CN101802179A - 双组分基因组黄病毒及其应用 - Google Patents

双组分基因组黄病毒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101802179A
CN101802179A CN200880023471A CN200880023471A CN101802179A CN 101802179 A CN101802179 A CN 101802179A CN 200880023471 A CN200880023471 A CN 200880023471A CN 200880023471 A CN200880023471 A CN 200880023471A CN 101802179 A CN101802179 A CN 101802179A
Authority
CN
China
Prior art keywords
flavivirus
virus
genome
cell
capsid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880023471A
Other languages
English (en)
Inventor
I·V·弗罗洛夫
A·V·舒斯托夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Original Assignee
TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TAXAS SYSTEM, University of, Regents of filed Critical TAXAS SYSTEM, University of, Regents of
Publication of CN101802179A publication Critical patent/CN101802179A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了双组分基因组黄病毒以及繁殖所述病毒的方法。因为所述黄病毒的遗传物质分布在两个基因组之间，所以所述黄病毒是复制缺陷型的，不能引起疾病，但能诱导免疫应答。尽管如此，本文所讨论的复制缺陷黄病毒的设计允许在工业水平上繁殖这类黄病毒。

Description

双组分基因组黄病毒及其应用
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、病毒学和免疫学领域。更具体地讲，本发明提供复制缺陷黄病毒并公开了其作为针对黄病毒相关疾病的疫苗的用途。
相关领域的描述
黄病毒科(Flaviviridae)的黄病毒属(Flavivirus)包含了多种重要的人和动物病原体，包括黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和丙型肝炎病毒。在自然界中，黄病毒在脊椎动物宿主与主要以大量蚊和蜱为代表的各种节肢动物媒介之间循环。该属的近40个成员，分属4个不同抗原复合群(antigenic complex)，都能引起人类疾病。
黄病毒基因组是约12kb的阳性极性单链RNA。它编码单个多肽，所述单个多肽在翻译时或翻译后由细胞蛋白酶和病毒蛋白酶加工为病毒结构蛋白，C、prM/M和E，其形成感染性病毒颗粒；以及非结构蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，其形成病毒基因组复制所需的酶复合物(Lindenbach和Rice，2001)。黄病毒基因组因具有5′甲基鸟苷酸帽子而模拟细胞信使RNA的结构，但又因缺乏3′-端聚(A)序列而不同于细胞RNA模板。
在黄病毒病毒体中，单拷贝病毒基因组RNA被C(衣壳)蛋白包装为核壳，被具有M和E蛋白的嵌入二聚体的脂质被膜包围。尚未完全理解核壳与被膜间相互作用机制，但是看来与例如甲病毒核壳-被膜相互作用相比具有更低特异性，并且来自隶属不同抗原复合群的病毒的衣壳蛋白和被膜蛋白可有效形成黄病毒病毒体(Chambers等，1999；Lorenz等，2002；Monath等，2002)。此外，核壳的存在并非颗粒装配绝对必需的，而且可通过从各种各样载体中仅表达prM和E来达到病毒样颗粒的形成和从细胞中释放出来。这些所谓的亚病毒颗粒(SVP)不含RNA或衣壳蛋白(Mason等，1991)，但具有组成二十面体的含脂质结构的被膜蛋白。含有prM/E的亚病毒颗粒能够诱导有效的免疫应答，从而保护动物以免此后感染具有复制能力的病毒(Konishi和Fujii，2002；Konishi，Fujii和Mason，2001；Konishi等，1992；Qiao等，2004)，DNA(Aberle等，1999；Colombage等，1998；Davis等，2001；Kochel等，1997；Kochel等，2000；Konishi等，2000a；Konishi等，2000b；Phillpotts，Venugopal和Brooks，1996；Schmaljohn等，1997)。由于缺乏核壳包装的复制型RNA，使亚病毒颗粒作为潜在疫苗的应用非常有利，但需要开发新手段，用于大规模生产或递送表达构建体。可根据病毒载体和非病毒载体来设计prM/E表达盒。就病毒载体而言，经常要考虑的是针对所用病毒载体的免疫应答或者是发展而来的、或者是先前已有的。在基于RNA聚合酶II启动子的有效控制之下编码这些基因的基于DNA的盒，看来是优先的。然而，它们在临床实践中的应用仍然有疑问。因此，目前仍然主要还是通过使用灭活疫苗或减毒活疫苗(分别为INV和LAV)来完成针对黄病毒的免疫接种。
近期研究表明，黄病毒结构蛋白对RNA基因组复制而言并非必要。它们可以是完整的，也可以是部分缺失的，并且这样的RNA(复制子)仍可自我复制并且不仅能表达非结构基因、而且还能表达其余结构基因和/或额外的异源基因。例如，可在体外合成缺乏功能性衣壳基因、但具有其它完整结构基因的黄病毒基因组并直接用于免疫接种。它们的复制导致亚病毒颗粒的产生并最终诱导保护性免疫应答。不能引起生产性传播感染的修饰黄病毒的应用是设计安全有效地生产保护性免疫疫苗的一种新手段(Aberle等，2005；Kofler等，2004)。然而，其应用很可能还需要改进将体外合成的RNA递送到允许RNA复制的细胞中的递送方法。这可通过采用完全自然的方式而达到：即通过将这些缺陷基因组包装到由病毒结构蛋白组成的感染性颗粒中。
尽管人们非常关注黄病毒相关疾病和将黄病毒连续扩散到新地区的问题，但是尚未开发出针对这些感染的抗病毒治疗药，而且至今只生产出了非常有限量的批准疫苗。已经批准灭活病毒疫苗(INV)用于预防蜱传脑炎(TBEV)和日本脑炎(JEV)。然而，像其它灭活病毒疫苗一样，这些疫苗效力有限，需要多次接种而且生产成本昂贵。尽管有这些缺陷，但是日本脑炎灭活病毒疫苗和蜱传脑炎灭活病毒疫苗具有良好的安全记录，并且与任何疾病的发生无关。唯一批准的针对黄病毒的减毒活疫苗(LAV)是广泛应用的黄热病病毒(YFV)17D株，该毒株是通过将黄热病病毒野生型Asibi株在鸡胚组织中连续传代开发出来的。尽管这种减毒活疫苗被认为是非常安全有效的，但在受接种者中还是检测到黄热病和不良反应的例子，包括最近在美国新兵招募中出现的例子。
黄病毒反向遗传学系统的发展已经开启了基于这些病毒的合理减毒的新型减毒活疫苗的设计。这种新型疫苗包括基于YFV 17D的嵌合体，其中黄热病病毒prM-E编码基因组片段已被源于异源黄病毒的prM-E盒取代。类似的基于嵌合病毒的方法应用于基于登革热和蜱传脑炎的骨架。在大多数情况下，嵌合黄病毒表现出高度减毒表型，但能诱导有效的保护性免疫应答并且针对随后的病毒感染进行保护，所述病毒的结构蛋白由嵌合体表达。这些嵌合疫苗候选物的免疫接种没有显示出被预先存在的“载体”免疫性预防，其干扰基于其它病毒载体的重组病毒疫苗的效力。
尽管嵌合黄病毒看来提供了相当普遍的生产新疫苗的方法，但是人们仍然关注嵌合体自身可能至少在免疫受损个体中是致病性的问题，或可能会产生致病性嵌合体的问题，因为在制备疫苗所需的这些病毒的繁殖过程中已经检测到突变。
因此，现有技术对于可用于针对黄病毒属的安全、有力和有效的疫苗类型是有缺陷的。本发明满足了本领域长期以来的需求和期望。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，提供了双组分基因组黄病毒。所述黄病毒包含编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、被膜蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白、而不编码黄病毒衣壳蛋白的假性感染性病毒基因组。另外，它也包含编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、衣壳蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白、而不编码黄病毒被膜蛋白的互补基因组。
在本发明的另一个相关实施方案中，提供了感染上述双组分基因组黄病毒的细胞培养系统。
在本发明的又一个相关实施方案中，提供了大规模繁殖双组分基因组黄病毒的方法。所述方法包括用上述双组分基因组黄病毒感染细胞培养系统，所述病毒能在同一细胞中有效复制这两个基因组并释放双组分黄病毒，因而能大规模繁殖双组分基因组黄病毒。
在本发明的另一个相关实施方案中，提供了免疫原性组合物，其包含上述双组分基因组黄病毒、佐剂、药学上可接受的载体或它们的组合。
在本发明的再一个相关实施方案中，提供了保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染的方法。所述方法包括给予受试者免疫有效量的上述免疫原性组合物，其中组合物在受试者体内诱发针对黄病毒的免疫应答，从而保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染。
附图简述
图1A-1C显示将衣壳和prM/E编码缺陷YFV基因组包装到感染性病毒颗粒中。图1A是复制缺陷YFV基因组中5′端序列的示意图。信号肽和跨膜结构域的位置用填黑方框表示。图1B显示含缺陷基因组的病毒颗粒从体外合成RNA共转染的细胞中释放出来。如本文所述，在指定时间点更换培养基并测定滴度。
图2A-2B显示具有复制衣壳特异性序列的YFV的复制。图2A是重组YFV基因组的示意图。密码子优化的衣壳编码序列用灰色标明。导致引入两个移码突变的YF/Cfrs/GFP/C基因组的衣壳中的替代OFR用填黑方框表示。在体外合成RNA转染后72小时评价滴度和CPE的发展。图2B显示对释放重组病毒的分析。将体外合成的RNA转染到细胞中，在指定时间点更换培养基并用噬斑测定来测定病毒滴度。
图3A-3B显示对能有效复制的含YF/C/GFP/C基因组变异体的选择和对适应性突变的鉴定。图3A是YF/C/GFP/C基因组和在有效复制变异体中鉴定出的缺失的示意图。数字表示在衣壳蛋白和GFP蛋白的氨基酸序列中的缺失位置。图3B显示在BHK-21细胞中重建缺失突变体的复制。将体外合成的RNA转染到细胞中，并在指定时间点更换培养基。在本文所述的噬斑测定中测定释放病毒的滴度。虚线表示检测限。
图4A-4C显示编码多蛋白异源基因上游的重组YFV基因组的复制。图4A显示重组基因组和位于GFP基因上游的ORF的序列的示意图。密码子优化的衣壳编码序列用灰色标明。箭头指向GFP编码序列的开始。下排的字母表示在衣壳序列和GFP序列中引入的突变。图4B显示所设计的YFV变异体在BHK-21细胞中的复制。将体外合成的病毒RNA转染到细胞中并在指定时间点更换培养基。在本文所述的噬斑测定中测定释放病毒的滴度。虚线表示检测限。图4C显示在BHK-21细胞中连续传代后，重组YFmut/GFP病毒的滴度。
图5A-5F显示对双组分基因组病毒复制的分析。图5A是在同一细胞中复制期间能反式互补(trans complementation)的YFV衣壳编码基因组和prM/E编码基因组的示意图。密码子优化衣壳编码基因用灰色标明。图5B显示含缺陷基因组的病毒颗粒从体外合成RNA共转染的细胞中释放出来。如本文所述，在指定时间点更换培养基并测定含有每种基因组的感染性病毒颗粒的滴度。图5C显示在MOI为～10感染单位(inf.u)/细胞的传代期间，双组分基因组YFV的复制。如本文所述，在指定时间点更换培养基并测定所释放的含有每种基因组的感染性颗粒的滴度。图5D显示在以不同MOI感染细胞后，双组分基因组YFV的复制。如本文所述，在指定时间点更换培养基并测定所释放的感染性颗粒的滴度。图5E显示感染细胞中这两种缺陷基因组的复制。用双组分基因组YFV，以MOI～1感染单位/细胞来感染BHK-21细胞，在感染后48小时评价基因组的复制。图(a)表示含有复制型YF/Cherry/Cco的细胞；图(b)显示具有复制型YF/GFP/prME基因组的细胞，图(c)是叠加图。图5F显示对从转染不同YFV特异性RNA的细胞中释放出的感染性病毒和VLP的分析。BHK-21细胞用指定RNA转染。在转染后24小时，用无血清培养基更换原培养基，再在24小时后收获。如本文所述，用超速离心沉淀颗粒并在不连续蔗糖梯度上进一步分析。用识别病毒E蛋白的D1-4G2 MAB，通过蛋白质印迹来测定各级分中YFV特异性蛋白质的存在。
图6A-6C显示在包装细胞系中缺乏所有结构基因的YFV复制子的包装。图6A是编码荧光标记Cherry、而非结构蛋白的YFV复制子的示意图。图6B是编码C-prM-E及其新形式的以前描述的VEE复制子的示意图。显示了在利用两种VEEV复制子开发出来的包装细胞系中包装Yfrep/Cherry的滴度。图6C显示含Yfrep/Cherry基因组的感染性病毒颗粒从用指定YF复制子转染的或用下一代同样颗粒感染的含VEErep/GFP-C-prM-E/Pac的细胞中释放出来。如本文中所述，在指定时间点更换培养基并测定所释放的包装复制子的滴度。
图7显示按照高和低MOI，对双组分基因组病毒的所提出的复制策略。在高MOI时，将两个基因组(编码prM/E的PIV基因组和编码衣壳的互补基因组)递送到同一细胞中并产生病毒复制所需的一整套蛋白质。细胞产生双组分基因组病毒，其可进一步按逐级递增的方式传代。在低MOI时，细胞仅接受这两个基因组中的一个，而用PIV感染的那些细胞产生不含遗传物质和核壳的SVP。
发明详述
本发明的目的是开发可用做针对黄病毒相关疾病的预防性疫苗的新型复制缺陷黄病毒。基于这样的考虑，本发明公开了双组分基因组黄病毒，例如黄热病病毒(YFV)，其中黄病毒基因组分别位于两个基因组上。这两个基因组在生产性复制所需的至少一种蛋白质(衣壳或prM/E)的表达上是缺陷型的，但是一旦递送到同一细胞中则彼此的功能可互补。可按照工业水平生产这些复制缺陷黄病毒，作为针对黄病毒感染的疫苗进一步应用，因为它们一旦感染动物时，是感染性的并能进行一轮感染。在这些动物中，感染了仅含基因组中的一个的颗粒的细胞，产生病毒非结构蛋白和一套不完整的结构蛋白。合成prM/E蛋白仅形成缺乏遗传物质、但能起到有效免疫原作用的亚病毒颗粒。因此，这些缺陷黄病毒将会结合灭活疫苗的安全性与减毒活疫苗的功效和可测量性。另外，这些缺陷黄病毒不仅能产生SVP，而且能表达异源蛋白。
迄今为止，黄病毒仍是主要的公众健康难题之一。它们广泛分布于南北两个半球并引起各种各样的人类相关疾病。然而，已生产出针对少数黄病毒感染的安全有效的疫苗。这些疫苗的特征是减毒活疫苗或灭活疫苗。唯一批准的针对黄病毒的减毒活疫苗是广泛应用的黄热病病毒17D株，该毒株是通过将黄热病病毒野生型Asibi株在鸡胚组织中连续传代开发出来的。已经开发出针对JEV、TBEV和YFV的减毒活疫苗，但没有批准生产针对其它黄病毒(例如登革热和WNE)的产品。活疫苗看来比灭活病毒或亚单位疫苗更有效。然而，明显的安全性问题仍需要考虑，因为有回复到致病表型的可能性。灭活疫苗的应用通常需要多次接种，需要生产大量材料并需要大容量设备来繁殖有毒力的病毒，用于制备灭活产品。因此，尽管对于两类黄病毒疫苗已有有希望的候选物，但是没有通用方法用于它们的开发。
黄病毒的区别特征在于被膜蛋白形成所谓亚病毒颗粒(SVP)的能力。可通过含有标准prM/E糖蛋白表达载体的真核细胞、或通过缺失衣壳基因的缺陷黄病毒基因组，有效产生这样的亚病毒颗粒。这些病毒样颗粒缺乏遗传物质和完整核壳，但能起到有效免疫原的作用并能诱导针对随后的复制型黄病毒感染的保护性免疫应答。可将缺乏衣壳编码序列的缺陷黄病毒基因组以RNA形式递送到细胞中或者利用包装细胞系将其包装为感染性病毒颗粒，其中例如由处于亚基因组启动子控制之下编码黄病毒衣壳基因的持续复制的甲病毒复制子反式提供衣壳(capsid is supplied in trans)。一旦在体外和体内感染幼稚细胞(naive cell)，这些假性感染性黄病毒能够复制并产生SVP，但不发生扩散性、生产性感染。因此，它们的应用不会引起疾病的发生，而且它们代表了介于活病毒与灭活病毒之间的有价值的中间体。它们进行一轮感染，诱导有效的免疫应答，并称之为假性感染性病毒(PIV)。
黄病毒反向遗传学系统的发展已经开启了基于这些病毒的合理减毒设计新型减毒活疫苗的机会。这种新型疫苗包括基于黄热病病毒17D的嵌合体，其中黄热病病毒prM-E编码基因组片段已被源于异源黄病毒的prM/E盒取代。这些嵌合黄病毒看来提供了相当普遍的生产新疫苗的方法。然而，人们仍然关注嵌合体自身可能至少在免疫受损个体中是致病性的问题，以及在免疫脊椎动物中复制期间可能会产生致病性嵌合体的问题，或者重组的复制型黄病毒可能会通过蚊或蜱传播的问题。
另一种在疫苗开发中有前途的方向是基于在黄病毒基因组中产生不可修复的缺失，这使得在所接种的宿主中生产性病毒复制效率更低或成为不可能事件。在这后一种情况下，编码整个复制机构、但缺少例如C编码区的病毒基因组可为体内免疫而被递送，其作为能够自我复制的体外合成的RNA。用体外合成的缺陷性RNA基因组进行直接免疫(其明确了在不存在完整病毒复制循环时亚病毒颗粒(SVP)的产生)，已被证明在产生保护性免疫中是安全有效的。然而，因为合成、稳定性和递送的问题，在生产基于RNA的疫苗候选物时可能存在重大障碍。因此，开发黄病毒疫苗的现有方法是基于制备非常安全、但具有有限效力并需要多次免疫接种的灭活病毒疫苗，或者是制备很有可能会回复成为野生型、致病性表型并通过节肢动物媒介传播的减毒活疫苗。
此外，将PIV作为疫苗来使用，需要其大规模生产，而将缺陷基因组包装成感染性病毒体的细胞系的开发证明了这种可能性。PIV可按按逐级递增的方式在包装细胞系中传代，但不能在幼稚细胞中传代。然而，这看来并非其大规模繁殖的唯一方式。本发明黄病毒的生产不需要开发这类细胞系，但本文所述的方法导致有效的PIV生产。另外，本发明的复制缺陷黄病毒不仅使用安全，而且能够按逐级递增的工业规模在组织培养物中复制并表达额外基因。因此，这些黄病毒是复制缺陷型的，而且不能引起人和动物的生产性、扩散性感染。
一般而言，病毒复制所需的遗传物质分隔在彼此能反式互补其缺陷的两个基因组中。它们两者均编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件和一整套非结构蛋白，形成复制酶复合物。因此，这两个RNA基因组能够自我复制；但这两者中的一个编码衣壳但缺失编码被膜蛋白的基因，而另一个则编码被膜基因，却不编码衣壳。
一旦递送到同一细胞中，这两个基因组产生一整套结构蛋白，细胞释放高滴度的含有所述基因组中的每一个的感染性病毒颗粒。在下一次传代时，幼稚细胞可被病毒感染，其MOI允许这两个基因组递送到同一细胞中。这导致生产性复制的发生并释放含所述基因组中的每一个的感染性病毒颗粒。因此，该系统允许按照逐级递增方式繁殖重组病毒。一旦接种到动物体内(其具有非常大量易感细胞)，基因组中的每一个递送到不同细胞中，扩散性感染成为不可能事件，具有编码被膜蛋白的基因组的病毒体感染的细胞，产生非感染性的病毒样颗粒，其缺乏遗传物质、但能起到有效免疫原的作用并能诱导针对随后野生型病毒感染的保护性免疫应答(图7)。
为了促进有效复制和互补，这两个缺陷基因组都需要其后的5′UTR和超过60nt(元件1)的存在，对于大多数黄病毒而言，是以衣壳的氨基端片段为代表的天然蛋白编码序列，或者对于瘟病毒属(pestivirus genus)成员而言是Npro基因。该序列的后面是泛蛋白(ubiquitine)或口蹄疫病毒(FAMDV)特异性2A蛋白酶编码序列，其与衣壳蛋白编码序列或被膜蛋白编码序列融合。这样的融合基因的组合对于两个基因组复制及其等效包装成病毒颗粒而言是必不可少的。
使用编码病毒结构蛋白的人工密码子优化序列避免了两个缺陷病毒基因组之间发生重组的可能性，这样的重组可能潜在导致形成复制型黄病毒。这两个缺陷基因组可用于表达额外基因，并因此起到载体的作用，用于产生针对异源蛋白的免疫应答。可将额外基因克隆到元件1序列与泛蛋白序列或FAMDV 2A蛋白酶序列之间。
如上所述，这些双组分基因组黄病毒在免疫接种上的应用不会导致已接种人群和动物中生产性、扩散性感染的发生。因为人和动物含有大量细胞，所以这些细胞以非常低的感染复数被感染时，就会导致仅感染一个基因组。这样的细胞能够只产生缺乏核壳和任何遗传物质的所谓的病毒样颗粒。这后一类颗粒起到有效免疫原的作用，但不能进行下一轮感染。本文还涵盖了具有反式互补功能的缺陷病毒基因组能表达额外遗传信息并可作为多价疫苗。
具体地讲，本发明使用了黄热病病毒的遗传物质来证明如上所述的方法的功效。就此而言，黄热病病毒的遗传物质分隔在彼此能反式互补其缺陷的两个病毒基因组中。原先设计的缺陷YFV基因组的每一个都编码完整RNA复制机构，但是它们中的一个缺失几乎全部衣壳基因，而另一个的基因组不编码prM/E。为了追寻各基因组在组织培养物中的复制并为了测定感染性颗粒的滴度，基因组编码不同荧光标记即GFP和Cherry。它们在细胞中的表达显示出特定基因组的感染和复制。一旦递送到同一细胞中，YF/GFP/prME和YF/C/Cherry预期产生一整套病毒结构蛋白并且最终包装成感染性病毒体。然而，令人惊奇的是，因为YF/C/Cherry复制的细胞毒性高，建立生产性复制的最初努力不成功。它产生非常高水平的荧光蛋白，但也引起强烈CPE，导致低水平释放感染性病毒颗粒。
为了进一步了解这一现象，设计出编码两拷贝衣壳基因的YFV基因组，其中之一可用于广泛的遗传操纵。该病毒也有显著的细胞毒性并以低滴度复制。在衣壳编码序列修饰之后，强烈显示出细胞毒性的增加是由衣壳蛋白自身引起的(当它不在C-prM-E盒的情况下表达时)，而不是由RNA二级结构的可能变化引起的(图2)。此外，在基因组中具有两拷贝衣壳基因的YF/C/GFP/C病毒可进一步进化和发展适于生长到更高滴度的变异体，同时具有更低水平的CPE发生。迄今为止，YF/C/Cherry或YF/C/GFP/C病毒的YFV衣壳表达对CPE诱导的影响的准确机制仍然不清楚。
对用于更高水平病毒释放的YF/C/GFP/C变异体进行测序，提供了产生能在体内和体外稳定表达额外异源蛋白的修饰感染性病毒的方法。然而，最重要的是，所鉴定的自发缺失代表了将原先设计的复制缺陷YF/C/Cherry病毒基因组修饰成为YF/Cherry/Cco的机会，这具有不同的蛋白质编码策略并能有效的反式互补YF/GFP/prME复制。用这两个基因组的体外合成RNA共转染的细胞产生病毒颗粒，其中这两个编码衣壳或编码prME的基因组以相同浓度存在，并且这种与众不同的病毒可按逐级递增方式在幼稚细胞中进一步传代。
细胞以低MOI感染明显证明了这两个基因组分别包装在不同病毒颗粒中，因此具有含互补功能的两个基因组的这种YFV不能称为分节段基因组病毒(其假定所有基因组片段都包装到同一病毒体中)，但可称之为双组分基因组病毒。同时具有这两个基因组区段、但分别包装的这类病毒先前在植物中已有讨论。这类病毒在免疫上的其它应用会引起对两个基因组之间可能重组的关注，这样的重组可导致形成具有感染性的、完整的可复制病毒。因此，尽管这是不太可能的事情，但是YF/Cherry/C RNA中的衣壳基因以缺乏环化序列的合成的密码子优化形式为代表。在用双组分基因组YFV的多次实验中，都没有检测到具有未分节段基因组的感染性YFV的形成。然而，也许在编码衣壳和prME的自我复制片段中，通过使用不同配对的环化序列，会额外降低重组的可能性。
有趣的是，在并非基于YFV基因组的构建体中对C-prM-E编码策略的修饰，导致完全不编码结构蛋白的YFV载体的包装急剧增加。比起仅表达C-prM-E盒的类似细胞系而言，从持续复制VEErep/GFP-C-prM-E/Pac产生C-GFP-Copt-prM-E的25个氨基酸的细胞系包装YFV复制子的滴度要高得多。包装的YFV复制子不仅释放滴度超过108inf.u/ml，而且在该包装细胞系中传代而不降低滴度。因此，通过克隆结构多蛋白上游的25个衣壳特异性密码子而对C-prM-E编码亚基因组RNA进行的简单修饰，对感染性颗粒的释放具有非常强烈的正面影响，并且可放宽基于YFV的载体递送和表达异源遗传信息的数量。本发明涵盖了所设计的C-prM-E表达的非同寻常的策略导致所翻译结构蛋白的不同区域化，促进感染性病毒体的形成。
总之，上文所讨论的结果表明，来自其它黄病毒的YF PIV(能够进行prM/E表达)、很可能还有PIV，可利用另一复制缺陷型的、产生衣壳的黄病毒基因组在组织培养物中传代(图7)。在同一细胞内复制期间，这两个缺陷基因组产生一整套病毒结构蛋白并有效包装到单独的感染性病毒颗粒中，其特征是双组分基因组病毒。如先前所证明，PIV起到有效免疫原的作用，因此，双组分基因组病毒可用于开发重组黄病毒特异性疫苗(图7)。这些疫苗将会比灭活疫苗更便宜，而且比减毒活疫苗更安全。从具有缺失prM/E基因的YFV基因组表达衣壳，需要5′端序列的额外修饰，并克隆额外的衣壳特异性序列。同样的修饰用于复制型YFV，导致开发出能表达额外遗传信息的病毒。在VEEV复制子中YFV C-prM-E表达盒的修饰用于产生包装细胞系，彻底改进了包装的基于YFV的载体。衣壳编码序列和启动子元件分隔在或者YFV基因组中或者在编码衣壳的复制缺陷型YFV基因组中，提供了独立于环化信号而表达来自异源黄病毒的结构基因的机会，并代表了研究包装过程机制的一种可能方式。
本发明涵盖产生和评价新型RepliVAX构建体，其包括但不限于：
(1)双组分基因组颗粒的产生(包括从已有构建体中去掉报道基因)和测定系统。RepliVAX可用稳定细胞系或在独特的双组分基因组系统中复制。就YFV而言，已经开发出具有两个缺陷基因组的系统，一个编码必需的C基因和红色荧光蛋白(Cherry)，而另一个编码prM蛋白和E蛋白以及绿色荧光蛋白(GFP)。用这两个基因组的体外合成RNA共转染的细胞产生病毒颗粒，其中C编码基因组或prME编码基因组以相同浓度存在，并且该双组分基因组病毒可按逐级递增方式在幼稚细胞中进一步传代，如果MOI超过1inf.u/细胞的话。
为了强化该系统，使这两个YFV基因组(RepliVAX YF和辅助基因组)中的报道基因缺失，使双组分基因组病毒可用于动物试验，并开发细胞系，其可用于定量分析含所述基因组中的每一个的颗粒。本发明在产生WNV中也涵盖类似工作。在体外合成修饰C编码基因组和prM/E编码基因组并转染到Vero细胞中。开发了定量测定含各基因组(编码C或编码prM/E)颗粒的数量的方法，即通过稀释双组分共培养物，然后测定表达C蛋白或表达prM/E蛋白的细胞系中的病灶形成(focus formation)。编码prM/E基因组的RepliVAX颗粒在产生C的细胞中能形成病灶，而且产生C的“辅助”基因组在产生C的细胞系中将会形成病灶。
(2)TBE嵌合体的产生：使用基于TBEV prM/E编码YFV的RepliVAX。自寡核苷酸合成prM/E编码盒，序列经过优化，用于最有效表达，即通过使用来自最有效翻译人mRNA的密码子频率。根据初步数据，prM中的TBEV信号肽被YFV特异性氨基酸序列取代，因为初步实验表明，这样的取代极大地提高了病毒颗粒的产量。这些RepliVAX基因组经过i)评价其产生SVP的能力和ii)包装成TBEV被膜，即通过使用两种包装Vero细胞系，表达基于TBEV衣壳和双组分基因组的包装系统，其中第二缺陷基因组表达密码子优化TBEV C。
除此之外，本发明还涵盖开发转衣壳化(transencapsidation)系统：本发明涵盖开发用于YFV RepliVAX平台的反式包装系统(trans-packaging system)。开发出将RepliVAX YF包装到被膜中的一个通用系统，该系统在感染树突细胞时将会是最有效的，因而在抗原呈递上也是最有效的。这样的包装独立于黄病毒糖蛋白，由RepliVAX基因组编码。这种反式包装系统有望克服因使用DEN糖蛋白和由编码来自不同DEN病毒的被膜糖蛋白的RepliVAX基因组所诱导的免疫应答的差异而导致的无效感染的可能性。
本发明涵盖检查：i)用于最有效感染性颗粒的产生的不同包装策略(包装细胞系与双组分基因组)；ii)源自不同DEN病毒(DEN1和DEN2)的蛋白质；iii)在Vero细胞中大规模产生包装RepliVAX基因组的效率；iv)在随后传代期间DEN盒的稳定性；和v)在RepliVax免疫接种后，在小鼠中诱导针对DEN1和DEN2的免疫应答的效率。
本发明也涵盖将TBEV prM/E编码的RepliVAX YF包装到同源蛋白、YFV蛋白、结构蛋白中。初步数据强烈表明这样的包装是有效的，而且对其进一步开发可能最终会导致开发出通用包装系统，用于编码任何异源prM/E盒的RepliVAX基因组。
本发明涉及双组分基因组黄病毒，所述病毒包含假性感染性病毒基因组和互补基因组，其中假性感染性病毒基因组编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、被膜蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白，而不编码黄病毒衣壳蛋白；互补基因组编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、衣壳蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白，而不编码黄病毒被膜蛋白。另外，假性感染性病毒基因组和互补基因组还必须编码5′UTR和含有RNA复制所必需的环化序列的衣壳蛋白可读框的氨基端片段。此外，假性感染性病毒基因组或互补基因组可包含与被膜蛋白或衣壳蛋白的编码序列融合的泛蛋白或口蹄疫(FAMDV)特异性2A蛋白酶。另外，假性感染性病毒基因组和互补基因组还可包含具有其它病毒、细菌或寄生虫的结构基因的额外遗传物质，其中这些基因的表达诱导针对这些病毒、细菌或寄生虫所导致感染的免疫应答。黄病毒的代表性实例可包括但不限于黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易斯(Saint Louis)脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷(Murray Valley)脑炎病毒、典型猪瘟病毒或丙型肝炎病毒。
本发明也涉及被本文所述的双组分基因组黄病毒感染的细胞培养系统。细胞培养系统的代表性实例可包括但不限于Vero、BHK-21、C7/10或者脊椎动物来源或蚊来源的其它细胞。
本发明还涉及大规模繁殖双组分基因组黄病毒的方法，所述方法包括：用上述双组分基因组黄病毒感染细胞培养系统，所述病毒能在同一细胞中有效复制这两个基因组；并释放双组分基因组黄病毒，因而能大规模繁殖双组分基因组黄病毒。通常，细胞培养系统用双组分基因组黄病毒感染，其感染复数大于1感染单位/细胞。另外，复制缺陷黄病毒是复制缺陷型的，不能引起疾病、感染，但能在体内进行一轮感染。
本发明还涉及免疫原性组合物，所述组合物包含：如上所述的双组分基因组黄病毒、佐剂、药学上可接受的载体或它们的组合。
本发明也涉及保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染的方法，所述方法包括：给予受试者免疫有效量的上述免疫原性组合物，其中组合物在受试者体内诱发针对黄病毒的免疫应答，从而保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染。另外，给予可通过腹膜内、皮内、皮下、肌内、口服或鼻内途径。黄病毒的实例可包括但不限于黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、典型猪瘟病毒或丙型肝炎病毒。
在本权利要求书和/或本说明书中当与术语“包含(包括)”联用时，名词术语前未加数词修饰时既可包括“一个(种)”，也可包括“一个或多个(一种或多种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或一个(种)以上”的含义。本发明的某些实施方案由或基本由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。本发明涵盖本文所述的任何方法或组合物都可以按照本文所述的任何其它方法或组合物来实施。在权利要求书中使用的术语“或”是指“和/或”，除非明确表示是仅指替代或替代是彼此排斥的，尽管本发明所公开的内容支持仅指替代以及“和/或”的定义。
本文所用的术语“免疫有效量”是指因诱导免疫应答而导致疾病或病症症状的改善或医治好的量。本领域技术人员知道，有效量可改善患者或受试者的病症，但可以是并非完全治愈疾病和/或病症。本文所用的“佐剂”定义为当包含在疫苗配方内时，非特异性地增强针对抗原的免疫应答的一种物质。
本文所公开的免疫原性组合物可单独给予或与另一药物、化合物或抗生素联合给予。这样的药物、化合物或抗生素可与本文所公开的免疫原性组合物同时或序贯给予。与免疫原性组合物联用的效果是降低了已知具有针对所治疗疾病的至少最低药理学效果或治疗效果的正常所需的药物、化合物或抗生素剂量。与此同时，降低了药物、化合物或抗生素对正常细胞、组织和器官的毒性，而不降低、改善、消除或以其它方式干扰药物、化合物或抗生素的任何细胞毒性、细胞抑制性、凋亡或其它杀伤性或抑制性疗效。
本文所述的组合物和药物、化合物或抗生素可通过本领域的任何标准方法全身或局部独立给予，例如皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、皮内、肌内、局部、肠道、直肠、鼻腔、含服、阴道或通过吸入喷雾、通过药泵或包含在透皮贴剂或植入物内。本文所述组合物的给药剂型可包含适于本给药方法的常规无毒的、生理上或药学上可接受的载体或溶媒。
本文所述的免疫原性组合物和药物、化合物或抗生素可独立给予一次或多次，以达到、维持或改善疗效。确定剂量或确定免疫原性组合物和药物、化合物或抗生素的适当剂量是包含单个给药剂量还是多个给药剂量是在本领域技术人员的知识范围之内的。
本领域众所周知，对于任何特定患者而言，这类免疫原性组合物的具体剂量水平取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合和接受治疗的具体疾病的严重程度。负责给药的人员将会为每个受试者确定合适剂量。此外，对于人类用药，制剂应当满足FDA生物标准办公室(FDA Office of Biologics standards)所要求的无菌性标准、致热性标准、一般安全性标准和纯度标准。
将本发明的免疫原性组合物给予受试者，应遵循用于治疗细菌感染的给药治疗的一般方案，同时结合考虑免疫原性组合物中各组分的毒性(如果有的话)，和/或在联合治疗的实施方案中，还要考虑抗生素的毒性。必要时，预期治疗周期可重复进行。本发明还涵盖的是各种标准治疗以及手术干预可与所述治疗联用。
本领域技术人员知道，本文所述的免疫原性组合物可与任何已知药理学上可接受的载体联用。另外，免疫原性组合物可通过任何已知给药途径给予，例如皮下、鼻内或粘膜途径。此外，可通过本领域技术人员已知的实验来确定所给予组合物的剂量。
下述实施例是为了说明本发明的不同实施方式而给出，不意味着以任何方式限制本发明。本领域技术人员将会容易地理解到本发明可适当地用于实现发明目的并获得提到的结果和优势，以及本发明固有的目的、结果和优势。本领域技术人员可以想到包含在如权利要求范围所限定的本发明精神之内的改变和其它用途。
实施例1
细胞培养
BHK-21细胞由Paul Olivo(Washington University，St.Louis，Mo)提供。它们在37℃下保持在补充了10％胎牛血清(FBS)和维生素的α极限必需培养基(αMEM)中。
实施例2
质粒构建体
对于所有质粒构建，都使用标准重组DNA技术。描述了含有YFV17D株基因组感染性cDNA的亲代低拷贝数质粒pACNR/FLYF-17Dx(Bredenbeek等，2003)，该质粒由Charles Rice博士(RockefellerUniversity，New York)提供。
pYF/GFP/prME含有缺陷YFV基因组(YF PIV)，其中编码YF衣壳基因氨基酸26-100的片段被源于pEGFP-N1(Clontech)的密码子优化GFP基因取代。在先前的研究中已设计出该质粒，其中称为pYF/PIV。pYF/C/Cherry编码完整衣壳蛋白，接着是prM信号肽和prM的6个氨基酸，其与Cherry(红色荧光蛋白之一)编码序列融合。后一基因与自E蛋白跨膜结构域开始的其余YF ORF符合读框地融合(详见图1A)。
质粒pYF/C/GFP/C含有YFV基因组，其中101个氨基酸长衣壳编码序列与GFP融合，后面紧跟口蹄疫病毒2A蛋白酶(FAMDV 2A)、密码子优化衣壳基因和其余YF多蛋白prM-NS5编码序列。pYF/Cfrs/GFP/C和pYF/Chyb/GFP/C具有基本相同的设计(图2A)，但在pYF/Cfrs/GFP/C中，将一个核苷酸插入到nt 202之后并缺失nt 422，而在pYF/Chyb/GFP/C中，nt 201与nt 422间的序列被编码相同氨基酸序列、但使用不同密码子的合成基因取代。
pYF/DC/GFP/C和pYF/C/DGFP/C是pYF/C/GFP/C的衍生物，其分别在衣壳编码序列和GFP编码序列中有缺失，其在选择缺失突变体中被鉴定出(详见图3A)。pYF/GFP含有YFV基因组，其中5′UTR后面紧跟编码YFV衣壳的25个氨基酸的ORF，其与GFP和FAMDV 2A和整个YFV多蛋白C-NS5融合，其中衣壳基因以密码子优化形式出现(图4A)。pYF/GFPmut具有基本相同的设计，但编码衣壳25个氨基酸的片段含有3个1nt长的插入和在GFP编码序列开始的点突变。
pYF/Cherry/Cco含有缺陷YFV基因组，其中75nt的衣壳与Cherry基因融合，后面紧跟编码FAMDV 2A蛋白酶的序列、具有prM信号肽的密码子优化衣壳、prM的6个氨基酸、E蛋白的49个羧基端氨基酸和其余YFV多肽(图5A)。pYFrep/Cherry含有YFV复制子，其中结构基因被Cherry蛋白编码序列取代。在氨基端，Cherry与YFV衣壳的25个氨基酸融合，而在羧基端，其后面紧跟FAMDV 2A，再后面是NS1信号肽和其余YFV多蛋白(图6A)。
pVEErep/C-prM-E/Pac质粒在别处已有介绍。pVEErep/GFP-C-prM-E/Pac质粒含有VEEV复制子，其中亚基因组RNA编码YFV衣壳的25个氨基酸，其与GFP融合，后面紧跟FMDV2A蛋白酶基因、密码子优化的YFV衣壳基因和prM/E基因。第二亚基因组启动子驱动Pac(嘌罗霉素乙酰转移酶)的表达。所有重组病毒基因组和复制子都克隆在SP6 RNA聚合酶启动子控制之下。
实施例3
RNA转录
质粒用CsCl梯度离心纯化。在转录反应之前，YFV基因组或含有复制子的质粒用XhoI线性化。含有VEEV复制子的质粒用MluI线性化。如别处所述，在帽子类似物存在下，经SP6 RNA聚合酶合成RNA。通过非变性条件下的凝胶电泳分析转录物的得率和完整性。转录反应的等分试样无需另外的纯化，就可用于电穿孔。
实施例4
RNA转染
在以前描述的条件(Liljestrom等，1991)下进行BHK-21细胞的电穿孔。为了建立包装细胞培养物，在VEEV复制子电穿孔后24小时，将Pur加入到培养基中，浓度为10mg/ml。5天后，当含复制子的细胞恢复有效生长时，进行体外合成YF PIV基因组的转染。
实施例5
测定含缺陷YFV基因组的感染性病毒颗粒的滴度
为了测定所释放的含不同缺陷基因组的病毒体滴度，将BHK-21细胞接种到6孔Costar板上，浓度为5×105细胞/孔。4小时后，细胞用不同稀释度的样品感染。在37℃5％CO2培养箱中孵育1小时后，用补充有10％FBS的2mlαMEM覆盖它们。孵育36小时后，通过在倒置紫外显微镜下对GFP阳性和Cherry阳性细胞进行计数，评价受感染细胞数。通过对显微镜视野下指定区域内产生荧光的细胞进行计数，测定来自接种量的受感染细胞的分数。将5个不同视野的计数结果进行平均，重新计算对应于各系列稀释的滴度。
通过在BHK-21细胞上的样品标准噬斑来确定复制型病毒的滴度(Lemm等，1990)。在37℃孵育3天后，用2.5％甲醛固定单层细胞并用结晶紫染色。
实施例6
病毒的传代
通过体外合成的VEEV复制子RNA转染，再经Pur选择，建立了包装细胞系。这些细胞系可以用体外合成的YFV复制子RNA转染或者用在先包装复制子感染。在附图说明中所示的时间点，通过更换培养基收获样品。通过以上文所示的MOI感染细胞，进行双组分基因组YF病毒的传代。在图示时间点通过更换培养基收获样品，并且如上所述地测定含缺陷基因组颗粒的滴度。通过使用100μl在前一代收获的病毒感染幼稚BHK-21细胞，进行复制型病毒的传代。在感染后72小时收获样品，通过噬斑测定来确定滴度。
实施例7
对YF SVP产生的分析
用8mg体外合成的YFV 17D病毒基因组或YF/GFP/prME病毒基因组转染BHK-21细胞，或者用YF/Cherry/Cco基因组和YF/GFP/prME基因组共转染BHK-21细胞。在补充有10％FBS的10mlαMEM中孵育24小时后，将后面的培养基更换为10ml无血清培养基VP-SF(Invitrogen)，24小时内收获并分析SVP的释放。所收集的VP-SF样品通过低速离心进行澄清(5,000r.p.m，10分钟，4℃)，然后使用PBS制备的2ml 10％蔗糖，并使用SW-41转子通过超速离心(39,000r.p.m，4℃，6小时)进行浓缩。
如前所述，在蔗糖密度梯度中进一步分析沉淀物(Schalich等，1996)。简而言之，将0.5ml样品上样到不连续蔗糖梯度(1.5ml 50％蔗糖、1.5ml 35％蔗糖和1.5ml 10％蔗糖，用PBS缓冲液制备)中。使用SW-55转子进行离心(45,000r.p.m，4℃，4小时)。分级后，样品用PBS稀释3倍，然后通过在Optima MAX超速离心机(Beckman)中，使用TLA-55转子进行离心(45,000r.p.m.4℃，1小时)，使SVP沉淀。将沉淀物溶于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的上样缓冲液(不加β-巯基乙醇(为了保持与D1-4G2 MAB的结合))中，再通过蛋白质印迹作进一步分析。蛋白质转移之后，用D1-4G2 MAB和辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的第二驴抗小鼠抗体(购自Santa Cruz Biotechology)处理硝酸纤维素膜。按照制造商的建议，用蛋白质印迹用鲁米诺试剂检测HRP(Santa CruzBiotechnology)。按照如上所述的用于YFV-PIV衍生的SVP同样的步骤，用YFV(2×108PFU)进行并列梯度分析。
实施例8
体内实验
按照附图说明中所示的剂量，通过颅内(i.e.)途径(20ml体积)，用重组YFV感染6日龄小鼠(远系Swiss Webster，Harlan)。对小鼠的病征和死亡监测8天，然后处死动物，通过噬斑测定评价脑内滴度。
实施例9
表达衣壳和prM/E的缺陷YFV基因组在复制效率上很不相同
在以前的研究中，已经开发出在YFV复制和将缺陷基因组包装成感染性YF病毒颗粒的包装中反式互补其缺陷的系统。为了达到这一点，设计细胞系，使得它们含有VEEV复制子，其产生YFV衣壳或在衣壳缺陷的YFV基因组中能互补其复制的完整结构多蛋白。然而，使用甲病毒复制子并非反式互补的绝对先决条件。其它盒明显可产生足够用于黄病毒基因组包装水平的功能性衣壳。因此，进行了一项工作，将任何异源表达载体从包装系统排除出去并自缺乏并非衣壳编码基因的结构基因的第二YFV基因组产生衣壳。
PIV基因组(YF/GFP/prME)在几乎全部衣壳编码序列中都含有缺失，并且第二互补基因组(YF/C/Cherry)缺失prM/E编码序列，但衣壳基因保持完整。为了分析这两个基因组在组织培养物中的复制模式，将两种不同的荧光蛋白(GFP和Cherry)克隆到它们的ORF中(图1A)。预期这两个基因组不能发展出生产性的、扩散性的感染，因为不能产生一整套结构蛋白。然而，当它们在同一细胞中复制时，则可产生病毒颗粒形成所需的所有蛋白质。
将体外合成RNA共转染到BHK-21细胞中，两种标记(GFP和Cherry)的同时表达证实了其复制。令人吃惊的是，所释放的含有衣壳编码基因组或prM/E编码基因组的感染性病毒颗粒的滴度比预期的要低，接近106inf.u/ml，表明反式互补无效(图1B)。对GFP和Cherry的表达模式进行比较，表明衣壳编码基因组的复制比其产生prM/E的对应物的复制要有效得多。电穿孔之后，Cherry的表达达到可检测水平的时间比GFP的缺陷基因组的表达要早18-24小时，但是更重要的是，在转染后2-3天内，其复制也会引起细胞死亡。快速CPE发展不是Cherry蛋白表达的副作用，因为Cherry被GFP取代的同样的盒也表现出高的致细胞病变性(数据未显示)。
在其它实验中，在从前设计的细胞系中，对表达GFP的基因组的复制和表达Cherry的基因组的复制进行了比较，所述细胞系中，自VEEV复制子表达了完整YFV结构多蛋白前体C-prM-E。与上述数据一致的是，表达衣壳的YF/C/Cherry基因组的复制对细胞具有有害效应，几乎所有转染细胞都在转染后96小时内死亡(图1C)，并且感染性病毒颗粒的释放滴度，比用表达prM/E的构建体YF/prME/GFP转染相同细胞的培养基中的滴度要低。
如前所述(Mason，Shustov和Frolov，2006)，携带YF/prME/GFP的细胞不发生CPE(图1C)并继续释放包装病毒基因组，甚至在细胞传代之后。因此，上述实验表明，或者YF/C/Cherry基因组中衣壳编码序列的存在、或者衣壳蛋白本身的表达(或两者同时)强烈决定了该复制RNA的致细胞病变性，并因此在产生衣壳和prM/E的基因组复制中导致很大差异，这可能是无效反式互补的原因。此外，转染细胞在感染性病毒颗粒释放达到高滴度之前就很可能死亡。
实施例10
衣壳蛋白对YFV基因组RNA复制的影响
为了区分衣壳或衣壳编码序列对缺陷YFV特异性RNA复制的影响，进行了设计(To distinguish between the effects of capsid orcapsid-coding sequence on replication of defective YFV-specific RNAwas designed)，其中一套重组YFV基因组(其中编码包含所有结构基因和非结构基因的完整多蛋白的序列)，和含有复制所需RNA启动子元件的5′-端序列是分开的。为了达到这一点，多蛋白中的天然衣壳基因用其密码子优化形式(Cco)取代，这样的优化形式具有在RNA复制中不起作用的突变环化序列。然后，将YFV 5′UTR克隆到Cco上游，紧接着编码天然衣壳而无prM特异性信号肽的序列，其与GFP和FAMDV 2A蛋白酶基因融合。因此，上游衣壳基因含有RNA复制所必需的环化信号和起始甲硫氨酸密码子。
在最终构建体YF/C/GFP/C中，ORF自其起始AUG开始并持续至完整多蛋白。Cco氨基酸序列与天然YFV衣壳的不同之处仅在于它具有脯氨酸作为首个氨基酸，因为这是FAMDV 2A特异性加工所需要的。该实验系统允许在5′端进行各种各样的操纵，包括对氨基端、ORF的天然衣壳编码部分的大量修饰，只要不影响功能性衣壳蛋白(Cco)的表达。因此，在另一盒YF/Cfrs/GFP/C中，第一衣壳在nt 202后含有1nt插入，在nt 421后含有1nt缺失。这些修饰的引入方式是为了保留计算机预测的病毒基因组5′端和负链RNA 3′端的二级结构，然而，它们改变了覆盖大衣壳片段的73个氨基酸长的肽序列。
在第三构建体YF/Chyb/GFP/C中，第一衣壳基因是天然序列和密码子优化序列的杂合体。它编码野生型蛋白，但环化信号的RNA序列下游，自nt 202开始，与野生型YFV基因组中的不同。因此，重组病毒基因组5′端编码：i)与GFP融合的天然衣壳基因(YF/C/GFP/C)，或ii)几乎天然的RNA序列(仅具有2个移码突变)，但却是强烈修饰的蛋白质(YF/Cfrs/GFP/C)，或iii)修饰的RNA序列，但却是天然蛋白质(YF/Chyb/GFP/C)。所有3种RNA和YF 17D基因组的RNA都在体外合成，并等量转染到BHK-21细胞中。
对感染性病毒释放的分析表明，仅有表达突变的第一衣壳的构建体YF/Cfrs/GFP/C能够有效复制至与YFV 17D所达到的相当的滴度(图2B)。然而，仍可察觉到复制率的差异。YF/Chyb/GFP/C和尤其是YF/C/GFP/C，表达与GFP融合的野生型衣壳的这两个基因组表现出高度致细胞病变表型并极大地降低了感染性病毒释放滴度，尽管存在以下事实：它们表达GFP比YF/Cfrs/GFP所表达的水平更高。总之，这些实验结果和先前部分所给出的结果表明，在其天然环境之外表达的YFV衣壳对重组病毒的致细胞病变性具有强烈影响，因而对其在组织培养物中的生长具有强烈影响。在额外的实验中，构建体的细胞毒性显示出不依赖于GFP融合形式或游离形式的衣壳表达(数据未显示)。GFP融合形式或游离形式所表达的GFP之间唯一可察觉的影响在于其胞内分布。
实施例11
具有致细胞病变性降低的YFV变异体的选择
在上述实验中，含两拷贝衣壳基因的YF/C/GFP/C病毒显示出很不寻常的复制(图2B)，特征是在体外合成RNA转染后头三天内感染性病毒非常无效的释放和大部分细胞群体死亡。然而，少量GFP阳性细胞存活下来，继续生长并在转染后72小时比转染后早期更有效地产生病毒(图2B)。到第5天，病毒滴度接近108inf.u/ml。这些数据表明病毒基因组中突变积累的可能性，这可影响其高度致细胞病变表型并导致延长的、更有效的感染性病毒的释放。
为了鉴定这些适应性变化，对随机选择的突变体的5′UTR、氨基端编码衣壳和GFP的片段进行了测序。它们在衣壳(氨基酸29-66)基因或GFP(氨基酸3-121)基因中的一个或两者中都含有大的符合读框的缺失，或者两者同时缺失(图3A)。有趣的是，缺失发生在非常短的(UAAA；SEQ ID NO：1)重复序列(位于衣壳序列内(在计算机预测的二级结构环内))与UGGUGA(SEQ ID NO：2)重复序列(在GFP基因内)之间。这些测序数据还不足以让我们最终了解到底是哪个缺失对病毒复制具有关键的正效应。因此，将GFP特异性缺失和衣壳特异性缺失都分别克隆到YF/C/GFP/C基因组中(图3B)。将体外合成的RNA转染到BHK-21细胞中，仅衣壳内缺失才表现出对感染性病毒释放得率的正效应。重组YF/DC/GFP/C、而不是YF/C/DGFP/C，表现出类似于YFV 17D的生长速率(图3B)。因此，这些实验结果表明，第一衣壳编码序列的修饰可能是改变病毒复制效率并构建能在组织培养物中有效繁殖的变异体的非常有效的方式。
实施例12
能表达异源基因的YFV的开发
为了实验性测定能有效复制并稳定表达异源基因的设计YFV的可能性，设计出两个重组YFV基因组：YF/GFP和YFmut/GFP。将75nt长的衣壳编码序列片段克隆到GFP和FAMDV 2A基因上游，其后紧接着含密码子优化衣壳基因的完整YFV多蛋白编码序列(图4A)。YF/GFP在5′-端序列中没有任何其它变化，而在YFmut/GFP中，额外修饰如下：i)GFP中的UGGUGA(SEQ ID NO：2)序列被替换为UCGUCA(SEQ ID NO：3)，其没有改变所编码的蛋白质序列，但修饰了重复序列中的一个，这是在YF/C/DGFP基因组和YF/DC/DGFP基因组中缺失形成期间所使用的；ii)介于环化序列与GFP之间的短片段通过产生3个单核苷酸插入而得以修饰。
产生了GFP特异性突变，以额外降低在GFP基因内导致编码序列缺失的重组的可能性。在衣壳编码序列中产生变化，以避免在介于残余的75nt长的序列之间可能的重组，所述序列在位于GFP下游的具有密码子优化衣壳基因的ORF开始处。将体外合成的RNA转染到BHK-21细胞中。在转染后18小时内，几乎所有细胞都表现出非常相似的可检测的GFP表达水平，因而表明这两种病毒都具有活力而且不需要额外的复制适应。YF/GFP病毒和YFmut/GFP病毒比野生型YFV17D的致细胞病变性更低，GFP阳性细胞可持续生长，直到达到完全汇合。然而，尽管致细胞病变性降低，但这两种病毒能有效复制并在培养基中积累到滴度大于5×108inf.u/ml(图4B)。
为了评价GFP插入的稳定性，将一份YFmut/GFP病毒贮液在BHK-21细胞中盲法传代5次。在收获样品滴度上未检测到明显变化(图4C)。5次传代之后，11％的病灶是GFP阴性，但被YFV特异性抗体染色。这些GFP-变异体仍不能发展噬斑，因此表明突变可能积累在GFP基因中，因为缺乏对功能性蛋白质的正选择，但并不是良好复制病毒的选择结果。基于PCR的分析也未检测到明显短于预期的片段。因此，如果使用表达异源基因、而非GFP的盒的话，将不会检测到蛋白质产生方面的差异。
在另一实验中，带有5×106和5×105inf.u的YF/GFP的6日龄小鼠经颅内接种。所有小鼠都出现脑炎的临床病征，在感染后第8天对其施行了安乐死。所有小鼠在其大脑内都显示表达GFP病毒的存在，浓度为2.46±0.68×108inf.u/ml。未检测到表达更高水平GFP或表现出更多致细胞病变表型的良好复制变异体。感染后8天，从脑部分离出的病毒样品也含有小于3％的GFP阴性变异体。这些数据表明，旨在分离功能性多蛋白编码序列和启动子元件的YFV基因组修饰的设计策略为稳定表达异源蛋白提供了一个机会。YF/GFP和YFmut/GFP表现出非常类似的复制特征，尽管如此，基于YFmut的载体很可能更优先用于需要长期实验和/或重复传代的研究。
实施例13
两个缺陷YFV基因组之间的反式互补
根据上述实验数据，在复制YFV基因组YF/Cherry/Cco中设计了一个缺陷(图5A)。这能表达衣壳基因并具有缺失的prM/E编码序列。它含有YFV 5′UTR，紧接着是25个氨基酸的衣壳、Cherry、FAMDV2A、具有prM特异性信号肽的Cco以及适当加工和区域化后面的NS1-5多蛋白所需的E蛋白羧基端片段。将体外合成的YF/Cherry/Cco和反式互补对应物YF/GFP/prME基因组转染到BHK-21细胞中。它们彼此互补结构蛋白合成上的缺陷，而且细胞有效产生感染性病毒颗粒具有或编码衣壳或编码prM/E的缺陷基因组，能分别表达Cherry或GFP(图5B)。重要的是，这两个基因组包装成非常类似的滴度，接近108inf.u/ml。它们引起无效CPE并且容易建立持续感染。不仅在转染后4-5天内，而且在其传代之后，细胞仍继续生长并产生病毒。
为了测定大规模生产的可能性，病毒贮液在幼稚BHK-21细胞中进一步传代，含每种基因组的颗粒滴度接近108inf.u/ml。此外，不必以高MOI进行传代。以MOI为～1inf.u/细胞所感染的细胞释放包装基因组与以MOI为～10inf.u/细胞所感染的一样有效。然而，当MOI再降至～0.1inf.u/细胞，则病毒滴度显著降低(图5D)。在MOI为1所感染的细胞单层中，容易检测到仅表达GFP或Cherry标记之一的细胞。然而，它们绝大部分同时表达这两者(图5E)。在蔗糖梯度中对病毒密度进行分析表明，用YF/GFP/prME RNA转染的细胞仅释放低密度病毒颗粒，相当于含有prM/E但缺乏核壳和RNA的所谓亚病毒颗粒(SVP)。然而，用含有这两个缺陷反式互补基因组的病毒进行感染，导致低密度和高密度颗粒的释放，证明在蔗糖密度梯度中与野生型YF 17D病毒样品分布相同。这些数据进一步表明双组分基因组病毒表现出的特征类似于天然YFV。
实施例14
缺乏结构基因的YFV复制子的包装
在以前的研究中，表达YFV C-prM-E盒的细胞系是从持续复制VEEV复制子开发出来的。该细胞系能有效作用于包装YF/prME/GFP缺陷病毒基因组，而且该活性表明，衣壳蛋白已产生并被适当加工，用于基因组incapsidation。然而，同样的细胞系不足以包装不编码结构蛋白的YF复制子。结果，包装后的复制子的滴度通常为107inf.u/ml以下。这种低水平包装的原因尚不清楚，但这些数据与先前公布的另一研究结果有关，在该研究中产生辛德比斯病毒(Sindbis virus)复制子的YF C-prM-E盒同样无效包装类似YF复制子。
为了测试包装YF复制子至更高滴度的可能性，我们设计了在与YF/GFP/Cco病毒基因组中相同的融合蛋白中编码YFV C-prM-E的VEEV复制子。一个亚基因组RNA编码ORF，其开始是25个氨基酸的衣壳蛋白，接着是GFP基因、FAMDV 2A蛋白酶、密码子优化衣壳和prM/E的编码序列。第二亚基因组RNA驱动编码嘌罗霉素乙酰转移酶的PAC基因的表达，该酶使细胞对因培养基中存在嘌罗霉素而导致的翻译抑制具有抗性。将体外合成的VEErep/GFP-C-prM-E/PacRNA转染到BHK-21细胞中，在Pur选择的几天之内建立Purr细胞系。然后细胞用所有结构基因都被Cherry编码序列取代的YFV复制子(YFrep/Cherry)转染(图6A)。如图6B所示，细胞系将后一种复制子包装为高得多的滴度，并在几天之内继续产生感染性颗粒，而不发生显著的CPE(图6C)。含YF复制子的细胞继续生长，通常实验被终止，因为同时表达GFP和Cherry的细胞达到汇合，引起其死亡。在多个实验中，甚至检测不到由VEEV复制子包装成YFV结构蛋白。含VEErep/GFP-C-prM-E/Pac的细胞系的一个额外优势在于将它用于YFV复制子进一步传代的可能性。这些细胞可用先前包装的构建体感染，并且这会导致出现扩散性感染并释放含复制子的颗粒，其滴度接近108inf.u/ml。
本文引用了下列参考文献：
Aberle et al.(1999).J Immunol 163(12)，6756-61.
Aberle et al.(2005).J Virol 79(24)，15107-13.
Chambers et al.(1999)J Virol 73(4)，3095-101.
Colombage et al.(1998)Virology 250(1)，151-63.
Davis et al.(2001)Journal of Virology 75(9)，4040-4047.
Kochel et al.(1997)Vaccine 15(5)，547-52.
Kochel et al(2000).Vaccine 18(27)，3166-3173.
Kofler et al(2004)Proc Natl Acad Sci U S A 101(7)，1951-6.
Konishi and Fujii(2002)Vaccine 20(7-8)，1058-67.
Konishi et al(2001)Journal of Virology 75(5)，2204-2212.
Konishi，et al(1992)Virology 188(2)，714-20.
Konishi，et al(2000a)Vaccine.Jan.18(11-12)，1133-1139.
Konishi，et al.(2000b)Virology 268(1)，49-55.
Lindenbach and Rice(2001).Flaviviridae：The Viruses and Their Replication.Fourth ed.In″Fields Virology″(D.M.Knipe，P.M.Howley，D.G.Griffin，R.A.Lamb，M.A.Martin，and B.Roizman，Eds.)，Vol.1，pp.991-1041.2vols.Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia.
Lorenz et al(2002)J Virol 76(11)，5480-91.
Mason et al(1991)Virology 180(1)，294-305.
Mason et al(2006)Virology 351(2)，432-43.
Monath，et al(2002)Vaccine 20(7-8)，1004-18.
Phillpotts et al(1996)Arch Virol 141(3-4)，743-9.
Qiao et al(2004)J Infect Dis 190(12)，2104-8.
Schmaljohn et al(1997)J Virol 71(12)，9563-9.

Claims (14)

1.一种双组分基因组黄病毒，所述病毒包含假性感染性病毒基因组和互补基因组，其中假性感染性病毒基因组编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、被膜蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白，而不编码黄病毒衣壳蛋白；互补基因组编码RNA复制所需的顺式作用启动子元件、衣壳蛋白和黄病毒的一整套非结构蛋白，而不编码黄病毒被膜蛋白。
2.权利要求1的双组分基因组黄病毒，其中所述假性感染性病毒基因组和所述互补基因组编码5′UTR和含有RNA复制所必需的环化序列的衣壳蛋白可读框的氨基端片段。
3.权利要求1的双组分基因组黄病毒，其中所述假性感染性病毒基因组或所述互补基因组包含与被膜蛋白或衣壳蛋白的编码序列融合的泛蛋白或口蹄疫(FAMDV)特异性2A蛋白酶。
4.权利要求1的双组分基因组黄病毒，其中所述假性感染性病毒基因组和所述互补基因组还包含：含有其它病毒、细菌或寄生虫的结构基因的额外遗传物质，其中所述基因的表达诱导针对所述病毒、细菌或寄生虫所导致感染的免疫应答。
5.权利要求1的双组分基因组黄病毒，其中所述黄病毒是黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、典型猪瘟病毒或丙型肝炎病毒。
6.一种感染权利要求1的双组分基因组黄病毒的细胞培养系统。
7.权利要求6的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统是Vero、BHK-21、C7/10或者脊椎动物来源或蚊来源的其它细胞。
8.一种大规模繁殖双组分基因组黄病毒的方法，所述方法包括：用权利要求1的双组分基因组黄病毒感染细胞培养系统，所述病毒能在同一细胞中有效复制这两个基因组；并释放所述双组分基因组黄病毒，因而能大规模繁殖双组分基因组黄病毒。
9.权利要求8的方法，其中所述细胞培养系统用所述双组分基因组黄病毒感染，其感染复数大于1感染单位/细胞。
10.权利要求8的方法，其中所述复制缺陷黄病毒是复制缺陷型的，不能引起疾病、感染，但能在体内进行一轮感染。
11.一种免疫原性组合物，所述组合物包含：权利要求1的双组分基因组黄病毒、佐剂、药学上可接受的载体或它们的组合。
12.一种保护受试者免受暴露于黄病毒导致的感染的方法，所述方法包括：给予所述受试者免疫有效量的权利要求11的免疫原性组合物，其中所述组合物在所述受试者体内诱发针对黄病毒的免疫应答，从而保护所述受试者免受暴露于黄病毒导致的感染。
13.权利要求12的方法，其中所述给予是通过腹膜内、皮内、皮下、肌内、口服或鼻内途径。
14.权利要求12的方法，其中所述黄病毒是黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、典型猪瘟病毒或丙型肝炎病毒。
CN200880023471A 2007-05-07 2008-05-07 双组分基因组黄病毒及其应用 Pending CN101802179A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92799307P 2007-05-07 2007-05-07
US60/927,993 2007-05-07
PCT/US2008/005824 WO2008137163A1 (en) 2007-05-07 2008-05-07 Two-component genome flavivirus and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101802179A true CN101802179A (zh) 2010-08-11

Family

ID=39943863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880023471A Pending CN101802179A (zh) 2007-05-07 2008-05-07 双组分基因组黄病毒及其应用

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8394620B2 (zh)
EP (1) EP2150614B1 (zh)
JP (1) JP5537419B2 (zh)
KR (1) KR20100016313A (zh)
CN (1) CN101802179A (zh)
AU (1) AU2008248061B2 (zh)
BR (1) BRPI0811281A2 (zh)
CA (1) CA2686398C (zh)
IL (1) IL201875A (zh)
RU (1) RU2527891C2 (zh)
WO (1) WO2008137163A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8815564B2 (en) 2008-03-14 2014-08-26 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Replication-defective flavivirus vaccines and vaccine vectors
CA2755257A1 (en) * 2009-03-16 2010-09-23 Sanofi Pasteur Biologics Co. Replication-defective flavivirus vaccine vectors against respiratory syncytial virus
EP2435572B1 (en) 2009-05-28 2017-08-16 The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Antigenic chimeric tick-borne encephalitis virus (tbev)/dengue virus type 4 (den4) recombinant viruses
US8691961B1 (en) * 2009-11-09 2014-04-08 Integral Molecular, Inc. Flavivirus reporter virus and methods of making and using the same
WO2013138776A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Merial Limited Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g
GB201716222D0 (en) * 2017-10-05 2017-11-22 Univ Leuven Kath Chimeric Flavivirus Vaccines
CN113355292B (zh) * 2021-06-04 2024-02-06 天康制药股份有限公司 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6676936B1 (en) 1988-07-14 2004-01-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services. Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses
ATE314476T1 (de) 1997-10-08 2006-01-15 Us Gov Health & Human Serv Chimärer impfstoff gegen das zeckenenzephalitis virus
US6541011B2 (en) 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
RU2288266C2 (ru) * 2000-02-10 2006-11-27 Зе Гавернмент Оф Зе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Зе Секретэри, Департмент Оф Хелс Энд Хьюмэн Сервисиз ИНФЕКЦИОННЫЕ КЛОНЫ ПОЛНОМЕРНОЙ кДНК КЛЕЩЕВОГО ФЛАВИВИРУСА
ES2374131T3 (es) 2000-02-16 2012-02-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos.
US7244434B2 (en) * 2002-08-13 2007-07-17 Intervet International B.V. Replicons of pestviruses that do not express C and or E1 protein and infectious viral particles containing same, that can be used in vaccines
AU2003297860A1 (en) * 2002-12-12 2004-07-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Large scale production of packaged alphavirus replicons

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0811281A2 (pt) 2014-10-21
US8394620B2 (en) 2013-03-12
KR20100016313A (ko) 2010-02-12
EP2150614B1 (en) 2014-08-06
US20090324623A1 (en) 2009-12-31
RU2009145104A (ru) 2011-06-20
JP2010526531A (ja) 2010-08-05
IL201875A0 (en) 2011-08-01
AU2008248061A1 (en) 2008-11-13
AU2008248061B2 (en) 2014-07-31
WO2008137163A1 (en) 2008-11-13
IL201875A (en) 2014-05-28
EP2150614A4 (en) 2011-09-14
JP5537419B2 (ja) 2014-07-02
CA2686398C (en) 2016-05-03
RU2527891C2 (ru) 2014-09-10
CA2686398A1 (en) 2008-11-13
EP2150614A1 (en) 2010-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101454022B (zh) 假性感染性黄病毒及其用途
DRYGA et al. Identification of mutations in a Sindbis virus variant able to establish persistent infection in BHK cells: the importance of a mutation in the nsP2 gene
Liu et al. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication
Kofler et al. Capsid protein C of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence
Lorenz et al. Intracellular assembly and secretion of recombinant subviral particles from tick-borne encephalitis virus
US8029802B2 (en) Vaccines against Japanese encephalitis virus and West Nile virus
CN101802179A (zh) 双组分基因组黄病毒及其应用
US20180340011A1 (en) Flavivirus Vaccine
US8614082B2 (en) Attenuation of encephalitogenic alphavirus and uses thereof
Shustov et al. Production of pseudoinfectious yellow fever virus with a two-component genome
JP2023523411A (ja) 組換えロタウイルス発現系および組換えロタウイルス
Greene et al. Venezuelan equine encephalitis virus in the guinea pig model: evidence for epizootic virulence determinants outside the E2 envelope glycoprotein gene
Liang et al. A replicon trans-packaging system reveals the requirement of nonstructural proteins for the assembly of bovine viral diarrhea virus (BVDV) virion
Růžek et al. Virology. Chapter 2a
KR100647892B1 (ko) 세포배양을 통한 바이러스의 생산 방법
Vasilakis et al. Genomic organization of arboviral families
RU2811686C2 (ru) Специфический в отношении млекопитающего арбовирус с дефектом роста

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1146490

Country of ref document: HK

AD01 Patent right deemed abandoned
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20170301

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1146490

Country of ref document: HK