CN114540308A - 稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系及构建方法，以pAcBac1.tR4‑MbPyl质粒为模板，构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，分别经BamH I和Hind III、BamH I和Nhe I双酶切，连接到pCMV‑flag、pIRES‑puro3和pIRES‑puro3‑flag载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western‑blot鉴定，得到阳性克隆paaRS真核表达质粒；将paaRS、pCMV‑EGFP(pEGFP)和pCMV‑TAG‑EGFP(pTAG‑EGFP)质粒按不同组合转染BHK‑21细胞，进行筛选，通过绿色荧光检测和Western‑blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞系，成功构建并筛选出稳定表达正交系统的细胞系，BHK‑21细胞aaRS‑4‑8，保藏号为CCTCC N：C2021280；为下一步利用正交系统拯救TAG突变病毒奠定了实验基础。
Description
技术领域
本发明属于正交氨酰tRNA合成酶及tRNA细胞系的构建技术领域，特别涉及一种稳定表达正交氨酰tRNA合成酶及tRNA的细胞系及构建方法。
背景技术
遗传密码扩充技术就是借助生物体细胞内自身的翻译系统，将具有新的化学、物理或生物学特性的非天然氨基酸(UAAs)定点引入到细胞内蛋白上，使其参与蛋白质的合成，从而赋予蛋白质新的理化性质、生物性质或药学性质的一种技术。在遗传密码扩充系统中，非天然氨基酸的转运需要与生物体内不存在交叉的特异tRNA、氨酰tRNA合成酶与密码子，因此这个系统又被称为正交系统。1965 年，人类开始研究终止密码子，在赭石密码子(TAA)、琥珀密码子(TAG)、蛋白石密码子(TGA)这三种终止密码子中，TAG密码子能够把对内源遗传密码子的干扰以及对宿主健康的影响降到最低。另外，TAG作为在大肠杆菌中使用率最低的终止密码子，最先被用于在大肠杆菌中编码非天然氨基酸 (Xie and Schultz,2006)。TAG也是目前研究得最为透彻、使用最广泛的编码非天然氨基酸的终止密码子。也就是说，在各种“终止密码子”对应的正交系统中，琥珀正交系统是目前应用技术最为成熟、效率最高的系统，并且大多数提高抑制终止效率的研究也都基于琥珀正交系统开展(Chin,2014)。琥珀正交系统主要包括以下几个组成部分：非天然氨基酸、正交氨酰tRNA合成酶/tRNA、TAG终止密码子以及报告基因，即增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein,EGFP)。目前，琥珀正交系统不仅应用于真核系统的各种生物蛋白领域，还应用到药物研发、致病细菌的发病机理和应激防御机制的研究，为病毒与疫苗的探究提供了一个新的技术平台。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA细胞系的构建方法，以pAcBac1.tR4-MbPyl质粒为模板，设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，分别经BamH I和Hind III、BamH I和Nhe I双酶切，连接到不同载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western-blot鉴定，得到阳性克隆paaRS(pCMV-aaRS-flag、 pIRES-puro3-aaRS和pIRES-puro3-aaRS-flag)真核表达质粒。
将paaRS、pEGFP和pTAG-EGFP质粒按不同组合转染BHK-21细胞，用G418和嘌呤霉素进行筛选，通过绿色荧光检测和Western-blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞系。
优选地：按照下表设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，并进行引物合成；
表1质粒构建所需引物
优选地：载体的制备具体为：
用BamH I/Hind III这一对限制性核酸内切酶酶切pCMV-flag质粒；用BamH I/NheI这一对限制性核酸内切酶分别双酶切pIRES-puro3、pIRES-puro3-flag质粒；通过琼脂糖凝胶电泳实验分离并切下目的片段，根据Omega-Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书回收载体。
优选地：正交氨酰tRNA合成酶/tRNA质粒的转染为:
将BHK-21细胞按1：4的比例铺在4个细胞培养瓶中，静置使细胞贴壁并生长过夜，待细胞汇合度达到60％～80％时进行转染，转染4～6h后，去掉opti-MEM培养基换成含10％FBS的DMEM 培养基，以1：1000的比例加入非天然氨基酸，转染12h后，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。
优选地，以pEGFP-puro质粒为模板，设计构建带有不同His标签的pCMV-EGFP(pEGFP)野生型重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，经BamH I和Sal I双酶切连接到pCMV-flag载体上，通过PCR、酶切、测序和Western-blot鉴定得到带有不同His标签的阳性克隆质粒pEGFP；以不同His标签的pEGFP质粒为模板，通过定点突变PCR反应，在pEGFP质粒的基因组上引入TAG终止密码子，通过测序鉴定得到pEGFP重组质粒和pTAG-EGFP突变体质粒。
优选地，pEGFP重组质粒和pTAG-EGFP突变体质粒的构建包括：
1)pEGFP野生型重组质粒的构建
2)pTAG-EGFP突变体质粒的克隆及构建
优选地，pEGFP野生型重组质粒的构建包括
1)引物的设计和合成
按照下表设计两对构建带有不同His标签的pEGFP野生型重组质粒的引物，并进行引物合成；
表2质粒构建所需引物
2)PCR扩增目的基因片段
3)PCR产物的回收与纯化
4)PCR产物的酶切
5)PCR产物的连接
6)连接产物的转化及单克隆菌株的挑取
7)重组克隆质粒的提取
8)重组克隆质粒pEGFP的鉴定。
优选地，通过定点突变PCR反应在不同His标签的pEGFP重组质粒的基因组上引入TAG终止密码子，得到在自然环境中不能够正常表达绿色荧光蛋白的pTAG-EGFP突变重组质粒，包括以下步骤：
1)突变质粒的引物设计
根据Takara MutanBEST Kit试剂盒，设计引入TAG终止密码子的引物，进行引物合成：
表3质粒构建所需引物
2)突变质粒的定点突变
以不同His标签的pEGFP质粒为模板，利用点突变引物EGFP-M-F和EGFP-M-R，通过Takara MutanBEST Kit试剂盒中的髙保真酶进行PCR反应，反应体系为50μL；
3)PCR产物的胶回收
以标准DL 5,000DNA Marker作为参照，将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有目的条带的胶条，进行胶回收；
4)突变质粒的转化及单克隆挑取
将100μL E.coli.DH5α感染态细胞从-80℃取出后，将上述胶回收产物进行转化涂板，在37℃培养箱倒置培养过夜，挑取单克隆菌株；
5)突变质粒提取及鉴定
上述方法构建的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系，其是BHK-21细胞aaRS-4-8，保藏号为CCTCC NO：C2021280。
稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系应用于利用正交系统拯救TAG突变病毒。
本发明公开了稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，以pAcBac1.tR4-MbPyl 质粒为模板，设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，分别经BamH I和Hind III、BamH I和Nhe I双酶切，连接到pCMV-flag、pIRES-puro3 和pIRES-puro3-flag载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western-blot鉴定，得到阳性克隆paaRS 真核表达质粒(pCMV-aaRS-flag、pIRES-puro3-aaRS和pIRES-puro3-aaRS-flag)；将paaRS、pCMV-EGFP (pEGFP)和pCMV-TAG-EGFP(pTAG-EGFP)质粒按不同组合转染BHK-21细胞，用G418和嘌呤霉素进行筛选，通过绿色荧光检测和Western-blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA 合成酶表达量最高的单克隆细胞系。成功构建并筛选出稳定表达正交系统的细胞系，为下一步利用正交系统拯救TAG突变病毒奠定了实验基础。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明：
图1是带有不同His标签的pEGFP重组质粒的构建及鉴定
A：EGFP基因的PCR产物；M:DNA分子质量标准；1-5：pCMV-EGFP-His质粒1、2、3、4、5的PCR产物；6-10： pCMV-EGFP-linker-His质粒1、2、3、4、5的PCR产物；11：阴性对照。B：EGFP质粒的酶切产物；M：DNA分子 质量标准；1-3：pCMV-EGFP-His质粒1、4、5的酶切产物；5-7：pCMV-EGFP-linker-His质粒1、4、5的酶切产物； 4、8：阴性对照。C：荧光显微镜下检测EGFP蛋白在BHK-21细胞中的表达；NC：阴性对照；1-3：pCMV-EGFP-linker -His质粒1、4、5转染BHK-21细胞的荧光产物；4-6：pCMV-EGFP-His质粒1、4、5转染BHK-21细胞的荧光产物。 D：Western-blot验证EGFP蛋白在BHK-21细胞中的表达；NC：BHK-21作为阴性对照；1-3：pCMV-EGFP-linker-His 质粒1、4、5的Western-blot产物；5-7：pCMV-EGFP-His质粒1、4、5的Western-blot产物。E：pCMV-EGFP-His-WT 和pCMV-EGFP-Linker-His-WT的序列分析。
图2是pTAG-EGFP重组质粒的构建及鉴定
A：荧光显微镜下检测pTAG-GFP质粒在BHK-21细胞中的表达；1：pCMV-EGFP-His；2：pCMV-TAG-EGFP-linker-His； 3：pCMV-TAG-EGFP-His。B：Western-blot验证pTAG-EGFP质粒在BHK-21细胞中的表达情况；1：pCMV-EGFP-His； 2：pCMV-TAG-EGFP-linker-His；3：pCMV-TAG-EGFP-His。C：pCMV-TAG-EGFP-His和pCMV-TAG-EGFP-Linker-His 的序列分析。
图3是paaRS/tRNA重组质粒的构建及鉴定
A：核酸电泳试验验证aaRS片段的PCR产物；M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2-4：带不同标签的aaRS片段 的PCR产物。B：核酸电泳试验验证paaRS质粒的酶切产物；M：DNA分子质量标准；1-4：pIRES-puro3-aaRS质粒 1-4的酶切产物；6-9：pIRES-puro3-aaRS-flag质粒1-4的酶切产物；11-14：pCMV-aaRS-flag质粒1-4的酶切产物；5、 8：阴性对照。C：Western-blot验证paaRS质粒的表达；1：BHK-21细胞；2：pIRES-puro3-aaRS-flag质粒转染BHK-21 细胞；3：pCMV-aaRS-flag质粒转染BHK-21细胞。D：pIRES-puro3-aaRS-tRNA-flag-1、pIRES-puro3-aaRS-tRNA-1 和pCMV-aaRS-tRNA-flag-1的序列分析。
图4荧光显微镜下观察pTAG-GFP和paaRS-flag质粒转染BHK-21细胞表达的荧光产物 NC：转染pEGFP-WT+pCDNA 3.1；1：转染pTAG-EGFP+pCDNA3.1；2：添加UAAs；3：转染pTAG-EGFP+UAAs； 4：转染pTAG-EGFP+pIRES-puro3-aaRS；5：转染pTAG-EGFP+pCMV-aaRS-flag；6：转染：pTAG-EGFP+ pIRES-puro3-aaRS-flag；7：转染：pTAG-EGFP+pIRES-puro3-aaRS+UAAs；8：转染pCMV-TAG-EGFP+pCMV-aaRS-flag +UAAs；9：转染pTAG-EGFP+pIRES-puro3-aaRS-flag+UAAs。
图5是单克隆细胞系的筛选及鉴定。
图6是单克隆细胞系稳定性的鉴定。
具体实施方式
以pEGFP-puro质粒为模板，设计构建带有不同His标签的pEGFP野生型质粒的引物，通过PCR 反应扩出目的片段，BamH I和Sal I双酶切PCR产物并连接到pCMV-flag载体上，通过PCR、酶切、测序和Western-blot鉴定得到阳性克隆质粒pEGFP；以不同His标签的pEGFP质粒为模板，通过定点突变PCR反应，在pEGFP质粒的基因组上引入TAG终止密码子，通过测序鉴定得到pCMV-TAG-EGFP (pTAG-EGFP)突变重组质粒。
真核表达质粒pcDNA3.1、BHK-21细胞为申请人实验室保存，pEGFP-puro质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。
1.pCMV-EGFP野生型重组质粒的构建
引物的设计和合成
按照表2设计两对构建不同His标签的pCMV-EGFP(pEGFP)野生型质粒的引物，并将引物序 列发送至上海生工生物有限公司进行引物合成。
PCR扩增目的基因片段
在室温条件下，将引物以12,500rpm，离心2min，加入适量的RNA-free Water稀释至10μM，放置在室温充分溶解，并瞬时离心后待用。参照Q5 High-Fidelity DNAPolymerase操作说明书，以 pEGFP-puro质粒为模板，用pEGFP-6x His-F和pEGFP-6x His-R、pEGFP-linker-6x His-F和 pEGFP-linker-6x His-R作引物，分别扩增EGFP片段；按以下的反应体系配制PCR反应液。混匀后，进行PCR反应。反应体系为50μL，具体PCR反应体系如下：
表4目的片段扩增的PCR反应体系
反应程序如下：
表5目的片段扩增的PCR反应程序
PCR产物的回收与纯化
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，根据DNA分子质量标准切下含有目的条带的胶条进行胶回收。
PCR产物的酶切
将胶回收的目的片段和载体分别使用Nhe I和BamH I两种限制性内切酶进行双酶切，37℃酶切 4～6h；通过琼脂糖凝胶电泳实验分离并回收载体片段和目的基因片段。具体酶切反应体系如下：
表6 PCR产物的酶切反应体系
PCR产物的连接
在200μL PCR管中，按照下表配制连接反应体系，混匀后瞬时离心，在金属浴中或PCR仪器中 16℃连接过夜。连接体系如下：
表7 PCR产物的连接体系
连接产物的转化及单克隆菌株的挑取
将上述连接产物转化到E.coli.DH5α感受态细胞中。
重组克隆质粒的提取
质粒提取具体操作按照Omega质粒小量提取试剂盒II型(Plasmid Mini Kit II)说明进行。
重组克隆质粒pEGFP的鉴定
(1)重组质粒的PCR鉴定
对提取的重组克隆质粒进行PCR扩增鉴定，在PCR管中加入以下反应体系：
表8重组质粒PCR鉴定的反应程序
反应程序如下：
表9重组质粒PCR鉴定的反应程序
以标准DL 1,000DNA Marker作为参照，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
(2)重组质粒的酶切鉴定
参考NEB的限制性内切酶使用说明，用Nhe I和BamH I对重组克隆质粒pEGFP进行双酶切鉴定，37℃水浴锅中酶切1～2h，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，以标准DL 1,000DNA Marker作为参照，将酶切结果与预期结果一致的重组克隆质粒送测序进一步鉴定。具体酶切鉴定体系如下：
酶切验证体系1(20μL体系)：
表10重组质粒酶切鉴定的反应体系
酶切验证体系2(20μL体系)：
表11重组质粒酶切鉴定的反应体系
(3)重组质粒的测序鉴定
将上述酶切鉴定结果为阳性的质粒送上海生工生物有限公司测序鉴定。测序结果用Megalign等软件进行序列比对，挑选阳性克隆质粒进行后续实验。
(4)重组质粒的Western-blot验证
重组质粒转染BHK-21细胞，具体步骤如下：按1：4的比例将BHK-21细胞铺在细胞培养瓶中，生长过夜，当BHK-21细胞融合度达到60％～80％时，按照LipofectamineTM2000Reagent说明书进行转染。将pcDNA3.1、pEGFP质粒转染BHK-21细胞，并设立阴性对照组(仅转入pcDNA3.1质粒) 以及空白对照组(正常培养，不转染任何质粒)，质粒转染细胞36-48h收样，进行Western-blot鉴定。pCMV-TAG-EGFP突变体质粒的克隆及构建
构建pCMV-TAG-EGFP(pTAG-EGFP)真核表达重组质粒，就是通过定点突变PCR反应在pEGFP 重组质粒的基因组上引入TAG终止密码子，得到在自然环境中不能够正常表达绿色荧光蛋白的 pTAG-EGFP突变重组质粒。
突变质粒的引物设计
根据Takara MutanBEST Kit试剂盒，设计引入TAG终止密码子的引物，如表3所示，将引物序 列送至上海生工生物有限公司进行引物合成：
突变质粒的定点突变
根据Takara MutanBEST Kit试剂盒突变使用说明书，以带不同His标签pEGFP质粒为模板，利用点突变引物EGFP-M-F和EGFP-M-R，通过Takara MutanBEST Kit试剂盒中的髙保真酶进行PCR 反应，将突变后的PCR产物进行转化即可得到目的质粒。反应体系为50μL，具体如下：
表12突变质粒的定点突变PCR反应
扩增程序如下：
表13突变质粒的定点突变PCR反应程序
PCR产物的胶回收
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，根据DNA分子质量标准切下含有目的条带的胶条进行胶回收，参考Omega-Gel Extraction Kit胶回收试剂盒使用说明书进行操作。
突变质粒的转化及单克隆挑取
将100μL E.coli.DH5α感染态细胞从-80℃取出后，将上述胶回收产物进行转化涂板，在37℃培养箱倒置培养过夜，挑取单克隆菌株。
突变质粒提取及鉴定
根据Omega质粒小量提取试剂盒II型(Plasmid Mini Kit II)操作说明书提取质粒并鉴定。
为了验证构建的质粒是否正确，申请人将待检测的1-10号质粒作为模板，以pEGFP-6x His-F 和pEGFP-6x His-R、pEGFP-linker-6x His-F和pEGFP-linker-6x His-R作为引物进行PCR扩增。EGFP 片段长度约600bp，对比DL 1000DNA Marker，pEGFP-His-(1、2、3、4、5)和pEGFP-linker-His- (6、7、9、10)扩出的条带在500bp-700bp之间，与预期结果相符。表明除pEGFP-linker-His-8质粒，其余质粒均连入了EGFP片段。
为了验证构建的质粒是否正确，申请人挑取PCR扩增为阳性的部分质粒进行酶切鉴定。EGFP片段长度约0.6kb，pCMV载体约3kb，通过双酶切理论上应切出0.6kb和3kb的片段。对比DL 5,000 DNA Marker，pEGFP-His-(1、2、3)和pEGFP-linker-His-(6、7、9)经酶切后均出现两条带，一条位于3000bp附近，而较大的一条带位于500bp附近，与预期的结果相符合。结果表明，这6个质粒均连入了目的片段。
荧光检测结果
为了验证构建的质粒是否正常表达绿色荧光蛋白，发明人将空载质粒、不同His标签的pEGFP 质粒分别转染BHK-21细胞中，转染12h后，在荧光显微镜下观察。转染空载质粒的细胞没有荧光产生，而实验组除了转染pEGFP-linker-His-2质粒的细胞没有荧光产生，其他质粒转染的细胞中均出现大量绿色荧光。
Western-blot检测蛋白表达的结果
为了进一步确认pEGFP质粒中绿色荧光蛋白的表达，发明人收取转染空载及带His标签的不同 pEGFP质粒的细胞，通过Western-blot检测绿色荧光蛋白的表达情况。除了空载和转染 pEGFP-linker-His-2的细胞不表达绿色荧光蛋白，其余5个质粒均能正常表达绿色荧光蛋白，其中 pEGFP-linker-His-1和pEGFP-His-3两个质粒的表达量最高。
测序结果
序列测定是保障构建质粒正确性的重要手段，为了进一步验证构建质粒的正确性，发明人将 pEGFP-linker-His-1和pEGFP-His-3两个质粒送上海生工进行测序鉴定。通过DNA序列软件MegAlign 比对，这两个质粒的EGFP序列部分与NCBI注释的EGFP原始序列完全一致，以上结果说明发明人成功构建能够表达绿色荧光蛋白的质粒。
pCMV-TAG-EGFP(pTAG-EGFP)突变质粒的鉴定结果
测序结果
利用Takara公司的质粒突变试剂盒，发明人获得了EGFP蛋白的突变质粒(pTAG-EGFP)，通过序列比对发现，pTAG-EGFP-linker-His和pTAG-EGFP-His在第118-120位碱基处成功引入TAG终止密码子。
荧光检测结果
按照实验设想，pTAG-EGFP-linker-His和pTAG-EGFP-His两个质粒由于引入了TAG终止密码子，所以在转染细胞后由于终止密码子的存在，造成蛋白翻译提前终止，不能产生绿色荧光。为了验证以上猜想，本实验将pEGFP-His、pTAG-EGFP-linker-His和pTAG-EGFP-His分别转染BHK-21细胞，转染24h后在荧光显微镜下观察荧光现象。pEGFP-His质粒转染的细胞中出现大量的绿色荧光，分别转染两个突变质粒的细胞中没有绿色荧光的产生。以上结果表明，这两个突变质粒可能由于TAG终止密码子的插入使蛋白翻译提前终止，不能产生绿色荧光。
増强型绿色荧光蛋白是一类广泛应用的报告基因，可通过对荧光强度的检测判断细胞内一个或多个基因的表达情况。在増强型绿色荧光蛋白的基因组上引入TAG终止密码子，使其翻译提前终止不能产生荧光。pTAG-EGFP作为琥珀正交系统的报告基因，当正交氨酰tRNA合成酶/tRNA识别増强型绿色荧光蛋白的基因组中的TAG终止密码子，即可在该位点引入非天然氨基酸从而使EGFP蛋白的合成能够正常进行并最终表达绿色荧光蛋白。通过PCR扩增、酶切、测序、荧光检测及最终 Western-blot结果表明，发明人成功构建pEGFP和pTAG-EGFP质粒，为后续构建特异引入正交系统的稳定表达细胞系提供实验基础。
稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
以本实验室保存的pAcBac1.tR4-MbPyl质粒为模板，设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA 真核表达质粒的引物进行PCR反应，PCR产物分别经BamH I和Hind III、BamHI和Nhe I双酶切，连接到pCMV-flag、pIRES-puro3和pIRES-puro3-flag载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western-blot 鉴定，得到阳性克隆paaRS(pCMV-aaRS-flag、pIRES-puro3-aaRS和pIRES-puro3-aaRS-flag)真核表达质粒。将paaRS、pEGFP和pTAG-EGFP质粒按不同组合转染BHK-21细胞，用G418和嘌呤霉素进行筛选，通过绿色荧光检测和Western-blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA表达量最高的单克隆细胞系。
正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
引物设计
按照表1设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，并将引物序列 送至上海生物生工有限公司进行引物合成。
目的片段的PCR扩增
参照Q5 High-Fidelity DNA Polymerase使用说明书，以pAcBac1.tR4-MbPyl质粒为模板，分别以 aaRS-tRNA-F1和aaRS-tRNA-R1、aaRS-tRNA-F2和aaRS-tRNA-R2这两对做上下游引物进行PCR反应。分别使用BamH I/Hind III、BamH I/Nhe I这两对限制性核酸内切酶酶切PCR片段，通过琼脂糖凝胶电泳实验分离并切下含目的片段的胶条进行胶回收。
载体的制备
用BamH I和Hind III对pCMV-flag载体质粒进行酶切；用BamH I和Nhe I对pIRES-puro3、 pIRES-puro3-flag载体质粒分别进行酶切；通过琼脂糖凝胶电泳实验分离并切下含目的片段的胶条进行胶回收。
目的片段和载体的连接
将酶切后片段和载体进行连接反应。
目的质粒的转化及单克隆挑取
将上述的3种连接产物分别转化到E.coli.DH5α感受态中，涂布含有相应抗生素的平板，在37℃培养箱中倒置培养过夜，挑取单克隆。
目的质粒的提取
参考Omega质粒小量提取试剂盒II型(Plasmid Mini Kit II)试剂盒操作说明书，提取三种单克隆质粒。
目的质粒的鉴定
(1)酶切鉴定。参考NEB的限制性内切酶使用说明，分别用BamH I/Nhe I、BamH I/Hind III这两对限制性核酸内切酶，对paaRS重组克隆质粒进行双酶切鉴定。
(2)测序鉴定。将上述酶切鉴定为阳性的质粒，每种挑选三个克隆送上海生工生物有限公司进行测序鉴定。
(3)Western-blot鉴定。
稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建
正交氨酰tRNA合成酶/tRNA质粒的转染
将BHK-21细胞按1：4的比例铺在4个细胞培养瓶中，静置使细胞贴壁并生长过夜，细胞融合度达到60％～80％时转染。参考LipofectamineTM2000 Reagent说明书，按照下表分别加入质粒进行转染。转染4～6h后，去掉opti-MEM培养基换成含10％FBS的DMEM培养基，并按照下表以1： 1000的比例加入非天然氨基酸，转染12h后，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。
表14不同组合的质粒的转染
抗生素筛选单克隆细胞
(1)按表14转染后，直至细胞达到100％密度时，按1：10的比例在细胞培养基中加入0.1mg/L 的G418和按1:3000的比例加入1x10-3mg/L嘌呤霉素；
(2)用含10％FBS的DMEM培养基每2～3天换一次液，同时加入相应的抗生素；
(3)用抗生素筛选直至单个细胞长成肉眼可见的细胞团，挑取细胞团分别进行扩大培养；
(4)每个试验组挑20-30个单克隆细胞至48孔细胞培养板传代培养；
(5)继续培养直至冻存细胞，并留存相应细胞样品在荧光显微镜下观察绿色荧光及Western-blot 鉴定。
单克隆细胞系的鉴定
绿色荧光检测鉴定
取少量待鉴定的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶的单克隆细胞铺于细胞培养瓶，在细胞达到 60％～80％密度时，按1：1000至1：3000的比例加入非天然氨基酸，在37℃条件下、5％CO2培养箱中培养12h左右，在荧光显微镜下观察细胞中是否有绿色荧光出现。
细胞系的RT-PCR鉴定
将BHK-21细胞作为阴性对照，用TIANamp Genomic DNA Kit提取BHK-21细胞以及细胞系的 DNA进行PCR扩增，鉴定aaRS基因是否成功整合到宿主细胞染色体。PCR反应条件参考表4、5。将PCR扩增产物混合6x loading buffer进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶成像系统检测分析结果。
Western-blot鉴定
将上述细胞，在37℃条件下、5％CO2培养箱中培养40～48h时，收集细胞样品，提取细胞中的蛋白，定量后进行Western-bolt鉴定，通过质粒带有的标签和标签抗体反应，根据目的条带的大小鉴定该单克隆细胞是否为阳性细胞系，从阳性细胞系中挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的细胞作为目的细胞系，用于后续实验。
单克隆细胞系的稳定性鉴定
将绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞继续传代培养至53代，观察并记录每一代细胞的绿色荧光信号强度，同时收集细胞样品，通过Western-bolt鉴定正交氨酰 tRNA合成酶蛋白量变化情况。
实验结果
正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达质粒的构建
paaRS/tRNA真核表达质粒的构建
为了构建paaRS-flag真核表达质粒，并便于后期的单克隆细胞系筛选，发明人分别使用了不同抗性的真核表达载体。以paaRS质粒作为模板，进行PCR扩增，得到2700bp左右的扩增片段(图3A)。重组质粒paaRS-flag经过Nhe I和Bam H双酶切，显示出2条与预期分子质量大小符合的DNA条带 (图3B)。为了验证paaRS-flag质粒是否表达，待检测质粒转染BHK-21细胞，质粒转染细胞36～ 48h，收集细胞沉淀，提取细胞总蛋白并进行Western-blot鉴定，结果表明转染paaRS-flag的细胞在 50ku左右处有目的条带(图3C)，与aaRS编码的蛋白大小相符。而对照组BHK-21细胞在相同位置无特异性条带(图3C)。以载体自带引物对待检测质粒进行测序，基因测序结果与aaRS序列对比，同源性为100％，表明成功构建paaRS-flag真核表达质粒(图3D)。
琥珀正交系统的验证
为了验证paaRS-flag真核表达质粒是否能够表达有活性的蛋白，发明人按照不同质粒组合转染 BHK-21细胞(表14)。结果如图4，转染pEGFP质粒的细胞后在显微镜下观察到大量绿色荧光，说 明pEGFP重组质粒在BHK-21细胞中正常表达绿色荧光蛋白(图NC)；而转染pTAG-GFP质粒的细 胞没有产生绿色荧光，说明终止密码子的有效性(图4A)；只有转染pTAG-EGFP和paaRS-flag质粒 并添加非天然氨基酸的组合才能产生绿色荧光(图4G、4H、4I)。为了验证正交系统的特异性，发 明人分别单独转染非天然氨基酸或者共转染pTAG-EGFP和paaRS-flag质粒但是不添加非天然氨基酸 等组合，这些质粒组合转染的细胞中均不能产生绿色荧光(图4A-4F)。以上结果表明只有在正交氨 酰tRNA合成酶/tRNA和UAAs这两个组分同时存在时，正交系统才能正常发挥工作，促使正交氨酰 tRNA合成酶/tRNA识别UAAs从而通读TAG琥珀终止密码子，使pTAG-EGFP突变质粒正常表达绿 色荧光蛋白。
单克隆细胞系的筛选及鉴定
为了获得稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系，发明人将上述质粒转染BHK-21细胞并分别用G418和嘌呤霉素抗生素进行了筛选，获得了不同抗性的单克隆细胞系。从图5可以看出，不同的单克隆细胞氨酰RNA合成酶的表达量存在明显差异，其中单克隆细胞系4-6、4-8和4-15的氨酰RNA合成酶表达量较高，4-9、4-20、4-12的表达量较低，4-4几乎不表达。因此本研究挑选单克隆细胞系4-8传代培养，以鉴定该细胞系的稳定性。
单克隆细胞系稳定性的鉴定
为了验证单克隆细胞系氨酰tRNA合成酶表达的稳定性，发明人将氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞4-8传代培养，通过Western-blot检测，该细胞系传代培养从P5至P53代都能够表达氨酰tRNA合成酶蛋白，且表达量无明显变化(图6)。以上结果表明该细胞系能够稳定持续表达外源转入的氨酰tRNA合成酶。
本发明提供稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系，其是BHK-21细胞aaRS-4-8，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021280，保藏日期为：2021年10月10日。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：以pAcBac1.tR4-MbPyl质粒为模板，设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表达重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，分别经BamH I和Hind III、BamH I和Nhe I双酶切，连接到pCMV-flag、pIRES-puro3和pIRES-puro3-flag载体上，通过PCR反应、酶切、测序和Western-blot鉴定，得到不同的阳性克隆paaRS(pCMV-aaRS-flag、pIRES-puro3-aaRS和pIRES-puro3-aaRS-flag)真核表达质粒；
将不同的paaRS、pEGFP和pTAG-EGFP质粒按不同组合转染BHK-21细胞，用G418和嘌呤霉素进行筛选，通过绿色荧光检测和Western-blot鉴定，挑选出绿色荧光信号最强和正交氨酰tRNA合成酶表达量最高的单克隆细胞系。
2.根据权利要求1所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：
按照下表设计构建两对正交氨酰tRNA合成酶/tRNA重组质粒的引物，并进行引物合成；
表1质粒构建所需引物
3.根据权利要求1所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：
载体的制备具体为：
用BamH I和Hind III对pCMV-flag载体质粒进行酶切；用BamH I和Nhe I对pIRES-puro3、pIRES-puro3-flag载体质粒分别进行酶切；通过琼脂糖凝胶电泳实验分离并切下目的片段，根据Omega-Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书回收载体。
4.根据权利要求1所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：正交氨酰tRNA合成酶/tRNA质粒的转染为：
将BHK-21细胞按1：4的比例铺在4个细胞培养瓶中，静置使细胞贴壁并生长过夜，待细胞汇合度达到60％～80％时进行转染；参考LipofectamineTM2000 Reagent说明书，按照表13分别加入质粒进行转染。转染4～6h后，去掉opti-MEM培养基换成含10％FBS的DMEM培养基，以1：1000的比例加入非天然氨基酸，转染12h后，在荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现。
5.根据权利要求1所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：以pEGFP-puro质粒为模板，设计构建带有不同His标签的pEGFP野生型重组质粒的引物，通过PCR反应扩出目的片段，使用BamH I和Sal I对PCR扩增的片段、pCMV-flag载体进行酶切，胶回收酶切产物；目的基因与线性化载体4℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞。挑取单菌落，提取质粒进行酶切与测序鉴定。测序鉴定表明，成功构建不同His标签的pEGFP质粒；以不同His标签的pEGFP质粒为模板，利用点突变引物EGFP-M-F和EGFP-M-R进行PCR反应，利用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。将纯化后PCR产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含有抗性的LB 平板，37℃静置培养过夜。12～16h后挑取单菌落，提取质粒进行测序鉴定。测序鉴定表明，成功构建2个不同His标签的pTAG-EGFP突变体质粒。
6.根据权利要求5所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：pEGFP野生型质粒和pTAG-EGFP突变体质粒的构建包括：
1)pEGFP野生型重组质粒的构建
2)pTAG-EGFP突变体质粒的克隆及构建。
7.根据权利要求6所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：不同His标签的pEGFP野生型质粒的构建包括
1)引物的设计和合成
按照下表设计两对构建不同His标签的pEGFP野生型重组质粒的引物，并进行引物合成；
表2质粒构建所需引物
2)PCR扩增目的基因
3)PCR产物的回收与纯化
4)PCR产物的酶切
5)PCR产物的连接
6)连接产物的转化及单克隆菌株的挑取
7)重组克隆质粒的提取
8)重组克隆质粒pEGFP的鉴定。
8.根据权利要求5所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的构建方法，其特征在于：通过定点突变PCR反应在pEGFP野生型质粒的基因组上引入TAG终止密码子，得到在自然环境中不能够正常表达绿色荧光蛋白的pTAG-EGFP突变体质粒，包括以下步骤：
1)突变质粒的引物设计
根据Takara MutanBEST Kit试剂盒，设计引入TAG终止密码子的引物，进行引物合成：
表3质粒构建所需引物
2)突变质粒的定点突变
以不同His标签的pEGFP质粒为模板，利用点突变引物EGFP-M-F和EGFP-M-R进行PCR反应，PCR反应体系50μL：Pyrobest DNAPolymerase(5U/μL)0.25μL，10x Pyrobest Buffer II5μL，NTP Mixture(各2.5mM)4μL，20μM上、下游引物各1μL，模板1μL，RNase-free Water38.75μL。扩增反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。
3)PCR产物的胶回收
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以标准DL 5,000DNAMarker作为参照；
4)突变质粒的转化及单克隆挑取
将100μL E.coli.DH5α感染态细胞从-80℃取出后，将上述胶回收产物进行转化涂板，在37℃培养箱中静置培养过夜，挑取单克隆菌株；
5)突变质粒提取及鉴定。
9.权利要求1-8任一所述方法构建的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系，其特征在于，其是BHK-21细胞aaRS-4-8，保藏号为CCTCC NO：C2021280。
10.权利要求9所述的稳定表达正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的细胞系的应用，其特征在于：应用于利用正交系统拯救TAG突变病毒。
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