗RABV-G蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h；用含1％BSA的PBST1:200倍稀释FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体(含1:500倍稀释的伊文思蓝)，37℃孵育1h；弃去液体用PBST清洗3次；置于倒置荧光显微镜下观察荧光信号。

选取F3代次细胞株进行间接免疫荧光鉴定，结果显示，稳转细胞株可在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光且荧光覆盖全视野，证明单克隆纯化后获得的细胞株可以高效表达RABV-G蛋白(见图5)。

(5)激光共聚焦(Confocal)鉴定

将BSR-G细胞传代，按2×10⁴个/孔密度加入已放置细胞爬片的24孔细胞培养板中，37℃温箱中培养36～48h后用4％多聚甲醛孵育20min固定细胞，PBS冲洗3次，加入1％BSA-PBS室温封闭30min，用封闭液1:500倍稀释一抗(鼠抗RABVG蛋白单抗)37℃孵育1h，用封闭液1:500倍稀释二抗(TRITC标记的抗鼠二抗)37℃孵育1h。PBST洗涤3次后，用50μM的细胞膜绿色荧光探针(DIO)37℃孵育15min，PBST洗涤3次后，取一滴含DAPI的抗荧光淬灭剂滴于爬片中央，3～5min后，用90％甘油封片，使用激光共聚焦显微镜观察荧光情况。

为进一步确定RABV-G在细胞中表达的位置，通过激光共聚焦进行鉴定(见图6)，在稳转细胞株的细胞膜上可观察到均匀分布用于检测G蛋白的红色荧光，而且红色荧光信号与商品化的细胞膜染料DIO有很好的共定位，证明RABV-G主要在细胞膜上表达。

(6)Westernblot鉴定

将BSR-G细胞传代，按MinuteTM质膜蛋白和细胞组分分离试剂盒说明提取细胞膜成分，用相应裂解液进行裂解，经5×loadingbuffer处理后进行10％的SDS-PAGE电泳，转移至NC膜，用封闭液1:500倍稀释的鼠抗RABV-G蛋白单克隆抗体37℃孵育1.5h，用封闭液1:10000倍稀释的二抗(HRP标记羊抗鼠IgG(H+L))37℃孵育1h，PBST冲洗3次后，加入显色液进行Westernblot分析。

选取F8代细胞提取膜蛋白进行WesternBlot鉴定，结果显示，细胞株可在约66KD处检测到目的蛋白表达，且与RABV-G蛋白大小相符，而BSR细胞对照组相同位置无特异性条带(见图7)，证明RABV-G正确表达且可定位于细胞膜。

(7)稳转细胞株遗传稳定性的鉴定

为了验证BSR-G细胞株中RABV-G蛋白表达的稳定性，将细胞进行连续传代培养，F2、F8及F15代细胞传代时留取部分细胞进行间接免疫荧光鉴定。

为了验证稳转细胞株BSR-GRABV-G蛋白表达的稳定性，选取F2、F8、F15代次细胞，利用间接免疫荧光进行检测，结果显示，该细胞株从F2至F15代都能够均一稳定表达RABV-G蛋白，证明该细胞株能够稳定持续表达外源转入的RABV-G蛋白(见图8)。

实施例3：G基因缺失的重组狂犬病病毒rSRV9-△G-eGFP在稳转细胞株的增殖

将BSR-G细胞和正常BSR细胞按合适的密度接种至24孔板，500μL/孔。将G基因缺失的重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)按MOI＝0.2分别接种单层BSR-G细胞和单层BSR细胞，37℃5％CO₂培养箱培养，于培养的1d-5d时使用荧光显微镜通过重组病毒带有的绿色荧光信号基团eGFP的表达情况观察病毒在稳转细胞株和正常细胞上的增殖情况。每24h收取一次病毒，测定病毒TCID50，并绘制病毒增殖曲线。

将G基因缺失的重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)按MOI＝0.2分别单层接种BSR-G细胞和BSR细胞，通过观察绿色荧光的表达来评价重组病毒的增殖情况，结果显示，重组狂犬病病毒(rSRV9-△G-eGFP)感染BSR-G细胞后可出现明显增殖趋势，而感染正常BSR细胞后则没有明显的增殖(见图9)。每天收集感染BSR-G细胞上清培养物，并进行病毒滴度测定，结果显示，重组病毒rSRV9-△G-eGFP可在BSR-G细胞增殖，病毒滴度可达10^5.3TCID50/mL；感染BSR细胞后，病毒滴度低于可检测值(见图10)。由此说明，BSR-G细胞株成功构建，并可用于复制缺陷型狂犬病病毒的增殖培养。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是基于脂质体转染法将表达狂犬病病毒SRV9病毒株跨膜糖蛋白的重组质粒与Piggy Bac转座子酶辅助质粒共转染BSR细胞。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对转染后的BSR细胞进行药物筛选。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括对转染后的BSR细胞进行克隆培养。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述跨膜糖蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述跨膜糖蛋白由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码获得。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法中用于扩增跨膜糖蛋白编码基因的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒构建过程中使用的载体为YHM-Cas9-SP。

8.由权利要求1-7任意一项所述构建方法获得的表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株。

9.由权利要求1-7任意一项所述构建方法获得的表达狂犬病病毒糖蛋白的稳转细胞株在生产狂犬病疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述狂犬病疫苗以复制缺陷型RABV作为疫苗载体。

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