CN116855538A - 一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法和缺陷性病毒及其应用 - Google Patents
一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法和缺陷性病毒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法和缺陷性病毒及其应用，涉及属于基因工程技术领域。一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，利用转座酶的基因转移功能能够将复制相关的病毒基因高效整合至细胞基因组中，在Cre重组酶的作用下激活复制相关的基因的表达，从而激活相应蛋白的翻译，保证复制缺陷型病毒在细胞中得以包装和扩增，从而实现复制缺陷型重组病毒的大量扩增。本发明提供的方法制备的细胞系可适用于对应复制缺陷型重组病毒的复制，为复制缺陷型重组病毒作为候选抗原制备疫苗和制备基因治疗载体提供了原料基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法和缺陷性病毒及其应用。
背景技术
多数病毒复制过程有六步，即吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。病毒能够在多种细胞中感染和复制，造成细胞裂解死亡。当病毒在细胞中复制能力增强时，必然会造成疾病大流行。例如副粘病毒科病毒为一类负股单股RNA病毒，病毒颗粒多形性，有囊膜及纤突，核衣壳螺旋状对称，纤突有两种糖蛋白，血凝素神经氨酸酶(HN)及融合蛋白(F)。病毒包膜与细胞膜融合是包膜病毒穿入宿主的主要方式，F蛋白具有膜融合活性，与病毒致病性有关。因此，制备缺陷型重组病毒有利于限制病毒的致病性的同时还方便对病毒的致病机制进行更加精细、准确的研究，从而在基因层面上对该病毒有更为深入的研究和了解。
在缺陷型重组病毒包装时，需要构建一种具有病毒复制能力的细胞系，然而当构建的缺陷型复制病毒缺乏感染宿主细胞的蛋白时，会限制所述缺陷型重组病毒的复制，无法实现缺陷型重组病毒在制备疫苗或其他生物制品中的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复制缺陷型重组病毒包装用细胞系的制备方法，通过Cre重组酶激活融合蛋白的表达，表达融合蛋白的细胞能够使得缺乏对应基因的重组副粘病毒进行复制。
本发明还提供了上述方案制备的细胞系在复制缺陷型重组病毒的增殖中的应用。
本发明提供了一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，包括以下步骤：
合成转座子系统识别的CALPdL-linear序列后克隆至质粒中，得到含CALPdL-linear的重组载体，将CAG启动子序列插入所述含CALPdL-linear的重组载体中，得到含CALPdL-CAG的重组载体；
扩增与复制相关的病毒基因，克隆至含CALPdL-CAG的重组载体中，得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体；
将含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体共转染哺乳动物细胞，得到复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系。
优选的，所述病毒包括副粘科病毒。
优选的，所述副粘科病毒包括仙台病毒。
优选的，所述仙台病毒的与复制相关的基因为F基因；所述F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述CALPdL-linear的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；
所述CAG启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选的，所述含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体的质量比为9:1；
所述含转座酶的重组载体包括SB100X或PBase。
本发明提供了所述制备方法制备得到的复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系在生产复制缺陷型重组病毒中的应用。
优选的，所述复制缺陷型重组病毒包括缺失F基因的仙台病毒。
优选的，所述复制缺陷型重组病毒的包装方法，包括以下步骤：
将T7 RNA聚合酶的编码基因克隆至质粒中，得到含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体；
将含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体和含转座酶基因的重组载体共转染哺乳动物细胞，经筛选，得到复制缺陷型重组病毒包装用细胞系；
将含缺失与复制相关的病毒基因的病毒基因组的重组载体与含所述病毒的各基因的重组载体共同转染所述复制缺陷型重组病毒包装用细胞系，得到转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系。
优选的，所述复制缺陷型重组病毒扩增的方法，将含CRE基因的重组载体转染至所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系中，将转染后的细胞系与所述转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系共培养，收集病毒。
本发明提供的复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，是将Cre重组酶识别相关序列和启动复制相关的病毒基因的启动子以及复制相关的病毒基因预先克隆至质粒中，得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体；将含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体共转染哺乳动物细胞，利用转座酶的基因转移功能能够将复制相关的病毒基因高效整合至细胞基因组中，同时后续在Cre重组酶的作用下激活复制相关的基因的表达，从而激活相应蛋白的翻译，保证复制缺陷型病毒在细胞中得以包装和扩增，从而实现复制缺陷型重组病毒的大量扩增。本发明提供的方法制备的细胞系可适用于对应复制缺陷型重组病毒的复制，为复制缺陷型重组病毒作为候选抗原制备疫苗和制备基因治疗载体提供了原料基础。
同时本发明技术方案中使用转座子系统，将外源的复制相关的病毒基因和细胞基因组进行整合，大大提高单纯质粒整合效率，较传统整合方法提高了50～100倍。
同时，本发明制备方法得到的扩增用细胞系遗传稳定性方面较强，细胞传代15代也不会丢失性状，同时也保持蛋白的高表达活性。
附图说明
图1为CALPdL-linear基因组成示意图；
图2为pUC-CALPdL序列图谱；
图3为pCALPdL-empty序列图谱；
图4为pCALPdL-Fwt-Flag质粒图谱；
图5为pCAGGS-Flag-T7opt序列图谱；
图6为pCAGGS-Flag-T7opt经验证插入序列无突变示意图；
图7为pSBtet-Flag-T7opt序列图谱；
图8为western blot检测LLC-MK2-Fwt-Flag细胞系表达蛋白(睡美人转座子系统)的结果；
图9为western blot检测BHK-Flag-T7opt细胞系表达蛋白的结果
图10为SEV-GFP-ΔF质粒谱图；
图11为SEV-ΔF质粒的敲除F后电泳结果；
图12为F基因敲除成功的验证实验结果；
图13为血凝试验检测示意图；
图14为F蛋白缺陷型仙台病毒的血凝试验结果；
图15为纯化后的病毒颗粒层；
图16为转座酶质粒和转座子质粒比例优化结果；
图17为LLC-MK2-Fwt-Flag细胞的遗传稳定性；
图18为pcDNA3.1-hyPBase重组质粒的谱图；
图19为western blot检测PB-LLC-MK2-Fwt-Flag细胞系表达蛋白(Piggybac转座子系统)的结果；
图20为转座子方法和非转座子方法在嘌呤霉素筛选结束后采用结晶紫染色比较结果。
具体实施方式
本发明提供了一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，包括以下步骤：
合成转座子系统识别的CALPdL-linear序列之间的序列后克隆至质粒中，得到含CALPdL-linear的重组载体，将CAG启动子序列插入所述含CALPdL-linear的重组载体中，得到含CALPdL-CAG的重组载体；
扩增与复制相关的病毒基因，克隆至含CALPdL-CAG的重组载体中，得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体；
将含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体共转染哺乳动物细胞，得到复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系。
本发明合成转座子系统识别的CALPdL-linear序列之间的序列后克隆至质粒中，得到含CALPdL-linear的重组载体，将CAG启动子序列插入所述含CALPdL-linear的重组载体中，得到含CALPdL-CAG的重组载体。
在本发明中，所述转座子系统优选包括睡美人转座子系统或Piggybac转座子系统。所述转座子系统识别的CALPdL-linear序列包括5'-loxp序列(L)，嘌呤霉素抗性基因(puromycin resistance gene)、富AT原件(d:AT-rich element)、3'-loxp序列(L)。CALPdL-linear中CALPdL-linear序列组成见图1，在本发明实施例中抗性基因为嘌呤霉素抗性基因PuroR。AU-rich element(ARE)优选为c-fos、c-myc、nur77或zif268基因的序列。
在本发明实施例中，所述CALPdL-linear序列优选如睡美人转座子系统识别的CALPdL-linear序列(SEQ ID NO:2，gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaatAccgcatcaggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattggatccct
atacagttgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtca
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taggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtatagggatccgcttc)和
Piggybac转座子系统识别的CALPdL-linear序列(SEQ ID NO:3，cacagcttggccacaatgtggtttttgtcaaac
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在本发明中，所述CAG启动子优选来自pCAGGS-GFP质粒，优选采用SpeI-HF/XbaI对pCAGGS-GFP质粒进行酶切，得到的酶切片段连接至用同样内切酶酶切后的pUC-CALPdL中，得到的含CALPdL-CAG的重组载体命名为pCALPdL-empty(谱图见图3)。所述CAG启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(attgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcggggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcc)所示。
得到含CALPdL-CAG的重组载体后，本发明扩增与复制相关的病毒基因，克隆至含CALPdL-CAG的重组载体中，得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体。
在本发明中，所述病毒优选包括副粘科病毒。所述副粘科病毒优选包括仙台病毒。所述仙台病毒的与复制相关的基因为F基因；所述F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(atgacagcatatatccagaggtcacagtgcatctcaacatcactactggttgttctcaccacattggtctcgtgtcagattcccagggataggctctctaacataggggtcatagtcgatgaagggaaatcactgaagatagctggatcccacgaatcgaggtacatagtactgagtctagttccgggggtagaccttgagaatgggtgcggaacagcccaggttatccagtacaagagcctactgaacaggctgttaatcccattgagggatgccttagatcttcaggaggctctgataactgtcaccaatgatacgacacaaaatgccggtgttccacagtcgagattcttcggtgctgtgattggtactatcgcacttggagtggcgacatcagcacagatcaccgcagggattgcactagccgaagcgagggaggccaaaagagacatagcgctcatcaaagaatcgatgacaaaaacacacaagtctatagaactgctgcaaaacgctgtgggggaacaaattcttgctctaaagacactccaggatttcgtgaatgatgagatcaaacccgcaataagcgaattaggctgtgagactgctgccttaagactgggtataaaattgacacagcattactccgggctgttaactgcgttcggctcgaatttcggaaccatcggagagaagagcctcacgctgcaggcgctgtcttcactttactctgctaacattactgagattatgaccacaatcaggacagggcagtctaacatctatgatgtcatttatacagaacagatcaaaggaacggtgatagatgtggatctagagagatacatggttaccctgtctgtgaagatccctattctttctgaagtcccaggtgtgctcatacacaaggcatcgtctatttcttacaacatagacggggaggaatggtatgtgactgtccccagccatatactcagtcgtgcttctttcttagggggtgcagacataaccgattgtgttgagtccggattgacctatatatgccccagggatcccgcacaactgatacctgacagccagcaaaagtgtatcctgggggacacaacaaggtgtcctgtcacaaaagttgtggacagccttatccccaagtttgcttttgtgaatgggggcgttgttgctaactgcatagcatccacatgtacctgcgggacaggccgaagaccaatcagtcaggatcgctctaaaggtgtagtattcctaacccatgacaactgtggtcttataggtgtcaatggggtagaattgtatgctaaccggagagggcacgatgccacttggggggtccagaacttgacagtcggtcctgcaattgctatcagacccattgatatttctctcaaccttgctgatgctacgaatttcttgcaagactctaaggctgagcttgagaaagcacggaaaatcctctctgaggtaggtagatggtacaactcaagagagactgtgattacgatcatagtagttatggtcgtaatattggtggtcattatagtgatcgtcatcgtgctttacagactcaaaaggtcaatgctaatgggtaatccagatgaccgtataccgagggacacatatacattagagccgaagatcagacatatgtacacaaacggtgggtttgatgcgatggctgagaaaagatga)所示。
在本发明中，所述扩增与复制相关的病毒基因的方法，优选采用引物对扩增复制相关的病毒基因。为了方便检测病毒基因，在所述病毒基因后添加Flag标签。所述引物对为包含了两个酶切位点和Flag标签的序列，优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5(aaaggcctctgaggccgaattcccatggggaaacatgacagcatatatccagaggtcacagtgc)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(atggcctgacaggccctcgagtcaCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCtcttttctcagccatcgcatcaaac)所示的反向引物。其中Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:7(GATTACAAGGATGACGACGATAAG)所示。
在本发明中，扩增与复制相关的病毒基因后，优选将扩增片段用T4 PNK酶处理，有利于DNA的5'端和3'端磷酸化，先克隆至pUC57质粒中，经过测序验证，没有发生突变的情况下再克隆至含CALPdL-CAG的重组载体中。
在本发明中，所述克隆至含CALPdL-CAG的重组载体的位置优选为EcorI和XhoI。构建的含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体优选为pCALPdL-Fwt-Flag(谱图见图4)为了评估不同种类的复制相关的病毒基因表达目标蛋白的效果，对病毒基因进行突变，记为F5R，为了方便检测病毒基因，在所述病毒基因F5R后添加Flag标签，记为F5R-Flag，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8(atgacagcatatatccagaggtcacagtgcatctcaacatcactactggttgttctcaccacattggtctcgtgtcagattcccagggataggctctctaacataggggtcatagtcgatgaagggaaatcactgaagatagctggatcccacgaatcgaggtacatagtactgagtctagttccgggggtagaccttgagaatgggtgcggaacagcccaggttatccagtacaagagcctactgaacaggctgttaatcccattgagggatgccttagatcttcaggaggctctgataactgtcaccaatgatacgacacaaaatgccggtcgtcgccgacggagattcttcggtgctgtgattggtactatcgcacttggagtggcgacatcagcacagatcaccgcagggattgcactagccgaagcgagggaggccaaaagagacatagcgctcatcaaagaatcgatgacaaaaacacacaagtctatagaactgctgcaaaacgctgtgggggaacaaattcttgctctaaagacactccaggatttcgtgaatgatgagatcaaacccgcaataagcgaattaggctgtgagactgctgccttaagactgggtataaaattgacacagcattactccgggctgttaactgcgttcggctcgaatttcggaaccatcggagagaagagcctcacgctgcaggcgctgtcttcactttactctgctaacattactgagattatgaccacaatcaggacagggcagtctaacatctatgatgtcatttatacagaacagatcaaaggaacggtgatagatgtggatctagagagatacatggttaccctgtctgtgaagatccctattctttctgaagtcccaggtgtgctcatacacaaggcatcgtctatttcttacaacatagacggggaggaatggtatgtgactgtccccagccatatactcagtcgtgcttctttcttagggggtgcagacataaccgattgtgttgagtccggattgacctatatatgccccagggatcccgcacaactgatacctgacagccagcaaaagtgtatcctgggggacacaacaaggtgtcctgtcacaaaagttgtggacagccttatccccaagtttgcttttgtgaatgggggcgttgttgctaactgcatagcatccacatgtacctgcgggacaggccgaagaccaatcagtcaggatcgctctaaaggtgtagtattcctaacccatgacaactgtggtcttataggtgtcaatggggtagaattgtatgctaaccggagagggcacgatgccacttggggggtccagaacttgacagtcggtcctgcaattgctatcagacccattgatatttctctcaaccttgctgatgctacgaatttcttgcaagactctaaggctgagcttgagaaagcacggaaaatcctctctgaggtaggtagatggtacaactcaagagagactgtgattacgatcatagtagttatggtcgtaatattggtggtcattatagtgatcgtcatcgtgctttacagactcaaaaggtcaatgctaatgggtaatccagatgaccgtataccgagggacacatatacattagagccgaagatcagacatatgtacacaaacggtgggtttgatgcgatggctgagaaaagagattacaaggatgacgacgataagtga，其中下划线处为突变氨基酸序列RRRRR对应的核苷酸序列)所示。实验证明，将不同种类的复制相关的病毒基因在相同的细胞系中表达，结果表明野生型病毒基因F表达量更高，因此选用野生型病毒基因F用于下游实验。
得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体后，本发明将含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体共转染哺乳动物细胞，得到复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系。
在本发明中，所述含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体的质量比为9:1。所述含转座酶的重组载体包括SB100X。本发明对所述重组载体和含转座酶的重组载体的质量比进行优化，结果表明质量比较高(1：5)或较低(1：20)都会影响整合效果。本发明对所述共转染的操作方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的共转染的方法即可。在本发明实施例中，所述共转染优选使用诺维赞转染试剂ExFectTransfection Reagent(货号T101-01)完成。所述哺乳动物细胞优选为LLC-MK2细胞系。所述LLC-MK2细胞系来源为中科院细胞库(LLC-MK2目录号GNO 6)。
在本发明中，所述共转染后，优选进行筛选，所述筛选的方法优选为含有10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素(puromycin白鲨货号BS111-25mg)的DMEM培养基进行筛选培养，每2天更换一次液，得到稳转细胞系命名为：LLC-MK2-Fwt-Flag。
在本发明中，制备的扩增用细胞系为Cre重组酶诱导表达C端带有Flag标签的野生型F蛋白的LLC-MK2细胞系。细胞系LLC-MK2-Fwt-Flag经过传代培养，发现遗传稳定性良好，在15代以内均未发生突变。
本发明提供了所述制备方法制备得到的复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系在生产复制缺陷型重组病毒中的应用。
在本发明制备的复制缺陷型重组病毒适用于所有类型的病毒，不同类型的复制缺陷型重组病毒中缺陷的基因在细胞系中完成表达即可。为了举例说明扩增的方法，以缺失F基因的仙台病毒为例开展扩增方法的实验。
在本发明中，所述复制缺陷型重组病毒的包装方法，优选包括以下步骤：
将T7 RNA聚合酶的编码基因克隆至质粒中，得到含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体；
将含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体和含转座酶基因的重组载体共转染哺乳动物细胞，经筛选，得到复制缺陷型重组病毒包装用细胞系；
将含缺失与复制相关的病毒基因的病毒基因组的重组载体与含所述病毒的各基因的重组载体共同转染所述制缺陷型重组病毒包装用细胞系，得到转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系。
在本发明中，所述将T7 RNA聚合酶的编码基因克隆至质粒中的方法优选为首先在所述编码基因的上游插入Flag标签，然后将含有Flag标签的T7 RNA聚合酶重组载体为模板插入pSBtet-puro中，得到含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体。在所述编码基因的上游插入Flag标签的构建方法优选为采用引物对1和引物对2分别扩增T7 RNA聚合酶的编码基因的位置，同时为了便于检测目标基因，同时添加酶切位点便于后续克隆至质粒中。所述引物对1优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的N-Flag-T7opt-for和核苷酸序列如SEQID NO:10所示的Amp-rev。所述引物对2优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的Amp-for和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的N-Flag-T7opt-rev。引物对1扩增得到5158bp的DNA片段，命名为Flag-T7opt-5K，引物对2扩增得到2280bp DNA片段，命名为Flag-T7opt-2K。将所述Flag-T7opt-5K、Flag-T7opt-2K克隆至质粒中，得到pCAGGS-Flag-T7opt(谱图见图5)。经测序验证，pCAGGS-Flag-T7opt中插入片段未发生突变(见图6)。所述质粒优选为pCAGGS-T7opt质粒。所述pSBtet-puro的插入位点优选为EcorI和XhoI。所述克隆的方法优选采用限制性酶切位点分别酶切目标片段和骨架载体，采用连接转化试剂盒得到重组载体pSBtet-Flag-T7opt质粒(见图7)。
在本发明中，所述含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体和含转座酶的重组载体的质量比优选为9:1。所述含转座酶的重组载体包括SB100X。所述哺乳动物细胞优选为BHK-21细胞系。所述BHK-21细胞系来源为中科院细胞库(BHK-21[C-13]目录号GNHa10)。
在本发明中，所述共转染后，优选进行筛选，所述筛选的方法优选为含有10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基进行筛选培养，每2天更换一次液，得到稳转细胞系命名为：BHK-Flag-T7opt。
在本发明中，所述细胞系经过检测，均检测到Flag标签，说明得到成功表达T7 RNA聚合酶的细胞系。
在本发明中，所述复制缺陷型重组病毒的制备方法，仙台病毒为例，优选为将SEV-GFP-ΔF质粒、pCAGGS-NP质粒、pCAGGS-P质粒、pCAGGS-L质粒、pCAGGS-Fwt质粒共转染至BHK-Flag-T7opt细胞中，转染后24h在对细胞进行换液，抗生素筛选72h后得到包装用细胞系。经检测，包装用细胞系中观察到绿色荧光蛋白表达。所述SEV-GFP-ΔF质粒、pCAGGS-NP质粒、pCAGGS-P质粒、pCAGGS-L质粒、pCAGGS-Fwt质粒的质量比优选为6:1:1:4:1。所述pCAGGS-NP质粒、pCAGGS-P质粒、pCAGGS-L质粒、的构建方法，优选参照CN112538498B公开的方法完成(具体见该发明说明书附图中图1中A和B和C以及图10)。所述SEV-GFP-ΔF质粒的谱图见图10。
在本发明中，所述生产复制缺陷型重组病毒的方法，优选将含CRE基因的重组载体转染至所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系中，将转染后的细胞系与所述转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系共培养，收集病毒。
本发明对含CRE基因的重组载体的转染方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可，例如在pCAG-Cre:GFP的基础上去掉了GFP基因，其中所述pCAG-Cre:GFP购买自淼灵生物货号P0734。所述共培养优选为将转染后的细胞系覆盖在BHK-Flag-T7opt细胞上层，培养4天。
在本发明中，包括两种条件表达方案，其中Cre重组酶诱导的条件表达，加入Cre重组酶后，Cre重组酶会切掉第一个loxp和第二个loxp前面的DNA序列，留下基因组的第二个loxp和后续的目的基因。而多西四环素诱导的条件表达，加入四环素类药物(Doxycycline-inducible Gene Expression多西四环素诱导基因表达)可以打开开关，使得目的蛋白进行表达。
在本发明中，对扩增的复制缺陷型病毒采用血凝试验进行检测，检测结果血凝价为1：8至1：32不等。
下面结合实施例对本发明提供的一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法和缺陷性病毒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法
1.制备pCALPdL-empty重组质粒
以pUC57-simple为骨架载体，基因合成CALPdL-linear序列(SEQ ID NO：2)，得到pUC-CALPdL。
将pCAGGS-GFP质粒和pUC-CALPdL使用SpeI-HF和XbaI进行酶切，将pCAGGS-GFP骨架酶切下的1616bp的片段(包含CAG启动子)插入pUC-CALPdL中的SpeI-HF和XbaI，得到pCALPdL-empty。
2.pUC57-Fwt-Flag质粒和pUC57-F5R-Flag质粒的构建方法
使用引物PCR扩增Fwt-Flag片段，反应程序见表1，反应体系为50μl反应体系，具体见表2。
表1扩增Fwt-Flag片段的反应程序
表2 6.PCR反应浓度和用量
| 组分 | 用量 |
| ddH2O | 19μL |
| 上游引物10μM | 2μL |
| 下游引物10μM | 2μL |
| 质粒模板 | 1μL(25ng) |
| 2XPhantaMaxMasterMix | 25μL |
引物序列如下：
F-Nco1-for:
aaaggcctctgaggccgaattcccatggggaaacatgacagcatatatccagaggtcacagtgc(SEQID NO:5)；
F-flag-Sfi1-rev:
atggcctgacaggccctcgagtcaCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCtcttttctcagccatcgcatcaaac(SEQ ID NO:6)。
扩增得到Fwt-Flag片段，再将Fwt-Flag片段使用T4 PNK处理，将DNA的5'端和3'端磷酸化，再将其与pUC57线性化片段相连，得到pUC57-Fwt-Flag质粒。
同理得到pUC57-F5R-Flag质粒。
对获得的两个质粒进行测序验证，测序结果正确没有点突变。
3.制备pCALPdL-Fwt-Flag和pCALPdL-F5R-Flag质粒
将pUC57-Fwt-Flag或pUC57-F5R-Flag质粒用EcorI和XhoI进行酶切，将酶切的DNA片段连接pCALPdL-empty质粒，得到pCALPdL-Fwt-Flag(谱图见图4)或pCALPdL-F5R-Flag。
4.将pCALPdL-Fwt-Flag和SB100X共转染LLC-MK2细胞系获得LLCMK2-Fwt-Flag细胞系
将3.6μg pCALPdL-Fwt-Flag和0.4μg SB100X质粒，使用诺维赞转染试剂ExFectTransfection Reagent(货号T101-01)按照说明书进行操作，将两种质粒共转染LLC-MK2细胞系。
转染后2d后使用含有10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素(puromycin白鲨货号BS111-25mg)的DMEM培养基进行培养，2天换一次液，3次换液后获得稳转细胞系，该稳转细胞系命名为：LLC-MK2-Fwt-Flag。
同理，获得LLC-MK2-F5R-Flag细胞系。
5.细胞系表达检测
将LLC-MK2-Fwt-Flag和LLC-MK2-F5R细胞系在6孔板中培养，进行细胞计数，2×105细胞转染2μg pCAGGS-CRE质粒，72h后将细胞使用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，将细胞收集后使用100μL细胞裂解液进行溶解。
每个样品使用15μL进行蛋白质电泳，再进行western blot进行检测，分别检测Flag标签和GAPDH蛋白(Flag标签检测抗体为CSTAnti-FLAG货号：14793S，GAPDH检测抗体为santa cruz货号SC365062)。
检测结果见图8。转染Fwt的细胞系表达量更高，因此选择LLC-MK2-Fwt-Flag进行下游试验。
实施例2
1.1将pCAGGS-T7opt质粒的T7 RNA聚合酶N端插入Flag标签得到pCAGGS-Flag-T7opt，具体使用以下引物对分别扩增两个片段；
引物对1：
N-Flag-T7opt-for：atggactacaaggacgatgacgacaaGatgaacaccatcaatattgccaagaacg(SEQ ID NO:9)；
Amp-rev:CATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTAC(SEQ ID NO:10)。
反应体系为50μl反应体系，反应程序见表3。
表3反应程序
扩增得到5158bp的DNA片段，命名为Flag-T7opt-5K。
引物对2：
Amp-for：GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTG(SEQ ID NO:11)
N-Flag-T7opt-rev：GTCCTTGTAGTCCATGGTGGCGAATTCTTTGCCA
AAATG(SEQ ID NO:12)。
反应体系为50μl反应体系，反应程序见表4。
表4反应程序
扩增得到2280bp DNA片段，命名为Flag-T7opt-2K。
将Flag-T7opt-5K和Flag-T7opt-2K两个片段使用诺维赞ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit(货号C115-01)按照说明书进行操作，得到在N端添加Flag标签的质粒：pCAGGS-Flag-T7opt。
经测序验证，结果表明插入结果正确无突变。
2.将N-Flag-T7opt插入pSBtet-puro，得到pSBtet-Flag-T7opt
将pCAGGS-Flag-T7opt使用EcorI和XhoI进行酶切，获得N-Flag-T7opt的DNA片段。将pSBtet-puro使用EcorI和XhoI进行酶切，得到pSBtet-puro质粒载体骨架。将N-Flag-T7opt的DNA片段和pSBtet-puro质粒载体骨架使用诺维赞T4 DNA Ligase(货号C301-01)进行连接和转化，获得pSBtet-Flag-T7opt质粒。
3.将pSBtet-N-Flag-T7opt和SB100X共转染BHK-21细胞系，筛选得到BHK-21-Flag-T7opt，BHK-21-Flag-T7opt为目的细胞系。
将3.6μg pSBtet-N-Flag-T7opt质粒和0.4μg SB100X质粒，使用诺维赞转染试剂ExFect Transfection Reagent(货号T101-01)按照说明书进行操作，将两种质粒共转染BHK-21细胞系。
转染后2d使用1.0μg/mL的嘌嘌呤霉素(puromycin白鲨货号BS111-25mg)的DMEM培养基进行培养，2天换一次液，3次换液后获得稳转细胞系，该稳转细胞系命名为：BHK-Flag-T7opt。
4.细胞系表达检测
将BHK-Flag-T7opt细胞系在6孔板中培养，细胞汇合度达到80％时，按照1.0μg/mL浓度在DMEM完全培养基中加入多西环素(doxycycline)，48h后将细胞使用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，将细胞收集后使用100μL细胞裂解液进行溶解。
每个样品使用15μL进行蛋白质电泳，再进行western blot进行检测，分别检测Flag标签(Flag标签检测抗体为CSTAnti-FLAG货号：14793S)。
检测结果如下：可以在98kd左右检测到T7opt的表达(图9)。
实施例3
F蛋白缺陷型仙台病毒包装方法
1.SEV-GFP-ΔF质粒(谱图见图10)的构建方法如下：
使用DNA分子生物學的方式去掉F基因，具体步骤如下：
1.以pUC57-Sev为模板使用如下引物进行PCR扩增，反应程序为预变性95℃30s；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃5min，30cycles；彻底延伸72℃5min，保存12℃，得到MFHN片段(5061bp)；
P-end-for(31-mer):CGTAGAAGAGGACATAGAGTCACTGACCAAC(SEQ ID NO:13)；
L-start-rev(20-mer):GGGAGGACTCCTGCCCATCC(SEQ ID NO:14)；
将MFHN片段平末端连接至线性化的pUC57质粒，制备重组载体pUC57-MFHN。
2.以pUC57-MFHN质粒为模板使用如下引物进行PCR扩增，反应程序为预变性95℃30s；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃5min，30cycles；彻底延伸72℃3.5min，保存12℃，得到Vector片段(3283bp)；
Vector.FOR(37-mer):AACTTAGGGATAAAGTGAGGTCGCGCGGTACTTTAGC(SEQ ID NO:15)；
Vector.REV(33-mer):GAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAA(SEQ ID NO:16)；
3.以pUC57-MFHN质粒为模板使用如下引物进行PCR扩增，反应程序为预变性95℃30s；变性95℃15s，退火58℃15s，延伸72℃5min，30cycles；彻底延伸72℃5min，保存12℃，得到Fragment片段(2841bp)；
Fragment.FOR(42-mer):CTTTATCCCTAAGTTTTTCTTATTTAAGACAAGGAGTGACCC(SEQID NO:17)；
Fragment.REV(26-mer):TGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTC(SEQ ID NO:18)；
4.将Vector片段(3283bp)和Fragment片段(2841bp)使用试剂盒CloneExpress试剂盒(诺维赞，货号C115)按照说明书进行操作，10μL反应体系，50℃反应15min，构建质粒pUC57-defect-F。
5.将pUC57-defect-F使用Not1(NEB，货号R0189S)和Age1(NEB货号R3552S)进行酶切得到2262bp片段；
将Sev-KOS(Y942H)质粒(为CN 112538498A中记载的图8的Sev-KOS(Y942H)质粒)使用Not1(NEB，货号R0189S)和Age1(NEB货号R3552S)进行酶切，得到两个片段10135bp和4312bp片段，
将上述3个片段使用T7 DNA聚合酶(诺维赞，货号C301)进行连接，得到去掉F基因的Sev-DelF-type1质粒。
预期的模拟电泳图见图11。对F基因敲除成功与否进行验证，具体方法如下：使用Hind3和Afe1限制性内切酶进行酶切，将结果和软件模拟结果比较，结果一致，说明仙台病毒F基因被切除成功。验证结果见图12，模拟结果#1是保留F基因的野生型SEV-PM，#2是切除基因的Sev-DelF-type1。
2.SEV-GFP-ΔF质粒、pCAGGS-NP质粒、pCAGGS-P质粒、pCAGGS-L质粒、pCAGGS-Fwt质粒的质量比优选为6:1:1:4:1。所述pCAGGS-NP质粒、pCAGGS-P质粒、pCAGGS-L质粒、的构建方法，参照CN112538498B公开的方法完成(具体见该发明中说明书附图的图1中A和B和C以及图10)。
将3μg SEV-GFP-ΔF质粒；0.5μg pCAGGS-NP质粒，0.5μg pCAGGS-P质粒，2μgpCAGGS-L质粒0.5μgpCAGGS-Fwt质粒；按照诺维赞转染试剂ExFect Transfection Reagent(货号T101-01)按照说明书进行操作。将上述质粒转染至5×105BHK-Flag-T7opt细胞中，转染后24h在对细胞进行换液，添加1.0μg/mL多西环素(doxycycline)，72h后能够检测到绿色荧光蛋白表达。
实施例4
1.F蛋白缺陷型仙台病毒的扩增
Day-1将LLC-MK2-Fwt-Flag细胞转染pCAGGS-CRE质粒。105细胞转染5μg pCAGGS-CRE质粒。
Day 0将转染pCAGGS-CRE后的LLC-MK2-Fwt-Flag细胞使用胰酶进行消化，覆盖在BHK-Flag-T7opt细胞上层。
Day 1-4将完全培养基更换为无血清的DMEM培养基(在无血清的DMEM培养基中添加5.0μg/mL重组胰蛋白酶)。4天后可以在荧光显微镜镜下检测到超过50％细胞表达绿色荧光蛋白。
通过将新的转染pCAGGS-CRE后的LLC-MK2-Fwt-Flag细胞添加进培养基可以扩增SEV-GFP-ΔF仙台病毒。
2.F蛋白缺陷型仙台病毒的检测
将细胞上清进行收集，进行血凝试验检测，最左侧孔加50μl细胞上清，之后在右侧加50μl PBS(磷酸盐缓冲液)，再进行倍比稀释，右侧的孔是左侧孔浓度的1/2。稀释后，每个孔中都加入50μl1％SPF鸡红细胞，常温下反应40min，立起来检测结果。
结果见图14。检测结果血凝价为1：8至1：32不等。根据培养时间有所差异，F蛋白缺陷型仙台病毒的滴度检测。
实施例5
F蛋白缺陷型仙台病毒的浓缩
1.通过将细胞上清液体15000g离心10分钟去除细胞器杂质，取细胞上清进行后续试验。
2.使用30000g、4℃离心14h获得病毒沉淀。
3.使用蔗糖密度梯度离心方式，30000g 4℃离心10h，在70％蔗糖和30％蔗糖之间获得病毒中间层。
4.将病毒中间层用PBS稀释后，再使用30000g 4℃离心10h获得纯化的仙台病毒沉淀。
结果见图15。可以看出在箭头所指的部分出现明显的一层沉淀为纯化的仙台病毒。
实施例5
转座酶质粒和转座子质粒的比例确定
使用500ng转座子质粒(pCALPdL-GFP)，将转座酶质粒分别为10ng，50ng，250ng，500ng和1000ng，5组条件(见表5)。分别转染2×104LLC-MK2细胞(使用诺维赞转染试剂ExFect Transfection Reagent(货号T101-01)按照说明书进行操作)。每一组4个孔，在12孔板中进行试验。
转染后2d后使用含有10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素(puromycin白鲨货号BS111-25mg)的DMEM培养基进行培养，2天换一次液，3次换液后获得稳转(pCALPdL-GFP)细胞株的克隆。7天后使用含有10％FBS和2.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基进行培养。所有的细胞转染pCAGGS-Cre质粒，计算显现GFP荧光的细胞克隆数目。
结果见表6和图16。
表5转座酶质粒和转座子质粒的比例
| 分组 | 转座酶(SB100×) | 转座子(pCALPdL-GFP) |
| 01 | 10ng | 500ng |
| 02 | 50ng | 500ng |
| 03 | 250ng | 500ng |
| 04 | 500ng | 500ng |
| 05 | 1000ng | 500ng |
不同处理组出现的克隆数目如表6所示。
表6不同处理组出现的克隆数目
| 分组 | -1 | -2 | -3 | -4 |
| 01 | 83 | 76 | 69 | 85 |
| 02 | 105 | 110 | 90 | 116 |
| 03 | 70 | 65 | 73 | 80 |
| 04 | 52 | 47 | 50 | 42 |
| 05 | 27 | 28 | 35 | 37 |
实施例6
LLC-MK2-Fwt-Flag细胞的遗传稳定性实验
试验方法如下：LLC-MK2-Fwt-Flag细胞平均3天传代一次，最高代数为15代记录为F15，以此类推。取F1、F7和F15代的106LLC-MK2-Fwt-Flag细胞转染5μg pCAGGS-Cre质粒，48h后检测Flag标签表达量。具体采用Western Blot检测Flag标签表达量；每个样品使用15μL进行蛋白质电泳，再进行western blot进行检测，分别检测Flag标签(Flag标签检测抗体为CSTAnti-FLAG货号：14793S)。
结果见图17。检测结果表明，F1，F7和F15代均有类似的表达量，因此确认细胞系保持稳定。
实施例7
PeggyBac转座子系统构建的细胞及其检测方法
采用和睡美人睡美人转座子系统相同的构建方法合成PeggyBac转座子系统识别的CALPdL-linear序列(SEQ ID NO:3)，再通过相同的构建步骤构建PB-pCALPdL-Fwt-Flag。将4.5μg PB-pCALPdL-Fwt-Flag和0.5μg含hyPBase的重组质粒(委托金斯瑞公司合成，谱图见图18，其中hyPBase的DNA序列为SEQ ID NO:19，atgggaagcagcctggatgacgagcacatcctgagcgccctgctgcagtccgacgacgaactggtgggcgaagattctgatagcgaggtgagcgaccacgtgagtgaagacgacgtgcaaagcgataccgaagaggcttttatcgacgaggttcatgaggtgcagcctaccagcagcggctctgagatcctggacgagcaaaatgtgatcgagcagccaggcagcagcctggctagcaaccgtatcctgaccctgccacagagaacaatccggggtaaaaacaagcactgctggagcacctccaaatctacacggagaagcagagtgtctgctctgaacattgtgcggtcccagagaggacctacaagaatgtgcagaaacatctacgaccccctgctgtgcttcaagctgtttttcacagacgaaatcatcagcgaaatcgtcaagtggaccaacgccgagattagcctgaagagacgcgagtctatgacatctgccaccttcagagacaccaacgaggacgagatctacgccttcttcggcatcctggtgatgacagccgtgagaaaagacaaccacatgagcaccgatgatctttttgatagaagcctgtccatggtgtacgtctccgtgatgagccgggacagattcgacttcctgatccgctgcctgagaatggacgacaagtccataagacctacactgcgggagaacgacgtgttcacccctgtgcggaagatctgggacctgttcatccaccagtgcatccagaactacacccctggagcccacctgaccatcgatgagcagctgctcggcttcagaggaagatgccccttcagagtgtacatccccaacaaaccttctaaatacggcattaagatcctgatgatgtgcgatagcggcaccaagtatatgatcaacggcatgccttatctgggcagaggcacacagacaaacggcgtgcccctgggagagtactacgtgaaggaactgagcaagcccgtgcacggcagttgcaggaatatcacctgtgacaattggttcaccagcatccctctggccaagaacctgctgcaggagccttacaagctgacaatcgtgggaaccgtgcggtccaacaagagagaaatccccgaggtgctgaagaatagccgcagcaggcctgtcggcacctctatgttctgcttcgacggccctctgaccctggtgagctacaagccaaagcctgctaagatggtctacctgctgtctagctgtgatgaggacgcctctatcaacgagagcaccggcaagcctcaaatggtgatgtactacaaccagaccaagggcggcgtggacaccctggaccagatgtgtagcgtgatgacctgcagcagaaagaccaatagatggcctatggccctgctgtacggcatgatcaacatcgcctgcatcaacagctttatcatctacagccacaacgtgtcctccaaaggcgagaaggtgcagagccggaagaagttcatgagaaacctttatatgagtctcacaagcagcttcatgcggaagcggctggaagcccctacgttgaagcggtacctgcgggataacatcagcaatatcctacccaaggaagtccccggcaccagcgacgatagcacagaggaacctgtgatgaagaaaagaacctactgcacctactgtccatctaaaatcagaagaaaggccaacgccagctgtaaaaagtgcaagaaggtgatctgcagagaacacaacatcgacatgtgccagtcttgtttttga)，使用诺维赞转染试剂ExFect Transfection Reagent(货号T101-01)按照说明书进行操作，将两种质粒共转染LLC-MK2细胞系。
转染后2d后使用含有10％FBS和5μg/mL嘌呤霉素(puromycin白鲨货号BS111-25mg)的DMEM培养基进行培养，2天换一次液，3次换液后获得稳转细胞系，该稳转细胞系命名为：PB-LLC-MK2-Fwt-Flag。将PB-LLC-MK2-Fwt-Flag细胞系在6孔板中培养，进行细胞计数，2×105细胞转染2μgpCAGGS-CRE质粒，72h后将细胞使用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，将细胞收集后使用100μL细胞裂解液进行溶解。
每个样品使用15μL进行蛋白质电泳，再进行western blot进行检测，分别检测Flag标签蛋白(Flag标签检测抗体为CSTAnti-FLAG货号：14793S)。
检测结果见图19。PB转座子系统也能够使得基因组整合，表达野生型F蛋白。
实施例8
转座子方法和非转座子方法比较实验
试验方法如下：分为两组进行试验，每组重复3个孔；
分组#1：2×105LLC-MK2细胞转染4.5μg pCALPdL-Fwt-Flag质粒和0.5μg SB100X质粒(模拟转座子方法)；
分组#2：2×105LLC-MK2细胞转染4.5μgpCALPdL-Fwt-Flag质粒(模拟非转座子方法)；
转染后连续7天使用5μg/ml嘌呤霉素进行筛选，在第8天使用结晶紫染色，结晶紫上色的面积与具有嘌呤霉素抗性的LLC-MK2细胞的数量(成功整合嘌呤霉素抗性的细胞)成正比。1，2，3号孔位(上面三个孔)为模拟非转座子方法的分组#1；4，5，6号孔位(下面三个孔)为模拟转座子方法的分组#2。通过ImageJ测量指定染色区域面积，根据像素面积的比值计算基因整合效率。
结果见图20。结果表明转座子转座子方法的结晶紫染色区域比非转座子方法的结晶紫蓝色区域数值大于200，转座子方法的基因整合效率比非转座子方法高200倍以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成转座子系统识别的CALPdL-linear序列克隆至质粒中，得到含CALPdL-linear的重组载体，将CAG启动子序列插入所述含CALPdL-linear的重组载体中，得到含CALPdL-CAG的重组载体；
扩增与复制相关的病毒基因，克隆至含CALPdL-CAG的重组载体中，得到含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体；
将含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体共转染哺乳动物细胞，得到复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系。
2.根据权利要求1所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，所述病毒包括副粘科病毒。
3.根据权利要求2所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，所述副粘科病毒包括仙台病毒。
4.根据权利要求3所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，所述仙台病毒的与复制相关的基因为F基因；所述F基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求3所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，所述CALPdL-linear的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；
所述CAG启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系的制备方法，其特征在于，所述含CALPdL-CAG-复制相关的病毒基因的重组载体和含转座酶的重组载体的质量比为9:1；
所述含转座酶的重组载体为SB100X或PBase。
7.权利要求1～6中任意一项所述制备方法制备得到的复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系在生产复制缺陷型重组病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述复制缺陷型重组病毒包括缺失F基因的仙台病毒。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述复制缺陷型重组病毒的包装方法，包括以下步骤：
将T7 RNA聚合酶的编码基因克隆至质粒中，得到含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体；
将含T7 RNA聚合酶的编码基因的重组载体和含转座酶基因的重组载体共转染哺乳动物细胞，经筛选，得到复制缺陷型重组病毒包装用细胞系；
将含缺失与复制相关的病毒基因的病毒基因组的重组载体与含所述病毒的各基因的重组载体共同转染所述复制缺陷型重组病毒包装用细胞系，得到转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述生产复制缺陷型重组病毒的方法，将含CRE基因的重组载体转染至所述复制缺陷型重组病毒扩增用细胞系中，将转染后的细胞系与所述转染后的复制缺陷型重组病毒包装用细胞系共培养，收集病毒。
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