CN114807232A - 一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明构建了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的WNV全长感染性克隆质粒，为开展WNV感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

Description

一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用
技术领域
本发明属于病毒分子生物学和基因重组技术领域，具体涉及一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用。
背景技术
西尼罗病毒(west nile virus，WNV)是一种单股正链RNA病毒，为黄病毒科黄病毒属成员，可引起人和动物发生西尼罗河热和西尼罗病毒脑膜脑炎，库蚊是其主要的传播媒介，鸟类是该病毒的中间宿主，而人和马则是终端宿主。WNV广泛分布于非洲、中东、欧洲的部分地区。目前尚无针对WNV感染的人用疫苗以及治疗药物。虽然我国至今没有WNV感染疫情发生，但有输入性传播的可能。WNV最早于1937年在乌干达西尼罗地区被发现，起初仅在小范围传播，并未引起严重疾病，直至1999年在美国纽约暴发流行后，迅速传播至美洲大陆，引发了严重的公共卫生问题。WNV除了给人类健康带来威胁外，在北美等地也导致了大量的马匹、鸟类等家禽及野生鸟禽的感染及死亡。
WNV基因组为单股正链RNA，由约11kb个核苷酸组成。整个基因组包括5’端非编码区(non-coding region，NCR)、3’端非编码区以及中间的一个开放阅读框架(open readingframe，ORF)。开放阅读框编码一个多聚前体蛋白，在病毒和宿主蛋白酶作用下可被切割成3种结构蛋白：衣壳蛋白(capsid protein，C)、膜蛋白(membrane protein，M)和包膜蛋白(envelope protein，E)以及7种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白在病毒颗粒组装成熟中发挥着重要作用，非结构蛋白主要参与病毒基因组的复制。
病毒感染性克隆，即含有病毒全长基因组的质粒是用于基础病毒学研究与抗病毒科技开发的重要工具。大肠杆菌是最常用也是操作最方便用于扩增质粒的宿主细胞，但黄病毒基因组在大肠杆菌中极不稳定，这给利用大肠杆菌为宿主菌构建病毒感染性克隆造成很大困难。
发明内容：
本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的西尼罗病毒全长基因组感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出西尼罗病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，引起小鼠死亡。该感染性克隆为开展西尼罗感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。
本发明提供了一株西尼罗病毒感染性克隆质粒，其特征在于：含有一株西尼罗病毒全长基因组，
在病毒基因组中引入了一个核苷酸点突变，以及长度为133个核苷酸的哺乳动物细胞内含子基因。
本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：能在大肠杆菌中高效扩增，稳定遗传。
本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：作为模板转录出病毒基因组RNA，将RNA转染BHK-21细胞，产生西尼罗病毒。
本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染Vero E6细胞，在细胞内表达病毒蛋白。
本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，并引起小鼠死亡。
本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，或基于该感染性克隆构建的突变株在西尼罗病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发中的应用。
附图说明
图1：根据限制性内切酶位点的分布将WNV基因组分为4段；
图2：质粒载体pUC18中SalI、XbaI和BamHI三个酶切位点的位次顺序；
图3：WNV感染性克隆质粒中的WNV基因表达结构(NCR:非编码区)；
图4：免疫荧光检测Vero E6细胞中的WNV核心蛋白
其中，左图为：对照BHK-21培养液感染的Vero E6细胞；
右图为：RNA转染BHK-21培养液感染的Vero E6细胞；
图5：免疫荧光检测病毒感染小鼠脑组织的中WNV核心蛋白；
其中，左图为：对照细胞培养液注射的小鼠脑组织切片
右图为：WNV注射的小鼠脑组织切片。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
一、WNV基因组限制性核酸内切酶位点分析：
根据序列一株WNV序列(GenBank:AF404756.1，文献：Complete genome SEQuencesand phylogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the UnitedStates,Europe,and the Middle East,Virology,2002,298(1),96-105)，基因组全长11029 nt(序列1)，分析基因组中限制性核酸内切酶位点的分布，利用位于第2495 nt的NgoMI酶切位点(G/CCGGC)、位于第5780nt的SplI酶切位点(C/GTACG)、位于第8870 nt的XhoI酶切位点(C/TCGAG)，将全长病毒基因组分为四段(图1)，目的是可使用这些酶切位点将四段合成的基因进行酶切、连接，从而得到病毒全长基因组。所用的质粒载体是pUC18，使用其中的三个酶切位点：SalI、XbaI和BamHI(图2)，将四段基因插入在该质粒载体中，通过酶切、连接，最终得到含有WNV全长基因组的质粒。
序列1：11029 nt
Figure BDA0003641030560000021
Figure BDA0003641030560000031
Figure BDA0003641030560000041
Figure BDA0003641030560000051
Figure BDA0003641030560000061
NCR：非编码区；图1显示WNV基因组的第2495 nt为NgoMI酶切位点，第5780 nt为SplI酶切位点，第8870 nt为XhoI酶切位点
二、WNV基因组分段合成：
委托生物技术公司合成四段分段基因。
片段1：病毒基因组5′端第1-2500 bp，在其5′端引入SalI酶切位点(G/TCGAC)和T7启动子，即T7噬菌体RNA聚合酶结合位点(TAATACGACTCACTATAG)，其序列如SEQ2，长2534nt，其3′端为病毒基因组第2495 nt的NgoMI酶切位点(G/CCGGC)，以及引入的XbaI酶切位点(T/CTAGA)；合成的基因插入在质粒载体pUC18的SalI和XbaI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F1。
片段2：病毒基因组第2495～5785 nt，其5′端为引入的SalI酶切位点以及病毒基因组中的NgoMI酶切位点，3′端为病毒基因组中5780 nt的SplI酶切位点(C/GTACG)，以及引入的XbaI酶切位点，其序列如SEQ3，长3303 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的SalI和XbaI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F2。
片段3：病毒基因组第5780～8875 nt，其5′端为引入的XbaI酶切位点以及病毒基因组中的SplI酶切位点，3′端为病毒基因组8870 nt的XhoI酶切位点(C/TCGAG)以及引入的BamHI酶切位点(GG/ATCC)，其序列如SEQ4，长3112 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的XbaI和BamHI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F3。
片段4：病毒基因组第8870～11029 nt，其5′端为引入的XbaI酶切位点以及病毒基因组中的XhoI酶切位点，3′端引入BamHI酶切位点，其序列如SEQ5，长2172 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的XbaI和BamHI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F4。
三、分段合成的片段1和片段2的连接：
将质粒pUC18-WNV-F2用限制性核酸内切酶NgoMI以及XbaI同时酶切，切出WNV基因组片段2；将质粒pUC18-WNV-F1也用NgoMI以及XbaI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为NgoMI以及XbaI酶切位点；将切出的WNV基因组片段2插入线性化的质粒pUC18-WNV-F1，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化感受态大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用NgoMI以及XbaI酶切，分析片段2是否插入质粒pUC18-WNV-F1中，如果酶切出片段2，则片段1和片段2连接成功，质粒命名为pUC18-WNV-F1F2。酶切、连接、大肠杆菌转化、质粒抽提等常规分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所述的方法进行。
四、片段1中插入哺乳动物内含子基因：
上述分段合成的片段1和片段2的连接操作多次均成功，将片段1和片段2连接反应液转化大肠杆菌STBL3，未见到阳性菌落，重复连接和转化大肠杆菌操作3次，仍未见阳性菌落。分析原因，极可能与黄病毒属病毒基因组在大肠杆菌中的不稳定性有关。其主要原因是病毒基因组中存在大肠杆菌启动子，导致病毒基因组在大肠杆菌中表达出对大肠杆菌具有毒性的异常蛋白质。
片段1包括了WNV的C基因、M基因和E基因以及NS1基因5′端31个核苷酸，由于片段1质粒在大肠杆菌中稳定，因此分析可能是片段1和片段2衔接处的基因序列影响了两段基因连接以后在大肠杆菌中的稳定性。我们尝试在片段1的近3′端插入一段哺乳动物内含子基因，即在片段1和片段2中间引入一段干扰基因，可能中止其在大肠杆菌中转录表达出毒性蛋白。该内含子序列理论上不影响WNV的产生，因为在哺乳动物细胞mRNA中，内含子序列可被切除。由于内含子剪接具有序列选择性，如CAG/G就是一个优选的内含子剪接位点，在CAG/G之间插入侧翼序列分别为5′-GTAAGT------CAG-3′的内含子，在哺乳动物细胞转录出的前体mRNA中，内含子被切除，前体mRNA再拼接为成熟mRNA。因此，我们选择位于基因组2350-2353 nt的CAAG为内含子插入位点，将第2352 nt的A变为G，密码子CAA随之变为CAG，编码的氨基酸均为谷氨酰胺，即该突变不改变其编码的氨基酸残基，从而形成哺乳动物细胞内含子的优化剪接位点CAG/G，在CAG/G之间插入一段哺乳动物内含子基因序列SEQ6，参考哺乳动物细胞表达载体pCI-neo(Promega公司产品，Genbank：U47120.2)中的内含子序列。将含有哺乳动物内含子基因的片段1命名为片段1I，相应质粒命名为pUC18-WNV-F1I。
按照三所述的方法，将分段合成的片段1I和片段2的连接，片段1I和片段2连接成功，得到质粒pUC18-WNV-F1IF2。
五、分段合成的片段3和片段4的连接：
将质粒pUC18-WNV-F4用限制性核酸内切酶XhoI以及BamHI同时酶切，切出WNV基因组片段4；将质粒pUC18-WNV-F3也用XhoI以及BamHI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为XhoI以及BamHI酶切位点；将切出的WNV基因组片段4插入线性化的质粒pUC18-WNV-F3，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化感受态大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用XhoI以及BamHI酶切，分析片段4是否插入质粒pUC18-WNV-F3中，如果酶切出片段4，则片段3和片段4连接成功，质粒命名为pUC18-WNV-F3F4。
SEQ2：2534 nt
Figure BDA0003641030560000071
Figure BDA0003641030560000081
SEQ3：3303 nt
Figure BDA0003641030560000082
Figure BDA0003641030560000091
SEQ4：3112 nt
Figure BDA0003641030560000092
Figure BDA0003641030560000101
SEQ5：2172 nt
Figure BDA0003641030560000102
Figure BDA0003641030560000111
SEQ6：133 nt
Figure BDA0003641030560000112
六、WNV全长基因组的连接：
将质粒pUC18-WNV-F1IF2用限制性核酸内切酶SalI和SplI同时酶切，切出WNV基因组片段F1F2；将质粒pUC18-WNV-F3F4也用SalI和SplI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为SalI和SplI酶切位点；将切出的WNV基因组片段F1IF2插入线性化的质粒pUC18-WNV-F3F4，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用SalI和SplI酶切，分析片段F1IF2是否插入质粒pUC18-WNV-F3F4中，如果酶切出片段F1IF2，则WNV全长基因组连接成功，即为WNV感染性克隆，质粒命名为pUC18-WNV2KI。
将质粒pUC18-WNV2KI转化大肠杆菌STBL3，抽提质粒，再转化大肠杆菌STBL3，连续10次，将每一次抽提的质粒送生物公司进行基因测序，结果未发现有核苷酸突变，表明该质粒能在大肠杆菌中稳定遗传。
如图3所示，感染性克隆pUC18-WNV2KI质粒中含有全长WNV基因表达结构，包括T7启动子和WNV全长基因组，该结构全长11192 bp，序列见SEQ7，插入在质粒载体pUC18的SalI和BamHI位点。其中1-6 nt为Sal酶切位点，7-24 nt为T7启动子，第2376 nt的G为WNV基因组原始序列中第2352 nt的A突变而来，2377-2509 nt为哺乳动物内含子基因，11187-11192nt为BamHI位点。
SEQ7：11192 nt
Figure BDA0003641030560000113
Figure BDA0003641030560000121
Figure BDA0003641030560000131
Figure BDA0003641030560000141
Figure BDA0003641030560000151
七、WNV基因组RNA的转录：
质粒pUC18-WNV2KI以限制性核酸内切酶BamHI酶切，然后以酶切线性化的质粒pUC18-WNV2KI为模板，用T7 RNA体外转录试剂盒转录出WNV基因组RNA，所用试剂为HiScribeTMT7 mRNA合成试剂盒(含
Figure BDA0003641030560000152
Reagent AG，NEB公司产品)，通过一步共转录加帽即可获得5’端带有7-甲基鸟苷(m7G)帽结构的mRNA。操作按照试剂说明书进行。转录反应液用磁珠mRNA纯化试剂纯化(Thermo Fisher公司产品)，纯化出的RNA用NanoDrop微量分光光度计(Thermo Fisher公司产品)测定浓度，用于细胞转染。
八、WNV基因组RNA转染BHK-21细胞：
将幼仓鼠肾细胞系BHK-21细胞接种于24孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM(Thermo Fisher公司产品)，次日细胞密度约80-90％时，将制备的WNV基因组RNA转染细胞，转染试剂用LipofectamineTM2000 reagent(Thermo Fisher公司产品)，每孔用WNV RNA 2μg，LipofectamineTM2000 reagent 2μl。转染8小时以后，吸除细胞培养液，每孔加500μl含10％胎牛血清的DMEM，继续培养48小时，吸出细胞培养液，冻存于-80℃冰箱，用于细胞感染。
九、病毒测序：
对上述WNV RNA转染BHK-21细胞培养液中的病毒进行测序鉴定，用Trizol Regent(Thermo Fisher公司产品)抽提培养液中的RNA，进行二代测序，获得WNV基因组全序列，结果显示：除2352nt为G以外，其余与WNV原始序列相同，不含哺乳动物内含子序列，表明该感染性克隆的构建方案达到其初始目的，即通过插入内含子序列获得了含WNV全长基因组、能在大肠杆菌中稳定复制的质粒，用该质粒为模板能制备出WNV，且WNV基因组中的内含子序列被剪切，而WNV基因组中第2352nt A→G突变不改变其编码的氨基酸残基。
十、Vero E6细胞感染：
将非洲绿猴细胞系Vero E6细胞接种于96孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM，体积100μl。次日细胞密度约80-90％时，将收集的WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液以三倍连续梯度稀释，加入Vero E6细胞培养孔中，每孔100μl。18小时以后，细胞用免疫荧光法检测WNV核心蛋白的表达。
十一、免疫荧光检测Vero E6细胞中的WNV核心蛋白：
吸除Vero E6细胞培养板中的培养液，每孔加100μl甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每孔以磷酸盐缓冲液(PBS)洗孔一次，随后加入100μl含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下简称3％BSA-PBS)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％BSA-PBS，每孔加100μl含抗WNV核心蛋白多克隆抗体(Sigma-Aldirch公司产品)的1％BSA-PBS(抗体1000倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的抗体工作液，每孔以PBS洗3次，随后加入100μl含荧光素Alexa Fluor 488-标记的抗兔IgG(Thermo Fisher公司产品)的1％BSA-PBS(荧光素抗体1500倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入DAPI细胞核染色液100μl，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的DAPI细胞核染色液，每孔以PBS洗3次，用细胞成像及分析系统(BioTek Cytation 5 Imaging Reader)对每孔细胞的荧光分布进行拍照，并计数绿色荧光阳性细胞，计算感染细胞的病毒滴度，即每毫升BHK-21细胞培养液感染Vero E6细胞的数量FFU(focus-forming unit，灶形成单位)。
在荧光显微镜下观察可见：WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞中可见绿色荧光分布(绿色荧光素标记的二抗)，而对照细胞内未见绿色荧光(图4)，表明RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞可表达WNV核心蛋白，表明RNA转染的BHK-21细胞培养液中存在感染性的WNV。通过荧光细胞计数、分析，病毒滴度达106FFU/ml。
十二、小鼠感染实验：
6周龄、雌性C57B/6小鼠，共12只，分为两组。病毒感染组腹腔注射WNV(即WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液)，剂量1*104FFU，体积200μl；对照组注射等体积对照BHK-21细胞(未用WNV RNA转染)培养培养液。随后每天观察小鼠的活动情况以及体重变化，在第7天每组处死2只小鼠，取小鼠大脑，用4％多聚甲醛固定72小时，随后经过乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸泡、包埋等处理，对大脑组织块切片，免疫荧光检测脑组织切片中的WNV核心蛋白。免疫荧光检测方法以及所用的抗WNV核心蛋白多克隆抗体同上所述。二抗为荧光素AlexaFluor 546-标记的抗兔IgG(Thermo Fisher公司产品)。
结果显示：小鼠腹腔注射WNV以后的第四天，出现行动迟缓、弓背、竖毛等发病症状，第7天开始死亡。对照组小鼠未出现发病症状。免疫荧光检测脑组织中的WNV核心蛋白，在荧光显微镜下可见病毒感染小鼠脑组织中分布有红色荧光(红色荧光素标记的二抗)，不同位置的荧光强度有所不同，而对照组小鼠脑组织中无红色荧光(图5)，表明WNV感染小鼠并侵入了小鼠大脑。至感染后第11天，WNV感染的小鼠全部死亡，而对照组未处死的小鼠全部存活。
上述在细胞和小鼠的实验结果均表明，本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的西尼罗病毒全长感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出西尼罗病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，引起小鼠死亡。为开展西尼罗病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。
以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
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Figure BDA0003641030560000181
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Figure BDA0003641030560000211
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Figure BDA0003641030560000281
Figure BDA0003641030560000291
Figure BDA0003641030560000301
序列表
<110> 中国人民解放军海军军医大学
<120> 一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11029
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60
acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120
ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180
ggactgaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240
gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300
tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagttttaa gaaggaacta 360
gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 420
accggaattg cagtcatgat tggcctgatc gccagcgtag gagcagttac cctctctaac 480
ttccaaggga aggtgatgat gacggtaaat gctactgacg tcacagatgt catcacgatt 540
ccaacagctg ctggaaagaa cctatgcatt gtcagagcaa tggatgtggg atacatgtgc 600
gatgatacta tcacttatga atgcccagtg ctgtcggctg gtaatgatcc agaagacatc 660
gactgttggt gcacaaagtc agcagtctac gtcaggtatg gaagatgcac caagacacgc 720
cactcaagac gcagtcggag gtcactgaca gtgcagacac acggagaaag cactctagcg 780
aacaagaagg gggcttggat ggacagcacc aaggccacaa ggtatttggt aaaaacagaa 840
tcatggatct tgaggaaccc tggatatgcc ctggtggcag ccgtcattgg ttggatgctt 900
gggagcaaca ccatgcagag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 960
tacagcttca actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 1020
acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 1080
cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt 1140
tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga 1200
gaagctcaca atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac 1260
aggggctggg gcaacggctg cggattattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa 1320
tttgcctgct ctaccaaggc aataggaaga accatcttga aagagaatat caagtacgaa 1380
gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 1440
gttggagcca ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 1500
aagcttggag aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc 1560
aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 1620
atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 1680
ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 1740
gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 1800
gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 1860
ggaacaacct atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca 1920
ggtcacggca ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgtaaagtt 1980
cctatctcgt cagtggcttc attgaacgac ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc 2040
aacccttttg tttcagtggc cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc 2100
tttggagact catacatagt ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccattggcac 2160
aagtctggaa gcagcattgg caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta 2220
gccgctctag gagacacagc ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt 2280
gggaaggctg tccatcaagt gttcggagga gcattccgct tactgttcgg aggcatgtcc 2340
tggataacgc aaggattgct gggggctctc ctgttgtgga tgggcatcaa tgctcgtgat 2400
aggtccatag ctctcacgtt tctcgcagtt ggaggagttc tgctcttcct ctccgtgaac 2460
gtgcacgctg acactgggtg tgccatagac atcagccggc aagagctgag atgtggaagt 2520
ggagtgttca tacacaatga tgtggaggct tggatggacc gatacaagta ttaccctgaa 2580
acgccacaag gcctagccaa gatcattcag aaagctcata aggaaggagt gtgcggtcta 2640
cgatcagttt ccagactgga gcatcaaatg tgggaagcag tgaaggacga gctgaacact 2700
cttttgaagg agaatggtgt ggaccttagt gtcgtggttg agaaacagga gggaatgtac 2760
aagtcagcac ctaaacgcct caccgccacc acggaaaaat tggaaattgg ctggaaggcc 2820
tggggaaaga gtattttatt tgcaccagaa ctcgccaaca acacctttgt ggttgatggt 2880
ccggagacca aggaatgtcc gactcagaat cgcgcttgga atagcttaga agtggaggat 2940
tttggatttg gtctcaccag cactcggatg ttcctgaagg tcagagagag caacacaact 3000
gaatgtgact cgaagatcat tggaacggct gtcaagaaca acttggcgat ccacagtgac 3060
ctgtcctatt ggattgaaag caggctcaat gatacgtgga agcttgaaag ggcagttctg 3120
ggtgaagtca aatcatgtac gtggcctgag acgcatacct tgtggggcga tggaatcctt 3180
gagagtgact tgataatacc agtcacactg gcgggaccac gaagcaatca caatcggaga 3240
cctgggtaca agacacaaaa ccagggccca tgggacgaag gccgggtaga gattgacttc 3300
gattactgcc caggaactac ggtcaccctg agtgagagct gcggacaccg tggacctgcc 3360
actcgcacca ccacagagag cggaaagttg ataacagatt ggtgctgcag gagctgcacc 3420
ttaccaccac tgcgctacca aactgacagc ggctgttggt atggtatgga gatcagacca 3480
cagagacatg atgaaaagac cctcgtgcag tcacaagtga atgcttataa tgctgatatg 3540
attgaccctt ttcagttggg ccttctggtc gtgttcttgg ccacccagga ggtccttcgc 3600
aagaggtgga cagccaagat cagcatgcca gctatactga ttgctctgct agtcctggtg 3660
tttgggggca ttacttacac tgatgtgtta cgctatgtca tcttggtggg ggcagctttc 3720
gcagaatcta attcgggagg agacgtggta cacttggcgc tcatggcgac cttcaagata 3780
caaccagtgt ttatggtggc atcgtttctc aaagcgagat ggaccaacca ggagaacatt 3840
ttgttgatgt tggcggctgt tttctttcaa atggcttatc acgatgcccg ccaaattctg 3900
ctctgggaga tccctgatgt gttgaattca ctggcggtag cttggatgat actgagagcc 3960
ataacattca caacgacatc aaacgtggtt gttccgctgc tagccctgct aacacccggg 4020
ctgagatgct tgaatctgga tgtgtacagg atactgctgt tgatggtcgg aataggcagc 4080
ttgatcaggg agaagaggag tgcagctgca aaaaagaaag gagcaagtct gctatgcttg 4140
gctctagcct caacaggact tttcaacccc atgatccttg ctgctggact gattacatgt 4200
gatcccaacc gtaaacgcgg atggcccgca actgaagtga tgacagctgt cggcctgatg 4260
tttgccatcg tcggagggct ggcagagctt gacattgact ccatggccat tccaatgact 4320
atcgcggggc tcatgtttgc tgctttcgtg atttctggga aatcaacaga tatgtggatt 4380
gagagaacgg cggacatttc ctgggaaagt gatgcagaaa ttacaggctc gagcgaaaga 4440
gttgatgtgc ggcttgatga tgatggaaac ttccagctca tgaatgatcc aggagcacct 4500
tggaagatat ggatgctcag aatggtctgt ctcgcgatta gtgcgtacac cccctgggca 4560
atcttgccct cagtagttgg attttggata actctccaat acacaaagag aggaggcgtg 4620
ttgtgggaca ctccctcacc aaaggagtac aaaaaggggg acacgaccac cggcgtctac 4680
aggatcatga ctcgtgggct gctcggcagt tatcaagcag gagcgggcgt gatggttgaa 4740
ggtgttttcc acaccctttg gcatacaaca aaaggagccg ctttgatgag cggagagggc 4800
cgcctggacc catactgggg cagtgtcaag gaggatcgac tttgttacgg aggaccctgg 4860
aaattgcagc acaagtggaa cgggcaggat gaggtgcaga tgattgtggt ggaacctggc 4920
aagaacgtta agaacgtcca gacgaaacca ggggtgttca aaacacctga aggagaaatc 4980
ggggccgtga ctttggactt ccccactgga acatcaggct caccaatagt ggacaaaaac 5040
ggtgatgtga ttgggcttta tggcaatgga gtcataatgc ccaacggctc atacataagc 5100
gcgatagtgc agggtgaaag gatggatgag ccaatcccag ccggattcga acctgagatg 5160
ctgaggaaaa aacagatcac tgtactggat ctccatcccg gcgccggtaa aacaaggagg 5220
attctgccac agatcatcaa agaggccata aacagaagac tgagaacagc cgtgctagca 5280
ccaaccaggg ttgtggctgc tgagatggct gaagcactga gaggactgcc catccggtac 5340
cagacatccg cagtgcccag agaacataat ggaaatgaga ttgttgatgt catgtgtcat 5400
gctaccctca cccacaggct gatgtctcct cacagggtgc cgaactacaa cctgttcgtg 5460
atggatgagg ctcatttcac cgacccagct agcattgcag caagaggtta catttccaca 5520
aaggtcgagc taggggaggc ggcggcaata ttcatgacag ccaccccacc aggcacttca 5580
gatccattcc cagagtccaa ttcaccaatt tccgacttac agactgagat cccggatcga 5640
gcttggaact ctggatacga atggatcaca gaatacaccg ggaagacggt ttggtttgtg 5700
cctagtgtca agatggggaa tgagattgcc ctttgcctac aacgtgctgg aaagaaagta 5760
gtccaattga acagaaagtc gtacgagacg gagtacccaa aatgtaagaa cgatgattgg 5820
gactttgtta tcacaacaga catatctgaa atgggggcta actttaaggc gagcagggtg 5880
attgacagcc ggaagagtgt gaaaccaacc atcataacag aaggagaagg gagagtgatc 5940
ctgggagaac catctgcagt gacagcagct agtgccgccc agagacgtgg acgtatcggt 6000
agaaatccgt cgcaagttgg tgatgagtac tgttatgggg ggcacacgaa tgaagacgac 6060
tcgaacttcg cccattggac tgaggcacga atcatgctgg acaacatcaa catgccaaac 6120
ggactgatcg ctcaattcta ccaaccagag cgtgagaagg tatataccat ggatggggaa 6180
taccggctca gaggagaaga gagaaaaaac tttctggaac tgttgaggac tgcagatctg 6240
ccagtttggc tggcttacaa ggttgcagcg gctggagtgt cataccacga ccggaggtgg 6300
tgctttgatg gtcctaggac aaacacaatt ttagaagaca acaacgaagt ggaagtcatc 6360
acgaagcttg gtgaaaggaa gattctgagg ccgcgctgga ttgacgccag ggtgtactcg 6420
gatcaccagg cactaaaggc gttcaaggac ttcgcctcgg gaaaacgttc tcagataggg 6480
ctcattgagg ttctgggaaa gatgcctgag cacttcatgg ggaagacatg ggaagcactt 6540
gacaccatgt acgttgtggc cactgcagag aaaggaggaa gagctcacag aatggccctg 6600
gaggaactgc cagatgctct tcagacaatt gccttgattg ccttattgag tgtgatgacc 6660
atgggagtat tcttcctcct catgcagcgg aagggcattg gaaagatagg tttgggaggc 6720
gctgtcttgg gagtcgcgac ctttttctgt tggatggctg aagttccagg aacgaagatc 6780
gccggaatgt tgctgctctc ccttctcttg atgattgtgc taattcctga gccagagaag 6840
caacgttcgc agacagacaa ccagctagcc gtgttcctga tttgtgtcat gacccttgtg 6900
agcgcagtgg cagccaacga gatgggttgg ctagataaga ccaagagtga cataagcagt 6960
ttgtttgggc aaagaattga ggtcaaggag aatttcagca tgggagagtt tcttctggac 7020
ttgaggccgg caacagcctg gtcactgtac gctgtgacaa cagcggtcct cactccactg 7080
ctaaagcatt tgatcacgtc agattacatc aacacctcat tgacctcaat aaacgttcag 7140
gcaagtgcac tattcacact cgcgcgaggc ttccccttcg tcgatgttgg agtgtcggct 7200
ctcctgctag cagccggatg ctggggacaa gtcaccctca ccgttacggt aacagcggca 7260
acactccttt tttgccacta tgcctacatg gttcccggtt ggcaagctga ggcaatgcgc 7320
tcagcccagc ggcggacagc ggccggaatc atgaagaacg ctgtagtgga tggcatcgtg 7380
gccacggacg tcccagaatt agagcgcacc acacccatca tgcagaagaa agttggacag 7440
atcatgctga tcttggtgtc tctagctgca gtagtagtga acccgtctgt gaagacagta 7500
cgagaagccg gaattttgat cacggccgca gcggtgacgc tttgggagaa tggagcaagc 7560
tctgtttgga acgcaacaac tgccatcgga ctctgccaca tcatgcgtgg gggttggttg 7620
tcatgtctat ccataacatg gacactcata aagaacatgg aaaaaccagg actaaaaaga 7680
ggtggggcaa aaggacgcac cttgggagag gtttggaaag aaagactcaa ccagatgaca 7740
aaagaagagt tcactaggta ccgcaaagag gccatcatcg aagtcgatcg ctcagcagca 7800
aaacacgcca ggaaagaagg caatgtcact ggagggcatc cagtctctag gggcacagca 7860
aaactgagat ggctggtcga acggaggttt ctcgaaccgg tcggaaaagt gattgacctt 7920
ggatgtggaa gaggcggttg gtgttactat atggcaaccc aaaaaagagt ccaagaagtc 7980
agagggtaca caaagggcgg tcccggacat gaagagcccc aactagtgca aagttatgga 8040
tggaacattg tcaccatgaa gagtggggtg gatgtgttct acagaccttc tgagtgttgt 8100
gacaccctcc tttgtgacat cggagagtcc tcgtcaagtg ctgaggttga agagcatagg 8160
acgattcggg tccttgaaat ggttgaggac tggctgcacc gagggccaag ggaattttgc 8220
gtgaaggtgc tctgccccta catgccgaaa gtcatagaga agatggagct gctccaacgc 8280
cggtatgggg ggggactggt cagaaaccca ctctcacgga attccacgca cgagatgtat 8340
tgggtgagtc gagcttcagg caatgtggta cattcagtga atatgaccag ccaggtgctc 8400
ctaggaagaa tggaaaaaag gacctggaag ggaccccaat acgaggaaga tgtaaacttg 8460
ggaagtggaa ccagggcggt gggaaaaccc ctgctcaact cagacaccag taaaatcaag 8520
aacaggattg aacgactcag gcgtgagtac agttcgacgt ggcaccacga tgagaaccac 8580
ccatatagaa cctggaacta tcacggcagt tatgatgtga agcccacagg ctccgccagt 8640
tcgctggtca atggagtggt caggctcctc tcaaaaccat gggacaccat cacgaatgtt 8700
accaccatgg ccatgactga cactactccc ttcgggcagc agcgagtgtt caaagagaag 8760
gtggacacga aagctcctga accgccagaa ggagtgaagt acgtgctcaa cgagaccacc 8820
aactggttgt gggcgttttt ggccagagaa aaacgtccca gaatgtgctc tcgagaggaa 8880
ttcataagaa aggtcaacag caatgcagct ttgggtgcca tgtttgaaga gcagaatcaa 8940
tggaggagcg ccagagaggc agttgaagat ccaaaatttt gggagatggt ggatgaggag 9000
cgcgaggcac atctgcgggg ggaatgtcac acttgcattt acaacatgat gggaaagaga 9060
gagaaaaaac ccggagagtt cggaaaggcc aagggaagca gagccatttg gttcatgtgg 9120
ctcggagctc gctttctgga gttcgaggct ctgggttttc tcaatgaaga ccactggctt 9180
ggaagaaaga actcaggagg aggtgtcgag ggcttgggcc tccaaaaact gggttacatc 9240
ctgcgtgaag ttggcacccg gcctgggggc aagatctatg ctgatgacac agctggctgg 9300
gacacccgca tcacgagagc tgacttggaa aatgaagcta aggtgcttga gctgcttgat 9360
ggggaacatc ggcgtcttgc cagggccatc attgagctca cctatcgtca caaagttgtg 9420
aaagtgatgc gcccggctgc tgatggaaga accgtcatgg atgttatctc cagagaagat 9480
cagaggggga gtggacaagt tgtcacctac gccctaaaca ctttcaccaa cctggccgtc 9540
cagctggtga ggatgatgga aggggaagga gtgattggcc cagatgatgt ggagaaactc 9600
acaaaaggga aaggacccaa agtcaggacc tggctgtttg agaatgggga agaaagactc 9660
agccgcatgg ctgtcagtgg agatgactgt gtggtaaagc ccctggacga tcgctttgcc 9720
acctcgctcc acttcctcaa tgctatgtca aaggttcgca aagacatcca agagtggaaa 9780
ccgtcaactg gatggtatga ttggcagcag gttccatttt gctcaaacca tttcactgaa 9840
ttgatcatga aagatggaag aacactggtg gttccatgcc gaggacagga tgaattggta 9900
ggcagagctc gcatatctcc aggggccgga tggaacgtcc gcgacactgc ttgtctggct 9960
aagtcttatg cccagatgtg gctgcttctg tacttccaca gaagagacct gcggctcatg 10020
gccaacgcca tttgctccgc tgtccctgtg aattgggtcc ctaccggaag aaccacgtgg 10080
tccatccatg caggaggaga gtggatgaca acagaggaca tgttggaggt ctggaaccgt 10140
gtttggatag aggagaatga atggatggaa gacaaaaccc cagtggagaa atggagtgac 10200
gtcccatatt caggaaaacg agaggacatc tggtgtggca gcctgattgg cacaagagcc 10260
cgagccacgt gggcagaaaa catccaggtg gctatcaacc aagtcagagc aatcatcgga 10320
gatgagaagt atgtggatta catgagttca ctaaagagat atgaagacac aactttggtt 10380
gaggacacag tactgtagat atttaatcaa ttgtaaatag acaatataag tatgcataaa 10440
agtgtagttt tatagtagta tttagtggtg ttagtgtaaa tagttaagaa aattttgagg 10500
agaaagtcag gccgggaagt tcccgccacc ggaagttgag tagacggtgc tgcctgcgac 10560
tcaaccccag gaggactggg tgaacaaagc cgcgaagtga tccatgtaag ccctcagaac 10620
cgtctcggaa ggaggacccc acatgttgta acttcaaagc ccaatgtcag accacgctac 10680
ggcgtgctac tctgcggaga gtgcagtctg cgatagtgcc ccaggaggac tgggttaaca 10740
aaggcaaacc aacgccccac gcggccctag ccccggtaat ggcgttaacc agggcgaaag 10800
gactagaggt tagaggagac cccgcggttt aaagtgcacg gcccagcctg gctgaagctg 10860
taggtcaggg gaaggactag aggttagtgg agaccccgtg ccacaaaaca ccacaacaaa 10920
acagcatatt gacacctggg atagactagg agatcttctg ctctgcacaa ccagccacac 10980
ggcacagtgc gccgacaatg gtggctggtg gtgcgagaac acaggatct 11029
<210> 2
<211> 2534
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
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cgcagttgga ggagttctgc tcttcctctc cgtgaacgtg cacgctgaca ctgggtgtgc 2640
catagacatc agccggcaag agctgagatg tggaagtgga gtgttcatac acaatgatgt 2700
ggaggcttgg atggaccgat acaagtatta ccctgaaacg ccacaaggcc tagccaagat 2760
cattcagaaa gctcataagg aaggagtgtg cggtctacga tcagtttcca gactggagca 2820
tcaaatgtgg gaagcagtga aggacgagct gaacactctt ttgaaggaga atggtgtgga 2880
ccttagtgtc gtggttgaga aacaggaggg aatgtacaag tcagcaccta aacgcctcac 2940
cgccaccacg gaaaaattgg aaattggctg gaaggcctgg ggaaagagta ttttatttgc 3000
accagaactc gccaacaaca cctttgtggt tgatggtccg gagaccaagg aatgtccgac 3060
tcagaatcgc gcttggaata gcttagaagt ggaggatttt ggatttggtc tcaccagcac 3120
tcggatgttc ctgaaggtca gagagagcaa cacaactgaa tgtgactcga agatcattgg 3180
aacggctgtc aagaacaact tggcgatcca cagtgacctg tcctattgga ttgaaagcag 3240
gctcaatgat acgtggaagc ttgaaagggc agttctgggt gaagtcaaat catgtacgtg 3300
gcctgagacg cataccttgt ggggcgatgg aatccttgag agtgacttga taataccagt 3360
cacactggcg ggaccacgaa gcaatcacaa tcggagacct gggtacaaga cacaaaacca 3420
gggcccatgg gacgaaggcc gggtagagat tgacttcgat tactgcccag gaactacggt 3480
caccctgagt gagagctgcg gacaccgtgg acctgccact cgcaccacca cagagagcgg 3540
aaagttgata acagattggt gctgcaggag ctgcacctta ccaccactgc gctaccaaac 3600
tgacagcggc tgttggtatg gtatggagat cagaccacag agacatgatg aaaagaccct 3660
cgtgcagtca caagtgaatg cttataatgc tgatatgatt gacccttttc agttgggcct 3720
tctggtcgtg ttcttggcca cccaggaggt ccttcgcaag aggtggacag ccaagatcag 3780
catgccagct atactgattg ctctgctagt cctggtgttt gggggcatta cttacactga 3840
tgtgttacgc tatgtcatct tggtgggggc agctttcgca gaatctaatt cgggaggaga 3900
cgtggtacac ttggcgctca tggcgacctt caagatacaa ccagtgttta tggtggcatc 3960
gtttctcaaa gcgagatgga ccaaccagga gaacattttg ttgatgttgg cggctgtttt 4020
ctttcaaatg gcttatcacg atgcccgcca aattctgctc tgggagatcc ctgatgtgtt 4080
gaattcactg gcggtagctt ggatgatact gagagccata acattcacaa cgacatcaaa 4140
cgtggttgtt ccgctgctag ccctgctaac acccgggctg agatgcttga atctggatgt 4200
gtacaggata ctgctgttga tggtcggaat aggcagcttg atcagggaga agaggagtgc 4260
agctgcaaaa aagaaaggag caagtctgct atgcttggct ctagcctcaa caggactttt 4320
caaccccatg atccttgctg ctggactgat tacatgtgat cccaaccgta aacgcggatg 4380
gcccgcaact gaagtgatga cagctgtcgg cctgatgttt gccatcgtcg gagggctggc 4440
agagcttgac attgactcca tggccattcc aatgactatc gcggggctca tgtttgctgc 4500
tttcgtgatt tctgggaaat caacagatat gtggattgag agaacggcgg acatttcctg 4560
ggaaagtgat gcagaaatta caggctcgag cgaaagagtt gatgtgcggc ttgatgatga 4620
tggaaacttc cagctcatga atgatccagg agcaccttgg aagatatgga tgctcagaat 4680
ggtctgtctc gcgattagtg cgtacacccc ctgggcaatc ttgccctcag tagttggatt 4740
ttggataact ctccaataca caaagagagg aggcgtgttg tgggacactc cctcaccaaa 4800
ggagtacaaa aagggggaca cgaccaccgg cgtctacagg atcatgactc gtgggctgct 4860
cggcagttat caagcaggag cgggcgtgat ggttgaaggt gttttccaca ccctttggca 4920
tacaacaaaa ggagccgctt tgatgagcgg agagggccgc ctggacccat actggggcag 4980
tgtcaaggag gatcgacttt gttacggagg accctggaaa ttgcagcaca agtggaacgg 5040
gcaggatgag gtgcagatga ttgtggtgga acctggcaag aacgttaaga acgtccagac 5100
gaaaccaggg gtgttcaaaa cacctgaagg agaaatcggg gccgtgactt tggacttccc 5160
cactggaaca tcaggctcac caatagtgga caaaaacggt gatgtgattg ggctttatgg 5220
caatggagtc ataatgccca acggctcata cataagcgcg atagtgcagg gtgaaaggat 5280
ggatgagcca atcccagccg gattcgaacc tgagatgctg aggaaaaaac agatcactgt 5340
actggatctc catcccggcg ccggtaaaac aaggaggatt ctgccacaga tcatcaaaga 5400
ggccataaac agaagactga gaacagccgt gctagcacca accagggttg tggctgctga 5460
gatggctgaa gcactgagag gactgcccat ccggtaccag acatccgcag tgcccagaga 5520
acataatgga aatgagattg ttgatgtcat gtgtcatgct accctcaccc acaggctgat 5580
gtctcctcac agggtgccga actacaacct gttcgtgatg gatgaggctc atttcaccga 5640
cccagctagc attgcagcaa gaggttacat ttccacaaag gtcgagctag gggaggcggc 5700
ggcaatattc atgacagcca ccccaccagg cacttcagat ccattcccag agtccaattc 5760
accaatttcc gacttacaga ctgagatccc ggatcgagct tggaactctg gatacgaatg 5820
gatcacagaa tacaccggga agacggtttg gtttgtgcct agtgtcaaga tggggaatga 5880
gattgccctt tgcctacaac gtgctggaaa gaaagtagtc caattgaaca gaaagtcgta 5940
cgagacggag tacccaaaat gtaagaacga tgattgggac tttgttatca caacagacat 6000
atctgaaatg ggggctaact ttaaggcgag cagggtgatt gacagccgga agagtgtgaa 6060
accaaccatc ataacagaag gagaagggag agtgatcctg ggagaaccat ctgcagtgac 6120
agcagctagt gccgcccaga gacgtggacg tatcggtaga aatccgtcgc aagttggtga 6180
tgagtactgt tatggggggc acacgaatga agacgactcg aacttcgccc attggactga 6240
ggcacgaatc atgctggaca acatcaacat gccaaacgga ctgatcgctc aattctacca 6300
accagagcgt gagaaggtat ataccatgga tggggaatac cggctcagag gagaagagag 6360
aaaaaacttt ctggaactgt tgaggactgc agatctgcca gtttggctgg cttacaaggt 6420
tgcagcggct ggagtgtcat accacgaccg gaggtggtgc tttgatggtc ctaggacaaa 6480
cacaatttta gaagacaaca acgaagtgga agtcatcacg aagcttggtg aaaggaagat 6540
tctgaggccg cgctggattg acgccagggt gtactcggat caccaggcac taaaggcgtt 6600
caaggacttc gcctcgggaa aacgttctca gatagggctc attgaggttc tgggaaagat 6660
gcctgagcac ttcatgggga agacatggga agcacttgac accatgtacg ttgtggccac 6720
tgcagagaaa ggaggaagag ctcacagaat ggccctggag gaactgccag atgctcttca 6780
gacaattgcc ttgattgcct tattgagtgt gatgaccatg ggagtattct tcctcctcat 6840
gcagcggaag ggcattggaa agataggttt gggaggcgct gtcttgggag tcgcgacctt 6900
tttctgttgg atggctgaag ttccaggaac gaagatcgcc ggaatgttgc tgctctccct 6960
tctcttgatg attgtgctaa ttcctgagcc agagaagcaa cgttcgcaga cagacaacca 7020
gctagccgtg ttcctgattt gtgtcatgac ccttgtgagc gcagtggcag ccaacgagat 7080
gggttggcta gataagacca agagtgacat aagcagtttg tttgggcaaa gaattgaggt 7140
caaggagaat ttcagcatgg gagagtttct tctggacttg aggccggcaa cagcctggtc 7200
actgtacgct gtgacaacag cggtcctcac tccactgcta aagcatttga tcacgtcaga 7260
ttacatcaac acctcattga cctcaataaa cgttcaggca agtgcactat tcacactcgc 7320
gcgaggcttc cccttcgtcg atgttggagt gtcggctctc ctgctagcag ccggatgctg 7380
gggacaagtc accctcaccg ttacggtaac agcggcaaca ctcctttttt gccactatgc 7440
ctacatggtt cccggttggc aagctgaggc aatgcgctca gcccagcggc ggacagcggc 7500
cggaatcatg aagaacgctg tagtggatgg catcgtggcc acggacgtcc cagaattaga 7560
gcgcaccaca cccatcatgc agaagaaagt tggacagatc atgctgatct tggtgtctct 7620
agctgcagta gtagtgaacc cgtctgtgaa gacagtacga gaagccggaa ttttgatcac 7680
ggccgcagcg gtgacgcttt gggagaatgg agcaagctct gtttggaacg caacaactgc 7740
catcggactc tgccacatca tgcgtggggg ttggttgtca tgtctatcca taacatggac 7800
actcataaag aacatggaaa aaccaggact aaaaagaggt ggggcaaaag gacgcacctt 7860
gggagaggtt tggaaagaaa gactcaacca gatgacaaaa gaagagttca ctaggtaccg 7920
caaagaggcc atcatcgaag tcgatcgctc agcagcaaaa cacgccagga aagaaggcaa 7980
tgtcactgga gggcatccag tctctagggg cacagcaaaa ctgagatggc tggtcgaacg 8040
gaggtttctc gaaccggtcg gaaaagtgat tgaccttgga tgtggaagag gcggttggtg 8100
ttactatatg gcaacccaaa aaagagtcca agaagtcaga gggtacacaa agggcggtcc 8160
cggacatgaa gagccccaac tagtgcaaag ttatggatgg aacattgtca ccatgaagag 8220
tggggtggat gtgttctaca gaccttctga gtgttgtgac accctccttt gtgacatcgg 8280
agagtcctcg tcaagtgctg aggttgaaga gcataggacg attcgggtcc ttgaaatggt 8340
tgaggactgg ctgcaccgag ggccaaggga attttgcgtg aaggtgctct gcccctacat 8400
gccgaaagtc atagagaaga tggagctgct ccaacgccgg tatggggggg gactggtcag 8460
aaacccactc tcacggaatt ccacgcacga gatgtattgg gtgagtcgag cttcaggcaa 8520
tgtggtacat tcagtgaata tgaccagcca ggtgctccta ggaagaatgg aaaaaaggac 8580
ctggaaggga ccccaatacg aggaagatgt aaacttggga agtggaacca gggcggtggg 8640
aaaacccctg ctcaactcag acaccagtaa aatcaagaac aggattgaac gactcaggcg 8700
tgagtacagt tcgacgtggc accacgatga gaaccaccca tatagaacct ggaactatca 8760
cggcagttat gatgtgaagc ccacaggctc cgccagttcg ctggtcaatg gagtggtcag 8820
gctcctctca aaaccatggg acaccatcac gaatgttacc accatggcca tgactgacac 8880
tactcccttc gggcagcagc gagtgttcaa agagaaggtg gacacgaaag ctcctgaacc 8940
gccagaagga gtgaagtacg tgctcaacga gaccaccaac tggttgtggg cgtttttggc 9000
cagagaaaaa cgtcccagaa tgtgctctcg agaggaattc ataagaaagg tcaacagcaa 9060
tgcagctttg ggtgccatgt ttgaagagca gaatcaatgg aggagcgcca gagaggcagt 9120
tgaagatcca aaattttggg agatggtgga tgaggagcgc gaggcacatc tgcgggggga 9180
atgtcacact tgcatttaca acatgatggg aaagagagag aaaaaacccg gagagttcgg 9240
aaaggccaag ggaagcagag ccatttggtt catgtggctc ggagctcgct ttctggagtt 9300
cgaggctctg ggttttctca atgaagacca ctggcttgga agaaagaact caggaggagg 9360
tgtcgagggc ttgggcctcc aaaaactggg ttacatcctg cgtgaagttg gcacccggcc 9420
tgggggcaag atctatgctg atgacacagc tggctgggac acccgcatca cgagagctga 9480
cttggaaaat gaagctaagg tgcttgagct gcttgatggg gaacatcggc gtcttgccag 9540
ggccatcatt gagctcacct atcgtcacaa agttgtgaaa gtgatgcgcc cggctgctga 9600
tggaagaacc gtcatggatg ttatctccag agaagatcag agggggagtg gacaagttgt 9660
cacctacgcc ctaaacactt tcaccaacct ggccgtccag ctggtgagga tgatggaagg 9720
ggaaggagtg attggcccag atgatgtgga gaaactcaca aaagggaaag gacccaaagt 9780
caggacctgg ctgtttgaga atggggaaga aagactcagc cgcatggctg tcagtggaga 9840
tgactgtgtg gtaaagcccc tggacgatcg ctttgccacc tcgctccact tcctcaatgc 9900
tatgtcaaag gttcgcaaag acatccaaga gtggaaaccg tcaactggat ggtatgattg 9960
gcagcaggtt ccattttgct caaaccattt cactgaattg atcatgaaag atggaagaac 10020
actggtggtt ccatgccgag gacaggatga attggtaggc agagctcgca tatctccagg 10080
ggccggatgg aacgtccgcg acactgcttg tctggctaag tcttatgccc agatgtggct 10140
gcttctgtac ttccacagaa gagacctgcg gctcatggcc aacgccattt gctccgctgt 10200
ccctgtgaat tgggtcccta ccggaagaac cacgtggtcc atccatgcag gaggagagtg 10260
gatgacaaca gaggacatgt tggaggtctg gaaccgtgtt tggatagagg agaatgaatg 10320
gatggaagac aaaaccccag tggagaaatg gagtgacgtc ccatattcag gaaaacgaga 10380
ggacatctgg tgtggcagcc tgattggcac aagagcccga gccacgtggg cagaaaacat 10440
ccaggtggct atcaaccaag tcagagcaat catcggagat gagaagtatg tggattacat 10500
gagttcacta aagagatatg aagacacaac tttggttgag gacacagtac tgtagatatt 10560
taatcaattg taaatagaca atataagtat gcataaaagt gtagttttat agtagtattt 10620
agtggtgtta gtgtaaatag ttaagaaaat tttgaggaga aagtcaggcc gggaagttcc 10680
cgccaccgga agttgagtag acggtgctgc ctgcgactca accccaggag gactgggtga 10740
acaaagccgc gaagtgatcc atgtaagccc tcagaaccgt ctcggaagga ggaccccaca 10800
tgttgtaact tcaaagccca atgtcagacc acgctacggc gtgctactct gcggagagtg 10860
cagtctgcga tagtgcccca ggaggactgg gttaacaaag gcaaaccaac gccccacgcg 10920
gccctagccc cggtaatggc gttaaccagg gcgaaaggac tagaggttag aggagacccc 10980
gcggtttaaa gtgcacggcc cagcctggct gaagctgtag gtcaggggaa ggactagagg 11040
ttagtggaga ccccgtgcca caaaacacca caacaaaaca gcatattgac acctgggata 11100
gactaggaga tcttctgctc tgcacaacca gccacacggc acagtgcgcc gacaatggtg 11160
gctggtggtg cgagaacaca ggatctggat cc 11192

Claims (6)

1.一株西尼罗病毒感染性克隆质粒，其特征在于：含有一株西尼罗病毒全长基因组，在病毒基因组中引入了一个核苷酸点突变，以及长度为133个核苷酸的哺乳动物细胞内含子基因。
2.如权利要求1所述的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：能在大肠杆菌中高效扩增，稳定遗传。
3.如权利要求1所述的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：作为模板转录出病毒基因组RNA，将RNA转染BHK-21细胞，产生西尼罗病毒。
4.如权利要求1所述的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染Vero E6细胞，在细胞内表达病毒蛋白。
5.如权利要求1所述的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，并引起小鼠死亡。
6.如权利要求1所述的一株西尼罗病毒感染性克隆，或基于该感染性克隆构建的突变株在西尼罗病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发中的应用。
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