CN113308463A

CN113308463A - 经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用

Info

Publication number: CN113308463A
Application number: CN202110516652.0A
Authority: CN
Inventors: 汤艳东; 蔡雪辉
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-08-27

Abstract

本发明公开了经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用。所述的经过反密码子编辑的tRNA携带正常氨基酸，同时能够识别所述的提前终止密码子，并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而使得蛋白以及复制缺陷型病毒能够在该tRNA存在下完成表达及复制。该方法并不依赖特殊的氨酰tRNA合成酶以及UAA。仅对tRNA的反密码子编码序列进行突变改造就可以实现携带正常氨基酸的tRNA识别终止密码子并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而实现对蛋白表达以及复制缺陷型病毒精准调控，提高疫苗的安全性。本发明提供了一种用于蛋白或病毒精准控制的新方法，特别是在新型的复制缺陷型病毒疫苗的生产中将具有良好的应用前景。

Description

经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用

技术领域

本发明涉及经过反密码子编辑的tRNA的新用途，特别涉及经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及复制缺陷型病毒复制中的应用，本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

病原微生物引起机体的疾病对人类以及动物健康造成了巨大的影响，制造安全有效的疫苗是控制病原微生物感染的优先选择。然而，疫苗的安全性以及有效性很难兼得。如果给病原微生物安装精确调控其复制的“分子开关”，使其在体外复制可控，在体内不能复制，但是可以同时激活细胞免疫反应与体液免疫反应，从而使疫苗更安全。这种形式的疫苗代表了一种奇妙的疫苗的中间形式，即在灭活疫苗(安全但免疫原性低)和弱毒疫苗(免疫原性好但不安全)之间的新型疫苗。

精准调控病毒复制的分子开关使上述设想成为可能，在本发明之前，密码子拓展技术的出现使满足上述要求的疫苗成为可能，该技术结合病毒的基因组已经用于复制缺陷型病毒疫苗的研究。在该种病毒生产过程中，琥珀密码子(UAG) 被整合到病毒基因组的必须基因中，这样病毒可以在含有正交系统aaRS/tRNA对及非天然氨基酸(UAA)存在的情况下复制[1-3]。由于宿主不包含特殊的aaRS/tRNA对，病毒只能经历一个周期的感染，不能复制。这一技术最近已应用于HIV-1[1,3]流感病毒A[2]以及寨卡病毒[4]疫苗的研究。流感病毒的动物实验证明，该疫苗效果理想，兼具治疗和预防功能并且能激发强大的体液免疫和细胞免疫。

然而，密码子拓展技术的实施需要特殊的氨酰tRNA合成酶，只催化非天然氨基酸与与其配对的tRNA结合，而不参与细胞内源的tRNA与氨基酸结合。同时需要特殊的人工合成的非天然氨基酸，病毒的组装过程复杂，对UAA的大小与结构有严格要求，必须与该位置原有的氨基酸相似，这使得在活的病毒蛋白中包含进UAA富有挑战。目前应用较多的正交系统包括大肠杆菌中获得的tRNA^Tyr-tyrosyl-tRNA合成酶对(TyrRS)[5]以及古菌中tRNA^Pyl-pyrrolysyl-tRNA合成酶对(PylRS)等[6-8]，它们只在UAG琥珀密码子中插入UAA。

综上所述，密码子拓展技术应用在正交对的选择，突变位点的选择以及底物的选择上仍存在各种各样的挑战[1]。

参考文献：

[1]WANG N,LI Y,NIU W,et al.Construction of a live-attenuated HIV-1vaccine through genetic code expansion[J].Angew Chem Int Ed Engl.2014,53(19):4867-4871.

[2]SI L,XU H,ZHOU X,et al.Generation of influenza A viruses as livebut replication-incompetent virus vaccines[J].Science.2016,354(6316):1170-1173.

[3]YUAN Z,WANG N,KANG G,et al.Controlling Multicycle Replication ofLive-Attenuated HIV-1 Using an Unnatural Genetic Switch[J].ACS SynthBiol.2017,6(4):721-731.

[4]ZHANG R R,YE Q,LI X F,et al.Construction and characterization ofUAA-controlled recombinant Zika virus by genetic code expansion[J].Sci ChinaLife Sci.2021,64(1):171-173.

[5]NIU W,SCHULTZ P G,GUO J An expanded genetic code in mammaliancells with a functional quadruplet codon[J].ACS Chem Biol.2013,8(7):1640-1645.

[6]LIU W,BROCK A,CHEN S,et al.Genetic incorporation of unnaturalamino acids into proteins in mammalian cells[J].Nat Methods.2007,4(3):239-244.

[7]ELSASSER S J,ERNST R J,WALKER O S,et al.Genetic code expansion instable cell lines enables encoded chromatin modification[J].Nat Methods.2016,13(2):158-164.

[8]ZHENG Y,YU F,WU Y,et al.Broadening the versatility of lentiviralvectors as a tool in nucleic acid research via genetic code expansion[J].Nucleic Acids Res.2015,43(11):e73.

[9]ATKINSON J,MARTIN R Mutations to nonsense codons in human geneticdisease:implications for gene therapy by nonsense suppressor tRNAs[J].NucleicAcids Res.1994,22(8):1327-1334.

[10]TEMPLE G F,DOZY A M,ROY K L,et al.Construction of a functionalhuman suppressor tRNA gene:an approach to gene therapy for beta-thalassaemia[J].Nature.1982,296(5857):537-540.

[11]PANCHAL R G,WANG S,MCDERMOTT J,et al.Partial functionalcorrection of xeroderma pigmentosum group A cells by suppressor tRNA[J].HumGene Ther.1999,10(13):2209-2219.

[12]BUVOLI M,BUVOLI A,LEINWAND L A Suppression of nonsense mutationsin cell culture and mice by multimerized suppressor tRNA genes[J].Mol CellBiol.2000,20(9):3116-3124.

[13]LUECK J D,YOON J S,PERALES-PUCHALTA,et al.Engineered transferRNAs for suppression of premature termination codons[J].Nat Commun.2019,10(1):822.

[14]PAPAYANNAKOS C,DANIEL R Understanding lentiviral vector chromatintargeting:working to reduce insertional mutagenic potential for gene therapy[J].Gene Ther.2013,20(6):581-588.

[15]ARYA S K,ZAMANI M,KUNDRA P Human immunodeficiency virus type 2lentivirus vectors for gene transfer:expression and potential for helpervirus-free packaging[J].Hum Gene Ther.1998,9(9):1371-1380.

[16]POESCHLA E M,WONG-STAAL F,LOONEY D J Efficient transductionofnondividing human cells by feline immunodeficiency virus lentiviral vectors[J].Nat Med.1998,4(3):354-357.

[17]OLSEN J C Gene transfer vectors derived from equine infectiousanemia virus[J].Gene Ther.1998,5(11):1481-1487.

[18]SCHNELL T,FOLEY P,WIRTH M,et al.Development of a self-inactivating,minimal lentivirus vector based on simian immunodeficiency virus[J].Hum Gene Ther.2000,11(3):439-447.

[19]ASMUTH D M,BROWN E L,DINUBILE M J,et al.Comparative cell-mediatedimmunogenicity of DNA/DNA,DNA/adenovirus type 5(Ad5),or Ad5/Ad5 HIV-1 clade Bgag vaccine prime-boost regimens[J].J Infect Dis.2010,201(1):132-141.

[20]SACHA J B,CHUNG C,RAKASZ E G,et al.Gag-specific CD8+ Tlymphocytes recognize infected cells before AIDS-virus integration and viralprotein expression[J].J Immunol.2007,178(5):2746-2754.

[21]RERKS-NGARM S,PITISUTTITHUM P,NITAYAPHAN S,et al. Vaccinationwith ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand[J].N Engl JMed.2009,361(23):2209-2220.

[22]KOFF W C,JOHNSON P R,WATKINS D I,et al.HIV vaccine design:insights from live attenuated SIV vaccines[J].Nat Immunol.2006,7(1):19-23.

[23]ROCHE S,REY F A,GAUDIN Y,et al.Structure of the prefusion form ofthe vesicular stomatitis virus glycoprotein G[J].Science.2007,315(5813):843-848.

发明内容

本发明的目的在于提供一种全新的方法用于蛋白表达精准调控以及复制缺陷型病毒的研究，该方法并不依赖特殊的氨酰tRNA合成酶以及UAA。仅对tRNA的反密码子编码序列进行突变改造，通过转染、注射或电转等方法就可以实现携带正常氨基酸的tRNA识别终止密码子(UAG或UAA及UGA)并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而实现对蛋白表达以及复制缺陷型病毒精准调控。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

在本发明中，我们将经过反密码子编辑的tRNA应用于蛋白表达精准调控与病毒复制精准调控，并建立稳定表达细胞系。出于安全性的考虑，本发明的病毒复制精准调控以HIV-1为骨架的慢病毒为模型，探索将经过反密码子编辑的tRNA做为控制HIV-1复制的分子开关。慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒(HIV-1) 产生，包含HIV-1的部分结构蛋白和非结构蛋白，可以作为HIV-1的研究模型。其中Gag是参与病毒组装和成熟的多功能蛋白。一些研究已经证明Gag因其具有相对保守的序列模式，是一种潜在的HIV-1免疫原。因此，本发明选择Gag为研究对象，以Trp^UGAtRNA/Arg^UGAtRNA/Gly^UGAtRNA3个代表性的经过反密码子编辑的tRNA对Gag蛋白的提前终止密码子(PTC)的通读进行验证。研究结果表明Arg^UGAtRNA和Gly^UGAtRNA均可以高效的携带对应的氨基酸进入蛋白编码序列提前终止密码子(PTC)对应的位置，对Gag蛋白中的多个位点突变均具有很高的介导通读能力，包装慢病毒的效率与野生型Gag蛋白几乎无异。进一步，我们使用2个位点联合突变，仍能成功包装出慢病毒。总的来说，本发明设计的经过反密码子编辑的tRNA可以作为精准控制蛋白表达和病毒复制的分子开关，可应用于几乎所有病原微生物的研究，特别是相应疫苗的研发。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用，其中，所述的蛋白的编码基因中一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换；所述的病毒为复制缺陷型病毒，该病毒基因组中的必须基因中的一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换，自身无法进行复制；所述的经过反密码子编辑的tRNA 携带正常氨基酸，同时能够识别所述的提前终止密码子，并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而使得所述的蛋白以及复制缺陷型病毒在经过反密码子编辑的 tRNA存在下完成表达及复制。

其中，优选的，所述的蛋白或复制缺陷型病毒基因组中的必须基因中的两个以上正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换。

其中，优选的，所述的经过反密码子编辑的tRNA选自以下tRNA中的一种或者二者的组合：

(1)Arg^UGA tRNA，该tRNA携带精氨酸，同时能够识别提前终止密码子 UGA，并将携带的精氨酸插入到相应的位置，其是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转录后得到；

(2)Gly^UGAtRNA，该tRNA携带甘氨酸，同时能够识别提前终止密码子UGA，并将携带的甘氨酸插入到相应的位置，其是由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列转录后得到。

进一步的，一种经过反密码子编辑的tRNA、含有1至多个拷贝的所述的经过反密码子编辑的tRNA的表达载体也在本发明的保护范围之内，所述的经过反密码子编辑的tRNA选自以下tRNA中的一种或者二者的组合：

再进一步的，本发明还提出了一种应用于蛋白表达精准调控或复制缺陷型病毒复制的细胞系，所述的细胞系中含有并稳定表达1至多个拷贝的本发明所述的经过反密码子编辑的tRNA。

其中，优选的，所述的细胞系还含有EGFP基因，所述的EGFP基因中的一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换。

其中，优选的，Arg^UGAtRNA存在的情况下，所述的EGFP基因中第74、110、 123或169位精氨酸编码基因中的至少一个被提前终止密码子所替换， Gly^UGAtRNA存在的情况下，所述的EGFP基因中第25、34、92或128位甘氨酸编码基因中的至少一个被提前终止密码子所替换。

更进一步的，本发明还提出了所述的表达载体在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用。以及

所述的细胞系在在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

为了实现蛋白和病毒在体外的可控表达和复制，提高疫苗的安全性，本发明提出了将经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关来精准控制蛋白表达及病毒复制。并以HIV-1伪病毒为例验证该技术在精准控制蛋白表达以及病毒复制中的可行性。研究结果表明经过反密码子编辑的tRNA可以高效的携带对应的氨基酸进入蛋白编码序列提前终止密码子(PTC)对应的位置，成功实现对蛋白表达及病毒复制的精准控制。本发明提供了一种全新的方法用于蛋白或病毒的精准控制，特别是在新型的复制缺陷疫苗的生产中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为经过反密码子编辑的tRNA介导315GFP报告基因终止密码子通读的能力；

其中：(A)经过反密码子编辑的tRNA Arg^UGAtRNA对不同位点的精氨酸TAG点突变的通读；(B)经过反密码子编辑的tRNA Gly^UGAtRNA对不同位点的甘氨酸TAG点突变的通读；转染野生型315GFP的组为阳性对照，未转染组为 Mock，转染315GFP突变体质粒和ACE-tRNA空载体pUC19的为阴性对照。细胞核用DAPI进行染色，scale bar＝200μm；(C)3个不同经过反密码子编辑的 tRNA介导不同位点通读的热图分析；

图2为Gag蛋白单氨基酸突变对慢病毒包装效率的影响；

其中：(A)psPAPX2或psPAPX2突变体、PMD2.G、PLVX-IRES-ZSGreen与指定的ACE-tRNA及其空载体包装慢病毒，200μL/孔的量感染铺于24孔板中的 293T细胞，感染后48h通过流式检测EGFP慢病毒感染HEK 293T细胞后细胞的平均发光强度；(B)与上述同样的方法包装含有Luc基因的慢病毒，200μL/ 孔的量感染铺于48孔板中的293T细胞，感染后48h检测萤火虫荧光素酶值；

图3为Gag蛋白双点突变对慢病毒包装效率的影响；

其中：(A)在Arg^UGA tRNA(D)Gly^UGA tRNA存在的情况下，用PMD2G，不同psPAPX突变体，PLVX-IRES-ZSGreen包装EGFP慢病毒，转染48h后收获上清，感染HEK293T细胞，48h后间接免疫荧光检测慢病毒的包装效率。不同慢病毒(B)Gag-229R^TGA/232R^TGA(E)Gag-221G^TGA/226G^TGA(G) Gag-221G^TGA/238G^TGA感染HEK 293T细胞后细胞的平均发光强度。在指定的Arg^UGA tRNA或Gly^UGA tRNA存在的情况下，用PMD2G-VSVG，HIV-Luc,(C) Gag-229R^TGA/232R^TGA(F)Gag-221G^TGA/226G^TGA(H)Gag-221G^TGA/238G^TGA包装 Luc慢病毒，转染48h后收获上清，感染HEK293T细胞，48h后检测萤火虫荧光素酶值；

图4为稳定表达Arg^UGAtRNA的细胞系的构建。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施过程中的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

实施例1

方法

1、材料与方法

1.1样品、细胞及毒株

人胚胎肾细胞(HEK293T)由本实验室保存。pDC-315-GFP质粒(以pEGFP-N1 质粒为模板，PCR扩增EGFP基因，将其克隆至pDC-315载体得到pDC-315-GFP) 由本实验室构建并保存。慢病毒包装系统质粒PLVX-IRES-ZSGreen1、HIV-1-Luc(以pGL3-Basic载体为模板，PCR扩增luciferase基因，将其克隆至 pFUGW载体得到HIV-1-Luc)、psPAX2和pMD2.G质粒均由本实验室保存。pUC57 质粒购于北京擎科生物科技有限公司。用于质粒转化的DH5α感受态，购于北京擎科生物科技有限公司(北京，中国)。经过反密码子编辑的三种tRNA——Arg^UGAtRNA、Gly^UGAtRNA以及Trp^UGAtRNA分别是由SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸序列转录后得到，所对应的DNA序列由北京擎科生物科技有限公司合成。将合成的与三种tRNA——Arg^UGAtRNA、Gly^UGAtRNA以及Trp^UGAtRNA对应的DNA 序列分别克隆至pUC57载体中，分别得到pUC57-Arg^UGAtRNA、 pUC57-Gly^UGAtRNA、pUC57-Trp^UGAtRNA。

1.2抗体制剂与试剂盒

用于分子克隆的T4 DNA Ligase购自Thermo Scientific公司；SpeI/SphI购自NEB公司；用于PCR扩增的KOD FX Neo购自东洋纺(Toyobo)公司；用于质粒小提以及中提的试剂盒PureLink^TM HiPure Plasmid Midiprep Kit购自Invitrogen 公司；

用于细胞转染的试剂jetPRIME Polyplus Transfection转染试剂购自杭州瑞宏生物技术有限公司。X-tremeGENE HP DNA Transfer Reagent购自ROCHE(罗氏)。用于细胞培养的DMEM、RPMI 1640购自Gibco公司；胎牛血清(Excell血清) 购自澳洲Excell公司；无血清细胞冻存液(CELLSAVING)购自新赛美公司。用于慢病毒检测的

Reporter(DLR^TM)Assay System试剂盒购自 Promega公司。通用型抗体稀释液购自新赛美公司。Anti-HIV1 p24抗体购自 Abcam公司。

2、含有提前终止密码子TGA的GFP突变体构建

选取pDC-315-GFP质粒为本体进行突变，对GFP编码序列中的第5、11、 21、25、32、34、41、52、68、92、105、117、128、135、175、190位甘氨酸；第58位色氨酸；第74、110、123、169位精氨酸进行点突变，突变为终止密码子TGA，用于点突变的引物、PCR反应体系以及条件如表1-3所示：

表1构建pDC-315-GFP突变体所用的引物

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

在100μL反应体系内转移至1.5mL离心管中，加入200μL无水乙醇，室温静置10min，12000rpm离心10min，有可见的白色沉淀，弃上清，用水溶解，加入DpnI进行酶切，酶切反应体系和条件如下表4所示：

表4酶切反应体系

将反应体系置于37℃水浴锅中反应2h。

转化：酶切完成后置于-20℃保存或直接用DH5α感受态进行转化。将上述反应体系置于冰上5min，直接加入50μL冰上融化的DH5α感受态，轻轻混匀，冰上静置20min，42℃热激45s，迅速返回冰浴2min。加入无菌无抗性LB/SOC 500～700μL，于37℃摇床中200r/min摇30min，菌液离心，用100μL无抗LB 重悬沉淀，涂到含有相应抗生素的培养基上，37℃细菌培养箱倒置培养过夜。

阳性质粒的提取鉴定：挑菌后用Omega小提质粒试剂盒提取质粒。步骤如下：在使用前在Solution I中加入指定浓度的RNaseI，在DNA Wash Buffer中加入指定体积的无水乙醇。取2～4mL菌液于2mL离心管中离心取沉淀，用250μL Solution I重悬，继续加入250μLSolution II，混匀后静置2～3min裂解。继续向该体系中加入350μL Soluion III中和裂解液。12000g离心10min，将上清转移至吸附柱，离心，弃废液，吸附柱中加入500μL HighBinding，离心。继续向吸附柱中加入700μL DNA Wash Buffer洗涤2次。空离去掉膜上多余的液体。将吸附柱放在新的1.5mL EP管中，向膜中央加入40μL Elution Buffer，10000xg离心1min进行洗脱，用紫外分光光度计对回收质粒进行浓度测定。

质粒的大量提取：将小提的质粒样品测序鉴定，对测序正确的突变体进行质粒大提。按说明书中的步骤进行操作：将菌液按适当的比例接种于装有150mL氨苄抗性LB的锥形瓶中，于37℃摇床中按220rpm/min摇10～12h。菌液置于50mL 离心管中，8000g/min离心10min，反复3次。弃上清，加入4mL含有RNase 的R3重悬沉淀。继续加入4mL提前预热的L7进行裂解。随后向反应体系中加入4mLN3终止裂解，8000g离心10min去除沉淀，将上清倒入带有滤纸的吸附柱上，自然流下。10mLW10洗涤2次。将吸附柱置于一个新的装有3.5mL异丙醇的50mL离心管中，加入5mL E4洗脱，4℃静置30min。10000g离心30min，加入500μLTE溶解沉淀，用紫外分光光度计进行浓度测定。

3、Trp^UGAtRNA/Arg^UGAtRNA/Gly^UGAtRNA PTC抑制的功能验证

将生长状态良好的293T细胞铺于12孔板中，待细胞生长至80％时，将1μg 的pDC-315-GFP质粒或pDC-315-GFP突变体质粒分别与1μg的pUC57-Trp^UGA tRNA/pUC57-Arg^UGAtRNA/pUC57-Gly^UGAtRNA或pUC57质粒按jetPRIME转染试剂说明书进行转染。步骤如下：

(1)取出待转染的质粒、转染试剂以及稀释液使其恢复室温。

(2)在超净台内，将1μg的pDC-315-GFP质粒或pDC-315-GFP突变体质粒与1μg的pUC57-Trp^UGA tRNA/pUC57-Arg^UGA tRNA/pUC57-Gly^UGAtRNA或 pUC19对照质粒置于200μL附带的jetPRIME buffer中进行稀释，涡旋10s混匀。

(3)接着按质粒：转染试剂(1：2)向该体系中加入4μL jetPRIME转染试剂，并立刻涡旋混匀10s。室温孵育10min。

(4)将上述反应体系逐滴均匀加入细胞培养上清中，轻轻晃动12孔板使之分布均匀，置37℃温箱中培养。

(5)转染后6h换含10％FBS的新鲜培养基，重新放回37℃细胞培养箱培养。

(6)转染48h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞的发光情况，并进行流式分析。

4、3种经过反密码子编辑的tRNA对pDC-315-EGFP突变体的通读情况将上述转染48h的细胞弃上清，PBS洗3次，用4％多聚甲醛固定40min， PBS洗涤3次，DAPI(Sigma，USA)1：10000稀释用于细胞核染色。置倒置荧光显微镜下进行观察。

5、3种经过反密码子编辑的tRNA对pDC-315-GFP突变体的通读流式检测将上述转染48h的12孔板细胞弃上清，PBS洗3次，胰酶消化，500μL 的DMEM将细胞重悬，直接进行流式分析。

6、psPAX2质粒突变体的构建

6.1含speI单酶切位点的psPAX2质粒突变体的构建

(1)引物设计

由于psPAX2质粒中含有两个speI的酶切位点，为了后续的点突变改造，需要将位于启动子起始位置的speI去除，保留单酶切位点。构建方案如下：引物F 中包含在speI对应碱基引入的一个点突变，由原来的“ACTAGT”改为“GCTAGT”。用如下的F/R引物扩增新的序列，重新插入用speI酶切的原载体中，由此构建的质粒只包含一个speI的酶切位点，命名为psPAPX2-mu-SpeI。构建 psPAPX2-mu-SpeI所用的引物如表5。

表5构建psPAPX2-mu-SpeI所用的引物

(2)PCR扩增目的基因

按照表6、表7的反应体系以及反应条件进行PCR反应。

表6 PCR反应体系

表7 PCR反应条件

(3)PCR产物胶回收

按Omega胶回收试剂盒的说明书进行回收，具体步骤如下：将PCR产物与指定体积的上样缓冲液混合后进行核酸凝胶电泳。紫外光下切割目的条带回收目的条带于1.5mL离心管中：按照切下的核酸胶的体积加入相应的Binding Buffer (XP2)。56℃孵育直至凝胶完全溶解，期间每2～3min颠倒混匀。离心柱装在2mL 收集管内，将750μL冷却到室温的胶溶液倒入离心柱中，室温10000g，离心1min，弃去离心液。再次往离心柱内加入300μL BindingBuffer(XP2)，10000g，离心1 min，弃去离心液。加入700μL SPW Wash Buffer(使用前加入指定体积的无水乙醇)洗涤离心柱。10000g离心1min。重复洗涤一次。弃收集管内的废液，12000 g离2min。将吸附柱置于新的1.5mL EP管中，向膜中央加入30～50μL ElutionBuffer，静置2min，10000g离心2min进行洗脱，回收产物用紫外分光光度计进行浓度测定。

(4)酶切

用speI酶切psPAPX2-mu-SpeI质粒，回收载体大片段与PCR产物重组。

载体的酶切反应体系如表8：

表8酶切反应体系

于37℃水浴酶切2h，进行琼脂糖凝胶电泳，确认酶切结果，回收片段。

(5)重组

反应体系如下表9：

表9重组反应体系

将重组混合物冰上孵育5min，37℃水浴30min，直接转化。挑菌并测序鉴定。

7、Gag-p24区含有TGA提前终止密码子的psPAX2质粒突变体的构建

对gag编码序列区的speI和sphI之间的甘氨酸和精氨酸分别突变为TGA，构建6个单点突变的突变体，分别命名为psPAX2-mu-221G，psPAX2-mu-226G， psPAX2-mu-229R，psPAX2-mu-232R，psPAX2-mu-233G，psPAX2-mu-238G，对检测结果较好的点进行双点联合突变，分别命名为psPAX2-mu-221G/226G， psPAX2-mu-221G/238G，psPAX2-mu-229R/232R。对甘氨酸和精氨酸突变位点交叉组合构建联合点突变，分别命名为psPAX2-mu-221G/229R，psPAX2-mu-221G/232R。

(1)引物设计

用于psPAX2 gag基因单点突变和双点突变的引物序列如下表10。

表10构建psPAX2 gag基因单点突变和双点突变体所用的引物

(2)引物退火

将GAG221G-F/GAG221G-R，GAG226G-F/GAG226G-R， GAG233G-F/GAG233G-R，GAG238G-F/GAG238G-R，GAG229R-F/GAG229R-R，GAG232R-F/232R-R，GAG221G 238G-F/GAG221G 238G-R，GAG229R 232R-F/GAG229R 232R-R；GAG221G 229R-F/GAG221G 229R-R；GAG221G 232R-F/GAG221G 232R-R；GAG221G 226G-F/GAG221G 226G-R退火，具体操作步骤如下：将合成的引物用水稀释至浓度为100μM，分别取10μL的上游引物和下游引物混合，开水煮10min，室温自然冷却，即获得带有SpeI和SphI粘性末端的双链小片段。

(3)酶切

用SpeI和SphI酶切psPAPX2-mu-SpeI质粒，回收载体大片段与退火形成的小片段连接。载体的酶切反应体系如下表11：

表11酶切反应体系

37℃水浴，酶切2h，进行琼脂糖凝胶电泳，确认酶切结果，回收片段。

(4)连接

反应体系如下表12：

表12连接反应体系

22℃连接30min，直接转化，挑菌，测序鉴定。

8、psPAPX2-mu-SpeI及其突变体用于慢病毒包装

8.1 psPAPX2-mu-SpeI及其突变体用于EGFP慢病毒包装

用含10％FBS的DMEM培养基将5×10⁵个HEK-293T细胞接种于六孔板中，于细胞培养箱中正常培养。待细胞生长12～24h且细胞密度约80％时准备转染。

(1)将jetPRIME转染试剂恢复室温并震荡混匀。

(2)在1.5mL离心管中加入200μL jetPRIME buffer，依次加入0.5μg pMD2.G质粒、1μg psPAX2突变体质粒、1μg指定的pUC57-Arg^UGA tRNA或 pUC57-Gly^UGAtRNA或pUC19质粒、1.5μg PLVX-IRES-ZSGreen1质粒，同时设立加入0.5μg pMD2.G质粒、1μg psPAPX2-mu-SpeI、1μg pUC19质粒、1.5μg PLVX-IRES-ZSGreen1质粒的组包装慢病毒作为阳性对照。涡旋10s混匀。

(3)接着按质粒：转染试剂(1：2)向该体系中加入8μLjetPRIME转染试剂，并立刻涡旋混匀10s。室温孵育10min。

(4)将上述反应体系逐滴均匀加入细胞培养上清中，轻轻晃动6孔板使之分布均匀，置37℃温箱中培养。

(6)转染后48h，收集细胞培养上清，用0.45μM滤膜进行过滤，于-80℃冰箱备用。

8.2 psPAPX2-mu-SpeI及其突变体用于Luc慢病毒包装

在1.5mL离心管中加入200μLjetPRIME buffer，依次加入0.5μgpMD2.G质粒、1μgpsPAX2突变体质粒、1μg指定的pUC57-Arg^UGA tRNA或 pUC57-Gly^UGAtRNA或pUC19质粒、1.5μgHIV-1-Luc转移质粒，同时设立加入0.5μgpMD2.G质粒、1μgpsPAX2-mu-SpeI、1μgpUC19质粒、1.5μg HIV-1-Luc 转移质粒的组包装慢病毒作为阳性对照。

9、慢病毒感染与检测

将生长状态良好的293T细胞铺于24孔板中，待细胞密度达80％后，弃去细胞培养上清，用包装的慢病毒进行感染，每孔接200μL包装的慢病毒，37℃温箱孵育2h，弃病毒液换含10％FBS的DMEM培养基，重新放回37℃细胞培养箱培养48h，对于包装的EGFP慢病毒DAPI染色后用倒置荧光显微镜观察并消化细胞后流式检测。对于包装的Luc慢病毒，生长状态良好的293T细胞铺于48 孔板中，每孔接200μL包装的慢病毒，48h后处理。5x Lysis Buffer用水稀释成工作浓度，每孔200μL冰上裂解30min，将裂解物100倍稀释，按照

Reporter(DLR^TM)Assay System试剂盒说明书进行检测。每次实验设3个重复，每个实验重复3次。

10、Lenti-74GFP-4xArg质粒的构建

以公司合成的pUC57-Arg^UGAtRNA为模板扩增Arg^UGAtRNA，以之前构建的 pDC-315-GFP突变体质粒为模板扩增315GFP^74TGA，作为报告基因，方便细胞系的筛选。以lentiCRISPRv2 puro为模板扩增WPRE 3’LTR，为方便后续的GFP标签的替换，PCR过程将WPRE前的BamHI改成XhoI。

对PCR扩增的WPRE 3’LTR与315GFP^74TGA，分别进行融合PCR，融合PCR 反应体系及步骤如下表13、14所示：

表13融合PCR反应体系

表14 PCR反应条件

对PCR产物进行电泳、胶回收。

对lentiCRISPRv2 puro载体用XbaI/PmeI进行酶切，回收大片段。用XbaI/PmeI 酶切融合PCR的片段，构建中间质粒，命名为lenti-74 TGA315GFP。菌液PCR 鉴定lenti-74TGA315GFP中是否包含融合的EGFP+WPRE+3’LTR片段。

对构建正确的质粒进行测序，测序正确的质粒用EcoRI/KpnI进行酶切。以合成的Arg-tRNA为模板进行PCR扩增得到4xArgtRNA，引物序列为：4XTCA-F: gtttggttaattaaggtaccGACGGGCCCGGGATCCgcggccgc；4XTCA-R: agacctagctagcgaattcGACGGCCAGTGAATTCgagctc，PCR反应同上，用EcoRI/KpnI 对lenti-74 TGA315GFP进行酶切，用相同的酶对PCR扩增的4xArgtRNA进行酶切，连接后，对构建正确的最终质粒命名为Lenti-74GFP-4xArg。

11、Lenti-74GFP-4xArg慢病毒的包装

将生长状态良好的293T细胞铺六孔板，待细胞密度达80％后，进行转染。

步骤如下：

(1)用ROCHE(罗氏)X-tremeGene HP DNA转染试剂并按其说明进行转染；

(2)在1.5mL离心管中加入200μL无血清的DMEM，依次加入0.5μg pMD2.G质粒、1μgpsPAX2突变体质粒、1.5μg Lenti-74GFP-4xArg转移质粒，涡旋混匀，接着按质粒：转染试剂(1：3)向该体系中加入12μL转染试剂，并立刻混匀。

(3)室温孵育15min。

(4)取出待转染的HEK-293T细胞，将上述转染混合液逐滴加入细胞培养上清，于37℃细胞培养箱继续培养48h。

(5)取上清，离心，过0.45μM的滤膜，于-80℃冻存备用。

12、Lenti-74GFP-4xArg慢病毒感染用于细胞系的构建

将包装的Lenti-74GFP-4xArg 1mL与5×10⁵个HEK-293T细胞混合于15mL 离心管中，37℃细胞培养箱孵育30min。在水平转子离心机中500rpm/min，离心2h。弃上清，用2mL的含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，铺于6孔板中。对发光的细胞进行多次流式分选，反复筛选出发光最强的细胞。

结果：

1.经过反密码子编辑的tRNA作为蛋白表达的精准分子开关

本发明以Trp^UGAtRNA/Arg^UGAtRNA/Gly^UGAtRNA为例，研究经过反密码子编辑的tRNA对精确控制蛋白表达调控以及病毒复制进行研究。首先在pDC-315-GFP质粒GFP编码区进行点突变，分别将GFP编码序列中的第5、11、 21、25、32、34、41、52、68、92、105、117、128、135、175、190位甘氨酸；第58位色氨酸；第74、110、123、169位精氨酸突变为终止密码子TGA。结果显示：Arg^UGAtRNA存在的情况下，74、110、123、169位精氨酸突变点通读效果较好(图1)，Gly^UGAtRNA存在的情况下，25、34、92、128位甘氨酸突变点 PTC抑制效果较好(图1)。虽然Arg^UGAtRNA对部分如5，11，25，117位甘氨酸突变位点也能够介导通读，但是效率显著低于精氨酸突变点(结果未展示)，这可能是由于甘氨酸在这些位置的插入效率低，或是甘氨酸的插入影响了蛋白的原始功能。而Gly^UGAtRNA对4个精氨酸突变位点以及1个色氨酸突变位点的PTC 几乎无抑制效果(结果未展示)。Trp^UGAtRNA对包括第58位色氨酸突变在内的所有的点突变几乎没有抑制作用(图1)。进一步，我们用流式分析315GFP各个突变点在Trp^UGAtRNA/Arg^UGAtRNA/Gly^UGAtRNA/pUC19分别存在情况下的发光平均值，并绘制热图(图1.C)，结果与间接免疫荧光一致。总的来说，通过对报告基因315GFP PTC抑制效率的鉴定，我们初步确认了Arg^UGA tRNA和 Gly^UGAtRNA可以对编码框内含TGA的PTC发挥很好的抑制功能。经过反密码子编辑的tRNA(ACE-tRNA)可以携带与之对应的氨基酸高效插入PTC。并且，从目前的结果看，Arg^UGAtRNA的效率高于Gly^UGAtRNA。

2.经过反密码子编辑的tRNA作为调控病毒复制的精准分子开关

我们以Arg^UGAtRNA和Gly^UGAtRNA为例，进行HIV-1慢病毒复制精准调控的研究。为了方便迅速的筛选到HIV基因组中理想的突变位点，我们首先在慢病毒包装系统中进行初步的探索，找出能够使Arg^UGAtRNA和Gly^UGAtRNA高效插入氨基酸的PTC位点。为了改造方便，在筛选突变位点之前我们首先将位于启动子中的SphI去除，构建只含有单SphI的质粒，新的质粒不影响慢病毒的包装(结果未展示)。我们在构建的新的质粒上将HIV-1Gag蛋白的第221位、226位、233 位、238位甘氨酸，以及第229位、232位精氨酸分别突变为TGA终止密码子，这些突变位点均位于p24蛋白编码区。本发明通过包装含有EGFP基因的慢病毒来检测这些突变质粒在经过反密码子编辑的tRNA存在情况下氨基酸的插入效率，同时设立转染不含经过反密码子编辑的tRNA的空载体作为对照。将包装的慢病毒感染HEK293T细胞，结果显示：在Arg^UGAtRNA存在的情况下，Gag蛋白第 229位和232位精氨酸的突变PTC抑制效果好，慢病毒的包装效率高。在Gly^UGAtRNA存在的情况下，Gag蛋白第221位和226位甘氨酸的突变包装效率高(图2)。

同时，萤火虫荧光素酶报告基因进行验证，包装了含有Luc基因的慢病毒来检测这些突变质粒在经过反密码子编辑的tRNA存在情况下氨基酸的插入效率，结果与含有EGFP报告基因的慢病毒的结论几乎一致。

同时，我们尝试在HIV基因组中引入多个TGA突变位点会更严格的控制病毒的复制，大大降低病毒逃逸以及病毒返强的风险，使突变病毒作为疫苗更加安全。为了研究两个氨基酸TGA突变是否足够有效产出病毒，我们根据单点突变筛选的结果较好的点构建双点突变病毒，因为Gag蛋白中的229R，232R，221G， 226G，238G突变表现出理想的慢病毒包装结果，所以我们尝试构建两种氨基酸的联合突变，Gag蛋白中的229位和232位精氨酸，221位和226位甘氨酸，221 位和238位甘氨酸分别同时突变。我们用突变的Gag蛋白结合囊膜蛋白VSVG、包含EGFP的转移质粒在指定的经过反密码子编辑的tRNA存在的条件下分别包装慢病毒，同时设立转染不含经过反密码子编辑的tRNA空质粒为阴性对照，转染野生型Gag-pol，VSVG，EGFP转移质粒包装的慢病毒为阳性对照。包装的慢病毒感染293T细胞，结果显示，在Arg^UGA tRNA存在的情况下，Gag蛋白第229 位和232位精氨酸的突变PTC抑制效果较好，慢病毒的包装效率高，但是与阳性对照组相比仍具有显著的差异(图3)。进一步用流式对慢病毒感染后细胞发光平均值进行分析，结果表明野生型Gag包装的慢病毒约为Gag 229位和232位突变发光平均值的4.41倍。在Gly^UGAtRNA存在的情况下，Gag蛋白第221位和226 位甘氨酸的双点突变与第221位和238位甘氨酸的双点突变均能包装出慢病毒。与之前单点突变的结果一致，221位和226位结合的双点突变要优于221位和238 位结合的双点突变，流式分析结果表明野生型Gag基因包装的慢病毒约为Gag 221位和226位联合突变发光平均值的5.98倍，为Gag 221位和238位联合突变发光平均值的17.53倍(图3)。

我们接着用野生型Gag基因及其双点突变体用于Luc慢病毒的包装，检测结果要低于包装的EGFP慢病毒，正常Gag包装的慢病毒分别为Gag 229位和232 位，221位和226位，221位和238位双点突变的8.76倍，12.21倍，20.5倍，这可能与Luc检测的灵敏度高有关，但是得出的结论与流式一致。总的来说，在同一种经过反密码子编辑的tRNA的背景下，Gag基因单点突变结果较好的点组合后也会以较高的效率包装出慢病毒。Arg^UGA tRNA背景下的Gag229R/232R突变略优于Gly^UGAtRNA存在条件下的Gag221G/226G突变，Gag221G/238G突变结果最不理想。以上结果表明，多位点的经过反密码子编辑的tRNA的插入效率相比 1个位点插入要低。

3.经过反密码子编辑的tRNA构建稳定表达细胞系

本发明以Arg^UGAtRNA和含有74位精氨酸点突变(TAG)的EGFP基因构建慢病毒，通过慢病毒感染HEK293T细胞系，使细胞稳定表达Arg^UGAtRNA，通过流式的方法筛选EGFP荧光强度高的单细胞进行克隆培养，成功构建稳定表达 Arg^UGAtRNA的细胞系(图4)。该细胞系可作为蛋白表达精准调控以及病毒复制的分子开关。

讨论：

疫苗开发的难点在于安全性和有效性的兼容[21,22]，反密码子编辑技术的出现无疑是一种有力的工具用于精确控制病毒的复制，提高病毒疫苗的安全性。正如在该研究中所描述的那样，经过反密码子编辑的的tRNA可以成功携带与之对应的氨基酸插入到病毒蛋白编码基因的PTC位置，实现病毒蛋白的正常表达，进而包装出完整的病毒粒子。该病毒粒子只在含有经过反密码子编辑的tRNA的细胞中增殖，在正常的宿主细胞中由于蛋白翻译的提前终止而组装不出正常的病毒粒子。在我们尝试包括精氨酸和甘氨酸在内的6个点中，除了233G位点，其它位点在对应的经过反密码子编辑的tRNA的作用下均表现出较好的蛋白翻译以及病毒包装功能。虽然单点突变的蛋白表达以及病毒包装效率较高。然而，我们在双点联合突变检测中，对照组并无发现任何相关蛋白的翻译以及病毒包装成功，仅在经过反密码子编辑的tRNA存在时，病毒包装成功。因此，选取两个甚至更多的点进行点突变是有必要的，不仅可以避免小概率的通读事件，并且可以降低病毒重组回复突变造成毒力返强的机率。

反密码子编辑的tRNA在复制缺陷病毒的生产，为病毒蛋白的翻译安装“开关”，实现病毒的复制可控方面要优于现在普遍应用的正交系统aaRS/tRNA，因为它操作简单，只需基因经过反密码子编辑的tRNA就可以实现在TAG、TGA、 TAA三种终止密码子处的特异插入，依赖细胞内源的氨酰tRNA合成酶，摆脱了对人工合成的非天然氨基酸以及细胞外源的氨酰tRNA合成酶的依赖，在疫苗生产方面会极大的降低成本。此外由于在突变位置插入原始的氨基酸，避免了非天然氨基酸因其形态和结构性质的差异引起的病毒蛋白的产量的降低或功能的失活[23]，因此在突变氨基酸选择上成功率更高。

研究表明哺乳动物细胞对琥珀色终止密码子(UAG)的非天然氨基酸掺入效率通常被认为较低，限制密码子拓展技术广泛用于细胞动物病毒研究的主要因素即是aaRS/tRNA对的效率。反密码子编辑的tRNA与aaRS/tRNA正交系统存在同样的问题，即tRNA的效率问题，受不同细胞转染效率的影响，这极大的限制了密码子拓展技术在许多病毒中的应用。

总的来说，为了实现病毒在体外的可控复制，提高病毒疫苗的安全性，我们首次将经过反密码子编辑的tRNA与病毒疫苗研究相结合。通过对HIV蛋白的结构和特性分析，我们选择病毒中的Gag蛋白为研究对象。通过初期验证，最终我们将精力集中在探索Arg^UGAtRNA/Gly^UGAtRNA两套系统对Gag蛋白的PTC抑制功能，结合Gag蛋白的结构特征，我们在P24蛋白的loop区选择了相应的精氨酸和甘氨酸进行TGA突变，研究结果表明Arg^UGAtRNA和Gly^UGAtRNA均可以高效的携带对应的氨基酸进入蛋白编码序列提前终止密码子(PTC)对应的位置，成功包装出慢病毒。该研究可能提供一种全新的方法用于新型的复制缺陷疫苗的生产，对于提高疫苗的安全性以及应用传统技术有挑战的疫苗研究提供重要参考。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达及病毒复制中的应用

<130> KLPI210256

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gcggccgcga acgctgacgt catcaacccg ctccaaggaa tcgcgggccc agtgtcacta 60

ggcgggaaca cccagcgcgc gtgcgccctg gcaggaagat ggctgtgagg gacaggggag 120

tggcgccctg caatatttgc atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa 180

tgtctttgga tttgggaatc ttataagttc tgtatgagac cacagatccc cgcgttggtg 240

gtatagtggt tagcatagct gccttcaaag cagttgaccc gggttcgatt cccggccaac 300

gcaccatttt tctcgacgac gccgccatct ctaggcccgc gccggccccc tcgcacagac 360

ttgtgggaga agctcggcta ctcccctgcc ccggttaatt tgcatataat atttcctagt 420

aactatagag gcttaatgtg cgataaaaga cagataatct gttcttttta atactagcta 480

cattttacat gataggcttg gatttctata agagatacaa atactaaatt attattttaa 540

aaaacagcac aaaaggaaac tcaccctaac tgtaaagtaa ttgtgtgttt tgagactata 600

aatatccctt ggagaaaagc cttgtttggc tctgtggcgc aatggatagc gcattggact 660

tcaagctgag cctagtgtgg tcattcaaag gttgtgggtt cgagtcccac cagagtcgcc 720

atttttctcg acaaggtcgg gcaggaagag ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg 780

catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt aaacacaaag 840

atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta 900

aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc 960

ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccggct ctgtggcgca atggatagcg 1020

cattggactt caagctgagc ctagtgtggt cattcaaagg ttgtgggttc gagtcccacc 1080

agagtcgcca tttttctcga cgaacgctga cgtcatcaac ccgctccaag gaatcgcggg 1140

cccagtgtca ctaggcggga acacccagcg cgcgtgcgcc ctggcaggaa gatggctgtg 1200

agggacaggg gagtggcgcc ctgcaatatt tgcatgtcgc tatgtgttct gggaaatcac 1260

cataaacgtg aaatgtcttt ggatttggga atcttataag ttctgtatga gaccacagat 1320

ccccggctct gtggcgcaat ggatagcgca ttggacttca agctgagcct agtgtggtca 1380

ttcaaaggtt gtgggttcga gtcccaccag agtcgccatt tttctcgacg agctc 1435

<210> 2

<211> 1378

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gcggccgcga acgctgacgt catcaacccg ctccaaggaa tcgcgggccc agtgtcacta 60

ggcgggaaca cccagcgcgc gtgcgccctg gcaggaagat ggctgtgagg gacaggggag 120

tggcgccctg caatatttgc atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa 180

tgtctttgga tttgggaatc ttataagttc tgtatgagac cacagatccc cgcgttggtg 240

gtatagtggt tagcatagct gccttcaaag cagttgaccc gggttcgatt cccggccaac 300

gcaccatttt tctcgacgac gccgccatct ctaggcccgc gccggccccc tcgcacagac 360

ttgtgggaga agctcggcta ctcccctgcc ccggttaatt tgcatataat atttcctagt 420

aactatagag gcttaatgtg cgataaaaga cagataatct gttcttttta atactagcta 480

cattttacat gataggcttg gatttctata agagatacaa atactaaatt attattttaa 540

aaaacagcac aaaaggaaac tcaccctaac tgtaaagtaa ttgtgtgttt tgagactata 600

aatatccctt ggagaaaagc cttgtttgcg ttggtggtat agtggttagc atagctgcct 660

tcaaagcagt tgacccgggt tcgattcccg gccaacgcac catttttctc gacaaggtcg 720

ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 780

ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 840

gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 900

actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 960

ggaaaggacg aaacaccgcg ttggtggtat agtggttagc atagctgcct tcaaagcagt 1020

tgacccgggt tcgattcccg gccaacgcac catttttctc gacgaacgct gacgtcatca 1080

acccgctcca aggaatcgcg ggcccagtgt cactaggcgg gaacacccag cgcgcgtgcg 1140

ccctggcagg aagatggctg tgagggacag gggagtggcg ccctgcaata tttgcatgtc 1200

gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct ttggatttgg gaatcttata 1260

agttctgtat gagaccacag atccccgcgt tggtggtata gtggttagca tagctgcctt 1320

caaagcagtt gacccgggtt cgattcccgg ccaacgcacc atttttctcg acgagctc 1378

<210> 3

<211> 1378

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gcggccgcga acgctgacgt catcaacccg ctccaaggaa tcgcgggccc agtgtcacta 60

ggcgggaaca cccagcgcgc gtgcgccctg gcaggaagat ggctgtgagg gacaggggag 120

tggcgccctg caatatttgc atgtcgctat gtgttctggg aaatcaccat aaacgtgaaa 180

tgtctttgga tttgggaatc ttataagttc tgtatgagac cacagatccc cggcctcgtg 240

gcgcaacggt agcgcgtctg acttcagatc agaaggttgc gtgttcaaat cacgtcgggg 300

tcaccatttt tctcgacgac gccgccatct ctaggcccgc gccggccccc tcgcacagac 360

ttgtgggaga agctcggcta ctcccctgcc ccggttaatt tgcatataat atttcctagt 420

aactatagag gcttaatgtg cgataaaaga cagataatct gttcttttta atactagcta 480

cattttacat gataggcttg gatttctata agagatacaa atactaaatt attattttaa 540

aaaacagcac aaaaggaaac tcaccctaac tgtaaagtaa ttgtgtgttt tgagactata 600

aatatccctt ggagaaaagc cttgtttggc ctcgtggcgc aacggtagcg cgtctgactt 660

cagatcagaa ggttgcgtgt tcaaatcacg tcggggtcac catttttctc gacaaggtcg 720

ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 780

ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 840

gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 900

actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 960

ggaaaggacg aaacaccggc ctcgtggcgc aacggtagcg cgtctgactt cagatcagaa 1020

ggttgcgtgt tcaaatcacg tcggggtcac catttttctc gacgaacgct gacgtcatca 1080

acccgctcca aggaatcgcg ggcccagtgt cactaggcgg gaacacccag cgcgcgtgcg 1140

ccctggcagg aagatggctg tgagggacag gggagtggcg ccctgcaata tttgcatgtc 1200

gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct ttggatttgg gaatcttata 1260

agttctgtat gagaccacag atccccggcc tcgtggcgca acggtagcgc gtctgacttc 1320

agatcagaag gttgcgtgtt caaatcacgt cggggtcacc atttttctcg acgagctc 1378

Claims

1.经过反密码子编辑的tRNA作为分子开关在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用，其中，所述的蛋白的编码基因中一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换；所述的病毒为复制缺陷型病毒，该病毒基因组中的必须基因中的一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换，自身无法进行复制；所述的经过反密码子编辑的tRNA携带正常氨基酸，同时能够识别所述的提前终止密码子，并将携带的氨基酸插入到相应的位置，从而使得所述的蛋白以及复制缺陷型病毒在经过反密码子编辑的tRNA存在下完成表达及复制。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蛋白或复制缺陷型病毒基因组中的必须基因中的两个以上正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的经过反密码子编辑的tRNA选自以下tRNA中的一种或者二者的组合：

(1)Arg^UGA tRNA，该tRNA携带精氨酸，同时能够识别提前终止密码子UGA，并将携带的精氨酸插入到相应的位置，其是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转录后得到；

4.一种经过反密码子编辑的tRNA，其特征在于，所述的经过反密码子编辑的tRNA选自以下tRNA中的一种或者二者的组合：

5.一种表达载体，其特征在于，所述的载体中含有1至多个拷贝的权利要求4所述的经过反密码子编辑的tRNA。

6.一种应用于蛋白表达精准调控或复制缺陷型病毒复制的细胞系，其特征在于，所述的细胞系中含有并稳定表达1至多个拷贝的权利要求4所述的经过反密码子编辑的tRNA。

7.如权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系还含有EGFP基因，所述的EGFP基因中的一个或多个正常氨基酸编码基因被提前终止密码子所替换。

8.如权利要求7所述的细胞系，其特征在于，Arg^UGAtRNA存在的情况下，所述的EGFP基因中第74、110、123或169位精氨酸编码基因中的至少一个被提前终止密码子所替换，Gly^UGAtRNA存在的情况下，所述的EGFP基因中第25、34、92或128位甘氨酸编码基因中的至少一个被提前终止密码子所替换。

9.权利要求5所述的表达载体在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用。

10.权利要求6-9任一项所述的细胞系在在精准控制蛋白表达或病毒复制中的应用。