KR100647892B1 - 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법 - Google Patents

세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100647892B1
KR100647892B1 KR1019990029632A KR19990029632A KR100647892B1 KR 100647892 B1 KR100647892 B1 KR 100647892B1 KR 1019990029632 A KR1019990029632 A KR 1019990029632A KR 19990029632 A KR19990029632 A KR 19990029632A KR 100647892 B1 KR100647892 B1 KR 100647892B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
cells
medium
culturing
cell
Prior art date
Application number
KR1019990029632A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010010642A (ko
Inventor
실바프레르마르코스다
요시다야마무라안나마야
포베스만조지
게렐리카르도
Original Assignee
훈다사오 오스왈도 크루즈-피오크루즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 훈다사오 오스왈도 크루즈-피오크루즈 filed Critical 훈다사오 오스왈도 크루즈-피오크루즈
Priority to KR1019990029632A priority Critical patent/KR100647892B1/ko
Publication of KR20010010642A publication Critical patent/KR20010010642A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100647892B1 publication Critical patent/KR100647892B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 종자 랏(lot)과 백신 생산을 위한 적합한 바이러스를 세포 배양을 통해 세포 단백질이 거의 섞이지 않는 상태를 유지하면서 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
여기서 사용되는 "바이러스"는 잡종(chimeric)바이러스를 포함하는 비활성 바이러스, 독성 약화 바이러스 및 재조합 바이러스를 뜻한다.
본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 과정에 관한 것이다: (a) 바이러스를 수용(permissive)할 수 있고 백신 생산의 기질로 적합한 세포 배양을 준비하는 단계; (b) 적절한 배지에 세포 종자를 낮은 밀도로 부유화하는 단계; (c) 30 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 세포 배양하는 단계; (d) (c)단계의 세포 배양물에서 배지를 제거하고 종자 바이러스로 접종하는 단계; (e) (d)단계의 세포 배양물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (f) 배지를 제거하고 세포를 한번 이상 세척한 후 배지를 대체하는 단계; (g) (f)단계의 세포 배양물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (h) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계; (i) 선택적으로, 적절한 간격을 두고 제거된 배지를 대체한 다음 적절한 기간 동안 재배양해서 배지에 포함되어 있는 바이러스를 여러 번 회수하는 단계; (j) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계; (k) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; (l) 바이러스를 -45℃ 또는 그 이하의 온도에서 저장하는 단계.
세포 배양, 백신

Description

세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법 {Process for the production of virus in cell cultures}
도 1a는 최초의 YF 아시비(Asibi)균주의 가계도와 YF 17D백신 균주와 아균주의 기원을 나타낸 것이며, 도 1b는 YF 감염성 클론 자세대(progeny) 바이러스를 나타낸 것이다.
도 2a는 배양시간에 따른 YF 17D 바이러스 균주 생산율을 나타낸 그래프이며, 도 2b는 배양시간에 따른 인터페론의 유도정도를 나타낸 그래프이며, 도 2c는 배양시간에 따른 신드비스(Sindbis)에 대한 저항정도를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 5시간, 도 3b는 24 시간, 도 3c는 72 시간후의 신드비스 바이러스 활성 상태를 보여주는 사진을 나타낸 것으로, YF 17D 바이러스 균주가 감염된 닭 배(embryo)의 섬유아세포 배양에서 신드비스(Sindbis) 바이러스가 인터페론에 의해 저해되었음을 보여준다. 상기 YF 바이러스를 연속적으로 희석하여 감염하였고 37℃에서 배양한 것이다.
도 4a는 세포에 액티노마이신 D를 전처리 한 경우의 배양시간에 따른 인터페론이 유도되는 정도를 나타낸 그래프이며, 도 4b는 세포에 액티노마이신 D를 전처리 한 경우 배양시간에 따른 YF 17D 바이러스 균주의 생산율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 방법을 사용해서 얻은 플래비바이러스(Flavivirus) 게놈의 원형구조와 잡종 바이러스의 구조를 나타낸 것이다.
본 발명은 세포 배양을 통한 바이러스의 생산방법에 관한 것으로서, 상세하게는 섬유아세포 배양을 통한 플래비바이러스 생산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 닭 배(embryo)의 섬유아세포 배양을 통한 17D 황열병 바이러스의 아균주를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신 생산을 위한 바이러스는 비활성, 독성약화, 그리고 재조합 DNA 기술을 이용한 유전자 조작을 통해 얻을 수 있다.
통상적인 백신은 세포조직 배양 또는 실험동물을 통해 바이러스의 면역성분이 파괴되지 않은 많은 양의 바이러스를 생산하여 얻을 수 있다. 일반적으로, 비활성화된 감염성을 갖고 있거나 살아있는 백신을 사용하기 위해서는 무독성 또는 독성이 약화된 바이러스를 선택하면 된다. 바이러스를 일반적이지 않은 성장 조건 (즉, 다양한 동물 숙주 또는 세포 배양)에 적응시키거나 거대한 바이러스를 세포에 접종해서 여러 번 세대 분화하면 독성을 잃게 되고, 임상 증상이 적게 또는 전혀 나타나지 않는 돌연변이가 생기는데, 이러한 돌연변이가 독성이 약화된 바이러스이다.
세포를 연속적으로 세대 분화시키면 독성이 약화된 백신 바이러스가 돌연변이 또는 도태에 의해 잠재적으로 독성이 있는 표현형으로 역전환 될 수 있다. 일반적으로, 사람에 대해 독성이 약화된 것으로 보이는 최초 바이러스를 한번 세대분화해서 다수의 1차종자 부분 표분(aliquot)을 만드는 종자 랏(lot) 시스템을 사용하여 최초 바이러스의 아개체군(subpopulation)을 생산한다. 이 1차 종자의 하나 이상의 바이러스의 부분표본을 다시 한번 세대분화해서 2차 종자를 생산한다. 이 2차 종자의 하나 이상의 부분표본은 한 배치의 백신 생산에 사용된다. 이런 방법으로 연속적인 세대분화는 제한될 수 있으며 도태 또는 돌연변이의 가능성이 최소화된다. 독성이 약화된 백신 바이러스를 얻기 위해 이런 방법을 사용한 예로는 황열병(YF) 백신 균주가 있다.
도 1a에서는 최초의 YF 아시비 균주의 가계도와 YF 17D 백신 균주 및 아균주의 기원이 서술되어 있다. 쥐(mouse) 태아 조직에서 또는 신경조직이 있거나 없는 잘게 썰은 닭 배(embryo)에서 YF 바이러스 아시비 균주를 부배양한다. 180 세대에서 모체 17D를, 195 세대에서 17DD를, 204 세대에서 17D-204 균주를 생산한다. 17DD 균주는 241세대까지 부차적으로 배양하고, 닭 발육란(embryonated chicken egg)에서 43세대를 더 세대분화하면 284 세대가 되는데, 이것은 오늘날 사람에게 접종하는 백신을 생산하는 배치이다. 상기 17D-204 균주를 닭 발육란(embryonated chicken egg)에서 더 부배양해서 현재 프랑스(I.Pasteur, 235세대), 미국(Connaught, 234세대)에서 사용중인 여러가지 백신 종자 랏을 만드는 콜럼비아 88 균주를 생산한다. WHO는 17D-204로부터 17D- 213 균주를 만들었는데, 독일 연방 공화국(FRG 83-66)의 1차 종자 랏(S1 112-69)을 237 세대인 조류 백혈증 바이러스가 없는 17D 종자(S1 213/77)로 생산하기 위한 것이다. 새로운 17D 아균주는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조하는데, 여기에는 플래비바이러스 게놈 구조 및 표현형에 대해 많은 지식이 요구된다. 황열병 바이러스는 양(positive)으로 꼬인 RNA 바이러스인 플래비비리대(Flaviviridae) 과의 플래비바이러스 속인 원형 바이러스이다. 플래비바이러스는 양(positive)으로 꼬인 RNA 한가닥을 가지며 정이십면체 껍질이 있는 40 ∼ 60nm의 지름의 구형 바이러스이며, 바이러스 복제는 세포질에서 일어난다. YF 바이러스의 RNA 게놈 길이는 10,862 뉴클레오타이드인데, 짧은 5'(118 뉴클레오타이드) 및 3'(511 뉴클레오타이드)의 번역되지 않는 부분, 5'캡(cap) 구조와 폴리아데닐화되어 있지 않은 3'말단을 가지고 있다. 이 한가닥의 RNA는 감염된 세포에서 번역되어 다단백질 전구체로 합성되고, 번역후 가수분해 과정을 거쳐서 바이러스의 특이적인 10개의 폴리펩타이드를 생산한다. 완전한 게놈에 대응하는 상보적인 DNA를 이용하여 RNA 게놈 특정 부분을 조작할 수 있다. Rocaniello와 Baltimore의 선구적 연구[Rocaniello, V.R. 와 Baltimore, D. (1981). "클론 폴리오바이러스의 상보 DNA는 포유동물에 감염될 수 있다." Science. 214:916-919]는 클론 cDNA로부터 바이러스를 생산할 수 있는 가능성을 보여준다. 시험관내 전사계의 발달[Melton, D.A.; Krieg, P.A.: Rabagliati, M.R.; Maniatis, T.; Zinn, K.와 Green, M.R. (1984). "박테리오파아지 SP6 프로모터가 있는 플라스미드로부터 생물학적으로 활성을 가지는 RNA와 RNA 결합 표지물(probe)의 효과적인 시험관내 합성". Nucl. Acids. Res. 12:7035-7056]로 세포내에서 cDNA 전사보다 더 효율적으로 시험관내서 완전한 길이의 바이러스 RNA를 생산할 수 있게 되었다. 배양세포에 RNA를 형질도입할 때, 양이온 리포좀과 일렉트로포레이션(electroporation) 같은 방법을 사용할 수 있게 됨으로써, 더 효과적으로 형질도입을 할 수 있게 되었다. 감염성 cDNA는 양(positive)으로 꼬인 바이러스에서 만들 수 있는데, 이것은 독성이 약화되는 현상을 포함한 다양한 생물학적 현상의 분자적인 기초를 이해하는 데 이용될 수 있다. YF 바이러스에서 처음으로 완전한 길이의 cDNA를 만들었고 1989년에는 배양한 척추동물세포에 시험관내 합성된 RNA를 형질도입해서 바이러스를 제조하였다[Rice 등, 1989].
YF 감염성 클론 바이러스 자손의 기원이 도 1b에 묘사되어 있다. 17D 아균주의 바이러스 RNA가 도 1에 F-204, C-204, 17D-213로 표시되어 있고 여러 그룹에서 백신 17DD의 완전한 염기 서열을 분석하고 발표하였다. 17D-204 아균주인 F-204와 C-204는 각각 다른 세포주에서 용균반으로 분리해냈고, 분리한 바이러스는 SW13 세포에서 증폭하여 이것으로 cDNA 클로닝과 염기서열분석을 하였다. 17D-213과 17DD 바이러스의 RNA는 백신 생산을 위해 선택한 바이러스에서 직접 분리하여 분석한 결과, 백신 바이러스의 독성 약화된 표현형을 나타내는 서열을 가지는 경향을 보인다. YF 감염성 cDNA가 유일하게 C-204 cDNA 라이브러리(library)로부터 얻어낸 것이다[Rice, C.M.; Grakoui, A.;Galler, R.과 Chambers, T.(1989)."시험관내에서 제조한 완전한 길이의 cDNA 주형으로부터 감염성 황열병 RNA로 전사". The New Biologist. 1:285-296]. 그러나, CEF 세포(241세대인 YFiv5.2/SL)에 형질도입하고 발육란에서 한번 세대분화한 바이러스(242세대인 YFiv5.2/VL)는 인간외 영장류에 적당하지 않은 정도의 신경독성을 가진 바이러스이므로, 인간백신 접종에 적당하지 않은 특징을 가지고 있다[Marchevsky,R.S., Mariano,J., Ferreira,V.S., Almeida,E., Cerqueira, M.J., Carvalho,R., Pissurno,J.W., Travassos da Rosa,A.P.A., Simoes,M.C., Santos,C.N.D., Ferreira,I.I., Muylaert,I.R., Mann, G.F., Rice,C.M.과 Galler,R., "상보 DNA로부터 밝혀낸 황열병 바이러스의 표현형 분석", Am.J.Trop.Med.Hyg.,52(1),pp. 75-80, 1995]. 도 1a에 설명되어 있는 17D-213과 17DD 아균주의 염기서열을 비교하여 C-204 바이러스 cDNA를 더 DD에 가깝도록 유전자를 조작 할 수 있다. 이러한 새로운 cDNA는 시험관내 RNA합성에 사용되고, CEF세포에 형질도입하여 241세대의 YFiv5.2/DD인 새로운 종자 바이러스가 생산된다. 본 발명과 같은 브라질 특허 제 PI 9701774호에서 설명한 것과 같이, CEF세포에서 242와 243세대인 1차와 2차 종자를 제조할 수 있다. 요약하면, 효과적이고 안전성을 가진 YF 17D 바이러스의 잘 알려진 백신 성분의 게놈을 조작해서 여러 병원균의 항원을 표현하는 벡터를 생산할 수 있다.
비활성, 독성약화 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 백신 바이러스를 생산하기 위해서는 숙주세포에도 적합해야 한다. 즉, 숙주 세포에서 자율적으로 복제 가능해야 한다. 더구나 많은 양을 생산하기 위해서는 바이러스가 고수율로 자랄수 있는 숙주세포를 사용해야 한다. 인간에게 비경구적으로 살아있는 바이러스 백신을 사용하기 위해서는, 숙주 세포는 외래 물질이 없어야 하고 발암성이 없 고 정상적인 핵상을 가지고 있어야 한다. 이것은 인간 이배체 섬유아세포(MRC-5), 원숭이의 신장(MK), 조류의 배(embryo) 섬유아세포(닭의 배(embryo) 섬유아세포)와 같은 다양한 포유동물 또는 조류 조직으로부터 1차 또는 연속적으로 세포를 배양해서 얻을 수 있다. 이 세포에 바이러스("종자 바이러스")를 감염시키면 바이러스 복제가 이루어진 후 보통 배양배지로 유출된다. 전체 과정에 사용한 조건과 물질들은 유전적 변이, 면역성 상실, 바이러스 비활성, 신경독성, 바이러스 투입에 대한 낮은 생산율과 외부물질에 의해 오염되는 문제점들이 나타나지 않도록 주의해야 한다.
미국특허 제 5,391,491호 및 제 5,550,051호에서는, 최소 0.01 mmol/l 산소농도가 포함되어 있는 배양배지에 바이러스가 포함된 지름이 100 ∼ 1000 ㎛인 조류 배(embryo) 세포 덩어리를 감염시켜서, 특히 플래비바이러스인 진드기 뇌염 바이러스같은 바이러스/바이러스 항원을 생산하는 방법을 제시하고 있다. 상기 과정에서 사용한 세포 덩어리는 최소 ml당 10 mg의 세포덩어리이다. 상기 출원에서는 세포 덩어리 크기와 산소 농도 조절로, 점차적인 세포 용해로 인한 배지의 세포 단백질 오염을 줄이고, 개개의 세포 또는 작은 덩어리를 사용했을 때는 낮았던 바이러스/바이러스 항원의 생산을 증가시킬 수 있다고 설명되어 있다. 표면이 산소와 접하는 2 × 107 세포수/ml 밀도의 큰 스케일의 세포 배양에서 TBE-바이러스/바이러스 항원 생산은 크게 감소되었다.
백신 바이러스 면역성을 보전하기 위해 여러 시도가 행해지고 있다. 미 국특허 제 5,021,347호에서는 백신 바이러스의 면역성분 파괴를 피할수 있는 일본 뇌염 바이러스의 E 단백질을 만드는 재조합 백신 바이러스를 서술하고 있다. 바이러스 감염에 사용하는 동물 배양세포는 백신 바이러스가 자랄 수 있는 세포이다. 상기 특허에 인용된 배양세포의 특정한 예로는 인간 골수육종에서 기원된 TK-143, 인간 양막에서 기원된 FL, 인간 자궁경부암에서 기원된 Hela, 인간 후인두암에서 기원된 KB, 원숭이 신장에서 기원된 CV-1, 원숭이 신장에서 기원된 BSC-1, 토끼 신장에서 기원된 RK13, 쥐 결합 조직에서 기원된 L929, CE(닭 배(embryo)) 세포, CEF(닭 배(embryo)의 섬유아세포)가 있다.
덧붙여서 Marchevsky 등[Marchevsky 등, 1995]은 재조합 YF 백신 바이러스의 종자 생산을 위해서는 인간 백신 생산에 적합한 것으로 보증된 SPF(특정한 병원균이 없는)인 배(embryo)의 섬유아세포(CEF)의 1차 배양 세포가 적합하다고 언급하고 있다.
이러한 상기 과정은 YF, 홍역, 유행성 이하선염, 풍진 같은 백신 바이러스 생산에 적합한 것으로 보증된 SPF-CEF 세포를 사용하는 이점에도 불구하고, 낮은 생산율 때문에 상대적으로 비경제적이다. 정상적으로 사용되는 세포밀도(1 × 106 세포수/cm2)의 CEF에서 생성된 YF 백신 바이러스에서도 그렇다. 각 종자에 대해 값 비싼 신경독성 검사를 해야 하기 때문에 이 조건하에서 필요한 종자 바이러스의 양과 비용은 너무 높다.
바이러스를 최적으로 생산하기 위해서는, 배양온도와 시간, 세포종자 밀도와 바이러스 접종에 관하여 주의깊게 조절되어야 한다. 그외의 여러 요소들이 바이러스 생산율을 결정한다. 예를 들면, 어떤 바이러스는 결함있는 방해 입자를 생산하는데 바이러스를 적게 투입함으로써 피할 수 있다. 어떤 바이러스는 인터페론을 잘 유도하고 인터페론 작용에 대해 민감하다. 생산율은 생산과 감염상실 사이의 균형으로 이루어지므로 사용하는 배양배지에서의 바이러스 안정성은 매우 중요하다.
인터페론이 Isaacs와 Lindemann에 의해 발견된 뒤로[Isaacs, A.와 Lindemann, J.Proc.Roy.Soc.Ser.B.,147:258.1957] 바이러스/세포계에서의 인터페론의 역할이 연구되었다. 인터페론은 항바이러스 성분을 가지고 있는 것으로, 바이러스, 핵산, 또는 항원/유사분열촉진 복합체들에 의해 세포가 자극되면 생산된다.
포유동물 및 조류의 인터페론은 3개의 주요 카테고리인, 알파, 베타, 감마로 나뉘어진다. 알파 인터페론은 백혈구가, 베타 인터페론은 섬유아세포가, 그리고 감마 인터페론은 동종항원, 종양, 유사분열촉진제에 의해 자극된 T 림프구와 자연킬러세포가 생산한다. 바이러스 또는 다른 유도인자가 세포를 자극하면 자극받은 세포는 인터페론을 분비한다. 인터페론의 이름은 기원이 된 세포를 자주 함축하는데, 예로는 감마인터페론은 "면역" 인터페론으로 알려져 있다. 인터페론은 인터페론 민감성 바이러스가 도입된 세포에서 저항을 유도한다. 세포 배양을 통한 바이러스 생산에서 어떤 백신 바이러스, 예를 들면 17D 황열병 백신 바이러스는 인터페론의 좋은 유도인자이면서 그것의 활성에 매우 민감하기 때문에 인 터페론계의 영향으로 낮은 바이러스 생산율을 갖는다.
인터페론은 세포가 바이러스에 대해 저항할 수 있게 하므로 임상적으로 항바이러스 약품이라 할 수 있다.
인터페론은 바이러스에 의해 발생한 병을 가진 인간을 치료할 수 있는 항바이러스적 활성이 장점이라면, 세포에서 바이러스 복제의 저해는 시험관내에서 바이러스를 생산할 때 단점이 된다. 이것은 여러 백신 바이러스 생산에서 낮은 생산율의 주요 원인이 된다.
프랑스 특허 제 2 689 519호에서, 인터페론 베타의 항바이러스 활성을 저해하는 인터페론 베타에 대한 다클론항체가 포함되어 있는 배지에서 병리강화증과 관계가 있는 바이러스로 감염시키는 시험관내 세포배양 과정을 제안한다. 이러한 상기 과정은 항체를 첨가하게 되면 원하는 생산물을 분리해 내기 어려운 단점을 가지기 때문에 백신 바이러스 생산 유용성에 한계를 준다.
따라서, 위에서 제시한 단점을 해결하면서 인터페론을 유도하고 또 이것에 민감한 백신 바이러스를 생산할 수 있는 과정을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 종자 랏(lot)과 백신 생산을 위한 적합한 바이러스를 세포 배양을 통해 세포 단백질이 거의 섞여 있지 않은 상태로 고수율로 생산하는 것에 관한 것이다.
여기서 사용되는 "바이러스"는 잡종(chimeric)바이러스를 포함하여 비활성 바이러스, 독성 약화 바이러스 및 재조합 바이러스를 뜻한다. 그 중에서도, 잡종 바이러스는 어떤 플래비바이러스의 구조 단백질을 적어도 한가지는 암호화하는 핵산 서열과 다른 플래비바이러스의 게놈으로서 그 구조 단백질을 작동할 수 있도록 암호화하는 핵산 서열을 갖는다. 더욱 상세하게는, 상기 잡종 바이러스는 플래비바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 그것을 작동하게 하는 YF 17D 바이러스의 게놈을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 있다.
기존에는 백신의 높은 알(egg) 단백질과 관련된 여러 가지 중요한 문제와 다량 생산의 어려움을 극복하기 위해 닭의 배(embryo)를 사용하는 대신 세포 배양을 하는데, 사용된 종자 바이러스의 양에 비해 바이러스를 매우 적게 생산하는 문제점을 가지고 있다.
본 발명은 종자 랏(lot)과 백신 바이러스의 생산에 대해 타개책을 제시하며, 바이러스에 의해 감염될 세포 종류와 밀도, 바이러스 투입량 및 안정제의 사용 등의 재료 및 조건의 세밀한 조절을 그 특징으로 한다.
본 발명은 하나의 실시 예에서 다음과 같은 단계를 포함하는 과정에 관한 것이다: (a) 바이러스를 수용할 수 있고 백신 생산의 기질로 적합한 세포 배양을 준비하는 단계; (b) 적절한 배지에 세포 종자를 낮은 밀도로 부유화하는 단계; (c) 30 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 세포 배양하는 단계; (d) (c)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 종자 바이러스로 접종하는 단계; (e) (d)단계의 세포 배양 물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (f) 배지를 제거하고 세포를 한번 이상 세척한 후 배지를 대체하는 단계; (g) (f)단계의 세포 배양물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (h) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계; (i) 선택적으로, 적절한 간격을 두고 제거된 배지를 대체한 다음 적절한 기간 동안 재배양해서 배지에 포함되어 있는 바이러스를 여러 번 회수하는 단계; (j) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계; (k) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; (l) 바이러스를 -45℃ 또는 그 이하의 온도에 저장하는 단계.
본 발명은 다른 실시 예에서 다음과 같은 단계를 포함하는 세포배양을 통한 플래비바이러스 백신의 생산과정에 관한 것이다: (a) 바이러스를 수용할 수 있고 백신 생산의 기질로 적합한 세포 배양을 준비하는 단계; (b) 적절한 배지에 세포를 낮은 밀도로 부유화하는 단계; (c) 30 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 세포 배양하는 단계; (d) (c)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 종자 바이러스를 접종하는 단계; (e) (d)단계의 세포 배양물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (f) 배지를 제거하고 세포를 한번 이상의 세척한 후 배지를 대체하는 단계; (g) (f)단계의 세포 배양물을 25 ∼ 40℃에서 적절한 시간 동안 배양하는 단계; (h) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계; (i) 선택적으로, 적절한 간격을 두고, 제거된 배지를 대체한 다음 적절한 기간 동안 재배양해서 배지에 포함되어 있 는 바이러스를 여러 번 회수하는 단계; (j) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계; (k) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; (l) 선택적으로, h,i,j 또는 k단계의 백신 성분을 동결 건조하는 단계. 배지 대체 단계에서 회수된 바이러스에 선택적으로 안정액을 첨가하고 -45 ∼ -196℃ 상태에 저장한다. 백신 생산물에는 숙주 세포 단백질, 예를 들면 닭 단백질은 거의 포함되어 있지 않다(<100 ng/인체 투여량(human dose)).
본 발명은 종자 랏(lot)과 백신 바이러스의 생산에 대해 타개책을 제시하며, 바이러스에 의해 감염될 세포 종류와 밀도, 바이러스 투입량 및 안정제의 사용 등의 재료 및 조건의 세밀한 조절을 그 특징으로 한다.
여러 요소들이 바이러스 생산에 영향을 줄 수 있다. 사용될 백신은 높은 순도를 요구하기 때문에 바이러스 생산증가를 위한 대안 방법에 많은 제한이 있다.
브라질에서 열린 황열병과 뎅그열-17D 균주 도입의 50년[1998년 5월 15-19일에 brazil, Rio de Janeiro]에 관한 국제 심포지움에서 YF 백신 바이러스 생산과정의 개선의 필요성이 논의되었다. Lopes, O.S.,는 YF 17D백신 바이러스 생산에 CEF 세포를 사용했다[Lopes, O.S.,"조직배양에 의한 황열병 백신의 발달". 브라질 연보의 황열병과 뎅그열-17D 균주 도입의 50년에 관한 국제 심포지움에서]. 세포배양을 사용하면 백신의 높은 알(egg) 단백질(∼ 250 ㎍ 닭 단백질/인체 투여량(human dose))과 관련된 여러 가지 중요한 문제와 다량생산의 어려움을 극복할 수 있으므로 닭의 배(embryo)를 사용하는 대신 세포배양을 한다.
상기에서 언급한 문제에 대한 해결책으로 Lopes,O.S.는 CEF 세포를 사용했지 만 사용된 종자 바이러스의 양에 비해 생산량이 매우 적은 것은 해결되어야 할 매우 중요한 숙제로 남아있다. 그러므로 여전히 황열병 백신을 닭 배(embryo)의 바이러스 접종에 의해 생체내에서 생산한다.
바이러스 생산 감소의 원인이 되는 요소를 알아내기 위해 CEF에서의 YF 17D 복제에 대한 연구가 수행되었다. 알아낸 요소들은 다음과 같은 것으로, 결함있는 방해 (defective interfering (DI))입자들, 인터페론의 유도와 작용에 대한 민감도, 세포 종자율의 효과가 있다. 표 1a ∼ 표 1d, 표 2 및 도 2, 도 3은 CEF에서의 YF 17D-213 바이러스에 대한 실험결과이다. 이 YF 17D 아균주는 조류 백혈증 바이러스 복합체가 없고 독성 약화된 표현형과 면역성을 가지며 인간외 영장류와 인간에서의 사용이 WHO에 의해 잘 알려져 있기 때문에 사용했다. 게다가 YF 17D 백신생산을 위해 WHO가 추천한 아균주여서 O.S.Lopes는 세가지의 연속적인 생산 배치에서 비인간 영장물의 독성이 약화된 바이러스를 생산하기 위해 CEF 세포에서 YF 백신 생산에 대한 초기 연구를 위해 사용했다. 그것의 가계도는 도 1에서 나타내고 있다. 대조군으로 여러 번의 복제사이클과 완전한 세포병리를 가지고 있고 인터페론은 생산하지 못하는 것으로 알려진 Vero 세포를 사용한다(표 1d).
Figure 111999008318897-pat00001
Figure 111999008318897-pat00002
Figure 111999008318897-pat00003
Figure 111999008318897-pat00024
표 1a와 도2a에서 보여주듯이, CEF는 배양 2일 후에 17D 바이러스 생산율이 최고가 되고, log10 생산율은 투입된 바이러스의 로그함수와 선형적인 관계가 있다(r=0.968, p<0.01). 바이러스를 10배 적게 투입할 때마다 바이러스 생산율이 0.53 log 감소 된다. 배양 7일 동안 세포병리효과가 전혀 나타나지 않았다.
기대했던대로 Vero 세포는 모든 바이러스 투입에서 바이러스 접종의 log10 농도와 반비례하여 시간에 따라 최고 적정까지 비슷한 생산율을 보인다(표 1d). 3일째에, 생산율은 바이러스 투입양과 직접적인 관계가 있는(r=+0.951, p<0.1) 반면에 5일째에 이 관계는 전환된다(r=-0.974, p<0.05). 가장 적은 바이러스 투입에서조차 CEF에서보다는 Vero 세포에서 바이러스를 200배 더 많이 생산한다. 감염된 모든 Vero 세포배양에서 거의 전체적으로 세포병리적인 효과를 보인다.
양 세포에서 바이러스 생산율은 바이러스를 가장 많이 투입했을 때조차 크게 감소되지 않았다. 높은 바이러스 농도를 사용한 Vero세포에서 다양한 바이러스 분석을 한 결과, 세포 병리학적 효과는 항상 관찰되었고 세포병리가 나타나지 않는 세포는 없다. 투입을 많이 했을 때 생산이 감소되고 세포병리가 나타나지 않는다면, 이것은 결함있는 방해 입자(defective interfering particles;DI's)의 존재를 의미한다. 이것은 DI's가 17D바이러스 복제에서 중요한 역할을 하지 않는다는 명백한 증거가 된다.
그러나, 상기에서도 언급했듯이 17D YF 바이러스는 IF를 잘 유도하고 IF 작 용에 민감하기 때문에 인터페론계는 17D YF 바이러스 복제를 제한하는 주요 기작의 하나이다.
상기에서 논의한 같은 실험에서, 모든 감염된 CEF 세포 배양에서 바이러스 투입(r=0.987, p<0.02)과 직접적으로 관련하여 인터페론이 유도된다(표 1b, 도2b). 접종후 다양한 시간에 IF 민감성 바이러스로 알려진 신드비스가 포함되어 있는 CEF에 17D YF의 감염은 3일째때 모든 배양이 전체적으로 저항성을 보이고 2일째에는 가장 적은 바이러스가 투입된 배양을 제외하고 모두 저항성을 보였다(표 1c, 도 2c와 3). 그래서, 인터페론의 유도와 활성에 대한 민감성은 CEF에서의 바이러스 생산율에 영향을 미치는 주요한 요소라고 결론 내릴 수 있다.
시험된 모든 YF 17D 아균주(DD, 5.2/VL와 5.2/DD)는 인터페론 유도와 민감성에 대하여 상기에서 논의한 17D-213 바이러스와 같은 반응을 보였다.
이러한 상기 결과는 인터페론계를 피하기 위해 특정한 조건에 따라 세포를 바이러스로 감염시킬 필요성을 증명하고 있다. 인터페론 저해제의 사용은 바이러스 생산율을 증가시키기 위한 해결책이 될 수 있다. 그러나, 지금까지 알려wu 있는 것들은 불완전한 인터페론 저해제이거나 세포에 유독할 수 있고 백신의 첨가물질로서 적합하지 않다. 이 점에서 최근의 연구는 DNA 의존 RNA 합성에 대한 비가역성 저해제인 액티노마이신 D는 인터페론 반응을 방해하고 복제회로를 도우므로 YF 바이러스 생산을 증가시킨다고 보여진다. 도 4는 액티노마이신 D를 세포에 전처리하고 17D YF 바이러스로 감염시켰을 때의 영향을 보여준다. 이 과정은 대조군 배양에 비해 바이러스 생산을 증가시켰다. 인터페론 생성 저 해로 인한 이러한 결과는, 낮은 생산율은 인터페론계로 인한 것이라는 것을 확신할 수 있다. 그러나, 액티노마이신 D는 비교적 세포에 유독하고 백신의 첨가물로서 적합하지 않다.
그러므로, 인터페론계 유도를 극복하기 위해 마지막으로 조사한 것은 바이러스 감염시의 세포밀도이다.
CEF에서 17DD YF 바이러스 생산시 세포종자밀도 영향을 알아보기 위한 실험의 결과는 표 2에 제시되었다.
Figure 111999008318897-pat00005
상기 결과는 log10 바이러스 생산율은 3 × 104 ∼ 2 × 105 세포수/cm 2 범위의 세포 log10 농도(r=0.994, p<0.001)에 선형적으로 반비례한다는 것을 명백히 증명 하고 있다. 이 범위에서 ml당 바이러스 생산율에서 2.2 log10 증가는 세포 농도가 log10 만큼 감소된다. 3 × 104 세포수/cm2 일 때 ml당 최고 생산을 얻을 수 있고, 세포 당 생산율은 2 × 105 세포/cm2 에서 얻은 것보다 251 pfu/세포 또는 481배 더 높다. 이러한 결과는 ml당 감염 바이러스 생산율과 세포 당 생산율이 세포종자밀도와 반비례한다는 것을 증명하고 있다. 이와 같이 인터페론계를 피하는 방법으로 효과적인 생산이 체계화될 수 있다.
높은 세포 종자밀도에서는 어떤 세포 병리학적인 면도 관찰되지 않은 반면 낮은 밀도에서는 바이러스 생산율이 최고된 1일후에 전체적으로 세포가 죽게 된다. 중간 밀도에서는 부분적으로 세포병리가 관찰된다.
본 발명에 따른 백신 바이러스 생산에서의 주요목표 중의 하나는 2 × 105 세포/cm2 이하의 낮은 밀도로, 1 × 104 ∼ 2 × 105 세포/cm2 이면 좋고 1 × 104 ∼ 1 × 105 세포/cm2 이면 더욱 좋고, 바이러스가 포함되어 있는 세포종자를 뿌리는 일이다.
백신 바이러스 생산에 있어서, 또 다른 중요한 점은 외부 단백질은 인간 백신 성분으로써 적합하지 않기 때문에 배양 배지에 사용되는 물질에 관한 것이다. 예를 들면, 소 태아 혈청 단백질은 면역성의 관점에서 비경구적 생산물로 적합하지 않다. 반면에, 소 태아 혈청(FBS) 없이 세포배양을 하면 예를 들면 CEF에서는 바이러스 생산율이 낮어진다. 실험에서, 17D YF 바이러스 생산율은 혈청이 없을 때 약 100 배 감소된다.
표 3은 혈청이 있을때와 없을 때 YF(17DD 아균주) 바이러스 복제와 신드비스 바이러스에 대해 저항이 유도되는지를 보여주고 있다.
Figure 111999008318897-pat00006
상기 결과는 혈청이 없을 때 바이러스 복제가 잘 되고 인테페론 유도에서는 어떤 중요한 변화도 발생하지 않았다는 것을 증명한다. FBS가 없을때 CEF에서 바이러스가 적게 생산되는 것은 FBS 알부민의 바이러스 안정화 효과를 증명하는 것이다.
본 발명에서는 생산한 바이러스를 안정화하기 위해 비경구 성분으로써 적절한 배지 보충물(예를 들면 인간 혈청 알부민(HSA))을 세포 배양에 첨가해서 바이러스를 많이 생산하였다. 펩타이드, 마미노산, 단백질 같은 비경구성분으로써 적 절한 물질이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 바이러스가 복제가능하고 백신 생산의 기질로 적합한, 특히 플래비바이러스 또는 재조합물이 성장가능하고 적은 세포밀도의 같은 과정이 적용되어 인터페론을 생산하는 세포를 바이러스 감염에 사용한다. 예를 들면, 닭 배(embryo)의 섬유아세포(CEF), 닭 배(embryo)세포(CE), 인간 이배체 섬유아세포(MRC-5), 원숭이 신장 세포, 벵골 원숭이 태아 폐(FRhL) 세포 등과 같은 조류 배(embryo)세포와 포유동물 세포가 있다.
본 발명은 특히 플래비바이러스와 재조합 플래비바이러스의 생산에 적합하다.
본 발명에서는 브라질 특허 제 PI 9701774호에서 제안한 재조합 YF 바이러스를 생산할 것이고, 조류 배(embryo) 섬유아세포를 구성하는 생물량, 특히 SPF(특정 병균이 없는)인 닭 배(embryo) 섬유아세포를 보증한다. 상기 브라질 특허 제 PI 9701774호는 다음에 참증으로써 언급된다.
다양한 17D 바이러스 아균주를 사용하여 여기에 서술되어 있는 YF 17D 백신 생산과정을 체계화한다. 감염 클론 기술의 클론된 상보 cDNA를 이용하여 만든 17D 아균주 또는 재조합 바이러스를 더 많이 분화시켜서 17D 바이러스 자손을 얻을 수 있다.
다른 재조합 YF 17D 바이러스는 다음과 같다:
1) 본 발명의 방법을 사용하여 번식한 후의 백신 제조를 위한 잡종 바이러스로서 플래비바이러스의 구조단백질을 적어도 하나를 암호화하는 핵산서열(도 5의 흰 부분)과 그것을 작동하게 하는 염기서열(도 5의 검은 부분)로 구성된 게놈을 가진다. YF 17D 염기 서열의 출처는 플라스미드 pYF5'3'IV/G1/2와 pYFM5.2/T3/27 또는 YF 17D 바이러스 게놈 서열을 가지는 플라스미드이다.
도 5의 윗쪽은 플래비바이러스 게놈의 원형구조이다. 5'말단으로부터 암호화되는 단백질의 순서는 다음과 같다:C, prM/M, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5. 첫 3개의 단백질은 RNA 분자를 포장하여 바이러스를 형성하는 구조 단백질, 즉 캡시드 (C, 12 ∼ 14 kDa), 막(M과 이것의 전구체 prM, 18 ∼ 22 kDa), 게놈의 1/4을 암호화하는 덮개(envelope)(E,52 ∼ 54 kDa)로 이루어져 있다. 나머지 게놈은 1부터 5까지의 합성 순서로 명명한 비구조 단백질(NS)을 암호화한다. 플래비바이러스의 3개의 큰 비구조 단백질인 NS1 (38 ∼ 41kDa),NS3(68 ∼ 70kDa)과 NS5(100 ∼ 103kDa)는 크게 보존된 서열이다. NS1의 역할은 아직 알려지지 않았으나 NS3는 2가지 기능을 가지는데 세포단백질 가수분해효소의 활성화되질 않을 자리에 대한 다단백질 공정에 필요한 단백질 가수분해 활성과 바이러스 RNA 복제에 관여하는 염기 삼인산화효소/헬리카아제 활성이다. 가장 크고 가장 많이 보존된 단백질인 NS5는 바이러스 RNA 중합효소의 공통된 부분이라고 여기는 여러 개의 염기서열 모티프를 가진다. 4개의 작은 단백질인 NS2A, NS2B, NS4A와 NS4B의 아미노산서열에서는 보존성이 거의 없으나 다수의 소수성 모양에서는 잘 보존되어 있다. NS2A는 NS1의 적당한 공정에 참여하는 반면 NS2B는 NS3 그 자체를 공정하는 NS3의 가수분해 활성과 NS4B 생산에 관여한다. 바이러스 RNA 합성은 RER(조면 소포체)이 관여하는 세포질에서 일어나기 때문에 소수성 단백질은 막에 박혀있고 단백질-단백질 상호작용을 통해 NS3와 NS5는 함께 바이러스 복제 복합체를 이루는 것으로 가정된다. 단편의 5'(118 염기들)와 3'(511 염기들)의 번역되지 않는 부분은 플래비바이러스의 보존된 염기서열부분과 음과 양으로 꼬인 RNA 가닥 복제와 양으로 꼬인 RNA 가닥 포장에 관여할 것이라고 여기는 염기 서열 요소를 포함한다. 잡종 플래비바이러스는 도 5의 아래에서 두 번째 부분에 설명되어 있는 것처럼 하나의 플래비바이러스의 덮개 E 단백질, prM-E 또는 E하나만으로 된 캡시드 C와 두 번째 플래비바이러스의 나머지를 포함한다. YF를 포함한 어떤 2개의 플래비바이러스 C의 카르복실 말단(마지막 20개 아미노산)에 있는 바이러스 단백질가수분해효소의 절단 부분 또는 신호효소 절단 부분에서 prM 단백질과 융합된다. 클론 cDNA 박테리아 플라스미드인 바이러스 게놈의 첫 번째 염기의 근접한 염기는 캡이 있는 감염성 RNA 전사의 시험관내 합성을 효과적으로 하게 하는 박테리오파아지 중합효소 프로모터 서열(SP6, T7 또는 T3)이다. 이것들을 차례로 배양세포에 RNA 형질도입하여 생산한다.
2) YF 17D 바이러스 게놈의 구조 또는 비구조 단백질 유전자 또는 암호화하지 않는 부분에 다른 병원균의 한정된 에피토프, 단백질 일부 또는 전체 단백질을 끼워 넣어 표현되며, 체액 또는 세포성 면역 반응의 특정한 점과 관련을 가져 병에 대한 백신으로서 사용될 수 있는 바이러스.
3) 다른 병원균 게놈 RNA의 일정한 에피토프, 단백질 일부 또는 전체 단백질을 표현하는 YF 17D 바이러스로, 체액 또는 세포성 면역 반응의 특정한 점과 관련을 가져 병에 대한 백신으로서 사용될 수 있는 바이러스.
상기의 모든 경우(1-3)에 재조합 바이러스는 YF 17D의 게놈을 모두는 아니지만 여전히 대부분을 포함하고 숙주세포에서 바이러스 복제에 대한 모든 주요한 단계는 원래의 17D 바이러스와 같다. 이 단계에는 세포질 복제, 바이러스 RNA 합성(양과 음으로 꼬인 가닥)에서 YF 17D 바이러스 단백질의 참가, 다단백질 공정, RNA를 포장하는 캡시드 형성, 바이러스 조합과 발아가 있다. 감염 생산에 있어서 모든 주요한 점은 유전자 조작 정도와 관계없이 이루어지기 때문에, 여기에 서술되어 있는 방법이 그대로 적용될 것이다.
그러므로, 본 발명의 하나의 실시예에서는, 우수제조규범(GMP)에 따라 인간 백신 생산에 적합한 보증된 세포에 바이러스를 감염시킨 뒤, 회복시켜서 YF 백신 바이러스가 생산된다.
본 발명의 더 좋은 실시예에서는, 인간 백신 생산에 적합한 것으로 보증된 세포인 닭 배(embryo) 섬유아세포(CEF)의 1 차 배양이 바이러스 번식을 위한 모든 생성 단계에서 사용된다. 여러 S.O.Ps.(기본작동과정)에 서술되어 있는 WHO 지침에 따라 세포는 사용되고 준비된다. 특히 YF 바이러스의 경우에, 낮은 생산율을 가지지만 원숭이에 대한 신경 독성을 포함한 모든 검사를 거친, CEF 배양을 통해 생산된 3가지 실험 백신이 있다.
SPF(특정 병원균이 없는)인 알(egg)을 사용한 닭 배(embryo) 섬유아세포(CEF)의 1차 배양에서 바이러스를 생산한다. 닭 배 섬유아세포(CEF) 배양은 예를 들면 단층, 현탁액에, 적당한 생반응물에, 미소운반물에 흡수되는 여러 형태로 이루어질 수 있다. CEF 세포 준비는 문헌에 기술되어 있다. 세 포는 적당한 배지에서 배양되고 후에 감염된다. 배양후 원심분리 또는 필터를 거쳐서 세포 찌꺼기를 제거함으로써 바이러스는 회복된다. 문헌에 기술되어 있는 것처럼, 바이러스가 포함되어 있는 상층액에 안정액을 첨가함으로써 얼리고, 푸는 일련의 조작을 하는 동안의 바이러스 감염의 안정성을 증가시킨다. 바이러스는 -45℃ 이하의 온도에서 저장한다.
이하 본 발명이 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 단층의 닭 배(embryo) 섬유아(CEF)세포 배양을 통해, 플라비 바이러스, 특히 17D 황열병 바이러스 생산.
(1) SPF 닭 배(embryo) 조직에 효소처리를 해서 세포현탁액을 만들었다(Day 0);
(2) 세포를 적당한 배지에 풀어 회복한 다음, 104 ∼ 105.3 세포수/cm2 에 적당한 0.1 ∼ 1.2 ml/cm2 크기인 단층 배양관 (플라스크, 둥근 병, 다층 증식기/반응기 등)에 종자를 뿌렸다;
(3) 30 ∼ 40℃에서 12 ∼ 72 시간동안 배양했다;
(4) 배지를 제거하고 바이러스를 적당하고 적은 부피의 배지에 세포당 0.2 ∼ 0.0001 감염단위(CCID50, LD50, pfu)로 첨가했다;
(5) 20 ∼ 40℃에서 0.5 ∼ 4 시간동안 바이러스가 부착되었다(Day 1);
(6) 종자를 제거하거나 제거하지 않고 적당한 배지를 0.1 ∼ 1.0 ml/cm2 만큼 첨가하고 다시 15 ∼ 30 시간동안 30 ∼ 40℃에서 배양했다;
(7) 배지를 제거하고 한번 이상 씻어주고 혈청이 없는 배지로 대체했다;
(8) 30 ∼40℃에서 다시 배양했다(Day2); 적당한 배양시간 후(37℃에서 접종후 36 ∼ 72시간), 바이러스가 포함된 배지를 걷어들였다(Day3);
(9) 바이러스를 -45 ∼ -196℃에 저장했다.
원하는 시간간격으로 배지를 전체적 또는 부분적으로 제거함으로써 배지에 포함되어 있는 바이러스를 걷어들였다.
실시예 2 : 알부민의 바이러스 안정화 효과의 증명.
상기 실시예 1 과정에 있어서 6, 7, 9단계의 배지에 인간 혈청 알부민 0.01 ∼ 10 ㎍/ml을 첨가했다. 표 4와 5는 그 결과를 보여줬다.
Figure 111999008318897-pat00007
이 결과는 근사치이기 하지만 0.03125% w/v HSA는 바이러스 감염성을 보호하기에는 불충분하다는 강력한 증거이다. 0.0625 ∼ 0.2500% w/v 알부민이 있을 때, 평균 손실 비율은 반감기가 2시간일때와 같은 시간당 0.15 log10이다.
Figure 111999008318897-pat00008
표 5에서 보여주듯이, 0.06%와 0.2% w/v 존재시 48시간에서 최고 적정이 관찰되었다. 세포당 생산율은 100 pfu/세포 범위에서 크게 만족스러웠다. 적합한 백신 성분인 HSA가 바이러스 생산을 잘 할 수 있게 한다는 것은 확실하다. 샘플을 안정액으로 1/2 희석하고(0.3 log10) 전체 닭 배(embryo)에 감염해서 생산된 최종 생산물인 바이러스를 조절하기 위해 사용된 것보다 0.2 ∼ 0.3 log10 덜 민감한 시스템에서 분석되었기 때문에 값이 객관적으로 높다. 이것을 기초로 하여, 표 4와 5에서 보여준 적정으로 log10 pfu/ml은 7.0이 되고 전체 닭 배(embryo)의 백신 생산에서 얻어진 것과 같다.
실시예 3 : 인간 백신 생산에 적합한 것으로 보증된 세포를 감염시켜서 우수제조규범(GMP)을 통해 플라비바이러스, 특히 17D 황열병 바이러스의 생산.
각각 표면 면적이 680 cm2인 전체 21개의 둥근 병을 각각의 배치를 위해 사용했다. WTO 지침은 플라스크의 10% 또는 500 ml 최소부피의 배양이 대조군으로 사용되기를 요구한다. 이 목적을 위해 175 cm2 표면적의 7 개 플라스크를 각 배치에서 사용했다.
각 랏(lot)의 생산은 실시예 1에서 설명한 것과 같은 과정에 의해 수행되었다.
SPF(특정 병원균이 없는)인 알(egg)로부터 얻은 1차 CEF 세포를 모든 랏(lot)에서 사용했고, 종자 바이러스 17DD-LOT 107/84를 모든 세포에 접종했다.
원심분리 튜브에 있는 3개의 롤러(roller)의 배지를 풀고 낮은 속도로 회전시켜서 세포 찌꺼기를 제거함으로써 바이러스를 얻는다. 1:1 비율로 안정제가 포함된 플라스크에서 상층액을 제거하고 에탄올 드라이 아이스 상태에서 회전시키면서 천천히 얼린다. 모든 바이러스는 실시예 1에서 설명한 것과 같이 저장한다.
생산 데이타는 아래 표 6에 보여준다.
Figure 111999008318897-pat00009
각 랏(lot)은 만족스러운 결과를 위해 무균상태, 잠재성 그리고 외부 작용물이 있는지 검사했다.
실시예 4 : 잡종 바이러스를 포함한 재조합 YF 바이러스 제조.
브라질 특허 제 PI 9701774호의 YF 17D 바이러스는 플라스미드 pYF5'3'IV/GI/2와 pYFM5.2/T3/27로부터 생산했고 여기 이후부터는 YFiv5.2/DD로 명명될 것이다. 플라스미드 pYF5'3'IV/GI/2와 pYFM5.2/T3/27는 미국형 균주 수집(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있고 각각 ATCC 허가 번호가 97771과 97772이다.
a) RNA 형질도입(transfection);
CEF 세포의 형질도입에 리포펙트아민(LipofectAMINE?? ; Life Technologiess catalogue # 18324-012)을 사용했다. RNase가 없는 PBS 용액에 20 ug/ml 농도로 다양이온 지질 2,3-디오라이록시-N-[2(스퍼미네칼복시아미도)에틸]-N-N,디메틸-2,3-bis(9-옥타디세니록시)-1-로판아미니움 트리플루오로 아세테이트(polycationic lipid 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxiamido)ethyl]-N-N-
dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy)-1-ropanaminium trifluoro acetate)와 멸균한 물에 녹아 있는 중성 디오라이일포스페티딜 에타놀아민(DOPE)(neutral dioleoylphosphatidyl ethanolamine(DOPE))을 3:1(w/w) 조성으로 해서 리포좀을 만들었다. PBS(phosphate buffered saline)를 만든 뒤 121℃에서 20분동안 가열증압해서 멸균하였다. PBS가 포함되어 있는 5ml 폴리스티렌에 리포펙트아민(LipofectAMINE??)을 첨가했다. 1차 CEF 세포를 뿌리고 24시간 후에 사용했다.
전사 혼합물이 세포배양액에 첨가되었다. 세포를 상온에서 20분동안 배양한 후 혼합액을 제거하고 PBS로 씻은 뒤 199배지에서 72시간동안 배양했다.
안정액이 첨가된 배양 상층액은 바이러스 원종을 구성한다. 바이러스 원종은 무균성, 독성, 잠재성 그리고 외부 작용물의 유무를 검사했다. 이것이 최초 종자 랏(lot)이다.
RNA를 연속적으로 희석하여 Vero 세포에 도입하고 이것을 반고체인 배지에 뿌리는 실험을 통해 전사의 특이적 감염성을 알아낼 수 있다. 크리스탈 바이올 렛으로 염색한 후 용균반을 세고 260nm에서 OD(광학농도)를 재서 RNA 양을 알아내면 전사의 특이적 감염성(PFU/ug 전체 RNA)을 결정할 수 있다. 이것으로 최초 원종의 감염 다양성에 대해 체계를 세울 수 있다. 적은 RNA투입 때문에 생긴 높은 수의 복제회로를 가진 바이러스 게놈의 돌연변이 축적 가능성을 줄이기 위해, 살아있는 바이러스의 감염과 동등한 적합한 수를 적용하면 된다.
b) 종자 랏(lot)의 생산
SPF(특정 병원균이 없는)인 알(egg)을 사용해서 CEF 세포의 1차 배양을 했다. 원심분리 용기에 있는 각 플라스크의 상층액을 풀어서 낮은 속도에서 회전시켜 세포찌꺼기를 제거해서 바이러스를 준비했다. 상층액은 1:1 비율로 안정액이 들어있는 플라스크에서 일정액이 제거되고 에탄올 드라이 아이스상태에서 회전시켜서 천천히 얼렸다. 모든 바이러스는 상기에 지시된 방법에 의해 저장했다.
b.1) 최초 종자 랏(lot)의 생산
CEF 1차 배양의 여러 배치에서 다양한 날 동안 수행된 3개의 분리된 전사/형질도입 실험으로 얻은 물질이 최초 종자 랏(lot)이다.
1차 닭 배(embryo)의 섬유아세포를 뿌려줬다. 3개의 175cm2 T-플라스크에서, CEF 세포에 시험관내에서 전사된 RNA를 리포펙트아민(LipofectAmine??)을 사 용하여 형질도입했다. 각 T-플라스크에는 80ml의 배양 상층액이 들어있다. 각각 다른 날에 형질도입을 3번 수행해서 종자 랏을 위한 다음과 같은 최초 다양한 CEF 세포를 생산했다: T1,104.66(4,66 log10 pfu/ml); T2,104.87(4,87 log 10 pfu/ml); T3,105.46(5,46 log10 pfu/ml). 각 랏(lot)은 480ml의 최초 바이러스를 제공한다. 80ml은 품질 관리용이고 남은 400 ml은 1차 종자 랏(lot)의 생산에 사용했다.
b.2) 1 차 종자 랏(lot)의 생산
2개의 1차 종자 랏(lot)을 LP1과 LP2라고 명명했다. LP1은 최초 종자 랏(lot) T3에서 얻어진 것이고 LP2는 T2로부터 얻었다. 각각은 무균성, 잠재성 그리고 외부작용물이 있는지 검사하였다.
얻어진 부피와 적정 농도는 다음 표 7과 같다.
Figure 111999008318897-pat00023
b.3) 2차 종자 랏(lot)
생산된 2차 종자는 LS1, LS2, LS3라고 명명했고, LS1과 LS2는 1차종자 LP1에서 얻고 LS3는 LP2로터 얻었다. 각각은 무균성, 잠재성 그리고 외부작용물이 있는지 검사하였다.
얻어진 부피와 적정농도는 다음 표 8과 같다.
Figure 111999008318897-pat00011
이 각각의 종자 랏(lot)은 현재 진행중인 제조 방법(발육란) 또는 세포계(CEF 세포)를 사용하여 거의 50년 동안 적어도 1년에 5천만 용량(doses) 속도로 YF 백신을 충분히 생산할 수 있다.
본 발명은 종자 랏(lot)과 백신 바이러스의 생산에 대해 타개책을 제시하며, 바이러스에 의해 감염될 세포 종류와 밀도, 바이러스 투입량 및 안정제의 사용 등의 재료 및 조건의 세밀한 조절을 그 특징으로 한다.
바이러스 생산 감소의 원인이 되는 요소를 알아내기 위해 CEF에서의 YF 17D 복제에 대한 연구가 수행되었다. 알아낸 요소들은 다음과 같은 것으로, 결함있는 방해 (defective interfering (DI))입자들, 인터페론의 유도와 작용에 대한 민감도, 세포 종자율의 효과가 있다.
본 발명은 ml당 감염 바이러스의 생산과 세포 당 생산이 세포 종자 밀도와 반비례한다는 것을 증명하였고, 이런 식으로 인터페론계를 피하는 방법으로 효과적 으로 바이러스를 생산할 수 있게 되었다. 또한, 본 발명은 생산한 바이러스를 안정화하기 위해 비경구 성분으로써 적절한 배지 보충물(예를 들면, 인간 혈청 알부민(HSA))을 세포 배양에 첨가해서 바이러스를 많이 생산할 수 있게 되었다. 한편, 본 발명은 특히 플래비바이러스와 재조합 플래비바이러스에 관한 것이다. 플래비바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 그것을 작동하게 하는 YF 17D 바이러스의 게놈을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 잡종 바이러스를 제공한다.

Claims (41)

  1. 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양을 통한 플래비바이러스의 생산 방법:
    (a) 백신 생산 기질로 적합하고 바이러스를 감염시켰을 때 인터페론을 생산하는, 닭 배(embryo) 세포 및 포유동물세포로 구성된 군중에서 어느 하나의 세포를 선택하여 배양을 준비하는 단계;
    (b) 상기 세포를 1×104 ~ 2×105 세포수/cm2의 밀도로 배지에 접종시키는 단계;
    (c) (b)단계의 접종된 세포를 30 ∼ 40℃에서 12 ∼ 72 시간 동안 세포 배양하는 단계;
    (d) (c)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 종자 바이러스를 접종하는 단계;
    (e) (d)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 12 ∼ 144 시간 동안 배양하는 단계;
    (f) (e)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 세포를 한번 이상 세척한 후 배지를 대체하는 단계;
    (g) (f)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 12 ∼ 144 시간 동안 배양하는 단계;
    (h) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계;
    (i) 선택적으로, 제거된 배지를 새로운 배지로 대체한 다음 12 ∼ 144 시간 동안 재배양해서 배지에 포함된 바이러스를 여러 번 회수하는 단계;
    (j) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계;
    (k) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; 및
    (l) 바이러스를 -45℃ 또는 그 이하의 온도에서 저장하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 닭 배(embryo)의 섬유아세포(CEF), 닭 배(embryo) 세포(CE), 인간 이배체 섬유아세포(MRC-5), 원숭이 신장 세포 및 벵골원숭이 태아 폐(FRhL) 세포 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 1차적으로 또는 더 많이 세대 분화되는 것임을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항 있어서, 상기 세포 접종 밀도는 1×104 ∼ 1×105 세포수/cm2인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 (e), (g) 및 (i)단계의 세포 배양시간은 12 ∼ 72 시간인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 안정제는 (h)단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 안정제는 인간 혈청 알부민(HSA), 펩타이드, 아미노산 및 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 야생, 독성 약화 또는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 황열병바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 독성 약화된 황열병바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 YF17D 바이러스 균주 또는 이의 아균주인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스의 생산 방법.
  16. 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양을 통한 재조합 바이러스의 생산 방법:
    (a) 백신 생산 기질로 적합하고 바이러스를 감염시켰을 때 인터페론을 생산하는, 닭 배(embryo) 세포 및 포유동물세포로 구성된 군중에서 어느 하나의 세포를 선택하여 배양을 준비하는 단계;
    (b) 상기 세포를 1×104 ~ 2×105 세포수/cm2의 밀도로 배지에 접종시키는 단계;
    (c) 합성 지질 또는 일렉트로포레이션(electroporation)처리로 세포에 핵산을 도입하는 단계;
    (d) (c)단계의 세포를 30 ∼ 40℃에서 12 ∼ 72 시간 동안 세포 배양하는 단계;
    (e) (d)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 종자 바이러스를 접종하는 단계;
    (f) (e)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 12 ∼ 144 시간 동안 배양하는 단계;
    (g) (f)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 세포를 한번 이상 세척한 후 배지를 대체하는 단계;
    (h) (g)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 12 ∼ 144 시간 동안 배양하는 단계;
    (i) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계;
    (j) 선택적으로, 제거된 배지를 새로운 배지로 대체한 다음 12 ∼ 144 시간 동안 재배양해서 배지가 포함하는 바이러스를 여러 번 회수하는 단계;
    (k) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계;
    (l) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; 및
    (m) 바이러스를 -45℃ 또는 그 이하의 온도에서 저장하는 단계.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 닭 배(embryo)의 섬유아세포(CEF), 닭 배(embryo) 세포(CE), 인간 이배체 섬유아세포(MRC-5), 원숭이 신장 세포 및 벵골원숭이 태아 폐(FRhL) 세포 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 1차적으로 또는 더 많이 세대 분화되는 것임을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 세포 접종 밀도는 1×104 ∼ 1×105 세포수/cm2인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  22. 삭제
  23. 제 16 항에 있어서, 상기 (f), (h) 및 (j)단계의 세포 배양시간은 12 ∼ 72 시간인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  24. 제 16 항에 있어서, 상기 안정제는 (i)단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 안정제는 인간 혈청 알부민(HSA), 펩타이드, 아미노산 및 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  26. 제 16 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 플래비바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 황열병바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  28. 제 16 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 플래비바이러스의 적어도 하나의 구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 그것을 작동하게 하는 다른 플래비바이러스의 게놈의 나머지를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 게놈을 갖는 잡종 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 플래비바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 그것을 작동하게 하는 YF 17D 바이러스의 게놈의 나머지를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 잡종 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생산 방법.
  30. 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양을 통한 플래비바이러스 백신의 생산 방법:
    (a) 백신 생산 기질로 적합하고 바이러스를 감염시켰을 때 인터페론을 생산하는, 닭 배(embryo) 세포 및 포유동물세포로 구성된 군중에서 어느 하나의 세포를 선택하여 배양을 준비하는 단계;
    (b) 상기 세포를 1×104 ~ 2×105 세포수/cm2의 밀도로 배지에 접종시키는 단계;
    (c) (b)단계의 접종된 세포를 30 ∼ 40℃에서 12 ∼ 72 시간 동안 세포 배양하는 단계;
    (d) (c)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 종자 바이러스를 접종하는 단계;
    (e) (d)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 16 ∼ 72 시간 동안 배양하는 단계;
    (f) (e)단계의 세포 배양물로부터 배지를 제거하고 세포를 한번 이상 세척한 후 배지를 대체하는 단계;
    (g) (f)단계의 세포를 25 ∼ 40℃에서 16 ∼ 72 시간 동안 배양하는 단계;
    (h) 안정제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 바이러스를 포함하는 배양물 상층액을 전체적 또는 부분적으로 회수하는 단계;
    (i) 선택적으로, 제거된 배지를 새로운 배지로 대체한 다음 16 ∼ 72 시간 동안 재배양해서 배지가 포함하는 바이러스를 여러 번 회수하는 단계;
    (j) 선택적으로, 회수한 바이러스에서 세포 찌꺼기 및 전체 세포를 제거하는 단계;
    (k) 선택적으로, 바이러스를 비활성화시키는 단계; 및
    (l) 선택적으로, (h), (i), (j) 또는 (k)단계의 백신 성분을 동결 건조하는 단계.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 닭 배(embryo)의 섬유아세포(CEF), 닭 배(embryo) 세포(CE), 인간 이배체 섬유아세포(MRC-5), 원숭이 신장 세포 및 벵골원숭이 태아 폐(FRhL) 세포 중에서 선택된 어느 하나 인것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 세포 배양에 사용되는 세포는 1차적으로 또는 더 많이 세대 분화되는 것임을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  33. 삭제
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 세포 접종 밀도는 1×104 ∼ 1×105 세포수/cm2인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  35. 삭제
  36. 제 30 항에 있어서, 상기 안정제는 (h)단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 안정제는 인간 혈청 알부민(HSA), 펩타이드, 아미노산 및 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  38. 제 30 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 야생, 독성 약화 또는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 황열병바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 상기 플래비바이러스는 독성 약화된 황열병바이러스인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
  41. 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 상기 황열병 바이러스는 YF 17D 바이러스 균주 또는 이의 아균주인 것을 특징으로 하는 플래비바이러스 백신의 생산 방법.
KR1019990029632A 1999-07-21 1999-07-21 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법 KR100647892B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990029632A KR100647892B1 (ko) 1999-07-21 1999-07-21 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019990029632A KR100647892B1 (ko) 1999-07-21 1999-07-21 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010010642A KR20010010642A (ko) 2001-02-15
KR100647892B1 true KR100647892B1 (ko) 2006-11-17

Family

ID=37698187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019990029632A KR100647892B1 (ko) 1999-07-21 1999-07-21 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100647892B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100378909B1 (ko) * 1998-03-18 2003-12-18 주식회사 엘지생명과학 사람세포주를이용한풍진백신의생산수율증대방법
KR20200008481A (ko) 2018-07-16 2020-01-28 김영문 식용이 가능한 음료컵

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4211843A (en) 1977-11-30 1980-07-08 L'institut Armand-Frappier Strain of measles virus and process of producing the same
KR19990038070A (ko) * 1997-11-03 1999-06-05 김춘란 약독화된 일본뇌염 바이러스주 및 이를 함유한 백신의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4211843A (en) 1977-11-30 1980-07-08 L'institut Armand-Frappier Strain of measles virus and process of producing the same
KR19990038070A (ko) * 1997-11-03 1999-06-05 김춘란 약독화된 일본뇌염 바이러스주 및 이를 함유한 백신의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010010642A (ko) 2001-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumar et al. Virological and immunological outcomes of coinfections
Kofler et al. Capsid protein C of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence
CN101454022B (zh) 假性感染性黄病毒及其用途
Lee et al. Mechanism of virulence attenuation of glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitis virus and Murray Valley encephalitis virus
Holland et al. Factors involved in the generation and replication of rhabdovirus defective T particles
Borucki et al. La Crosse virus: replication in vertebrate and invertebrate hosts
JP5758632B2 (ja) 蚊において複製不可能な弱毒化組み換えアルファウイルス属及びそれらの使用
TWI414605B (zh) 登革熱血清型１減毒病毒株
JPH06511150A (ja) キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス
CA2564934C (en) Recombinant lentiviral vector for expression of a flaviviridae protein and applications thereof as a vaccine
KR102389908B1 (ko) 백신 내의 뎅기 바이러스 키메라 구조체를 위한 조성물 및 방법
WO2020258757A1 (zh) 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法
Ehrengruber et al. Semliki Forest virus A7 (74) transduces hippocampal neurons and glial cells in a temperature-dependent dual manner
RU2307872C2 (ru) НОВАЯ ПОЛНОРАЗМЕРНАЯ ГЕНОМНАЯ PHK ВИРУСА ЯПОНСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ НЕЕ ИНФЕКЦИОННАЯ кДНК JEV И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
Wege et al. Neurovirulence of murine coronavirus JHM temperature-sensitive mutants in rats
CN101802179A (zh) 双组分基因组黄病毒及其应用
Freire et al. Production of yellow fever 17DD vaccine virus in primary culture of chicken embryo fibroblasts: yields, thermo and genetic stability, attenuation and immunogenicity
KR100647892B1 (ko) 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법
Lee et al. Dengue type 4 live-attenuated vaccine viruses passaged in Vero cells affect genetic stability and dengue-induced hemorrhaging in mice
Lim et al. Long-term cardiac gene expression using a coxsackieviral vector
EP1002054B1 (en) Process for the production of virus in cell cultures
US9388428B2 (en) Compositions and methods related to viruses of the genus Negevirus
JPH05276941A (ja) フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法
Ma et al. Propagations of grouper (Epinephelus sp.) viruses in a new fibroblast-like cell line from orange spotted grouper (E. coioides) brain
Syzdykova et al. Fluorescent tagging the NS1 protein in yellow fever virus: Replication-capable viruses which produce the secretory GFP-NS1 fusion protein

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee