ES2374131T3 - Flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos. - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico que comprende: una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 3, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 345, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 625 de la SEQ ID NO: 10.

Description

Flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a los campos de la inmunología y la virología y más concretamente a flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos para la producción de vacunas de flavivirus atenuados, vivos e inmunógenos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Los virus del dengue son patógenos transmitidos por mosquitos del género Flavivirus (familia Flaviviridae). Se han identificado cuatro serotipos del virus del dengue (abreviados a menudo como “DEN”), que incluyen dengue-1, dengue-2, dengue-3, dengue-4 (DEN-1 a DEN-4). El genoma del flavivirus es un ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 11 kb de longitud, que contiene una región 5’ no codificante (5’NC); una región codificante que codifica las proteínas estructurales víricas; cinco proteínas no estructurales, designadas como NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5; y una región 3’ no codificante (3’NC). Las proteínas estructurales víricas incluyen la cápsida, la premembrana/membrana y la envuelta. Las proteínas estructurales y no estructurales se traducen como una única poliproteína. La proteína se procesa a continuación mediante proteasas celulares y víricas.
[0003] Transmitidos por los mosquitos Aedes aegypti a los seres humanos en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, los virus del dengue producen millones de casos de enfermedad cada año, variando desde la fiebre del dengue a la a menudo fatal fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (DHF/DSS). La infección secundaria de los seres humanos con un serotipo heterólogo del virus DEN puede inducir una respuesta inmunopatológica y se considera un posible factor de riesgo para la DHF/DSS. Por tanto, existe la necesidad del desarrollo de una vacuna que confiera protección frente a todas las cepas del virus del dengue.
[0004] Debido a que la erradicación de los mosquitos Aedes aegypti parece ser prácticamente imposible, el desarrollo de vacunas eficaces seguras frente a los cuatro serotipos del virus del dengue es una prioridad de la Organización Mundial de la Salud. Sin embargo, está actualmente disponible una vacuna eficaz, no aprobada, contra cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue. Se ha demostrado que el paso en serie de flavivirus naturales por diversos cultivos celulares, tales como en células primarias de riñón de perro (PDK), produce variantes del virus que han perdido virulencia, retienen la inmunogenicidad y producen síntomas clínicos no adversos.
[0005] En la Mahidol University de Tailandia han desarrollado virus del dengue vivos atenuados de los cuatro serotipos haciendo pasar virus naturales por el cultivo celular. Representan en la actualidad los candidatos más prometedores a vacunas de virus atenuados vivos para inmunizar contra la infección y/o la enfermedad del virus del dengue. Estas vacunas candidatas se han designado mediante una combinación de su serotipo del dengue, la línea celular a través de la cual se pasaron y el número de veces que se pasaron. De esta manera, un virus natural del dengue del serotipo 1 pasado en células PDK 13 veces se designa cono virus DEN-1 PDK-13. Las otras vacunas candidatas son DEN-2 PDK-53 (secuencia de nucleótidos, de la SEQ ID NO: 15; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 16), DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 (treinta pases en las células primarias de riñón de mono verde, seguido por tres pases en células fetales de pulmón de macaco) y DEN-4 PDK-48. Estos cuatro virus candidatos de vacunas se derivaron mediante pases en el cultivo de tejidos de los virus DEN-1 16007, DEN-2 16681. DEN-3 16562 y DEN-4 1036 parentales naturales, respectivamente.
[0006] Los ensayos clínicos preliminares en seres humanos con estos virus atenuados han indicado que DEN2 PDK-53 tiene la dosis infecciosa más baja (dosis infecciosa mínima del 50% de 5 unidades de formación de placas
o UFP), en seres humanos, es fuertemente inmunógeno y no produce síntomas clínicos inaceptables. Las vacunas de los virus DEN-1 PDK-13, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 y DEN-4 PDK-48 tienen dosis infecciosas mínimas superiores al 50%, de 10.000, 3500, y 150 UFP, respectivamente, en seres humanos Las mayores dosis infecciosas requeridas para las últimas tres vacunas candidatas aumentan las preocupaciones con respecto a la eficacia relativa de cada componente del serotipo en una vacuna tetravalente de virus del dengue. Aunque solamente se necesitó una única inmunización con el virus DEN-2 PDK-53 o el virus DEN-4 PDK-48 monovalente para conseguir un 100% de seroconversión en sujetos humanos, se necesitó un estímulo de refuerzo para conseguir el mismo índice de seroconversión para los virus DEN-1 PDK-13 y DEN-3 PGMK-30/FRhL-3, que tienen dosis infecciosas más elevadas para los seres humanos.
[0007] El virus DEN-2 PDK-33 de la vacuna candidata, abreviado de ahora en adelante como PDK-53, tiene algunos marcadores biológicos asociados con la atenuación que se pueden medir, entre los que se incluyen la sensibilidad a la temperatura, tamaño pequeño de la placa, replicación decreciente en el cultivo de células C6/36 de mosquito, replicación decreciente en mosquitos intactos, pérdida de neurovirulencia en ratones lactantes e incidencia decreciente de viremia en monos. Los ensayos clínicos de la vacuna PDK-53 candidata han demostrado su seguridad e inmunogenicidad en seres humanos. Además, la vacuna PDK-53 induce respuestas de memoria en los linfocitos T específicos del virus del dengue en los receptores humanos de las vacunas. Se han identificado diferencias de nucleótidos entre DEN-2 16681 y PDK-53 (Kinney y col., Virology, 230, 1997).
[0008] Excepto para el virus DBN-2 PDK-53, el número y la identidad de las mutaciones genéticas que se acumulan durante los múltiples pases en el cultivo celular y que se asocian con los fenotipos atenuados de las vacunas candidatas son desconocidos. Ni las contribuciones relativas de dichas nutaciones asociadas a la atenuación al mecanismo real de la atenuación, ni el potencial de las mutaciones inversas de invertir cualquiera de las vacunas candidatas al fenotipo biológico virulento del virus del dengue natural se conocen para cualquiera de estas cuatro vacunas candidatas. Resulta crítica una comprensión de los marcadores de la atenuación de una vacuna candidata para la predicción de su estabilidad y seguridad.
[0009] De acuerdo con esto, existe una necesidad de virus del dengue avirulentos, aún inmunógenos a utilizar en el desarrollo de vacunas del virus del dengue, para conferir protección contra uno o más serotipos del virus del dengue. Lo que sería ideal es una vacuna que protegiera de manera simultánea a un individuo contra varias cepas virulentas de esta familia potencialmente peligrosa (Flaviviridae) de virus. Por tanto, se necesita particularmente una vacuna tetravalente que se pueda usar para inmunizar a un individuo frente a los cuatro serotipos del dengue.
[010] Se han descrito virus quiméricos para uso en vacunas. El documento WO93/06214 describe un virus quimérico para uso en una preparación de vacuna que tiene un genoma que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína estructural de un flavivirus y secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína no estructural de otro flavivirus.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[011] Se describen flavivirus quiméricos inmunógenos, una estructura del virus del dengue 2 para preparar los flavivirus quiméricos y los procedimientos para producir los flavivirus quiméricos. Se proporcionan flavivirus quiméricos inmunógenos, solos o en combinación, en un vehículo farmacéuticamente aceptable en forma de composiciones inmunógenas para minimizar, inhibir, o inmunizar a individuos frente a la infección mediante uno o más flavivirus o cepas flavivíricas, particularmente, cepas del virus del dengue de los serotipos DEN-1, DEN-2, DEN3 y DEN-4. Cuando se combinan, se pueden usar flavivirus quiméricos inmunógenos como vacunas multivalentes para conferir protección simultánea frente a la infección por más de una especie o cepa de flavivirus. Preferiblemente, los flavivirus quiméricos se combinan en una composición inmunógena útil como vacuna tetravalente contra los cuatro serotipos conocidos de virus del dengue.
[012] Los flavivirus quiméricos inmunógenos avirulentos proporcionados en la presente memoria descriptiva contienen genes de las proteínas no estructurales del virus del dengue 2 atenuado, o de uno de sus equivalentes, y uno o más de los genes de las proteínas estructurales o de sus porciones inmunógenas del flavivirus contra el cual se va a conferir inmunogenicidad tal como se define en las reivindicaciones, En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico (denominado también en la presente memoria como ácido nucleico quimérico) que comprende;
una primera secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales y una proteína de la cápsida (C) de la cepa PDK-53 de la vacuna del virus del dengue 2 atenuado; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 3, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido
345.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico (denominado también en la presente memoria descriptiva como ácido nucleico quimérico) que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales y una proteína de la cápsida (C) de la cepa PDK-53 de la vacuna del virus del dengue 2 atenuado, en la que la proteína C contiene una serina en la posición del aminoácido 100; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 4, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido
447.
[013] Durante la evaluación del virus quimérico de la invención, se descubrió de manera inesperada que la avirulencia de la cepa atenuada del virus PDK-53 es atribuible a la presencia de mutaciones específicas con sustitución de aminoácidos en las proteínas no estructurales y una mutación con sustitución de nucleótidos en la región 5’ no codificante. Esta mutación con sustitución de nucleótidos se produce se produce en el tallo de una estructura en horquilla que se conserva en los cuatro serotipos del dengue. En particular, una única mutación en NS1-53, una mutación doble en NS1-S3 y en 5’NC-57, una mutación doble en NS1-53 y en NS3-250, y una mutación triple en NS1-53, en 5’NC-57 y en NS3-250 pueden proporcionar un virus DEN-2 atenuado.
[014] Además, el genoma de cualquier virus del dengue 2 que contiene sustituciones de aminoácidos no conservativas en estos loci se puede usar como estructura de las quimeras avirulentas descritas en la presente memoria descriptiva. Además, se pueden usar también otros genomas de flavivirus que contienen mutaciones análogas en el mismo loci, tras la alineación de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos y el análisis de la estructura del tallo, como la estructura del esqueleto y se define en la presente memoria descriptiva como equivalente a las mutaciones atenuantes del genoma de PDK-53 del virus del dengue 2.
[015] El esqueleto, la región de la quimera que comprende las regiones no codificantes 5’ y 3’ y la región que codifica las proteínas estructurales, puede contener también mutaciones adicionales que mantienen la estabilidad del fenotipo avirulento y reducen la posibilidad de que el virus avirulento o la quimera puedan revertir hacia el virus natural virulento. Por ejemplo, si se desea, una segunda mutación en el tallo de la estructura en horquilla en la región 5’ no codificante proporcionará estabilidad adicional.
[016] Estos virus quiméricos pueden comprender sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos y aminoácidos en sus proteínas estructurales y no estructurales además de las específicamente descritas en la presente memoria descriptiva.
[017] Debe entenderse que las proteínas estructurales y no estructurales incluyen cualquier proteína que comprenda o cualquier gen que codifique la secuencia de la proteína completa, un epítopo de la proteína, o cualquier fragmento que comprenda, por ejemplo, dos o más de sus restos aminoácidos.
[018] Se describe en la presente memoria descriptiva un procedimiento para preparar los virus quiméricos de esta invención usando técnicas recombinantes, mediante la inserción de las sustituciones requeridas en el genoma de la estructura apropiada.
[019]
Las composiciones pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y los virus quiméricos atenuados de esta invención que contienen secuencias de aminoácidos derivadas de otros serotipos del virus del dengue, otras especies de flavivirus u otras especies estrechamente relacionadas, tales como el virus de la hepatitis
C.
Las secuencias de aminoácidos derivadas de otros serotipos del virus del dengue, otras especies de flavivirus u otras especies estrechamente relacionadas, tales como el virus de la hepatitis C, se pueden expresar en un hospedador, una célula hospedadora o cultivo celular. Las proteínas o polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos derivadas de otros serotipos de virus del dengue, otras especies de flavivirus u otras especies estrechamente relacionadas, pueden actuar como inmunógenos y de esta manera, usarse para inducir una respuesta inmunógena contra otros serotipos del virus del dengue, otras especies de flavivirus u otras especies estrechamente relacionadas.
[020] Las composiciones pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, uno o más virus quiméricos atenuados de esta invención y composiciones inmunizantes adicionales. Los ejemplos de dichas composiciones inmunizantes adicionales incluyen, pero no se limitan a, vacunas del virus del dengue, vacunas del virus de la fiebre amarilla, vacunas del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, vacunas del virus de la encefalitis japonesa, vacunas del virus del Nilo Occidental, vacunas del virus de la hepatitis C u otras vacunas. Dichas vacuas pueden ser vacunas de virus atenuados vivos, vacunas de virus muertos, vacunas de subunidades, vacunas de vectores de ADN recombinantes o cualquiera de sus combinaciones.
[021] Se pueden usar flavivirus quiméricos atenuados como vacunas con el fin de impartir inmunidad contra diversas especies de flavivirus de manera simultánea.
[022] Se describen flavivirus quiméricos codificados por el ácido nucleico quimérico que se define en las reivindicaciones, que contiene sustituciones de aminoácidos o de nucleótidos que retienen la inmunogenicidad del virus evitando a la vez cualquier efecto patógeno del virus.
[023] Es el objeto de la presente invención proporcionar ácidos nucleicos quiméricos como se define en las reivindicaciones, que comprenden la secuencia de nucleótidos de un virus del dengue 2 atenuado y la secuencia de nucleótidos de un segundo flavivirus, en el que la secuencia de nucleótidos del segundo flavivirus dirige la síntesis de los antígenos del flavivirus.
[024] Se describen composiciones para vacunas que comprenden más de una especie de flavivirus.
[025] Se describe un procedimiento para preparar composiciones inmunógenas o vacunas usando técnicas recombinantes mediante la inserción de las sustituciones requeridas en un genoma de flavivirus apropiado.
[026] Se describen composiciones y procedimientos para impartir inmunidad frente a más de un flavivirus de manera simultánea.
[027] Se describen sondas y cebadores de ácidos nucleicos para uso en cualquiera de numerosas pruebas genéticas rápidas que son diagnósticas para cada uno de los virus de vacunas de la invención actual. Esto puede comprender ensayos de reacción en cadena de la polimerasa, ensayos de hibridación y otras técnicas de detección de las secuencias de ácidos nucleicos conocidas en la materia. Por ejemplo, se describe un sistema de detección automatizado del ácido nucleico basado en la PCR.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[028]
La FIGURA 1 muestra esquemáticamente la organización genómica de los virus DEN-2/DEN-1 quiméricos. Las designaciones de las quimeras se basan en las estructuras de los clones infecciosos específicos del virus DEN2 y en las inserciones de los genes estructurales (C-prM-E) de los virus DEN-1. Se usan en las designaciones letras subrayadas de la estructura y de las inserciones de los virus. D2/1 indica la quimera DEN-2/DEN-1; la primera letra tras el guión es la estructura vírica DEN-2, parental 16681 (P), PDK53-E (E), o PDK53-V (V); la última letra indica los genes estructurales de la cepa 16007 (p) del DEN-1 parental o su vacuna derivada, la cepa PDK-13 (V). La estructura de PDK53-E contiene tres mutaciones de aminoácidos específicas del virus DEN-2 PDK-53 (NS1-53-Asp, NS2A-181-Phe, y NS4A-75-Ala, así como la mutación 5’NC-57 del virus PDK-53-La estructura de PDK53-V contiene estos mismos loci específicos del virus PDK-53 más el locus NS3-250-Val específico del virus PDK-53.
Las FIGURAS 2A y 2B muestran las características de crecimiento de los virus DEN-2/DEN-1 quiméricos en células LLC-MK2. Las barras punteadas indican el virus DEN-1 16007 y los virus quiméricos que expresan las proteínas estructurales del virus DEN-1 16007. Las barras rayadas indican el virus DEN-1 PDK-13 y los virus quiméricos que expresan las proteínas estructurales del virus PDK-13. Las barras blancas indican los tres virus con la estructura DEN-2 derivados de los clones infecciosos del virus DEN-2 16681 (P48) y las dos variantes (PDK53-E y PDK53-V; E48 y V48, respectivamente). Figura 2A: Diámetros promedio de las placas (± SD). Se calcularon los valores de diez placas individuales de cada virus en el día 10 después de la infección. pp: placas de tamaño determinadas con gran precisión menores de 1 mm. Figura 2B: Sensibilidad a la temperatura (ts) y picos de los títulos de los virus quiméricos en el día 8 o 10 después de la infección. Las puntuaciones de ts se basaron en la reducción de los títulos de los virus a 38,7ºC frente a aquellos a 37ºC (-, +, 2+ y 3+ indican una reducción de los títulos menor de o igual a 60%, 61-90%, 91-99%, >99%, respectivamente, calculada a partir de al menos tres experimentos). Las alturas del gráfico de barras representan el log10 de los títulos de los virus a 37ºC. La multiplicidad de la infección (m.o.i.) fue aproximadamente de 0,001 UFP/célula.
La FIGURA 3 muestra las curvas de crecimiento de DEN-1 16007, DEN-1 PDK-13, DEN-2 16681-P48, DEN-2 PDK53-E48, DEN-2 PDK53-V48 y los virus DEN-2/DEN-1 quiméricos en células C6/C36 Se infectaron las células a una m-o-i. aproximada de 0,001 UFP/ml.
FIGURAS 4A-C. Figura 4A: Diámetros promedio de placas ± SD en milímetros (n=12) de los virus DEN216681, PDK-53 y 16681/PDK-53 recombinantes a los nueve días después de la infección en células LLC-MK2. La replicación de los títulos de los picos a los 6-8 días después de la infección de las células LLC-MK2 fue a una m.o.i. de aproximadamente 0,001 UFP/célula en un único experimento. Se muestran las puntuaciones de sensibilidad a la temperatura (ts) para el crecimiento de los virus a 37ºC o 38,7ºC en células LLC-MK2 por encima de los gráficos de barras para la replicación de los títulos de los virus. Puntuaciones de (-), (+/-) y (+) indican menos del 81%, 81-89% y 90-97% de reducción en el título vírico, respectivamente, a 38,7ºC. Se determinaron las puntuaciones a los ocho días después de la infección. Figura 4C: Promedio de replicación de los títulos de los virus a los 12 días después de la infección de células C6/36 a una multiplicidad de aproximadamente 0,001 UFP/célula en dos experimentos independientes. Los títulos de los picos individuales se indican mediante líneas verticales en cada gráfico de barras. Las designaciones numéricas de los virus Px y Vx recombinantes (en el que x = loci 5’NC, NS1, y/o NS3) indican la genomanipulación de los loci específicos del virus 16681 parental (P en la designación de los virus) en los clones infecciosos específicos del virus PDK53 o en vacunas de PDK-53 candidatas recíprocas (V en la designación del virus), la genomanipulación de loci específicos del virus en el clon 16681, respectivamente. Se indican los virus análogos en las tres gráficas mediante gráficos de barras de un modelo sólido idéntico o de sombreado de doble patrón. El análogo del virus P5 es el virus V13, lo que supone que el fenotipo vírico se determina predominantemente por los loci 5’NC-57, NS1-53 y NS3-250 Los virus P5 y V13 contienen los loci 5’NC-57-C (16681), NS1-53-Asp (PDK-53) y NS3-250-Val (PDK-53) dentro de los antecedentes genéticos de los virus PDK-53 y 16681, respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[029] La siguiente descripción incluye el mejor modo contemplado actualmente de llevar a cabo la invención. Esta descripción se hace con el objetivo de ilustrar los principios generales de las invenciones y no deberá tomarse en un sentido limitante.
[030] Se describen en la presente memoria descriptiva flavivirus quiméricos inmunógenos, un virus del dengue 2,
o estructura equivalente del virus del dengue 2 para preparar los flavivirus quiméricos de esta invención y los procedimientos para preparar los flavivirus quiméricos. Los flavivirus quiméricos inmunógenos son útiles, solos o en combinación, en un vehículo farmacéuticamente aceptable como composiciones inmunógenas para minimizar, inhibir o inmunizar individuos frente a una infección por uno o más flavivirus o cepas flavivíricas, particularmente cepas de los serotipos DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 del virus del dengue. Cuando se combinan, los flavivirus quiméricos inmunógenos se pueden usar como una vacuna multivalente para conferir protección simultánea frente a la infección. Preferiblemente, los virus quiméricos del dengue se combinan en una composición inmunógena útil como vacuna tetravalente contra los cuatro serotipos conocidos del virus del dengue.
[031] Los flavivirus quiméricos inmunógenos de la actual invención son también útiles, en combinación con las cepas avirulentas del virus, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como composiciones inmunógenas para minimizar, inhibir o inmunizar individuos frente a la infección por múltiples especies patógenas Por ejemplo, uno o más de los flavivirus quiméricos inmunógenos de la actual invención se pueden combinar con serotipos avirulentos del virus de flavivirus seleccionados para proporcionar una vacuna tetravalente segura y eficaz contra los cuatro serotipos conocidos del virus del dengue. Los flavivirus quiméricos de la actual invención se pueden combinar con vacunas de virus avirulentos para proporcionar una vacuna segura y eficaz frente a la infección por múltiples especies patógenas.
[032] Las composiciones pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, uno o más virus quiméricos atenuados de esta invención y otras composiciones inmunizantes adicionales. Los ejemplos de dichas composiciones inmunizantes adicionales incluyen, pero no se limitan a, vacunas del virus del dengue, vacunas de la fiebre amarilla, vacunas de la encefalitis transmitida por garrapatas, vacunas de la encefalitis japonesa, vacunas del virus del Nilo Occidental, vacunas del virus de la hepatitis C u otras vacunas. Dichas vacunas pueden ser vacunas del virus atenuado vivo, vacunas de virus muertos, vacunas de las subunidades, vacunas de vectores de ADN recombinantes o cualquiera de sus combinaciones.
[033] Las quimeras pueden comprender la estructura del virus del dengue 2 de un virus del dengue 2 atenuado y adicionalmente secuencias de nucleótidos seleccionadas entre más de un serotipo de virus del dengue, otras especies de flavivirus otras especies estrechamente relacionadas, tales como el virus de la hepatitis C, o cualquiera de sus combinaciones. Se pueden usar estas quimeras para inducir una respuesta inmunógena frente a más de una especie seleccionada entre los serotipos del virus del dengue, especies de flavivirus, otras especies estrechamente relacionadas o cualquiera de sus combinaciones.
[034] La quimera preferida es una quimera de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de un virus del dengue 2 atenuado, y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de un segundo flavivirus, en la que el virus del dengue 2 es una vacuna de la cepa PDK-53 como se define en las reivindicaciones.
[035] Los términos “uno”, “unos” y “el” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se definen para significar uno o más e incluyen el plural a no ser que el contexto sea inapropiado.
[036] El término “resto” se usa en la presente memoria descriptiva para referirse a un aminoácido (D o L) o un aminoácido mimético que se incorpora en un péptido mediante un enlace amida. De esta forma, el aminoácido puede ser un aminoácido que se produce naturalmente o, a no ser que esté limitado de otra forma, puede comprender los análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se producen naturalmente (es decir, aminoácidos miméticos). Además, un enlace amida mimético incluye modificaciones en la estructura peptídica bien conocidas por los expertos en la materia.
[037] Además, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en la secuencia de aminoácidos, o en la secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos, que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos de un 5%, más normalmente menos de un 1%) en una secuencia codificada son variaciones modificadas conservativamente, en las que las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Son bien conocidas en la técnica las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí.
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (K), Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
[038] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “virus quimera”, “virus quimérico”, “flavivirus quimera” y “flavivirus quimérico” significan una construcción infecciosa que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de un virus del dengue 2 y secuencias de nucleótidos adicionales que no son el mismo virus del dengue 2. Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden ser secuencias procedentes del virus del dengue 1, virus del dengue 3 o virus del dengue 4.
[039] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, “construcción infecciosa” indica un virus, una construcción vírica, una quimera vírica, un ácido nucleico derivado de un virus o cualquiera de sus porciones, que se puede usar para infectar una célula.
[040] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, “ácido nucleico quimérico” significa una construcción que comprende un ácido nucleico que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de un virus del dengue 2 y adicionalmente la secuencia de nucleótidos que no es del mismo origen que la secuencia de nucleótidos del virus del dengue 2. De manera correspondiente, cualquier flavivirus quimérico o flavivirus quimera de la invención se va a reconocer como un ejemplo de un ácido nucleico quimérico.
[041] Las proteínas estructurales y no estructurales usadas en la invención debe entenderse que incluyen cualquier proteína que comprenda o cualquier gen que codifique la secuencia de la proteína completa.
[042] Las secuencias de nucleótidos del genoma de ARN de las quimeras de la invención actual están enumeradas en las secuencias relacionadas en términos de ADN.
[043] A no ser que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que una persona normalmente experta en la materia a la que pertenece esta invención entiende comúnmente. Aunque se pueden usar otros materiales y procedimientos similares
o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los procedimientos y materiales preferidos.
Flavivirus quiméricos
[044] Los tipos 1-4 de virus del dengue (DEN-1 a DEN-4) son flavivirus patógenos trasmitidos por mosquitos. El genoma de los flavivirus contiene una región 5’ no codificante (5’-NC), seguida por una región que codifica la proteína de la cápsida (C), seguida por una región que codifica las proteínas de la premembrana/membrana (prM), seguida por una región que codifica la proteína de la envoltura (E), seguida por la región que codifica las proteínas no estructurales (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) y finalmente una región 3’ no codificante (3’NC). Las proteínas de la estructura vírica son C, prM y E, y las proteínas no estructurales son NS1-NS5. Las proteínas estructurales y no estructurales se traducen como una única poliproteína y se procesan mediante proteasas celulares y víricas.
[045] Los flavivirus quiméricos de la invención son construcciones formadas por genes de proteínas no estructurales de un serotipo de virus del dengue que se fusionan con genes de proteínas que codifican una proteína estructural de un serotipo diferente de virus del dengue, como se define en las reivindicaciones
[046] Los flavivirus quiméricos inmunógenos avirulentos descritos en la presente memoria descriptiva contienen los genes de las proteínas no estructurales del virus del dengue 2 atenuado, o de uno de sus equivalentes, y uno o más genes de proteínas estructurales, o de sus porciones antigénicas, del flavivirus contra el cual se confiere la inmunogenicidad. Los flavivirus adecuados incluyen, pero no se limitan a los relacionados en la Tabla 1.
[047] Otros flavivirus adecuados para uso en la construcción de los flavivirus quiméricos que se describen son DEN-1 16007, DEN-2 16681, DEN-3 16562 y DEN-4 1036 virulentos naturales y las cepas DEN-1 PDK-13, DEN-2 PDK-53 (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16), DEN-3 PMK-30/FRhL-3 y DEN-4 PDK-48 de las vacunas atenuadas. Se describen en la presente memoria descriptiva flavivirus o variantes adecuadas adicionales de los flavivirus relacionados anteriormente. En las Tablas 2-5 se muestran las diferencias genéticas entre las parejas de virus DEN1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 naturales/atenuados junto con los cambios en las secuencias de aminoácidos codificadas por los genomas víricos.
[048] Se proporcionan en la presente memoria descriptiva las secuencias relacionadas de DEN-2 PDK-53 (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16) que corresponden a la variante DEN-2 PDK-53-V, en la que la posición 5270 del nucleótido del genoma está mutada de un A a un T y la posición del aminoácido 1725 de la poliproteína o posición del aminoácido 250 de la proteína NS3 contiene un resto de valina. La variante DEN-2 PDK-53 sin esta mutación en el nucleótido, DEN-2 PDK-53-E, difiere de PDK-53-V solo en esta posición. DEN-2 PDK-53-E tiene un A en la posición del nucleótido 5270 y un glutamato en el aminoácido de la posición 1725 de la poliproteína, la posición del aminoácido 250 de la proteína NS3 (Tabla 3).
[049] A lo largo del texto, las designaciones de las quimeras se basan en las estructuras de los clones infecciosos específicos del virus DEN-2 y las inserciones de los genes estructurales (prM-E o C-prM-E) de otros flavivirus. Cada designación comienza con DEN-2 para la estructura del dengue 2, seguida por la cepa en la cual se insertan los genes estructurales. La variante de la estructura particular se refleja en la siguiente letra. La variante particular de la estructura de DEN-2 a partir de la cual se construye la quimera se indica por la letra siguiente colocada después de un guión, parental 16681 (P), PDK53-E (E), o PDK53-V (V); La última letra indica los genes estructurales C-prM-E de la cepa parental (P) o de su vacuna derivada (V) o los genes estructurales prM-E de la cepa parental (P1) o de su vacuna derivada (V1). Por ejemplo, DEN-2/3-VP1 (SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10) denota la estructura de DEN-2 PDK-53V y los genes prM-E de DEN-3 16562 natural; DEN-2/4-VP1 (SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12) denotan la estructura de DEN-2 PDK-53V y los genes prM-E de DEN-4 1036 natural. Otras quimeras de la presente invención, denotadas de la misma manera, están claramente definidas en la presente memoria descriptiva por las secuencias dadas a conocer. Por ejemplo, DEN-2/1-PV se define en la presente memoria descriptiva como consistente de la estructura del dengue 2 natural, DEN-2 16681, y los genes C-prM-E de la cepa de la vacuna del dengue 1, DEN-1 PDK-13.
[050] Se identifican en la presente memoria descriptiva (Tabla 3) nueve mutaciones de nucleótidos entre los genomas del virus DEN-2 16681 natural y dos cepas atenuadas de virus PDK-53. Tres de estas mutaciones son mutaciones silenciosas en el sentido que no dan como resultado la producción de un aminoácido que difiere del aminoácido en la misma posición en el virus natural, La primera mutación es una mutación de nucleótidos C a T (natural a PDK-53) en la posición 57 del nucleótido del genoma (nt 57) en la región 5’ no codificante. La segunda mutación es una mutación A a T en la posición 524 del nucleótido del genoma, que codifica la sustitución de aminoácidos de Asp a Val en la región premembrana de la proteína estructural, prM-29.
[051] En las regiones de las proteínas no estructurales se descubrió una mutación Gly a Asp (natural a PDK-53) en la proteína no estructural NS1-53 (posición 2579 del nucleótido del genoma); se descubrió una mutación Leu a Phe (natural a PDK-53) en la proteína no estructural NS2A-181 (posición 4018 del nucleótido del genoma); se descubrió una mutación Glu a Val (natural a PDK-53) en la proteína no estructural NS3-250 (posición 5270 del nucleótido del genoma); se descubrió una mutación Gly a Ala /natural a PDK-53) en la proteína no estructural NS4A75 (posición 6599 del nucleótido del genoma).
[052] La cepa atenuada del virus PDK-53 tiene un genotipo mixto en el nt 5270 del genoma. Una porción significativa (aproximadamente el 29%) de la población de virus codifica la NS3-250-Glu no mutada que está presente en el virus DEN-2 16681 natural más bien que en la mutación NS3-250-Val. Como ambas variantes genéticas son avirulentas, esta mutación puede no ser necesariamente una quimera avirulenta.
[053] Se descubrió de manera inesperada que la avirulencia de la cepa atenuada del virus PDK-53 se puede atribuir a la presencia de mutaciones específicas en la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales en la región 5’ no codificante (Ejemplo 5). En particular, una única mutación en NS1-53, una mutación doble en NS1-53 y en 5’NC-57, una mutación doble en NS1-53 y en NS3-250 y una mutación triple en NS1-53, en 5’NC-57 y en NS3-250, dan como resultado la atenuación del virus DEN-2. Por tanto, se puede usar el genoma de cualquier virus del dengue 2 que contiene dichas sustituciones de aminoácidos o sustituciones de nucleótidos no conservativas es estos loci como la estructura de las quimeras avirulentas descritas en la presente memoria descriptiva. La estructura puede contener también mutaciones adicionales que mantienen la estabilidad del fenotipo avirulento y que reducen la posibilidad de que el virus o la quimera avirulenta puedan revertir hacia el virus natural virulento. Por ejemplo, si se desea, una segunda mutación en el tallo de la estructura en horquilla en la región 5’ no codificante proporcionará una estabilidad adicional al fenotipo avirulento. Las mutaciones en esta región perturban las estructuras secundarias potenciales importantes para la replicación vírica. En particular, las mutaciones en la región 5’ no codificante tienen la capacidad de perturbar la función de la cadena de ARN de sentido positivo y la función de la cadena d sentido negativo durante la replicación. Una única mutación es esta estructura de tallo corto (de únicamente 6 restos nucleótidos de longitud) en los virus DEN y de la encefalitis equina de Venezuela perturban la formación de la estructura de horquilla (Kinney y col., Virology 67, 1269-1277, (1993)). Mutaciones adicionales en esta estructura de tallo disminuyen la posibilidad de reversión en este locus, manteniendo a la vez la viabilidad del virus. Además, los genomas de los flavivirus que contienen una estructura de tallo análoga que consiste en secuencias cortas de nucleótidos (tallos consistentes en 6 o más pares de bases en la estructura en horquilla) localizadas en la región 5’ no codificante y que tienen una o más mutaciones en la estructura del tallo pueden ser también útiles como la estructura del esqueleto de esta invención.
[054] Se pueden conseguir dichas mutaciones mediante mutagénesis dirigida al sitio usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Además, se describen otros genomas de flavivirus que contienen mutaciones análogas en los mismos loci tras la alineación de las secuencias de aminoácidos, como la estructura del esqueleto de una quimera y se definen en la presente memoria descriptiva como equivalentes a la del genoma PDK-53 del dengue 2. Los expertos en la materia deben entender, como se describe en la presente memoria descriptiva, que se conocen bien en la técnica los ensayos de cribado de virulencia, y se pueden usar para distinguir entre estructuras de esqueletos virulentas y avirulentas.
Construcción de flavivirus quiméricos
[055] Se pueden producir los flavivirus quiméricos descritos en la presente memoria descriptiva cortando y empalmando uno o más de los genes de las proteínas estructurales de los flavivirus frente a los cuales se desea la inmunidad en un estructura del genoma del virus del dengue PDK-53, o de su equivalente tal como se ha descrito anteriormente, usando técnicas de genomanipulación recombinante bien conocidas por los expertos en la materia para eliminar el correspondiente gen PDK-53 y sustituirlo por el gen deseado. Alternativamente, al usar las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias, se pueden sintetizar las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de los flavivirus usando técnicas conocidas de síntesis de ácidos nucleicos e insertarse en un vector apropiado. Se produce de este modo el virus inmunógeno avirulento usando técnicas de genomanipulación recombinante conocidas por los expertos en la materia.
[056] Tal como se ha mencionado anteriormente, el gen que se va a insertar en la estructura codifica una proteína estructural de flavivirus. Preferiblemente, el gen del flavivirus que se va a insertar es un gen que codifica una proteína C, una proteína PrM y/o una proteína E. La secuencia insertada en la estructura del dengue 2 puede codificar las proteínas estructurales PrM y E. La secuencia insertada en la estructura del dengue 2 puede codificar las proteínas estructurales C, prM y E. La estructura del virus del dengue es el genoma del virus del dengue 2 PDK53 e incluye cualquiera de los genes cortados y empalmados que codifican las proteínas estructurales PrM y E del dengue 1 (DEN-2/1), los genes cortados y empalmados que codifican las proteínas estructurales PrM y E del dengue 3 (DEN-2/3), o los genes cortados y empalmados que codifican las proteínas estructurales PrM y E del dengue 4 (DEN-2/4), en el que el gen cortado y empalmado que codifica la proteína estructural del virus del dengue 3 dirige la síntesis de una proteína E que contiene una leucina en la posición del aminoácido 345.
[057] En una realización particular, la quimera de esta invención codifica la proteína estructural C del virus del dengue 2 PDK-53 y dirige la síntesis de una proteína C que contiene una serina en la posición del aminoácido 100 y comprende un gen cortado y empalmado que codifica las proteínas estructurales del dengue 4 que dirigen la síntesis de una proteína E que contiene una leucina en la posición del aminoácido 447.
[058] En una realización adicional, la quimera de esta invención codifica la proteína estructural C del virus del dengue 2 PDK-53 y dirige la síntesis de una proteína C que contiene una serina en la posición del aminoácido 100 y comprende un gen cortado y empalmado que codifica las proteínas estructurales del dengue 4 que dirigen la síntesis de una proteína E que contiene una leucina en la posición del aminoácido 447 y una valina en la posición del aminoácido 364. Las proteínas estructurales descritas en la presente memoria descriptiva pueden estar presentes como la única proteína estructural del flavivirus o en cualquier combinación de proteínas estructurales de flavivirus en una quimera vírica de esta invención.
[059] Las quimeras de esta invención se genomanipulan mediante recombinación de clones de ADNc del genoma de longitud completa derivados de cualquiera de las variantes PDK-53 del virus de dengue 2 (-E o –V (SEQ ID NO: 15)). Las vacunas de PDK-53 sin clonar contienen una mezcla de dos variantes de genotipos, designadas en la presente memoria descriptiva como PDK53-E y PDK53-V. La variante PDK53-V contiene las nueve mutaciones de nucleótidos específicas de la vacuna de PDK-53, incluyendo la mutación Glu a Val en la posición del aminoácido NS3-250. La variante PDK53-E contiene ocho de las nueve mutaciones de la vacuna de PDK-53 y la NS·-250-Glu del virus 16681 parental. Se construyen clones de ADNc infecciosos para ambas variantes y los virus derivados de ambos clones están atenuados en ratones. Los marcadores fenotípicos de la atenuación del virus DEN-2 PDK-53 incluyen un tamaño pequeño de placas, sensibilidad a la temperatura (particularmente en células LLC-MK2), replicación limitada (particularmente en células C6/36), atenuación en ratones recién nacidos (especialmente, pérdida de neurovirulencia en ratones lactantes) e incidencia decreciente de viremia en monos. Las quimeras que son útiles como vacunas candidatas se construyen en los antecedentes genéticos de las dos variantes de DEN-2 PDK-53 que contienen mutaciones en las regiones no estructurales del genoma, incluyendo C a T de 5’NC-57 (16681 a PDK-53) en la región 5’ no codificante, así como mutaciones en la secuencia de aminoácidos de las proteínas no estructurales, tales como, por ejemplo, Gly a Asp de NS1-53 y Glu a Val de NS3-250.
[060] Se pueden evaluar los virus quiméricos o ácidos nucleicos quiméricos adecuados que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales de otros flavivirus o serotipos del virus del dengue para determinar su utilidad como vacunas cribándolos para los marcadores fenotípicos anteriores de la atenuación que indican avirulencia y cribándolos para la inmunogenicidad. Se pueden evaluar la antigenicidad y la inmunogenicidad usando la reactividad in vitro o in vivo con anticuerpos de flavivirus o suero inmunoreactivo usando procedimientos de cribado rutinarios conocidos por los expertos en la técnica.
Vacunas de flavivirus
[061] Los virus quiméricos y ácidos nucleicos quiméricos preferidos proporcionan virus atenuados vivos útiles como inmunógenos o vacunas. Las quimeras pueden presentar elevada inmunogenicidad y al mismo tiempo no producir efectos patógenos o letales peligrosos.
[062] Hasta ahora, no ha estado disponible una vacuna eficaz contra todas las cepas de virus del dengue. Se han desarrollado vacunas candidatas atenuadas vivas individuales para los cuatro serotipos mediante pases en serie de virus naturales en células primarias de riñón de perro (PDK) u otros tipos de células. Tal como se ha descrito anteriormente, el virus PDK-53 es una útil vacuna candidata del dengue. Sin embargo, una vacuna derivada de PDK-53 proporcionaría únicamente inmunidad contra el serotipo de DEN-2.
[063] Para evitar la posible incidencia de la DHF/DSS en pacientes vacunados contra únicamente un serotipo del virus del dengue, se necesita una vacuna tetravalente que proporcione inmunidad simultánea para los cuatro serotipos del virus. Se puede producir una vacuna tetravalente combinando el PDK-53 del dengue 2 con las quimeras del dengue 2/1, dengue 2/3 y dengue 2/4 descritas anteriormente en un vehículo farmacéutico adecuado para la administración como vacuna multivalente.
[064] Los virus quiméricos o ácidos nucleicos quiméricos que se describen pueden comprender los genes estructurales de cualquier virus natural o atenuado en una estructura del virus DEN-2 virulenta o una atenuada. Por ejemplo, la quimera puede expresar los genes de las proteínas estructurales del virus DEN-1 16007 natural o de su vacuna candidata PDK-13 derivada de cualquiera de los antecedentes del DEN-2 PDK-53.
[065] Tal como se describe en el Ejemplo 1, todos los virus DEN-2/1 quiméricos que contienen las proteínas C, prM y E de cualquier virus DEN-1 16007 (quimeras DEN-2/1-EP y VP) o virus PDK-13 (quimeras DEN-2/1-EV y VV) en las estructuras de DEN-2 PDK-53 retienen todos los marcadores de atenuación fenotípicos del virus DEN-2 PDK
53. Los virus quiméricos DEN-2/1 EO y VP, que contienen las proteínas C, prM y E del virus DEN-1 16007 son más estables genéticamente después de pasar por el cultivo celular que en los virus DEN-2/1-EV y VV. La inmunogenicidad de los virus quiméricos que expresan las proteínas estructurales del virus DEN-1 16007 fue mayor en comparación con los títulos de anticuerpos neutralizantes estimulados por el virus de la vacuna PDK-13 y las quimeras que expresan las proteínas estructurales del virus PDK-13. De esta manera, los virus DEN-2/1-EP y VP quiméricos, que expresan los genes estructurales del virus DEN-1 16007 natural dentro del antecedente genético de las dos variantes de DEN-2 PDK-53, son potenciales vacunas candidatas DEN-1) que son superiores a la vacuna candidata PDK-13. Estas dos quimeras se replican bien en células LLC-MK2 y retienen los marcadores de atenuación asociados con el virus DEN-2 PDK-53, entre los que se incluyen un tamaño pequeño de la placa, sensibilidad a la temperatura, replicación restringida en células de mosquito y la atenuación en ratones. Son al menos tan inmunógenas como el virus DEN-1 16007 natural en ratones.
[066] Otros ejemplos, tales como las quimeras DEN-2/3 y DEN-2/4, en los Ejemplos 2-4, mostraron también que los virus quiméricos que contienen genes de proteínas estructurales procedentes de los virus DEN-3 o DEN-4 naturales contenidas en las estructuras de DEN-2 PDK-53, son vacunas candidatas adecuadas que retienen todos los marcadores fenotípicos de los virus DEN-2 PDK-53 (Tabla 14) proporcionando a la vez inmunogenicidad frente a los virus DEN-3 o DEN-4. La estrategia descrita en la presente memoria descriptiva de usar un antecedente genético que contiene los determinantes de la atenuación en regiones no estructurales del genoma que expresa los genes de las proteínas estructurales de los virus heterólogos ha conducido al desarrollo de vacunas candidatas de flavivirus atenuados vivos que expresan los genes de las proteínas estructurales naturales de óptima inmunogenicidad. De esta manera, se pueden diseñar vacunas candidatas para las variantes inmunógenas de múltiples patógenos flavivíricos.
[067] Los virus usados en las quimeras descritas en la presente memoria descriptiva se hacen crecer de forma típica usando técnicas conocidas en la materia. A continuación se llevan a cabo titulaciones en placa de los virus y se cuentan las placas con el fin de evaluar la viabilidad y las características fenotípicas de los cultivos en crecimiento. Los virus naturales se pasan a través de líneas de células cultivadas para derivar los materiales de partida de los candidatos atenuados.
[068] Se construyeron clones infecciosos quiméricos a partir de varios clones de serotipos del dengue disponibles. Se puede llevar también a cabo, si se desea, la clonación de los fragmentos de ADNc específicos del virus. Los fragmentos de ADNc que contienen los genes de la proteína estructural o de la proteína no estructural se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir del ARN del virus del dengue con diversos cebadores. Los fragmentos amplificados se clonan en los sitios de escisión de otros clones intermedios. Los clones quiméricos intermedios del virus del dengue se secuencian a continuación para verificar la fiabilidad del ADNc específico del virus del dengue insertado.
[069] Los plásmidos quiméricos con el genoma de longitud completa construidos mediante la inserción de la región del gen de la proteína estructural o de la proteína no estructural de los virus con serotipo del dengue en vectores son obtenibles usando técnicas recombinantes bien conocidas por los expertos en la materia.
Análisis de nucleótidos y de aminoácidos
[070] Se proporciona la secuencia de nucleótidos de DEN-2 PDK-53 en la SEQ ID NO: 15. Se proporcionan las secuencias de aminoácidos de DEN-2 PDK-53-V en la SEQ ID NO: 16. Se describe adicionalmente en la Tabla 3 la variante E de PDK-53, que varía de PDK-53-V en la posición del nucleótido 5270 y en la posición del aminoácido 1725 de la poliproteína. En la Tabla 3 se muestra una comparación de las sustituciones críticas de nucleótidos y aminoácidos que se han descubierto entre la cepa parental y el virus atenuado Las secuencias de los amplicones del ADNc de DEN-2 se amplificó a partir del ARN genómico vírico de DEN-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR).
[071] A diferencia de PDK-53, que no contiene mutaciones de aminoácidos en la proteína E con respecto al virus del dengue 2 natural, los virus atenuados Mahidol DEN-1, DEN-3 y DEN-4 tienen todos mutaciones de aminoácidos en la proteína E (Tabla 2, 4 y 5).
[072] Cada uno de los últimos tres virus posee una mutación Glu a Lys (parental a vacuna) en la proteína E, aunque la mutación se localiza en un resto de aminoácido diferente en la proteína E. Esta sustitución produce un cambio de un aminoácido cargado negativamente a otro cargado positivamente. La sustitución Glu a Lys en la proteína E del virus de la vacuna DEN-4 fue la única mutación presente en la proteína E, mientras que las proteínas E de los virus de la vacuna DEN-1 y DEN 3 tenían cinco y tres mutaciones de aminoácidos, respectivamente.
[073] La mutación NS1-53 en el virus de la vacuna DEN-2 PDK-53 es significativo para el fenotipo atenuado de este virus, debido a que la NS1-53-Gly del virus DEN-2 16681 se conserva en casi todos los flavivirus, incluyendo los virus transmitidos por garrapatas, secuenciados hasta la fecha. El virus de la vacuna Mahidol DEN-4 contiene también una mutación de aminoácidos en la proteína NS1 en la posición 253. Este locus, que tiene una mutación Gln a His en el virus de la vacuna DEN-4 PDK-48 es Gln en los cuatro serotipos naturales del virus del dengue. Este resto Gln es único en los virus del dengue dentro del género flavivirus. La proteína NS1 es una glicoproteína que se segrega a partir de células infectadas por flavivirus. Está presente sobre la superficie de la célula infectada y anticuerpos específicos de NS1 está presentes en el suero de los individuos infectados con el virus. Se ha informado de la protección de animales inmunizados con la proteína NS1 o pasivamente con el anticuerpo específico de NS1. La proteína NS1 parece participar en la replicación temprana del ARN vírico.
[074] Las mutaciones que se produjeron en las proteínas NS2A, NS2B, NS4A, y NS4B de las cepas atenuadas DEN-1, 2, 3 y 4 fueron todas de naturaleza conservativa. Las mutaciones NS4A-75 y NS4A-95 de los virus de las vacunas DEN-2 y DEN-4, respectivamente, se produjeron en sitios de conservación de aminoácidos entre los virus del dengue, pero no entre los flavivirus en general.
[075] La proteína NS3 flavivírica posee al menos dos funciones reconocidas: la proteinasa vírica y la ARN helicasa/NTPasa. La proteína NS3 de 698 aa (virus DEN 2) de longitud contiene un dominio aminoterminal de la serina proteasa (tríada catalítica NS3-51-His, 75-Asp, 135-Ser) que está seguido por los motivos de la secuencia para las funciones de la ARN helicasa/NTPasa). Ninguna de las mutaciones en las proteínas NS3 del virus DEN-1, DEN-2, o DEN-3 se produjo con un motivo reconocido. La mutación NS3-510 Tyr a Phe en el virus DEN-1 PDK-13 fue conservativa. Debido a que los virus DEN-2, 3 y 4 naturales contienen Phe en esta posición, es improbable que la mutación Tyr a Phe juegue un papel en la atenuación del virus DEN-1. La mutación NS3-182 Glu a Lys en el virus DEN-1 PDK 13 se produjo en la posición que se conserva como Asp p Glu en la mayor parte de los flavivirus transmitidos por mosquitos y puede jugar algún papel en la atenuación. Tal como se ha señalado en informes anteriores, la NS3-250-Glu en el virus DEN-2 16681 se conserva en todos los flavivirus transmitidos por mosquitos, excepto para el virus de la fiebre amarilla.
Procedimiento de administración
[076] Las quimeras víricas descritas en la presente memoria descriptiva se combinan individualmente o junto a un portador farmacéuticamente aceptable o vehículo de administración en forma de un inmunógeno o vacuna para seres humanos o animales. Los términos “portador farmacéuticamente aceptable” o “vehículo farmacéuticamente aceptable” se usan en la presente memoria descriptiva para denotar cualquier composición o compuesto que incluya, pero sin limitarse a, agua o solución salina, un gel, salvia, disolvente, diluyente, fluido base de pomada, liposoma, micela, micela gigante, y similares, que sea adecuado para el uso en contacto con un tejido de animal vivo
o de ser humano sin producir respuestas fisiológicas adversas, y que no interactúa con los otros componentes de la composición de una manera perjudicial.
[077] Las formulaciones inmunógenas o de vacunas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria UFP vírica y preparada mediante el uso de técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo y el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación de manera uniforme e íntima el ingrediente activo con vehículos líquidos. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas y no acuosas para inyección estéril que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales herméticos, y pueden almacenarse en estado criocongelado (liofilizado) que requiere únicamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso.
Se pueden preparar disoluciones y suspensiones para inyecciones extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles comúnmente usados por una persona normalmente experta en la técnica.
[078] Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una de sus fracciones apropiadas del ingrediente administrado. Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones pueden incluir otros agentes comúnmente usados por una persona normalmente experta en la técnica.
[079] La composición inmunógena o de vacuna se puede administrar mediante diferentes rutas, tales como oral o parenteral, que incluyen, pero no se limitan a, bucal y sublingual, rectal, parenteral, en aerosol, nasal, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y tópica. La composición se puede administrar en diferentes formas, que incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas y liposomas. Se espera que se puedan requerir entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 dosis por pauta de inmunización. Las dosis inicial puede variar entre aproximadamente 100 y aproximadamente 50.000 UFP, con un intervalo de dosificación preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 20.000 UFP, un intervalo de dosificación más preferido de entre aproximadamente 1000 a aproximadamente 12.000 UFP y el intervalo de dosificación más preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 4000 UFP. Las inyecciones de un estímulo de refuerzo pueden variar en la dosificación entre aproximadamente 100 y aproximadamente 20.000 UFP, con un intervalo de dosificación preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 15.000, un intervalo de dosificación más preferido de aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000 UFP, y el intervalo de dosificación más preferido de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 UFP. Por ejemplo, el volumen de administración variará dependiendo de la ruta de administración. Las inyecciones intramusculares variarán en volumen desde aproximadamente 0,1 ml a 1,0 ml.
[080] La composición se puede almacenar a temperaturas de entre aproximadamente -100ºC a aproximadamente 4ºC. La composición también puede almacenarse en un estado liofilizado a diferentes temperaturas incluyendo a temperatura ambiente. La composición se puede esterilizar mediante los medios convencionales que conoce una persona normalmente experta en la técnica. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, filtración. La composición puede combinarse también con agentes bacteriostáticos, tales como timerosal, para inhibir el crecimiento bacteriano.
Calendario de administración
[081] La composición inmunógena o de vacuna descrita en la presente memoria descriptiva se puede administrar a seres humanos, especialmente individuos que viajan a regiones en las que está presente el virus del dengue, y también a los habitantes de aquellas regiones. El tiempo óptimo de administración de la composición es aproximadamente de uno a tres meses antes de la infección inicial. Sin embargo, se puede administrar la composición después de la infección inicial para mejorar el progreso de la enfermedad, o después de la infección inicial para tratar la enfermedad.
Adyuvantes
[082] Se puede administrar una variedad de adyuvantes conocidos por una persona normalmente experta en la técnica junto con el virus quimérico en una composición inmunógena o de vacuna. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes polímeros, copolímeros tales como copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, incluyendo copolímeros en bloque, polímero P1005, adyuvante completo de Freund (para animales), adyuvante incompleto de Freund; monooleato de sorbitán, escualeno, adyuvante CRL-8300, alúmina, QS 21, dipéptido de muramilo, motivos de oligonucleótidos CpG y combinaciones de motivos de oligonucleótidos CpG, trehalosa, extractos bacterianos, incluyendo extractos micobacterianos, endotoxinas detoxificadas, lípidos de membrana, o sus combinaciones.
Secuencias de ácidos nucleicos
[083] Las secuencias de los ácidos nucleicos de los virus DEN-1 16007 DEN-1 PDK-13, DEN-2 16681, DEN-2 PDK-53 (SEQ ID NO:15), DEN-316562, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3, DEN-4 1036 y DEN-4 PDK-13 son útiles para diseñar sondas y cebadores de ácidos nucleicos para detectar el virus del dengue en una muestra o espécimen con elevada sensibilidad y especificidad. Se pueden usar sondas o cebadores correspondientes a cada subtipo vírico para detectar la presencia del virus DEN-1, del virus DEN-3 y del virus DEN-4, respectivamente, para detectar la infección del virus del dengue en general en la muestra, para diagnosticar la infección con el virus del dengue, para distinguir entre los diversos subtipos del virus del dengue, para cuantificar la cantidad de virus del dengue en la muestra, o para vigilar el progreso de las terapias usadas para tratar una infección por el virus del dengue. El ácido nucleico y las correspondientes secuencias de aminoácidos son también útiles como herramientas d investigación de laboratorio para estudiar los organismos y las enfermedades y para desarrollar terapias y tratamientos para las enfermedades.
[084] Las sondas de ácidos nucleicos se hibridan selectivamente con moléculas de ácidos nucleicos que codifican los virus DEN-1, DEN-3 y DEN-4 o sus secuencias complementarias. Por “selectiva” o “selectivamente” se entiende una secuencia que no se hibrida con otros ácidos nucleicos para evitar la adecuada detección del virus del dengue. Por tanto, en el diseño de los ácidos nucleicos hibridantes, la selectividad dependerá del resto de componentes presentes en la muestra. El ácido nucleico hibridante debería tener al menos un 70% de complementariedad con el segmento del ácido nucleico con el cual se hibrida. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva para describir ácidos nucleicos, el término “hibrida selectivamente” excluye los ácidos nucleicos que se hibridan aleatoriamente de manera ocasional, y de esta manera, tiene el mismo significado que “que se hibridan específicamente”. El ácido nucleico que se hibrida selectivamente puede tener al menos un 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, y 99% de complementariedad con el segmento de la secuencia a la cual se hibrida, preferiblemente un 85% o más.
[085] La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes, que no se construyen de ninguna manera como limitaciones impuestas al alcance de la misma,
[086] La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La materia sujeto de los ejemplos 1, 5 y 6 se incluye a efectos comparativos.
Ejemplo 1
Preparación de una vacuna quimérica del dengue 1: PDK-53/Dengue 1
Cultivos de virus y células
[087] Se dispuso de los virus DEN-1 16007 y DEN-2 16681 naturales procedentes de la colección almacenada en los Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA). Se recuperó el virus DEN-1 16007 del suero de un paciente con DHF/DSS en 1964 en Tailandia. Se aisló el virus siguiendo tres pases en células BS-C-1 de riñón de mono verde y un pase en células LLC-MK2, pasado dos veces en mosquitos Toxorhynchites amboinensis, y a continuación se pasó en células primarias de riñón de perro (PDK) en el Center for Vaccine Development, Mahidol University, Tailandia, para derivar el virus de la vacuna candidata DEN-1 PDK-13 (Yoksan y col., "Dengue virus vaccine development: study on biological markers of uncloned dengue 1-4 viruses serially passaged in primary kidney cells," pp. 35-38, En Arbovirus research in Australia, Proceedings of the Fourth Symposium. CSIRO/QIMR, Brisbane, Australia (1986); Bhamarapravati y Sutee, Vaccine 18: 44-47 (2000)). Se usó un único pase en LLC-MK2 de este virus de vacuna candidata (lote de 10 de marzo de 1989), a no ser que se mencione otra cosa. Tras los pases en el moquito anteriormente mencionados, se pasó el virus 16007 una vez en células LLC-MK2 para el uso.
[088] Los virus se hicieron crecer en células LLC-MK2 y C6/36 en medio esencial mínimo modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía penicilina/estreptomicina y suero bovino fetal al 5% (FBS). Se llevaron a cabo titulaciones de la placa del virus en placas de 6 pocillos de células Vero o LLC-MK2 confluentes tal como se ha descrito anteriormente (Miller y col., Am. J. Trop. Med. & Hyg. 35: 1302-1309 (1986)). Los primeros 4 ml de medio sobrenadante – contenían agarosa SeaKem LE al 1% (FMC BioProducts, Rockland, Maine) en medio nutriente (hidrolizado de lactoalbúmina al 0,165% [Difco Laboratories, Detroit, Mich.]), extracto de levadura al 0,033% [Difco], solución salina equilibrada de Earl, 25 mg/l de sulfato de gentamicina [Bio Whittaker, Walkersville, Md.], 1,0 mg/l de anfotericina B [Fungizone, E. R. Squibb & Sons, Princeton, N.J.], y FBS al 2%) – se añadió después de la adsorción de 200 μl del inóculo del virus durante 1,5 h a 37ºC. Tras la incubación a 37ºC durante 7 días, se añadieron unos segundos 2 ml de sobrenadante conteniendo 80 μg/ml más de colorante vital de rojo neutro (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.). se contaron las placas 8 a 11 días después de la infección.
Construcción de clones infecciosos D2/1 quiméricos
Vectores pD2-16681-P48, pD2-PDK53-E48, pD2-PDK53-V48
[089] Se usaron tres vectores DEN-2 para la construcción de los clones D2/1 quiméricos. Estos se modificaron a partir de los clones DEN-2 infecciosos notificados por Kinney y col. (Virology 230: 300-308 (1997)). El clon pD216681-P48 se modificó a partir de pD2/IC-30P-A para contener los sitios de clonación MluI y NgoMIV en las posiciones de los nucleótidos 451 y 2380, respectivamente. Se introdujeron los mismos sitios de clonación en ambos clones específicos del virus DEN-2 PDK-53, pD2/IC-130Vx-4 y -130Vc-K, y los clones modificados se designaron como pD2-PDK53-E48 y pD2-PDK53-V48, respectivamente. Se encontraron dos errores en la clonación en el pD2/IC-130Vx-4 y -140Vc-K originales en el nt 6665 y en el nt-8840. Estos defectos se corrigieron en pD2-PDK53-E48 y -V48. El sitio de clonación NgoMIV introducido dio como resultado dos mutaciones de nucleótidos (nt 2381 y 2382; TG a CC), que codificaron una sustitución de Val a Ala en E-482. Los cambios de nucleótidos introducidos en el sitio MluI fueron silenciosos. El sitio MluI introducido en la unión C/prM se usó para clonar los genes prM-E de los virus heterólogos.
pD2/1-PP, -EP, -VP, -PV, -EV, y –VV quiméricos
[090] Se construyeron dos clones DEN-2 intermedios, pD2I-P y pD2I-E, eliminando los fragmentos HpaI (nt-2676) a XbaI (término 3’ del ADNc genómico vírico) de pD2-16681-P48 y pD2-PDK53-E48, respectivamente. Estos clones intermedios se usaron para subclonar fragmentos de ADNc específicos del virus DEN-1. Los fragmentos de ADNc que contenían los genes C-prM-E del virus DEN-1 16007 o PDK-13 se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa – transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de ARN vírico de DEN-1 con los cebadores DENBg1.5NC (5’-TAGAGAGCAGATCTCTG-3’ (SEQ ID NO: 31); secuencia conservada en el 5’NCR de los genomas víricos del dengue, secuencia subrayada en un sitio BgIII) y cD1-2394.Ngo:
(5’-TGTGACCATGCCGGCTGCGATGCACTCACCGA-3’ (SEQ ID NO: 32); sitio NgoMIV subrayado seguido por la secuencia complementaria próxima al extremo 3’ del gen E del virus DEN-1). Los fragmentos amplificados se clonaron en los sitios BgIII-NgoMIV de los clones pD2I-P y pD2I-E intermedios. Los clones pD2/1 quiméricos intermedios se secuenciaron para verificar la fiabilidad del ADNc específico del virus DEN-1 insertado. Los fragmentos escindidos desde los clones pD2/1 intermedios con SstI (que precede al promotor T7) y NgoMIV se clonaron en los vectores DEN-2 con genoma de longitud completa, pD2-16681-P48, pD2PDK53-E48, y pD2-PDK53-V48. Se construyeron seis plásmidos pD2/1 quiméricos con genoma de longitud completa insertando la región del gen C-prM-E del virus DEN-1 16007 o PDK-13 en estos tres vectores (FIG. 1). Los plásmidos se designaron pD2/1-XY y sus virus derivados se designaron DEN2/1-XY, en el que X = los antecedentes del clon DEN-2 infeccioso (P = clon 16881 parental, E variante PDKS3-E, V = variante PDK53-V) e Y = inserción C-prM-E específica del virus DEN-1 (P = cepa 16007 parental, V = Vacuna PDK-13 candidata). La estructura de PDK53-E contiene tres mutaciones de aminoácidos específicas del virus DEN-2 PDK-53 (NS153-Asp, NS2A-181-Phe y NS4A-75-Ala) así como la mutación 5’NC-57 del virus PDK-53. La estructura de PDK53-V contiene estos mismos loci específicos del virus PDK-53 más el locus NS3-250-Cal específico de virus PDK-53 adicional.
Recuperación de virus recombinantes
[091] Todos los plásmidos recombinantes se hicieron crecer en células Escherichia coli XL1-Blue. Se transcribió el ARN vírico recombinante y se bloqueó con el m7GpppA bloqueado análogo procedente de 200-400 ng de ADNc linealizado con XbaI, y se transfectó en 3-4 x 106 células LLC-MK2 o BHK-21 mediante electroporación. Las células transfectadas se transfirieron a matraces de 75 cm2 en medio DMEM que contenía FBS al 10%. Las proteínas víricas expresadas en las células transfectadas se analizaron mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA). Las células infectadas con virus se fijaron en acetona fría con hielo durante 30 min. Se usaron en el ensayo anticuerpos monoclonales 1F1 y 3H5, respectivamente, específicos de los virus DEN-1 y DEN-2, y se detectó la unión con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón marcado con fluoresceína. Se cosecharon los virus después de 8 a 10 días, y a continuación se pasaron en células LLC-MK2 una vez (DEN-2-16681-P48, DEN-2 PDK53-E48 y -V48, DEN-2/1-PP, - EP, y -VP) o dos veces (DEN-2/1-PV, -EV, y - VV) para obtener las siembras de trabajo. Los virus D2/1-EV y – VV se pasaron una tercera vez en células LLC-MK2 para obtener títulos víricos mayores requeridos para el estímulo o la inmunización de los ratones.
Caracterización de los fenotipos de replicación de virus quiméricos en cultivos celulares
[092] Se midieron los tamaños de las placas 10 días después de la infección en células LLC-MK2. Se calcularon los diámetros promedio de placa a partir de 10 placas de cada virus. Se llevaron a cabo las curvas de crecimiento vírico en matraces de 75 cm2 de células LLC-MK2 o C6/36 a aproximadamente una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0,001. Tras la adsorción durante 2 h, se añadieron 30 ml de medio DMEM (para células LLC-MK2) o de medio nutriente sobrenadante (para células C6/36) que contenía FBS al 5% y penicilina/estreptomicina, y se incubaron los cultivos en CO2 al 5% a 37ºC o 29ºC, respectivamente. Se cosecharon alícuotas de medio de cultivo a intervalos de 48 h durante 12 días, se ajustaron en FBS al 12,5%, y se almacenaron a -89ºC antes de la titulación.
[093] Se ensayó la sensibilidad a la temperatura en células LLC-MK2. Las células que crecieron en dos conjuntos de matraces de 75 cm2 se infectaron e incubaron tal como se ha descrito para el estudio de crecimiento. Un conjunto de cultivos se incubó durante 8 días a 37ºC, el otro a 38,7ºC. Se calculó la relación del título del virus a 38,7ºC frente al título a 37ºC. Se designó el virus como sensible a la temperatura si el título del virus a 38,7ºC se redujo un 60% o más, con respecto a su título a 37ºC.
Secuenciación del ADNc vírico
[094] Se extrajo el ARN vírico de la siembra de virus o usando el kit QIAmp Viral RNA (Qiagen, Valencia, Calif.). Los cebadores específicos del virus DEN-1 se basaron en los datos publicados de la cepa Singapore S275/90 (Fu y col., Virology 88: 953-958 (1992)). Cinco de los 7 fragmentos de ADNc vírico solapante se amplificaron mediante la RT-PCR con el Sistema Titan One-Tube RT-PCR (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.). Ambas cadenas de los amplicones de ADNc se secuenciaron directamente. Para la secuenciación del genoma vírico de DEN-1 PDK-13, se extrajo el ARN genómico del molde directamente de un vial de una vacuna DEN-1 PDK-13 candidata (lote de 10 de marzo de 1989). Se determinaron las secuencias 5’ y 3’ terminales de los genomas víricos de DEN-1 16007 y DEN-1 PDK-13 con el kit 5’ RACE (GIBCO BRL) y encolando el ARN genómico con poli(A). Se llevó a cabo la secuenciación automatizada tal como se recomendaba en un secuenciador PRISM 377 (PerkinElmer/Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
Estudios con ratones
[095] Camadas de crías de ratones ICR blancos exogámicos de un día de edad se inocularon intracranealmente con 5.000 UFP de virus en un volumen de 30 ml. Se observaron diariamente para la parálisis y la muerte, y los ratones supervivientes se pesaron individualmente una vez cada semana durante 5 semanas.
[096] Se ensayaron respuestas de anticuerpos neutralizantes en ratones ICR de 3 semanas de edad. Se inocularon por vía intraperitoneal con 104 UFP de virus, y se realizó un estímulo de refuerzo con la misma cantidad de virus 3 semanas o 6 semanas después. Los ratones se sangraron 2 días antes del estímulo inicial y 3 semanas después del estímulo inicial.
[097] El linaje ICR de ratones engendrados de manera endogámica usados anteriormente no es normalmente susceptible de manera fatal al estímulo con el virus DEN-1 natural. Por tanto, para ensayar completamente la capacidad de la quimera vírica DEN-2/1 de inducir una respuesta inmune eficaz, fue necesario utilizar ratones AG129 endogámicos, que carecen de receptores para el interferón alfa/beta y el interferón gamma (Muller y col., Science 264: 1918-1921 (1994)), ya que se ha encontrado que estos ratones son susceptibles al estímulo intraperitoneal con altas dosis de virus DEN-1 natural, cepa Mochizuki. Por tanto, se inmunizaron ratones AG-129 endogámicos de 3,5-4,5 semanas de edad por vía intraperitoneal con 104 UFP de DEN-1 16007 natural, vacuna candidata Mahidol DEN-1 PDK-13, virus DEN-2/1-EP quimérico o virus DEN-2/1-VP quimérico. Estos ratones inmunizados se estimularon por vía intraperitoneal con una dosis letal de virus DEN-1 Mochizuki.
Ensayos de neutralización
[098] Se ensayaron muestras de suero de ratón para los anticuerpos neutralizantes mediante el ensayo de neutralización con reducción de placa dilución de suero (PRNT). Se incubaron sesenta UFP de virus DEN-1 16007 con diluciones en serie 2 veces, de especímenes de suero de ratón inactivados térmicamente (56ºC durante 30 min) durante la noche a 4ºC. se identificó el título del anticuerpo neutralizante como la dilución en serie más elevada que redujo el número de placas de virus en el ensayo en un 50% o más.
Resultados
[099] Para evaluar el potencial del los clones de ADNc infecciosos derivados de las dos variantes del virus DEN-2 16681 PDK-53 (PDK-53-E y PDK-53-V) para servir como vectores para el desarrollo de la vacuna, los inventores genomanipularon clones de ADNc de DEN-2/DEN-1 quiméricos (D2/1-EP, D2/1-VP, D2/1-EV, y D2/1-VV) que contenían los genes estructurales (C-prM-E) del virus DEN-1 16007 natural o de su vacuna derivada, la cepa PDK13, dentro de la estructura de estos dos vectores (FIG. 1). Se construyeron también otros dos clones quiméricos, D2/1-PP y D2/1-PV, que contenían los genes estructurales (C-prM-E) del virus DEN-1 16007 o PDK-13 en la estructura del virus DEN-2 16681 natural, para comparación (FIG. 1). Los inventores secuenciaron el ADNc genómico de longitud completa en todos los clones infecciosos. Se incorporó un artefacto de ADNc silencioso en los clones quiméricos en el nt 297 (T a C), Se genomanipuló una mutación silenciosa en el nt 1575 (T a C) en todos los clones quiméricos para eliminar el sitio XbaI natural en el gen E del virus DEN-1.
[0100] Los títulos tras la transfección de las células LLC-MK2 o BHK-21 fueron de 10º - 106 UFP/ml para los virus quiméricos D2/1-PP, -EP, y –VP que contenían los C-prM-E del virus DEN-1 16007. Estos títulos aumentaron a
106,5-107,5
después de un único pase en células LLC-MK2, comparable a los títulos obtenidos para sus virus parentales. Títulos inferiores de 102-104 UFP/ml se obtuvieron en células transfectadas para los virus DEN-2/1-PV, -EV, y – VV quiméricos que contenían los C-prM-E del virus DEN-1 PDK-13. El virus D2/1-PV alcanzó 106 UFP tras 2 pases en células LLC-MK2. Mientras que los virus D2/1-EV y –VV alcanzaron los títulos de 103,3 – 105,3 UFP/ml tras dos a tres pases. Las células infectadas con cualquiera de los virus DEN-2/1 quiméricos fueron positivas mediante IFA con el anticuerpo monoclonal 1F1 (específico de la proteína DEN-1E) y negativos con el anticuerpo monoclonal 3H5 (específico de la proteína DEN-2E), indicando que las proteínas DEN-1E apropiadas se expresaron mediante las quimeras. Los genomas víricos DEN-2/1-PP, DEN-2/1-EP, y DEN-2/1-VP se secuenciaron completamente analizando directamente el solapamiento de los fragmentos amplificados mediante la RT-PCR del ARN vírico genómico extraído de las siembras maestras. Los tres genomas tuvieron la secuencia esperada.
Crecimiento de los virus quiméricos en cultivos de células LLC-MK2 y C6/36
[0101] Todos los virus DEN-2/1 quiméricos produjeron placas más pequeñas, con respecto a la placa de 6,8 ± 0,4 mm del virus DEN-1 16007 natural en células LLC-MK2 (FIG. 2A). Ambas placas víricas de DEN-2/1-EP (3,1 ± 0,3 mm) y -VP (2,8 ± 0,3 mm) fueron similares en tamaño a las de los virus DEN-1 PDK-13 (2,9 ± 0,3 mm). Los virus DEN-2/1-PV, DEN-2/1-EV, y DEN-2/1-VV que contenían el C-prM-E del virus DEN-1 PDK-13 formaron placas diminutas (1,3 ± 0,3 mm) o como puntitos (<1 mm). El virus DEN-2 16681-P48 produjo 3,5 ± 0,3 mm de placas que fueron similares a las placas del virus DEN-2 16681 natural. Los virus DEN-2 PDK53-V48 formaron placas que fueron más pequeñas y difusas que las del virus DEN-2 PDK53-E48. Las placas de 5,1 ± 0,3-mm del virus DEN-2/1-PP fueron más grandes que las de otros virus quiméricos, pero más pequeñas que las de los virus DEN-1 16007.
[0102] Se ensayaron los virus para la sensibilidad a la temperatura en células LLC-MK2. Se determinó la sensibilidad a la temperatura en el día 8 o 10 después de la infección tal como se indica en la FIG. 2B. La sensibilidad a la temperatura se basaba en la reducción de los títulos de los virus a 38,7ºC de los de a 37ºC. La sensibilidad a la temperatura se calculó a partir de las medidas tomadas en al menos 3 experimentos.
[0103] La variante DEN-2 PDK53-V (D2-PDK53-V48) fue más sensible a la temperatura que el virus DEN-2 PDK53-E (D2-PDK53-E48) y el virus DEN-2 16681 (DEN-2-16681-P48) fue algo sensible a la temperatura (70-87% de reducción en el título a 38,7%). Múltiples pruebas de sensibilidad a la temperatura para el virus DEN-2-PDK53-E48 dieron como resultado una reducción en el crecimiento de 83%-97%. El título del virus DEN-1 16007 se redujo es un 40% o menos a 38,7ºC convirtiendo al virus en el menos sensible a la temperatura en este estudio. Todos los virus quiméricos fueron sensibles a la temperatura con respecto al virus DEN-1 16007, y fueron al menos tan sensibles a la temperatura como PDK-13.
[0104] Todos los virus DEN-1, DEN-2, y D2/1 quiméricos alcanzaron los picos de los títulos entre 8 y 10 días después de la infección en células LLC-MK2 (FIG. 2B). Los virus derivados de clones DEN-2-16681-P48, DEN-2PDK53-E48, y DEN-2-PDK53-V48 se replicaron a 107,0 UFP o más, como hicieron los virus DEN-2 16681 y PDK-53. Aunque alcanzando un título del pico similar, el virus DEN-2-PDK53-V48 se replicó más lentamente que el virus DEN-2-PDK53-E48 durante los primeros 4 días después de la infección. Los virus DEN-2/1-PP, DEN-2/1-EP, DEN-2/1-VP, y DEN-2/1-PV quiméricos alcanzaron los títulos de los picos sobre las 106,7 UFP/ml, lo que fue comparable de los títulos de los picos de sus virus DEN-1 y DEN-2 parentales Los virus DEN-2/1-EV y –VV quiméricos, que tuvieron títulos de los picos de 105,6-105,9 UFP o menores en varios experimentos separados, se replicaron menos eficazmente que los otros virus.
[0105] Las quimeras específicas del virus PDK-13 dieron como resultado menores títulos de los virus recuperados a partir de las células transfectadas, con respecto a las quimeras específicas del virus 16007. Experiencias previas con las quimeras DEN-2/DEN-1 y DEN-2/DEN-4 indican que los virus quiméricos que presentan la replicación paralizada durante la transfección y desarrollan posteriormente elevados títulos de virus tras el pase en un cultivo celular acumulan a menudo mutaciones inesperadas. Pueden surgir virus de creciente capacidad replicativa a través de la selección de subpoblaciones de variantes de virus, dando como resultado errores de incorporación durante la transcripción in vitro del ADNc, Los virus quiméricos que se replicaron bien en células transfectadas fueron genéticamente más estables tras el pase en células LLC-MK2. Una replicación eficaz con un pase mínimo en cultivos de células de mamíferos puede ser un criterio importante de estabilidad y adecuabilidad genética para un virus de vacuna derivado de un clon infeccioso.
[0106] Se vigilaron las curvas de crecimiento vírico en células C6/36 tras la infección de células C6/36 a una multiplicidad aproximada de 0,001 UFP/ml (FIG. 3), los tres virus con estructura DEN-2, DEN-2-16681-P48, DEN-2PDK53-E48 y DEN-2-PDK53-V48, se replicaron de igual manera que el virus DEN-2 16681 original y las dos variantes de PDK-53, respectivamente. Ambos virus DEN-2-PDK53-E48 y DEN-2-PDK53-V48 se replicaron aproximadamente 4000 veces menos eficazmente que los virus DEN-2-16681-P48, DEN-1 16007 y PDK-13 en células C6/36. Los virus DEN-1 16007 y PDK-13 se replicaron con títulos elevados a 108,7 y 108,4, UFP/ml, respectivamente. El virus DEN-2/1-PP quimérico se replico a 105,2 UFP/ml, lo que fue equivalente a los títulos de los picos de las dos variantes DEN-2-PDK53 La replicación de los virus DEN-2/1-EP y DEN-2/1-VP quiméricos fue muy ineficiente en células C6/36. Estos virus alcanzaron títulos d los picos menores de 102 UFP/ml.
Neurovirulencia en ratones lactantes
[0107] Grupos de ratones ICR recién nacidos con 1 día de edad (n=16) se inocularon intracranealmente con 5000 UFO de virus. El virus DEN-2 16681 natural fue fatal en un 100% con un tiempo de supervivencia promedio a 14,1 ± 1,6 días, mientras que los virus DEN-2-PDK53-E48 y DEN-2-PDK53-V48 derivados de ambos clones fracasaron en matar cualquier ratón ICR. A diferencia del virus DEN-2 16681, que mata normalmente al 50% o más de los ratones estimulados, el virus DEN-1 16007 natural produjo solo una única fatalidad (21 días después del estímulo) en los ratones ICR. El virus DEN-1 PDK-13 no mata ninguno de los ratones ICR. Los ratones ICR infectados con el virus DEN-1 16007 tuvieron pesos corporales promedio significativamente menores (p<0,00003, test de la t de Student), con respecto al grupo control inoculado con diluyente, entre 21-35 días después del estímulo. Todos los grupos de ratones ICR estimulados con cinco virus DEN-2/1 quiméricos (no se ensayó el virus DEN-2/1-VV) tuvieron menores pesos promedio (p<0,02) en comparación con el grupo control, pero sus pesos promedio fueron significativamente mayores (p<0,004) que los del grupo DEN-1 16007 28 días después de la infección. Los pesos corporales promedio de los grupos de ratones ICR estimulados con 104 UFP del virus DEN-1 16007 o PDK-13 fueron casi idénticos a aquellos de los ratones ICR estimulados con 5000 UFP del virus DEN-1 16007 entre 7-35 días después del estímulo.
Inmunogenicidad de los virus DEN-2/1 quiméricos en ratones
[0108] Ratones ICR exogámicos: Para ensayar la inmunogenicidad de los virus quiméricos, grupos de ratones ICR de 3 semanas de edad (n=8) se inmunizaron por vía intraperitoneal con 104 UFP de virus en el Experimento 1 y el Experimento 2 (Tabla 7). En el Experimento 1, se extrajo sangre de los ratones 20 días después de la inmunización primaria y a continuación se realizó un estímulo de refuerzo 2 días después. La Tabla 7 muestra la inversa de los títulos de PRNT cuyo criterio de valoración es la reducción en el 50% de la placa de las muestras de suero combinadas de cada grupo inmunizado. Se muestra también el intervalo de títulos individuales para los ocho ratones en muchos de los grupos. En ambos experimentos, la inversa del título del suero combinado de los ratones inmunizados con el virus 16007 fue de 80 antes del refuerzo y de 2560 después del refuerzo. En ambos experimentos, los ratones inmunizados con virus DEN-2/1-PP, -EP, o DEN-2/1-VP quiméricos tuvieron un título del suero combinado que fue al menos tan elevado como los de los grupos inmunizados con el virus 16007 antes (inversa de los títulos de 40-160) y después (inversa de los títulos de 2560-5210) del refuerzo. Las respuestas inmunes de los ratones en estos grupos de virus fueron casi equivalentes en el Experimento 1 y el Experimento 2.
[0109] El virus PDK-13 y las tres quimeras que contenían los genes estructurales de PDK-13 indujeron inversas de títulos de PRNT mínimos o bajos de 10-20 frente al virus DEN-1 16007 en los 20 días después de la primera inmunización en el Experimento 1. Se estimuló una inversa de título de PRINT algo mayor de 40 por cada uno de estos virus 41 días después de la inmunización en el Experimento 2. El desarrollo de anticuerpos neutralizantes fue inferior y de menor magnitud tras la inmunización con el virus PDK-13, DEN-2/1-PV, - EV, o –VV que con el virus 16007, DEN-2/1-PP, -EP, o –VP en estos ratones. Un ratón en el grupo DEN-2/1-PV en el Experimento 1 y un ratón en cada uno de los grupos DEN-2/1-EV en ambos experimentos fracasaron en producir un título de PRNT detectable antes del estímulo de refuerzo. Los títulos reforzados fueron también mayores para los grupos PDK-13, DEN-2/1-PV, -EV, y –VV inmunizados en el Experimento 2 (inversa de los títulos combinados de 160-2560) que en el Experimento 1 (inversa de los títulos combinados de 80). Excepto en el grupo DEN-2/1-PV en el Experimento 2, estos títulos reforzados fueron inferiores a los de los títulos de PRNT reforzados inducidos por el virus 16007 natural y los virus DEN-2/1-PP, -EP, y –VP quiméricos que contienen los genes estructurales del virus DEN-1 16007 natural (Tabla 7). El título de PRNT elevado obtenido para el suero combinado de los ratones reforzados con el virus DEN-2/1-PV dio como resultado que el suero de dos ratones tuviera inversa de los títulos de 2560 y 10.240. Los restantes 6 ratones en este grupo tuvieron una inversa de los títulos de 20 a 640, que fueron similares a las de los títulos individuales de los ratones en los grupos PDK-13, DEN-2/1-EV, y –VV. Los virus PDK-13, DEN-2/1-PV, DEN-2/1-EV, y DEN-2/1-VV parecieron ser menos inmunógenos que los virus 16007, DEN-2/1-PP, -EP, y –VP en estos ratones exogámicos. Las muestras de suero combinadas de los ratones inmunizados con virus DEN-2-16681-P48, DEN-2-PDK-53-E48, o DEN-2-PDK-53-V48 no contienen anticuerpos neutralizantes cruzados contra el virus DEN-1 16007.
[0110] Ratones AG-129 endogámicos: Para ensayar la inmunogenicidad de los virus quiméricos, grupos de ratones AG-129 endogámicos de 3,5-4,5 semanas de edad se inmunizaron por vía intraperitoneal con 104 UFP del virus DEN-1 16007 natural, vacuna candidata de Mahidol DEN-1 PDK-13, DEN-2/1-EP quimérico, o DEN-2/1-VP quimérico A los 26 días después de la primera inmunización, los sueros combinados de los ratones inmunizados con virus DEN-2/1-EP o DEN-2/1-VP quiméricos tuvieron una inversa de los títulos de anticuerpos neutralizantes con reducción de placa dilución del suero de un 70% (PRNT70) de 80-160. Estos títulos fueron equivalentes (en 2 veces) a la respuesta del anticuerpo neutralizante estimulada por la vacuna candidata DEN-1 PDK-13, pero inferiores del título de 640 estimulado por el virus DEN-1 16007 natural. Los ratones del control inyectados por vía intraperitoneal con solución salina tamponada con fosfato tuvieron títulos de menos de 10. Todos los ratones se estimularon por vía intraperitoneal con 107 UFP de virus DEN-1 virulento natural, cepa Mochizuki, a los 28 días después de la primera inmunización. Todos los once ratones no inmunizados del control murieron en los 21 días (tiempo de supervivencia promedio de 11,5 ± 4,2 días [promedio ± desviación estándar]) tras el estímulo, mientras que todos los ratones inmunizados con el virus DEN-1 (16007, PDK-13, DEN-2/1-EP, DEN-2/1-VP) sobrevivieron al estímulo con el virus DEN-1 Mochizuki. A los 34 días después del estímulo con DEN-1 Mochizuki, todos los ratones inmunizados con el virus tuvieron los títulos de PRNT70 recíprocos de 1280-2560. Los virus DEN-2/1 y DEN-2/1-VP fueron muy inmunógenos y protectores para los ratones AG-129.
Análisis de las secuencias de nucleótidos de los genomas víricos de DEN-1 16007 y PDK-13
[0111] Los inventores secuenciaron los genomas del virus DEN-1 16007 natural (número de acceso del GenBank AF180817) y su vacuna derivada de PDK-13 (número de acceso AF180818). Hubo diferencias en 14 nucleótidos y 8 aminoácidos codificados entre los virus 16007 y PDK-13 (Tabla 2). Se produjeron mutaciones silenciosas en las posiciones 1567, 2695, 2782, 7330, y 9445 de nucleótidos del genoma, en los genes E, NS1, NS4B, y NS5. A diferencia del virus de la vacuna candidata DEN-2 PDK-53 que no tuvo mutaciones de aminoácidos en la proteína E, el virus DEN-1 PDK-13 tuvo cinco mutaciones de aminoácidos en E, que incluían E-130 Val a Ala, E-203 Glu a Lys, E-204 Arg a Lys, E-225 Ser a Leu, y E-447 Met a Val. Las mutaciones de aminoácidos en los genes no estructurales incluyeron NS3-182 Glu a Lys, NS3-510 Tyr a Phe, y NS4A-144 Met a Val. El virus PDK-13, específico de E-447-Val se incorporó en todas las construcciones quiméricas.
Inmunización de monos con virus DEN-2/1 quiméricos
[0112] Se ensayó la inmunogenicidad de los virus DEN-2/1-EP y DEN-2/1-VP en macacos comedores de cangrejos (Macaca fascicularis). La inmunización de los monos se llevó a cabo por medio de una inyección subcutánea con 106 UFP de virus DEN-2/1-EP o DEN-2/1-VP quimérico. Los sueros obtenidos a partir de los monos inmunizados se analizaron para determinar la presencia de viremia mediante ensayo directo de la placa de alícuotas de suero en monocapas de células LLC-MK2 mantenidas en placas de 6 pocillos en un sobrenadante de agarosa, y mediante inoculación de alícuotas de suero en cultivos de células LLC-MK2 mantenidas en medio líquido. No se identificaron virus infecciosos en ninguno de los sueros de mono mediante cualquiera de estos dos procedimientos de ensayo clásicos. Mediante estos dos ensayos de virus, no hubo viremia detectable tras la inmunización con cualquier virus DEN-2/1-EP o DEN-2/1-VP quimérico. Los sueros de los monos se ensayaron para los anticuerpos neutralizantes específicos del virus DEN-1. A los 30 días después de la inmunización primaria, los sueros de tres monos individuales inmunizados con virus DEN-2/1-EP quimérico tuvieron títulos de anticuerpos neutralizantes con reducción de la placa y dilución en suero del 50% (PRNT50) de 80, 160 y 1280. Los sueros de tres monos individuales inmunizados con DEN-2/1.VP quimérico tuvieron títulos de PRNT50 de 160, 160 y 640. Los monos inyectados con diluyente como control para el experimento tuvieron títulos de PRNT50 recíprocos de menos de 10, tal como hicieron todos los monos justo antes de la inmunización. Los virus DEN.2/1-EP y –VP estimularon los anticuerpos neutralizantes específicos del virus DEN-1 en primates no humanos.
Ejemplo 2
Construcción de clones infecciosos de DN-2/3 quiméricos
[0113] Se usó una estrategia de ligadura in vitro para los clones infecciosos DEN-2/3 con genoma de longitud completa
(i) Clones intermedios DEN-2/3 del extremo 5’: pD2I/D3-P1-Asc y pD2I/D3-E1-Asc
[0114] Se usaron los clones intermedios DEN-2, pD2I-P y pD2I-E para subclonar el fragmento de ADNc específico del virus DEN-3 16562. El fragmento de ADNc que contenía los genes prM-E del virus DEN-3 16562 natural se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa – transcripción inversa (RT-PCR) a partir del ARN vírico de DEN-3 con cebadores D3-435.Mlu:
(5’-TGCTGGCCACTTAACTACGCGTGATGGAGAGCCGCGCA-3’ (SEQ ID NO: 33); sitio Mlul subrayado seguido por la secuencia del virus DEN-3 próxima al extremo 5’ del gen prM) y cD3-2394.Ngo: (5’-TGTAATGATGCCGGCCGCGATGCATGAAAATGA-3’ (SEQ ID NO: 34); sitio NgoMIV subrayado seguido por la secuencia complementaria próxima al extremo 3’ del gen E del virus DEN-3. El sitio Mlul contenía una mutación silenciosa para el virus DEN-2 en el aminoácido prM-5-Thr. Esta posición es Ser en el virus DEN-3), pero Thr en el virus DEN-2/3 quimérico. El sitio NgoMIV dio como resultado una sustitución Val a Ala en E-482 del virus DEN-2, y una sustitución Ile a Ala en E-480 del virus DEN-3. Se clonó el fragmento amplificado en los sitios Mlul-NgoMTV de los clones pD2I-P y pD2IE intermedios. Se introdujo un sitio de restricción AscI en la dirección 3’ del sitio NgoMIV mediante mutagénesis dirigida al sitio para facilitar la ligadura in vitro. Este único sitio AscI estaba solo 16 nts en la dirección 3’ desde el sitio NgoMIV y se escindió antes de la ligadura in vitro de los clones DEN-2/3 de longitud completa. Se introdujo una mutación adicional en nt 1970 (A a T) que cambió el aminoácido E-345 desde His a Leu, para permitir la desviación de los virus quiméricos viables en células LLC-MR2, tal como se explica a continuación. Estos clones DEN-2/3 quiméricos intermedios, pD2I/D3P-Asc y pD2I/D3-E-Asc, se secuenciaron para verificar la fiabilidad del ADNc específico del virus DEN-3 insertado. Se incorporó una mutación silenciosa en nt 552 (C a T) en ambos clones quiméricos intermedios.
(ii) Clones intermedios DEN-2 del extremo 3’; pD2-Pm^b-Asc, pD2-Em^b-Asc, y pD2-Vm^b- Asc
[0115] Se obtuvieron los clones DEN-2 intermedios que contenían la secuencia de ADNc específica del virus DEN2 truncado procedente de nt 2203-10723 (extremo 3’) del virus DEN-2 16681, PDK53-E, o PDK-53-V mediante deleción del extremo 5’ (que incluye la secuencia del promotor T7 y los nt 1-2202 de DEN-2) del ADNc específico del virus en los clones de longitud completa, pD2-16681-P48, pD2-PDK53-E48, y pD2-PDK53- V48, respectivamente. Se introdujo también un sitio AscI en el nt 2358 (22 nts en la dirección 5’ del sitio NgoMIV) para facilitar la ligadura in vitro. Este sitio AscI se escindió antes de llevar a cabo la ligadura in vitro del genoma de longitud completa, de los clones infecciosos DEN-2/3 quiméricos.
(iii) ADNc de DEN-2/3 quimérico de longitud completa: DEN-2/3-PP1, DEN-2/3-EP1, y DEN-2/3-VP1
[0116] Se digirieron mediante AscI de tres a diez mg de los clones pD2I/D3 del extremo 5’ y D2 del extremo 3’ intermedios, se trataron con fosfatasa de intestino de ternero (CIP), y a continuación se digirieron con NgoMIV. Los fragmentos pequeños AscI-NgoMIV escindidos se eliminaron haciendo pasar el ADN digerido a través de columnas giratorias de purificación mediante la PCR Qiagen. Los extremos 5’ y 3’ grandes, se linealizaron, y a continuación se ligaron los clones intermedios juntos (5’ : 3’ = relación molar 1:3) para obtener el genoma de longitud completa el DEN-2/3-PP1 (pD21/D3-P1-Asc ligado con pD2- Pm^b-Asc), DEN-2/3-EP1 (pD2I/D3-E1-Asc ligado con pD2-Em^b-Asc), y DEN-2/3-VP1 (pD2I/D3- E1-Asc ligado con pD2-Vm^b-Asc). Estos ADN ligados se cortaron a continuación con Xbal para producir el extremo 3’ linealizado del ADNc vírico requerido para la transcripción del ARN vírico recombinante.
Recuperación de los virus DEN-2/3 quiméricos
[0117] Se transcribió el ARN vírico recombinante a partir de ADNc linealizado con XbaI y se bloqueó con el m7GpppA análogo bloqueado. Se transfectaron células LLC-MK2 o BHK-21 (3- 5x106 células) mediante electroporación tal como se describe por Kinney y col. (J. Virol 230: 300-308 (1997)). Las células transfectadas se transfirieron a matraces de 75 cm2 en medio DMEM que contenía FBS al 10%. Las proteínas expresadas en las células transfectadas se analizaron mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) Las células infectadas con virus se fijaron en acetona fría en hielo durante 30 min. Se usaron los anticuerpos monoclonales 8A1 y 3H5 específicos del virus DEN-3 y DEN-2, respectivamente, en el ensayo, y se detectó la unión con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón marcado con fluoresceína. Se cosecharon los virus después de 5 a 11 días, y a continuación se pasaron en células LLC-MK2 una vez para obtener siembras de trabajo. Los genomas víricos extraídos de estas siembras se secuenciaron para confirmar los genotipos de los virus de la progenie, Una estrategia temprana usando clones intermedios D2I/D3 del extremo 5’ que contenían los genes prM-E de DEN-3 16562 auténtico dieron como resultado mutaciones en diversas posiciones diferentes en los genomas de los virus recuperados de las células LLC-MK2 o BHK-21 transfectadas y pasados una vez en células LLC-MK2. Una mutación en el nt 1970 de A a T, que cambió el aminoácido E-345 de His a Leu, se encontró en siete de los nueve virus recombinantes recuperados de manera independiente. Fue evidente que los virus quiméricos DEN-2/3 originales eran inestables en células LLC-MK2 y/o BHK-21. La mutación individual en E-345 fue la única mutación que se produjo en los genomas de los tres virus recuperados, indicando que esta mutación puede ayudar a estabilizar los virus en el cultivo. Los inventores introdujeron esta mutación en todos los clones DEN-2/3 infecciosos y los virus recombinantes recuperados de dichos clones mutagenizados probaron ser estables en cultivo celular.
Ejemplo 3
Construcción de clones infecciosos DEN-2/4 quiméricos
Vectores pD2-16681-P48, pD2-PDK53-E48, pD2-PDK53-V48
[0118] Los tres vectores de la estructura de DEN-2 usados para la construcción de los clones DEN-2/4 quiméricos se modificaron tal como se ha descrito anteriormente. Se ha informado anteriormente de los clones infecciosos DEN2 en Kinney y col., 1997. Se modificó el clon pD2-16681-P48 a partir de pD2/IC-30P-A para contener los sitios de clonación MluI y NgoMIV en las posiciones 451 y 2380 de los nucleótidos, respectivamente. Se introdujeron los mismos sitios de clonación en los clones específicos del virus DEN-2 PDK-53, pD2/IC-130Vx-4 y -130Vc-K, y los clones modificados se designaron como pD2-PDK53-E48 y pD2-PDK53-V48, respectivamente. Se encontraron dos errores en la clonación en los nucleótidos nt 6665 y nt 8840 de los pD2/IC-130Vx-4 y -130Vc-K originales. Estos defectos se corrigieron en pD2-PDK53-E48 y -V48. El sitio de clonación NgoMIV introducido dio como resultado dos mutaciones de nucleótidos (nt 2381 y 2382); TG a CC) que codificaban una sustitución Val a Ala en E-482 del virus DEN-2. Los cambios de nucleótidos introducidos en el sitio MIuI fueron silenciosos para el virus DEN-2 y los virus DEN-2/4 quiméricos. Se usaron el sitio MIuI (próximo a la unión C/prM) y el sitio NgoMIV (cercano a la unión E/NS1) para clonar los genes prM-E de los virus heterólogos.
pDEN-2/4-PP1, -EP1, y -VP1 quiméricos
[0119] Se construyeron dos clones DEN-2 intermedios, pD2I-P y pD2I- E, eliminando los fragmentos Hpal (nt 2676) y XbaI (término 3’ del ADNc genómico vírico) de pD2-16681-P48 y pD2-PDK53-E48, respectivamente. Estos clones intermedios se usaron para subclonar lo fragmentos de ADNc específicos del virus DEN-4 1036. El fragmento de ADNc que contenía los genes prM-E del virus DEN-4 1036 se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa – transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir del ARN vírico de DEN-4 con los cebadores D4-453Mlu:
(5’-GGCGTTTCACTTGTCAACGCGTGATGGCGAACCCCTCA-3’ (SEQ ID NO: 35); sitio MIuI subrayado seguido por la secuencia próxima al extremo 5’ del genoma vírico de DEN-4 1036 y cD4-2394.Ngo: (5’-AGTGATTCCGCCGGCAGCTATGCACGTCATAGCCAT-3’ (SEQ ID NO: 36); sitio NgoMIV subrayado seguido por la secuencia complementaria próxima al extremo 3’ del gen E del virus DEN-4). Se clonaron los fragmentos amplificados en los sitios MluI-NgoMIV de los clones pD2I-P y pD2I-E intermedios. Se secuenciaron los clones DEN-2/4 quiméricos intermedios para verificar la fiabilidad del ADNc específico del virus DEN-4 insertado. Se incorporó una mutación silenciosa en el nt 1401 (A a G) en ambos clones intermedios. Los fragmentos escindidos de los clones DEN-2/IC-P48, -VE48, y -VV48 con NgoMIV y ScaI (en la dirección 3’ de la secuencia del ADNc de DEN-2 en estos plásmidos) se clonaron en los clones intermedios D2/4 quiméricos en NgoMIV/ScaIcut para obtener los clones D2/4-PP, -EP, y –VP quiméricos de longitud completa. Sin embargo, el ARN transcrito de estos clones quiméricos solo produjo virus quiméricos DEN-2/4 viables en células c6/36 transfectadas, pero no en células LLC-MK2 transfectadas. Tras pasar los virus quiméricos en células C6/36 una vez más para obtener títulos mayores, se pasaron estos virus en células LLC-MK2 cinco veces para obtener virus DEN-2/4 quiméricos estables que se replicaron eficazmente en células LLC-MK2. Los títulos de estas siembras de virus aumentaron desde 200 IFP/ml en el primer pase de células LLC-MK2 a más de 106 UFP/ml en el quinto pase de células LLC-MK2.
[0120] Se secuenciaron los genomas de los virus del primer, segundo, tercer y quinto pases de células LLC-MK2 de los virus DEN-2/4-PP, se identificaron cuatro mutaciones, C-100 (Arg a Ser), específica del virus DEN-2, E-364 (mezcla de Ala a Ala/Val), específica del virus DEN-4, E447 (Met a Leu), específica del virus DEN-4 y NS4B-239 (Ile a Leu) específica del virus DEN-2 (posiciones de aminoácidos basadas en las secuencias del virus DEN-2/4 quiméricas). Se introdujeron las tres mutaciones localizadas en los genes estructurales (C y E) en los clones de ADNc infecciosos de DEN-2/4-PP, -EP, y –VP para obtener los clones DEN-2/4-PP1, -EP1, y -VP1, respectivamente.
Los tres clones DEN-2/4 quiméricos produjeron virus quiméricos viables, de elevada titulación en células LLC-MK2 inmediatamente después de la transfección indicando que estas tres mutaciones ayudaron a los virus a replicarse en células LLC-MK2. Los clones DEN-2/4 quiméricos se mutagenizaron también para contener diferentes combinaciones de las cuatro mutaciones para determinar qué mutaciones son necesarias para la le eficacia de la replicación de los virus DEN-2/4 quiméricos en células LLC-MK2- La mutación de DEN-4 E-447 (Met a Leu) sola o junto con la mutación DEN-4 E-364, en combinación con la mutación de DEN-2 C-100 (Arg a Ser) fue adecuada para permitir la derivación del virus DEN-2/4 en células LLC-MK2.
Recuperación de los virus recombinantes
[0121] Se hicieron crecer los plásmidos recombinantes pD2/4-PP1, -EP1, y -VP1 en células Escherichia coli XL1-Blue. Se transcribió el ARN vírico recombinante y se bloqueó con el m7GpppA análogo bloqueado procedente de 200-400 ng de ADNc linealizado con XbaI, y se transfectó en 3-5.106 células LLC-MK2. Las células transfectadas se transfirieron a matraces de 75 cm2 con medio DMEM que contenía FBS al 10%. Se analizaron las proteínas víricas expresadas en las células transfectadas mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA). Las células infectadas con virus se fijaron en acetona fría en hielo durante 30 min Se usaron anticuerpos monoclonales 1H10 y 3H5 específicos del virus DEN-2, respectivamente, en el ensayo, y se detectó la unión con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón marcado con fluoresceína. Se cosecharon los virus después de 8 a 10 días, y a continuación se pasaron en células LLC-MK2 una vez para obtener las siembras de trabajo. Se secuenciaron completamente los genomas de estas tres siembras de trabajo, y todos los genomas víricos DEN-2/4 quiméricos contenían las secuencias esperadas. Se proporcionan en el presente documento, en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la quimera DEN 2/4.
Ejemplo 4
Caracterización de los virus quiméricos DEN-2/3 y DEN-2/4
[0122] Los virus DEN-2/3 y DEN-2/4 quiméricos infecciosos, viables, que expresan la región del gen prM/E del virus DEN-3 16562 natural o de DEN-4 1036 natural, respectivamente, expresaron de manera apropiada los epítopos de la proteína de la envoltura (E) específicos del virus DEN-3 o DEN-4, tal como se analizó mediante inmunofluorescencia indirecta de las células LLC-MK2 infectadas con el virus con anticuerpos monoclonales dirigidos contra E específicos del virus. Estos virus quiméricos, así como los virus DEN-2/1 quiméricos, expresaron también los epítopos de neutralización apropiados específicos del serotipo DEN cuando se ensayaron frente a fluidos ascíticos polivalentes de ratón normalizados o anticuerpos monoclonales en ensayos de neutralización con reducción de placa dilución en suero (Tabla 8). Los virus DEN-2/1-EP, DEN-2/3-EP1, y DEN-2/4-EP1 quiméricos se neutralizaron mediante estos anticuerpos normalizados específicos del virus DEN a títulos de PRNT50 recíprocos que fueron al menos tan elevados como los que se produjeron para los virus DEN-1, DEN-3, y DEN-4 naturales, respectivamente (Tabla 8). Estos datos de neutralización indicaron que los virus DEN-2/1, DEN-2/3, y DEN-2/4 expresaron epítopos de neutralización apropiados específicos del serotipo DEN de los virus DEN-1, DEN-3, y DEN4, respectivamente.
Replicación en células LLC-MK2
[0123] Se controló la replicación y la sensibilidad a la temperatura de las quimeras DEN-2/3 en células LLC-MK2 como la replicación y la sensibilidad a la temperatura de las quimeras de DEN-2/1 se examinaron en el Ejemplo 1. Los virus DEN-2/3-PP1, -EP1, y -VP1 y los virus DEN-2/4-PP1, -EP1, y -VP1 quiméricos, que expresaban la región del gen prM/E del virus DEN-3 16562 o del virus DEN-41036 en el antecedente genético de DEN-2 16681 (-PP1), variante DEN-2 PDK-53-E (-EP1), o la variante DEN-2 PDK-53-V (-VP1), respectivamente, se replicaron para dar títulos elevados de los picos de al menos 106,3 UFP/ml en células LLC-MK2. Tal como se define en términos de la reducción de títulos de virus a 38,7ºC frente a los 37ºC (-, +, 2+, 3+ indica la reducción del título de menos de o igual a 60%, 61-90%, 91-99%, >99%, respectivamente, calculada a partir de al menos 3 experimentos). Los virus DEN2/3-PP1 y DEN-2/4-PP1 quiméricos presentaron tanto sensibilidad a temperaturas límite (DEN-2/3-PP1) como sin sensibilidad a la temperatura (DEN-2/4-PP1). Los virus DEN-2/3-EP1 y -VP1 quiméricos, así como los virus DEN2/4-EP1 y -VP1 quiméricos, todos los cuales se construyeron en el antecedente genético de la variante DEN-2 PD53-E o –V, retuvieron los fenotipos sensibles a la temperatura que presentaron los virus de las dos variantes (virus DEN-2-PDK53-E48 y -V48, respectivamente). Las quimeras construidas en el antecedente de la variante PDK-53-V presentaron un mayor grado de sensibilidad a la temperatura que las construidas en el antecedente de la variante PDK-53-E.
Tamaños de placa en células LLC-MK2
[0124] El tamaño de placa resultante de la inoculación de células LLC-MK2 colocadas en un sobrenadante de agarosa, se usaron como marcador biológico para determinar la atenuación tal como se describe en el Ejemplo 1, se examinaron para los virus DEN-2/3 y DEN-2/4 quiméricos. El tamaño de placa promedio en mm sigue a cada virus o quimera entre paréntesis: DEN-3-16562 (6,6), DEN-2/3-PP1 (5,4), DEN-2/3-EP1 (4,5), DEN-2/3-VP1 (2,3), DEN-41036 (8,6), DEN-2/4-PP1 (3), DEN-2/4-EP1 (1,5), DEN-2/4-VP1 (1,2), DEN-2-16681-P48 (4,2), DEN-2-PDK53-E48 (2,5) y DEN-2-PDK-53-V48 (1,8).
[0125] Los tamaños de las placas de los virus DEN-2/3-PP1 y DEN-2/4-PP1 presentaron diámetros de placa promedios que fueron más grandes que los de los virus DEN-2 16681 o PDK-53 (tal como se describe en el Ejemplo 1), pero más pequeños que los del los virus DEN-3 16562 y DEN-4 1036 naturales, respectivamente. Esto indica que los genes estructurales procedentes de los virus DEN-3 y DEN-4 donantes y de la cápsida y/o las regiones de los genes no estructurales en el antecedente genético del virus DEN-2 16681 receptor, afectaron ambos el tamaño de la placa. Los virus DEN-2/3-EP1 y -VP1 y DEN-2/4-EP1 y -VP1 quiméricos presentaron reducciones significativas en el tamaño de la placa, con respecto a los virus DEN-3 16562 y DEN-4 1036 naturales, respectivamente. El efecto específico del antecedente de DEN-2 PDK-53 sobre el tamaño de la placa puede ser el resultado de la interacción sinérgica de las mutaciones en los loci NS1-53 y NS3-250 del virus DEN-2 PDK-53. Consiguientemente, las quimeras –VP1 presentaron mayores reducciones en el tamaño de la placa de los que lo hicieron las quimeras – EP1. Los virus DEN-2/1, DEN-2/3, y DEN-2/4 quiméricos construidos en el antecedente genético del virus de la vacuna candidata DEN-2 PDK-53, retuvieron el fenotipo del tamaño de placa decreciente que presentó el virus DEN2 PDK-53
Replicación en células C6/36
[0126] Se usó la capacidad de los virus para replicarse en un cultivo de células C6/36 de mosquito como marcador biológico para determinar la atenuación tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se examinó también la de los virus DEN-2/3 y DEN-2/4 quiméricos. Los títulos de los picos promedio en unidades de Log10 de UFP/ml siguen a cada virus o quimera entre paréntesis; D3-16562 (7,3), DEN-2/3-PP1 (7,6), DEN-2/3-EP1 (5,2), DEN-2/3-VP1 (5,7), D41036 (8,7), DEN-2/4-PP1 (7,8), DEN-2/4-EP1 (4,5), DEN-2/4-VP1 (4,4), DEN-2-16681-P48 (8,3), DEN-2-PDK53-E48 (5,4) y DEN-2-PDK-53-V48 (5).
[0127] Ambas variantes del candidato Mahidol DEN-2 PDK 53 presentan una eficacia de replicación decreciente con respecto al virus DEN-2 16681 natural en un cultivo de célula C6/36 de mosquito (virus DEN-2-PDK-53-E48 y -V48 frente a DEN-2-16681-P48). Se ha atribuido la capacidad de replicación decreciente en células C6/36 a las mutaciones en los dos loci 5’-NC-57 y NS1-53 en el virus DEN-2 PDK-53; consistente con esta visión, se replicaron ambas variantes para reducir de manera equivalente los títulos de los picos en estas células. Se retuvo el fenotipo de la replicación paralizada en células C6/36 en los virus DEN-2/3-EP1 y - VP1 y DEN-2/4-EP1 y -VP1, todos los cuales se replicaron a títulos de pico inferiores que los de los virus DEN-3 16562 o DEN-4 1036 naturales, respectivamente. Los virus DEN-2/3-PP1 y DEN-2/4-PP1 quiméricos, construidos en el antecedente genético del virus DEN-2 16681 natural, se replicaron en esencialmente la misma extensión (DEN-2/3-PP1) o algo inferior (DEN2/4-PP1) que los virus DEN-3 16562 y DEN-4 1036 naturales, respectivamente. Estos resultados indican que el efecto de paralización de la replicación de los loci 5’-NC-57 y NS1-53 en el antecedente específico del virus DEN-2 PDK-53 se preservó en aquellos virus quiméricos que se construyeron dentro del antecedente genético de DEN-2 PDK-53.
Neurovirulencia en crías de ratón
[0128] Se estimularon crías de ratones ICR blancos, exogámicos (n=16 para cada grupo) por vía intracraneal con 104 UFP de virus DEN-3 y DEN-4 naturales. Los virus de la vacuna candidata Mahidol DEN-3 y DEN-4, los virus DEN-2/3-PP1, -E1, VP1, quiméricos, y los virus DEN-2/4-PP1, -EP1, y -VP1 quiméricos (Tabla 9). Los virus DEN-3 16562 y DEN-4 1036 naturales, que produjeron de manera precisa un 100% de fatalidad en las crías de ratones. Constituyeron un modelo más sensible para la atenuación de la neurovirulencia vírica que el del modelo del estímulo de DEN-2 16681, que da como resultado un 50-100% de fatalidad en crías de ratones estimuladas con este virus. De manera interesante, el virus de la vacuna candidata Mahidol DEN-4 PDK-48 dio también como resultado un 100% de fatalidad en ratones estimulados, aunque el tiempo de supervivencia promedio de estos ratones fue aproximadamente dos días más que el de los ratones estimulados intracranealmente con el virus DEN-4 1036 natural (Tabla 9). Igualmente, el virus de la vacuna DEN-2 PDK-53 y sus ambas poblaciones variantes, los virus DEN-2/3-EP1 y -VP1 quiméricos y los virus DEN-2/4-EP1 y -VP1 quiméricos estaban atenuados (sin fatalidades) en las crías de ratones. Esta atenuación puede ser atribuible, al menos en parte, al antecedente genético de DEN-2 PDK-53 atenuado de estos virus quiméricos, debido a que el virus DEN-2/4-PP1 quimérico presentó una significativa neurovirulencia (62,5% de mortalidad) en estos ratones. Esta última quimera se construyó en el antecedente genético del virus DEN-2 16681 natural.
Inmunización de ratones AG-129 con virus DEN-2/3 y DEN-2/4 quiméricos
[0129] Se inmunizaron por vía intraperitoneal ratones AG-129 endogámicos con 105 UFP del virus de la vacuna candidata Mahidol DEN-3 o DEN-4 p con 105 UFP de virus DEN-2/3-EP1 o DEN-2/4-EP1 quimérico (Tabla 10) El virus DEN-2/3-EP1 quimérico estimuló títulos de PRNT70 recíprocos de 80-320 a las 4-6 semanas después de la inmunización primaria. Estos títulos fueron esencialmente equivalentes a los estimulados para el virus de la vacuna Mahidol DEN-3 (cepa PGMK-30/FRhL-3). Sin embargo, el virus DEN-2/4-EP1 quimérico estimuló un título de anticuerpos neutralizantes de 20-40, que fue inferior al título de 80-320 estimulado por el virus de la vacuna candidata Mahidol DEN-4 PDK-48. Sin embargo, ambos virus DEN-2/3 y DEN-2/4 quiméricos, estimularon las respuestas de anticuerpos neutralizantes en ratones AG-129.
Ejemplo 5
Atenuación del virus de la vacuna del dengue-2: cepa 16681 (PDK-53)
Cultivos de virus y células
[0130] Se investigaron el virus DEN-2 16681 parenteral, algunos pases intermedios de PDK (PDK-5, - 10, -14, -35, y -45) del virus 16681, los virus 16681/PDK-53 recombinantes, y el pase de células LLC-MK2-1 genéticamente caracterizado del virus de la vacuna candidata PDK-53.
[0131] Se hicieron crecer cultivos de células BHK-21 (clon 15), LLC-MK2, Vero, y C6/36 en medio esencial mínimo modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado térmicamente (56ºC durante 30 min) al 10% (FBS; HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah), 3,7 g/l de bicarbonato de sodio (GIBCO-BRL, Life Technologies, Gaithersburg, Md.), 100 unidades/ml de penicilina G, y 100 mg/ml de sulfato de estreptomicina (GIBCO-BRL).
[0132] Se llevaron a cabo las titulaciones de las placas en monocapas confluentes de células Vero en placas de plástico de 6 pocillos tal como se ha descrito anteriormente (Miller y col., Am. J. Trop. Med. &amp; Hyg. 35: 1302-1309 (1986)). Un inóculo de 200 μl de virus se adsorbió durante 1,5 h a 37ºC, seguido por la adición de 4 ml de medio sobrenadante en agarosa que contenía agarosa Seakem Le al 1% (FMC BioProducts, Rockland, Md.) en medio nutriente (hidrolizado de lactoalbúmina al 0,165% [Difco Laboratories, Detroit, Mich.], extracto de levadura al 0,033% [Difco], solución salina equilibrada de Earl, 25 mg/l de sulfato de gentamicina [Bio Whittaker, Walkersville, Md.], 1,0 mg/l de anfotericina B [Fungizone®, E. R. Squibb &amp; Sons, Princeton, N.J.], y FBS al 2%) tras la incubación a 37ºC durante 7 días, se añadió un segundo sobrenadante de 2 ml en agarosa que contenía 80 μg/ml de colorante vital rojo neutro (GIBCO-BRL)
Construcción de virus DEN-2 16681/PDK-53 recombinantes
[0133] Durante la validación genética de los virus DEN-2 derivados de clon en el presente estudio, se descubrieron dos errores de clonación del ADNc nt-6665 A a G (NS4A-97 Tyr a Cys) y nt-8840 A a G (NS5-424 Glu a Gly), en el clon pD2/IC-130Vc-K (variante NS3-250-Val) específico del virus PDK-53 anteriormente informado (Kinney y col., Virology 230: 300-308 (1997)). Estos defectos se corrigieron en un clon específico del virus PDK-53 (variante NS3-250-Val) recientemente derivado, pD2/ICVV45R.
[0134] En los estudios preliminares, los virus 16681/PDK-53 recombinantes que contenían regiones del gen específico del virus PDK-53 dentro del antecedente genético del virus 16681 se usaron para investigar los loci genéticos implicados en los marcadores de atenuación del virus PDK-53. El análisis de estos virus indicó que la mutación PDK-53 en el nt 57 en la región 5’NC y las mutaciones de aminoácidos en NS1-53 (analizadas de manera vinculada a la mutación NS2A-181) y NS3-250 fueron las determinantes del fenotipo específico del virus PDK-53. La mutación prM-29 tiene un pequeño efecto sobre la virulencia. Basándose en el análisis y en la comparación de la secuencia, las mutaciones 5’NC, NS1 y NS3 se sometieron a un análisis mutacional adicional. La mutación 5’NC se produjo en una posible estructura de tallo. Las mutaciones NS1 y NS3 se produjeron ambas en loci conservados en algún flavivirus. Se construyeron 14 plásmidos pD2/IC- 16681/PDK-53 recombinantes intercambiando fragmentos de ADNc entre pD2/IC-30P-A (clon 16681) y pD2/IC-VV45R (clon PDK-53) en los sitios SstI de la enzima de restricción (que precede al promotor T7), SalI (nt 165), SphI (nt 1380), SpeI (nt 2370 y nt 3579), KpnI (nt 4493), XhoI (nt 5426), y XbaI (extremo 3’ del clon). Se hicieron crecer todos los plásmidos recombinantes en Escherichia coli, cepa XLIblue, y se linealizaron en el único sitio XbaI genomanipulado en el término 3’ del ADNc. Las células BHK-21 se transfectaron con el ARN vírico transcrito mediante el procedimiento de Liljestrom y col. (J. Virology 63: 4107-4113 (1991)).
[0135] Los genotipos de los loci 5’NC-57, NS1-53, y/o NS3-250 específicos del virus D2/IC-PX 16681 (en el que x = 5, 1, y/o 3 para indicar la incorporación del parental [P en la designación de los virus] en los virus pD2/IC-VV45R (estructura de [PDK-53]) y D2/IC-Vx (en el que x indica la incorporación recíproca de los loci específicos de los tres virus de las vacunas candidatas de PDK-53 [V en la designación de virus] dentro de la estructura de pD2/IC-30P-A [16681] que se muestran en la Tabla 11. Si los loci 5’NC, NS1, y NS3 son los determinantes primarios del fenotipo específico del virus PDK-53, entonces los virus D2/IC-P5 y D2/IC-V13 deberían ser equivalentes (análogos) debido a que ambos virus contienen 5’NC-57-C, NS1-53-Asp, y NS3-250-Val. En la Tabla 11 se indican las parejas de virus análogos derivados de la mutagénesis recíproca de los clones específicos del virus 16681 y PDK-53. Para investigar adicionalmente el locus prM-29, los inventores movieron el locus prM-29-Asp del virus DEN-2 16681 en pD2/IC-VV45R y pD2/IC-P5 para derivar los virus D2/IC-Pp y -P5p, respectivamente. Las recombinaciones recíprocas dieron como resultado los virus D2/IC-Vp y -V5p.
[0136] Cada uno de los virus derivados de clones (siembra de BHK-21 transfectada) se propagó una vez en células LLC-MK2. Los genotipos de todos los virus 16681/PDK-53 recombinantes, pasados en células LLC-MK2-1, se confirmaron mediante los análisis completos de las secuencias de nucleótidos. Debido a que todos los virus tuvieron las secuencias de nucleótidos esperadas, los inventores infirieron que sus clones de ADNc son también correctos. Todos los virus derivados de clones contenían el locus c en el nt 8571 específico del virus 16681, que es el sitio de una mutación silenciosa en el virus PDK-53. Se usó la secuenciación directa de los amplicones de ADNc solapantes generados a partir del ARN genómico vírico de DEN-2 usando la reacción en cadena de la polimerasa – transcriptasa inversa (RT-PCR) para determinar la secuencia de todos los términos del ADNc. Se determinaron las secuencias de los 30 nucleótidos 5’ y 3’ terminales del genoma mediante secuenciación directa del ADNc del clon infeccioso en el plásmido oBRUC-139. El prefijo D2/IC se elimina en las designaciones del virus en la Tabla 11 y en el texto siguiente.
Caracterización de los fenotipos de replicación de los virus 16681/PDK-53 recombinantes
[0137] Se analizaron los virus para el tamaño de la placa, la sensibilidad a la temperatura, y la replicación en células LLC-MK2 y C6/36. Se evaluaron los tamaños de las placas después de 9 días de incubación en agarosa en monocapas de células LLC-MK2 que crecían en placas de 6 pocillos. Se llevaron a cabo las curvas de crecimiento vírico en matraces de 75 cm2 de células LLC-NM2 o células C6/36 inoculadas a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de aproximadamente 0,001 UPF/célula. Tras la adsorción a 37ºC durante 2 h, se añadieron 30 ml de medio DMEM (células LLC-MK2) o el medio nutriente sobrenadante (células C6/36) que contenía penicilina/estreptomicina y FBS al 5%, y se incubaron los cultivos en CO2 al 5% a 37ºC o 29ºC, respectivamente. Se eliminaron alícuotas del medio de cultivo a intervalos de 48 h, se ajustaron a FBS al 12,5%, y se almacenaron a -80ºC antes de la titulación del virus.
[0138] Se llevaron a cabo ensayos de sensibilidad a la temperatura en células LLC-MK2 que crecían en matraces de 75 cm2. Se inocularon las células a una m.o.i. de aproximadamente 0,001 UFP/célula. Tras la adsorción durante 2 h a 37ºC, se añadieron 30 ml de medio DMEM que contenía FBS al 5%. Se incubó un conjunto de cultivos durante 8 días a 37ºC, el otro a 38,7ºC. Se calculó la relación del título del virus a 38,7ºC frente al título a 37ºC.
Ensayo de neurovirulencia en ratón
[0139] Se inocularon camadas de crías de ratones ICR blancos exogámicos por vía intracraneal con 104 UFP de virus en un volumen de 30 ml. Se pesaron individualmente los ratones una vez a la semana y se observaron para la parálisis o la muerte durante 35 días.
Fenotipos de placas de virus 16681/PDK-53 recombinantes
[0140] Se midieron los diámetros promedio de las placas de los virus (n=12) a los 9 días después de la infección en un sobrenadante de agarosa en células LLC-MK2 (FIG. 4). Las placas más grandes (diámetro promedio 3,2-3,4) se produjeron por el virus 16681 natural, su virus 30P-A derivado de clon, y el virus P513 recombinante, que contenía los loci 5’NC, NS1, y NS3 específicos del virus 16681 en el antecedente genético del virus VV45R (PDK-53) (Tabla 11). Estos tres loci específicos de 16681 en el antecedente genético de PDK-53 fueron suficientes para reconstituir el genotipo de placa grande del virus 16681.
[0141] Cada una de las mutaciones individuales 5’-NC-57-T, NS1-53-Asp, y NS3-250-Val específicas del virus PDK-53 incorporadas en el genotipo 16681 dieron como resultado tamaños de placas significativamente decrecientes (p < 0,00003) de 2,1-2,3 mm en los virus V5, V1, y V3, respectivamente, frente a los del virus 16681. Los fenotipos de las placas de los virus P13 y P51 fueron similares a los de sus virus análogos V5 y V3 (indicados por gráficos de barras con un modelo sólido o rayado idénticos en la FIG. 4). El tamaño de la placa de 2,8 mm del virus P53 difirió del de las placas víricas de 16681 en un grado menor (p < 0,03) que el de las placas de 2,1 mm de su virus V1 análogo, Las placas de 1,1 – 1,6 mm de las parejas de virus análogos V13 (P5) que contenía los loci NS1 y NS3 específicos del virus PDK-53), V53 (P1) (loci 5’NC y NS3 específicos del virus PDK-53) y del virus V51 (P3) (loci %’NC y NS1 específicos del virus PDK-53) fueron esencialmente equivalentes en las placas de 1,3 mm del virus PDK-53. Estos resultados indican que todas las combinaciones emparejadas de estos tres loci específicos de estos tres virus P1DK-53 en la estructura de 16681 generaron un virus de placa pequeña similar al del virus PDK-53. Aunque el virus V51 produjo un fenotipo de la placa que fue similar al del virus PDK-53, los tres loci 5’NC-C, NS1-53-Gly, y NS3-250-Glu específicos del virus 16681 se requirieron en el antecedente PDK-53 del virus P513 para reconstituir el fenotipo de la placa de 16681. La presencia de los tres loci de PDK-53 en la estructura 16681 generó el virus V513, que tuvo un fenotipo de placa más pequeño (p < 0,001, test de la t de Student) que los de cualquiera de los virus PDK-53 o VV45R. La diferencia entre el tamaño de la placa del virus PDK-53 y el del virus VV45R no fue significativa.
[0142] El virus Vp recombinante, que contenía el locus prM-29-Val específico del virus PDK-53 en el antecedente 16681, tuvo un tamaño de la placa significativamente reducido (p < 0,002) de 2,6 mm. Sin embargo, el fenotipo de placa de 1,0 mm del virus Pp (locus prM-29-Asp de 16681 en el antecedente de PDK-53) fue esencialmente idéntico a las placas de 1,1 mm y 1,3 mm de los virus VV45R y PDK-53 (FIG. 4A), respectivamente. El locus prM-29 no afecta los fenotipos de la placa de los virus P5p (1,0 ± 0,0 mm) y V5p (2,0 ± 0,4 mm), que produjeron placas similares a las de P5 (1,1 ± 0,3 mm) y V5 (2,3 ± 0,4 mm), respectivamente.
Replicación de los virus 16681/PDK-53 recombinantes en células LLC-MK2 y C6/36
[0143] Todos los virus se replicaron bien en células LLC-MK2, alcanzando títulos de los picos de 107,3 – 107,9 UFP/ml a los 6-8 días después de la infección. PDK-53 y su virus VV45R derivado de clon se replicaron a una velocidad reducida durante los primeros cuatro días después de la infección, con respecto a los otros virus. Para determinar las sensibilidades a la temperatura, células LLC-MK2 infectadas con el virus se incubaron a 37ºC o 38,7ºC en 2-5 experimentos (FIG. 4B). Se determinaron las puntuaciones de sensibilidad a la temperatura a los 8 días después de la infección. Todos los virus presentaron algún grado de sensibilidad a la temperatura en estas condiciones, En experimentos individuales el virus 16681 natural mostró un 75-80% de reducción del título a 38,7ºC. El virus V1 y los virus análogos P3 (V51), que mostraron un 84-86% de reducciones promedio en el título, fueron ligeramente más sensibles a la temperatura que el virus 16681. Sin embargo, solo PDK-53, VV45R, V513, P5p, Pp, y los virus recombinantes análogos V13 y P5, todos los cuales contenían ambos loci NS1-53-Asp and NS3-250-Val específicos del virus PDK-53, mostraron de manera reproducible una reducción promedio en el título de 90-97% a 38,7ºC.
[0144] El virus 16681 y su virus 30P-A derivado de clon se replicaron a unos títulos pico promedio de 108,6-108,8 UFP/ml a los 12 días después de la infección en dos experimentos independientes de curvas de crecimiento en células C6/C36 (FUG. 4C) La replicación del virus PDK-53 (título del pico de 104,5 UFP/ml y de su virus VV45R derivado de clon (título del pico de 104,6 UFP/ml) fue aproximadamente 15.000 veces menos eficaz en células C6/36. Los loci 5’NC y NS1 específicos del virus 16681 en el antecedente PDK-53 del virus p51 reconstituyeron completamente la eficacia de la replicación con la del virus 16681 natural. De manera inversa, los loci 5’NC y NS1 específicos del virus PDK-53en el antecedente 16681 del virus V51 fueron suficientes para establecer el fenotipo de replicación paralizada del virus PDK-53. Las parejas de virus análogos recombinantes V5 (P13) y V1 (P53) que contenían la región 5´NC o el locus NS1 específicos del virus PDK-53, respectivamente, se replicaron a unos títulos pico promedio de 105,9 – 106,7 UFP/ml. Aunque el título promedio del pico del virus V53 fue aproximadamente 40 veces mayor que el del virus V5 en células C6/36, los títulos de los picos de los virus P513, P13, P53, V3, V13, V513, y P3 fueron muy similares a los de los virus P51, P1, P5, 30P-A, V1, V51, y VV45R, respectivamente. Estos datos indican que el locus NS3-250 tuvo poco o ningún efecto observable sobre la replicación en células C6/36 (FIG. 4C). Los virus Vp y 16681 tuvieron casi igual títulos de picos promedio en células C6/36, como los de los virus P5 y P5p. Los virus Pp y V5p produjeron títulos de picos promedio que fueron ligeramente mayores (8 y 40 veces, respectivamente) que los de los virus PDK-53 y V5, respectivamente. El locus prM-39 pareció tener poco o ningún efecto sobre la replicación vírica en células C6/36.
Neurovirulencia de los virus 16681/PDK-53 recombinantes en crías de ratones
[0145] Para investigar la neurovirulencia de los virus recombinantes, se infectaron por vía intracraneal dos camadas de crías de ratones ICR blancos, ocho ratones por camada, con 104 UFP de virus. El virus DEN-2 16681 y su virus 30P-A derivado de clon producen un 50%-100% de mortalidad en estos ratones. Los tiempos de supervivencia promedio (AST) de los ratones que sucumben al estímulo con el virus 16681 o 30P-A variaron de 15,2 a 16,8 días en diversos experimentos. Los ratones se pesaron individualmente cada 7 días después de la infección. Un solo ratón murió en el día 1 después de la infección, presumiblemente como resultado del trauma de la inoculación, en cada uno de los grupos P53 y Vp (Tabla 12). Estos dos ratones se excluyeron de los análisis. No hubo fatalidades y no hubo pérdida de peso en el grupo de control, inoculado con diluyente.
[0146] Se observaron tres fenotipos de neurovirulencia en los ratones (Tabla 12). El primer fenotipo consistió en los virus DEN-2 16681, 30P-A, P513, P51, V3, y Vp, virulentos en ratones, que produjeron al menos un 50% de mortalidad con un AST de 13,2-17,0 días (Tabla 12). En otros dos experimentos independientes, el virus Vp produjo un 46,67% de mortalidad con un AST de 17,4 ± 1,4 días (n=16) y 56,25% de mortalidad con un AST de 18,3 ± 1,3 días (n=16). En un experimento independiente, el virus p51 produjo solo un 25% de mortalidad con un AST de 15,9 ± 5,5 días (n=16). Un segundo fenotipo consistió en los virus PDK-53, W45R, V513, Pp, y el análogo de V51 (P3) atenuados en ratón, que no produjeron mortalidad, y los virus V1, análogo de V13 (P5), P5p, y V5p casi atenuados, que mataron únicamente 1 de 16 ratones (Tabla 12). La presencia de los dos loci 5’NC-57-T y NS 1-53-Asp específicos del virus PDK-53 en el antecedente genético de 16681 fue suficiente para dar como resultado en o mantener la atenuación en los virus V51 (P3) análogos. Excepto para el virus P53, todos los virus que contenían el locus NS1-53-Asp específico del virus PDK-53 estaban atenuados o casi atenuados.
[0147] El tercer fenotipo, el de virulencia intermedia, caracterizado por las parejas de virus análogos V5 (P13) y V53 (P1), y el virus P53, que produjo un 18,75%-37,5% de la mortalidad en ratones y una significativa pérdida de peso (p < 0,001, test de la t de Student, a las 3 semanas de la infección, con respecto a los ratones del control inoculados con diluyente) en ratones que sobrevivieron al estímulo del virus. Los virus V5 (P13) y V53 (P1) contenían el locus 5’NC-57-T, pero no el NS1-53-Asp, del virus PDK-53. El virus V1 (6,25% de mortalidad) fue más atenuado que el virus V5, que produjo un 18,75% de mortalidad y una significativa pérdida de peso en los supervivientes. De manera inversa, el locus 5’-NC-57-C específico del virus 16681 produjo una pequeña reversión de la virulencia en el virus P5 (6,25% mortalidad) mientras que el resto NS1-53-Gly en el virus P1 dio como resultado un nivel intermedio (37,5%) de mortalidad y una significativa pérdida de peso en los supervivientes. A diferencia del virus V análogo casi atenuado, el virus P53 tuvo un fenotipo de virulencia intermedia. El locus NS1-53 tuvo un efecto más significativo sobre la virulencia del fenotipo que el del locus 5’-NC-57.
[0148] El locus prM-29 no mostró efecto en los virus P5p, Pp, y Vp, con respecto a los virus P5, PDK-53, y 16681, respectivamente. El virus V5p, que contenía los loci 5NC-57-T y prM-29-Val específicos del virus PDK-53, estuvo casi atenuado (Tabla 2). El locus NS3-250 no parece contribuir significativamente al fenotipo de neurovirulencia en ratones en los virus V3, P13, V53, V13, y P3, que presentaron fenotipos que fueron equivalentes a los virus 16681, P1, V5, V1, y PDK-53, respectivamente. La diferencia en el nivel de mortalidad producida por los virus P53 y P5 sugirió que el locus NS3-250-Glu específico del virus 16681 puede contribuir algo a la virulencia del fenotipo en algunos contextos genéticos.
Evolución de mutaciones en el virus de la vacuna DEN-2 PDK-53
[0149] Se analizaron los pases intermedios PDK-5, -10, -14, -35, y -45 del virus 16681 para determinar la acumulación de las nueve mutaciones de nucleótidos en la cepa de la vacuna PDK-53. Se amplificaron los amplicones directamente del ARNm genómico extraído de la siembra vírica mediante la RT/PCR. Se llevó a cabo la secuenciación automatizada de pequeñas regiones genómicas, que contenían los nuevo loci relevantes, usando los cebadores apropiados. En la Tabla 13 se muestran los restos de nucleótidos identificados en cada uno de los nueve loci para estos virus. La mutación Leu a Phe en NS2A-181 y las mutaciones silenciosas en E-37, NS3-342, y NS5334 aparecen en el pase de PDK-5y fueron los restos predominantes en el pase PDK-10 (NS2A-181), PDK-14 (E373, NS3-342), o PDK-35 (NS5-334). Las mutaciones de C a T en 5’-NC-57, de Asp a Val en prM-29, de Gly a Asp en NS1-53, y de Gly a Ala en NS4A-75 se produjeron mediante el pase de PDK-35. El 5’-NC-57-T fue predominante en el pase PDK-35. Mientras que otras mutaciones relacionadas llegaron a ser predominantes en el pase de PDK
45. La mutación de Glu a Val en NS3-250 apareció en el pase de PDK-45 y no mutó completamente en la Val específica del virus en la vacuna candidata de PDK-53 actual (Tabla 13). Aproximadamente el 29% de la población vírica en la vacuna PDK-53 contiene NS·-250-Glu. El virus PDK-45 era genéticamente equivalente al virus de la vacuna PDK-53. En el presente estudio, no se llevó a cabo ningún intento para determinar las proporciones relativas de los dos nucleótidos en el loci genético mixto que se muestra en la Tabla 13.
Tabla 1 Virus candidatos para Flavivirus Quiméricos +
Principales especies Otras transmisiones por mosquitos: Especies transmitidas por mosquitos
Dengue-1 ** Alfuy Jugra
Dengue-3 ** Bagaza Kokobera Dengue-4 ** Banzi ** Ntaya Fiebre amarilla ** Bouboui Rocio ** Encefalitis japonesa ** Bussuquara ** Sepik ** Encefalitis del Valle Murray ** Edge Hill ** Spondweni ** Encefalitis de San Luís ** Ilheus Stratford Nilo occidental ** Naranjal Tembusu
Uganda S Kunjin * Meningitis turcoisraelí
Usutu ** Wesselsbron ** Zika**
Transmitidas por garrapatas Sin vector artrópodo demostrado
Absettarov ** Apoi *
Gadgets Gully Aroa
Hanzalova ** Cacipacore Hypr ** Isla Carey Kadam Cowbone Ridge Karshi Dakarbat **
Kumlinge ** Entebbe bat
Enfermedad del bosque Kyasanur ** Jutiapa
Langat Koutango *
Louping ill ** Modoc * Meaban Leucoencefalitis del Myotis de Montana Fiebre hemorrágica de Omsk ** Negishi **
Powassan ** Phnom-Penh bat
Royal Farm Rio Bravo ** Primavera rusa Saboya Encefalitis de verano ** Sal Vieja Saumarez Reef San Perlita Tyuleniy Sokuluk
* = Infección notificada por laboratorio ** = Infección natural y notificada por laboratorio
+ = La lista incluye los miembros clasificados actualmente entre los miembros del género Flavivirus en el International Catalogue of Arboviruses, Including Certain Other Viruses of Vertebrates, Nick Karabatsos, ed. The American Society of Tropical Medicine and Hygiene. 1985.
Tabla 2 Resumen de las diferencias en nucleótidos y aminoácidos entre los genomas del virus DEN-1 16007 y su derivado para vacuna, la cepa PDK-13
Posición del Nucleótido Aminoácido Posición Posición
nucleótido PDK-13 16007 PDK-13 en la en la en el proteína poliproteí genoma na
1323 T C Val Ala E-130 410 1541) G A Glu Lys E-203 483 1543) A G
1545 G A Arg Lys E-204 484 1567 A G GIn Gln E-211 491 1608 C T Ser Leu E-225 505 2363 A G Met Val E-477 757 2695 T C Asp Asp NS1-92 867 2782 C T Ala Ala NSI-121 896 5063 G A Glu Lys NS3-182 1657 6048 A T Tyr Phe NS3-510 1985 6806 A G Met Val NS4A-144 2238 7330 A G Gln Gln NS4B-168 2412 9445 C T Ser Ser NS5-624 3117
Tabla 3 Resumen de las diferencias en nucleótidos y aminoácidos entre los genomas del virus DEN-2 16681 y su derivado para vacuna, la cepa PDK-53
Posición del Nucleótido Aminoácido Posición Posición
nucleótido PDK-53 PDK-53 en la en la
16681 16681
en el proteína poliproteí genoma na
57 C Tª --524 A T Asp Val prM-29 2055 C T Phe Phe E-373 653 2579 G A Gly Asp NS1-53 828 4018 C T Leu Phe NS2A-181 1308 5270 A T/A Glu Glu/Valb NS3-250 1725 5547 T C Arg Arg NS3-342 1817 6599 G C Gly Ala NS4A-75 2168 8571 C T Val Val NS5-334 2825
[a] región no codificante
[b] La vacuna PDK-53 contiene dos variantes genéticas en el nt-5270
Tabla 4 Resumen de las diferencias en nucleótidos y aminoácidos entre los genomas del virus DEN-3 16562 y su derivado para vacuna, la cepa PGMK-30/Frhl-3
Posición del Nucleótido Aminoácido Posición Posición
nucleótido PGMK-PGMK-en la en la
16562 16562
en el 30FRhL-3 30FRhL-3 proteína poliproteí genoma na
550 C T Ala Ala prM-38 152
1521 C/T C Ser/Leua Ser E-196 476
1813 G A Lys Lys E-293 573
1838 A G Ser Gly E-302 582
1913 G A Glu Lys E-327 617
2140 C T Ala Ala E-402 682
3725 T C Phe Leu NS2A-86 1211
4781 C A Gln Lys NS3-90 1563
a Se han localizado dos variantes genéticas significativas en el nt-1521
Tabla 5 Resumen de las diferencias en nucleótidos y aminoácidos entre los genomas del virus DEN-4 1036 y su derivado para vacuna, la cepa PDK-48
Posición del Nucleótido Aminoácido Posición Posición
nucleótido PDK-48 PDK-48 en la en la
1036 1036
en el proteína poliproteí genoma na
1211 T C Ile Ile E-91 370
1971 G A Glu Lys E-345 624
3182 G C Gln His NS1-253 1027
6660 C T Leu Phe NS4A-95 2187
6957 A A/T Ile Ile/Phe NS4B-44 2286
7162 T C Leu Ser NS4B-112 2354
7546 C C/T Ala Ala/Val NS4B-240 2366
7623 G T/G Asp Tyr/Asp NS5-21 2508
Tabla 6 Resumen de mutaciones no silenciosas entre los genomas de las cepas de vacuna parentales de los virus DEN-1, DEN-2, DEN-3, y DEN-4
Posición del DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 nucleótido en el genoma
57 5’NC-57 c-t 524 prM-29 D-V 1323 E-130 V-A 1521 E-196 S/L-S 1541) E-203 E-K 1543) 1545 E-204 R-K 1608 E-225 S-L 1838 E-302 S-G 1913 E-327 E-K 1971 E-345 E-K 2363 E-477 M-V 2579 NS1-53 G-D 3182 NS1-253 Q-H 3725 NS2A-86 F-L 4018 NS2A-181 L-F 4781 NS3-90 Q-K 5063 NS3-182 E-K 5270 NS3-250 E-V/E 6048 NS3-510 Y-F 6599 NS4A-75 G-A 6660 NS4A-95 L-F 6806 NS4A-144 M-V 6957 NS4B-44 I-I/F 7162 NS4B-112 L-S 7546 NS4B-240 A-
A/V 7623 NS5-21 D-D/Y
Tabla 7 Inmunogenicidad de los virus en ratones Títulos” de reducción-neutralización en placa frente al virus DEN-1 16007
Experimento Refuerzo Experimento Refuerzo 1b primario 2b primario
Sueros combinados de virus Sueros Sueros Sueros inmunizante (gama) combinados (gama) combinados combinados (gama) (gama)
DEN-1 16007 80 (20 - 80) 2560 (80 - 20480) 80 (20 - 160) 2560 (160 - 5120) D2/1-PP 80 c 5120 c 40 (10 - 160) 5120 (160 -10240) D2/1-EP 80 (20 - 320) 10240 (640 - 20480) 160 (20 - 320) 5120 (2560 -D2/1-VP 40 (10 - 160) 2560 (160 - 5120) 80 (10 - 320) 10240)
5120 (40 - 10240) DEN-1 PDK-13 10 (10 - 40) 80 c 40 (20 - 80) 320 (20 - 640) D2/1-PV 10 (<104-20) 80 c 40(10-80) 2560 (20 - 10240) D2/1-EV 20 (<10d- 20) 80 c 40 (<104-40) 160 (10 - 320) D2/1-VV 10(10-40) 80 c 40(10-160) 160 (20-640)
a Los títulos son la inversa de la dilución que produce una reducción en placa de al menos el 50%. b Ratones ICR exogámicos de 3 semanas se inmunizaron intraperitonealmente con 104 UFP de virus, y se reforzaron con la misma dosis de virus 3 semanas después en el experimento 1, o 6 semanas después en el experimento 2. Primario = suero extraído 20 días (experimento 1) o 41 días (experimento 2) tras la inmunización primaria. Refuerzo = suero extraído 21 días tras el refuerzo en ambos experimentos. c No se han determinado los títulos individuales d Solo el título de suero de un ratón fue inferior a 10 en estos grupos e Los títulos en negrita indican que los títulos del suero combinado son 4 veces mayores a los títulos calculados con una reducción en placa del 70%. El resto de títulos combinados, bien no fueron diferentes o fueron dos veces
mayores que los títulos para una reducción en placa del 70%.
Tabla 8 Neutralización de virus quiméricos DEN mediante anticuerpos normalizados
Anticuerpo
Virus D1-AFa D2-AFa D2-H5b D3-AFa D3-8A1b D4-AFa
DEN-1 16007c 1280d 40 20 40 20 20 DEN-2/1-EPe 2560 ; ; ; ; ; DEN-216681c 80 2560> 40960 40 < 20 40 DEN-316562c 80 160 40 1280 5120 40 DEN-2/3-EP1c ; ; ; 2560 20480 ; DEN-4 1036c 20 40 < 20 80 < 20 1280 DEN-2/4-EP1c ; ; ; ; ; 2560
a
Fluidos ascíticos (antisuero polivalente ) de los virus específicos de ratón AF = DEN-1 (D1), DEN-2 (D2), DEN-3
(D3), y DEN-4 (D4). b Anticuerpos monoclonales D2-H5 y D3-8A1, específicos de la proteína de la cubierta (E-específicos) específicos de los virus DEN-2 y DEN-3, respectivamente.
c Virus DEN de tipo natural. d Se muestra la Inversa de los títulos de neutralización en suero mediante dilución en placa (criterio de valoración 50%); ; = no ensayado c Virus quiméricos DEN-2/1-EP, DEN-2/3-EP1, o DEN-2/4-EP1 que expresan genes estructurales de los virus DEN-1
16007, DEN-3 16562, o DEN-4 1036 respectivamente
Tabla 9 Neurovirulencia de los virus quiméricos DEN-2/3 y DEN-2/4 en ratones ICR recién nacidos
Estímulo del virusa
Porcentaje de mortalidadb AST (SD) (días)
DEN-316562d
100,0 14,1 (2,1)
DEN-3 P30/FRhl-3e
15,0 16,2 (3,2)
DEN-2/3-PP1f
32,5 19,0 (2,1)
DEN-2/3-EP1f
0,0 -
DEN-2/3-VP1f
0,0 -
DEN-4 1036d
100,0 8,6 (0,6)
DEN-4 PDK-48e
100,0 10,7 (1,5)
DEN-2/4-PP1f
62,5 17,8 (2,8)
DEN-2/4-EP1f
0,0 -
DEN-2/4-VP1f
0,0 -
DEN-2 16681d
87,5 15,2 (2,6)
DEN-2 PDK53-E48c
0,0 -
DEN-2 PDK53-V48c
0,0 -
Diluyente
0,0 -
a Ratones recién nacidos estimulados intracranealmente con 104 UFP de virus. b {Número de muertes / número total (n=16) de ratones estimulados} x 100.
c Tiempo de supervivencia promedio (AST) y desviación estándar (SD); -= no aplicable, porque no hubo muertes en este grupo d Virus natural con serotipo DEN
e
Virus de la vacuna candidata Mahidol DEN: DEN-3 = PGMK-30/FRhL-3 (P30/FRhL-3); DEN-4 = PDK-48; DEN-2 = variante PDK-53-E (locus NS3-250-Glu) y variante PDK-53-V (NS3-250-Val locus). Ambas variantes de virus PDK-53-E y -V se han derivado de ADN de clones infecciosos de los variantes f Virus quiméricos DEN-2/3 o DEN-2/4. La región génica prM/E del virus DEN-3 16562 o del virus DEN-4 1036 se expresó en el fondo genético del virus DEN-2 16681 natural (virus PP1), vacuna candidata Mahidol de la variante PDK-53-E de DEN-2 (virus EP1), o vacuna candidata Mahidol de la variante PDK-53-V de DEN-2 (virus VP1)
Tabla 10 Eficacia protectora de los virus quiméricos DEN-2/1 en ratones AG-129a
Inversa de los títulos de anticuerpo neutralizante frente al virus homólogo apropiado DEN-3 o DEN-4 a las 4 o 6 semanas de la inmunización
Virus inmunizante 4 semanas 6 semanas DEN-3 16562b 320c 640 DEN-3 P30/FRhL-3d 160 320 DEN-2/3-EP1c 80 320 DEN-4 1036b 160 1280 DEN-4 PDK-48d 80 320 DEN-2/4-EP1c 20 40
a Los ratones AG-129 son una cepa endogámica que carece de receptores para el interferón alfa/beta e interferón gamma. Los ratones de 3,5 -4,5 semanas de edad se inmunizaron intraperitonealmente con 105 UFP de virus. b Virus DEN natural. c Inversa de la dilución de sueros combinados que neutralizaron un 70% o más de los virus DEN-3 16562 naturales iniciales que se utilizaron para probar los sueros procedentes de ratones con virus DEN-3 o quimeras DEN-2/3-EP1, o el virus DEN-45 1036 natural inicial que se utilizaron para probar el suero procedente de los ratones inmunizados con el virus DEN-4 o la quimera DEN-2/4-EP1.d Virus de las vacunas candidatas Mahidol DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 (P30/FRhL-3), DEN4 PD-48. e Quimeras DEN-2/3-EP1 o DEN-2/4-EP1 que expresan la región génica prM/E de los virus DEN-3 16562 o DEN-4 1036, respectivamente.
Tabla 11 Genotipos de los virus recombinantes 16681/PDK-53 de DEN-2 Virus derivado de Determinantes de los virus Dengue-2 16681 en el antecedente PDK-53aclon (análogo) b
5’NC-57 prM-29 NS1-53 NS2A-181 NS3-250 NS4A-75
DEN-2 PDK-53 t V D F V A VV45R (V513) . . . . . . P5 (V13) c ... . . P1 (V53) . .G. . . P3 (V51) . ... E . P51 (V3) c .G. . . P53 (V1) c ... E . P13 (V5) . .G. E . P513 (30P-A) c . G . E .
Determinantes PDK-53 de Dengue-2 en el antecedente 16681 c
5’NC-57 prM-29 NS1-53 NS2A-181 NS3-250 NS4A-75
DEN-2 16681 c D G L E G 30P-A (P513) . . . . . . V5 (P13) t . . . . . V1 (P53) . . D . . V3 (P51) . . . . V V51 (P3) t . D . . V53 (P1) t . . . V V 13 (P5) . . D . V. V513 (VV45R) t . D . V .
a
El genoma del virus de vacuna candidato dengue-2 PDK-53 difiere del resto de sus parientes 16681 en nueve loci de nucleótidos, incluyendo tres mutaciones silenciosas (no mostradas) una mutación en las posición del nucleótido 57 en el genoma de la región no codificante 5’ (5’NC-57; letras minúsculas), y cinco nucleótidos que codifican mutaciones en aminoácidos (abreviaturas con una sola letra mayúscula) en las posiciones del polipéptido premembrana (prM)-29, la proteína no estructural 1 (NS1)-53, NS2A-181, NS3-250, y NS4A-75 (32). Los loci genéticos procedentes del virus pariente 16681 se introdujeron mediante ingeniería genética en el ADNc antecedente del clon infeccioso específico del virus PDK53, pD2/IC-VV45R. Los puntos indican identidad de secuencia con el virus PDK-53 (variante NS3-250-Val). La vacuna PDK-53 candidata también contiene una variante genética que tiene Glu en NS3-250 (32).
b Se muestran los genotipos del virus DEN-2 16681 natural, su derivado atenuado de vacuna, el virus DEN-2 PDK-53, el VV45R infeccioso derivado de clon (genéticamente equivalente al PDK-53 variante NS3-250- Val) y 30P-A (genéticamente equivalente al 16681 natural), y los virus recombinantes 16681/PDK-53. Las designaciones numéricas para los virus recombinantes Px y Vx (donde x = loci 5’NC, NS1, y/o NS3 ) indican un loci parental (P en la designación del virus) específico del virus 16681 introducido mediante ingeniería genética en el ADNc del clon infeccioso específico del virus PDK-53 (serie superior) o el loci específico del virus del candidato de vacuna PDK-53 recíproco (V en la designación del virus) introducido mediante ingeniería genética en el clon 16881 (serie inferior), respectivamente. P5 y V13 sin virus análogos, asumiendo que el fenotipo específico del virus PDK-53 se determina predominantemente mediante los 5’NC-57, NS 1-53, y NS3-250. Ambos virus P5 y V13 contienen los loci 5’NC-57-c, NS1-53-Asp, y NS3-250- Val en sus antecedentes genéticos.
c
Los loci genéticos procedentes del virus PDK-53 se genomanipularon en el ADNc antecedente del clon infeccioso específico del virus 16681, pD2/IC-30P-A. Los puntos indican la identidad de la secuencia con el virus 16681.
Tabla 12 Neurovirulencia de los virus DEN-2 16681, PDK-53, y virus recombinante 16681/PDK-53 en ratones ICR blancos recién nacidos
Estímulo del ratóna Genotipo víricob Virus Mortalidad AST(SD) 5’-NC57 prM29 NS153 NS2A181 NS3250 NS4A75 (análogo)c (%) (días)
DEN-2 16681 68,75 15,2(1,2) c D G L E G 30P-A (P513) 81,25 14,6(2,3) . . . . . . P513(16681) 100,0 13,2(1,6) . V . F . A P51 (V3) 50,0d 15,9(5,5) . V . F V A P1 (V53) 37,5d 19,0(4,2) t V . F V A P13 (V5) 37,5d 13,5(2,1) t V . F . A P53 (V1) 20,0d 17,0(7,8) . V D F . A P5p (V13) 6,25 15,0 . . D F V A P5 (V13) 6,25 27,0 . V D F V A Pp (PDK-53)0 -e t . D F V A P3 (V51) 0 -t V D F . A V3 (P51) 75,0d 16,4(3, . . . . V .
2) Vp (16681) 87,5 17,0(0, . V . . . . 9) V53 (P1) 18,75d 21,3(6, t . . . V . 1) V5 (P13) 18,75d 21,7(4, t . . . . .
2) V5p (P13) 6,25 20,0 t V . . . . V13 (P5) 6,25 17,0 . . D . V . V1 (P53) 6,25 22,0 . . D . . . V51 (P3) 0 -T . D . . . V513 0 -t . D . V . (PDK-53) VV45R (V513)0 -t V D F V A DEN-2 0 -t V D F V A PDK-53
a Porcentaje de mortalidad y tiempo de supervivencia promedio (AST) ± desviación estándar (SD) de ratones ICR blancos endogámicos recién nacidos estimulados intracranealmente con 104 UFP de virus. Dieciséis ratones por grupo, excepto los grupos P53 y Vp en los que murió un solo ratón en el día I tras la inyección, supuestamente como resultado del traumatismo de inoculación. Estos dos ratones fueron excluidos del estudio. b Consultar el texto para una explicación de los tipos de virus. Los puntos indican identidad de secuencia
con el virus 16681. c Consultar el texto para una explicación de las designaciones de los virus y de los virus análogos. d El peso corporal promedio de los ratones supervivientes fue significativamente inferior (p < 0,001, prueba de la t de Student) que en los ratones de control inoculados con diluyente (no mostrado) 3 semanas después de la infección. e El tiempo promedio de supervivencia no es de aplicación porque no se produjo mortalidad en este grupo de ratones.
Tabla 13 Evolución del virus DEN-2, cepa de vacuna PDK-53, durante el paso de la cepa relacionada 16681 por células primarias (PDK) de riñón de perro
Posición del nucleótido en el genoma a / Posición en el polipéptido traducido b / Aminoácidos codificados c 57ª 524 2055 2579 4018 5270 5547 6599 8571 NS1-53 NS2 NS3-NS3-NS4A
prM-29b E-373 NS5A-250 342 -75
334 181
Virus D - Vc F - F G - D L - F E - V R - R G - A V - V
16681 Cd A C G C A T G C PDK-5 C A C/Te G T/ A T/C GC C / T PDK-10 C A T/C G T A C/T G T / C PDK-14 C A T G T A C G T / C
PDK-35 T T/A T A/G T A C C /T G PDK-45 T T T A T A/C C T T PDK-53 T T T A T A/C C T T
a Posiciones en el genoma del nucleótido de las nueve diferencias en la secuencia de nucleótidos entre los virus 16681 y
PDK-53. La posición del nucleótido 57 se encuentra entre la región no codificante 5’ del genoma vírico.
b Las designaciones de proteína son de la siguiente forma: prM = proteína premembrana; E = glicoproteína de la envoltura;
NS = proteína no estructural.
c Los restos de aminoácidos específicos del virus (16681 - PDK-53) se muestran para cada posición de aminoácido
d Se indican los nucleótidos A, C, G, y T (ADNc de sentido directo).
e Se identificaron dos poblaciones genéticas para este locus del virus. El orden de los dos nucleótidos refleja las alturas
relativas de pico de las señales del nucleótido en los cromatogramas de la secuencia.
Tabla 14 Conservación de los marcadores de atenuación fenotípicos en DEN-2 PDK-53 en virus quiméricos DEN.
Virus DEN
Fenotipo de atenuación DEN-2a DEN-2/1 DEN-2/3 DEN-2/4
Atenuación en ratones + + + +
Disminución de la replicación en + + + + células C6/36
Placas pequeñas en células LLC-MK2 + + + + Sensibilidad a la temperatura en + + + + células LLC-MK2
a Virus de vacuna candidata Mahidol DEN-2 PDK-53 en el virus quimérico DEN-2/1, y los virus DEN-2/3, y DEN-24 se introdujeron en el antecedente genético DEN-2 PDK-53, NS3-250-Val o variante –Glu. Los fenotipos mostrados de los virus quiméricos son representativos de los virus quiméricos construidos en el antecedente de cualquiera de los variantes del virus DEN-2 PDK-53.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0150]
<110> El Gobierno de los Estados Unidos de América, representado por el Secretario del Departamento de Salud y Servicios Humanos, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
<120> FLAVIVIRUS QUIMÉRICOS, AVIRULENTOS E INMUNÓGENOS 15
<130> 14114.0334P1
<140> 60/182, 829
<141> 20 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 9
<211> 10717
<212> ADN 25 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
30 <221> CDS
<222> (97)...(10266)
<400> 9
<210> 10
<211> 3389 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética 10
<400> 10
<210> 11
<211> 10723 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética 10
<221> CDS
<222> (97)...(10272)
<400> 11 15
<210> 12
<211>
3391 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 12
<210> 15
<211>
10723 5 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética 5 <221> CDS
<222> (97)...(10272)
<400> 15
<210> 16
<211> 3391 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética 10
<400> 16
<210> 31
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 31
<210> 32
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 32
<210> 33
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 33
<210> 34
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 34
<210> 35
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 35
<210> 36
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:/Nota = construcción sintética
<400> 36

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un ácido nucleico que comprende:
    una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 3, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 345, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 625 de la SEQ ID NO: 10.
  2. 2.
    Un ácido nucleico que comprende: una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53, en la que la proteína C contiene una serina en la posición del aminoácido 100, correspondiendo dicha serina a la serina en la posición del aminoácido 100 de la SEQ ID NO: 12; y una segunda secuencia de nucleótido que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 4, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 447, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 727 de la SEQ ID NO: 12.
  3. 3.
    El ácido nucleico de la reivindicación 2, que comprende además una valina en la posición 364 de la proteína E.
  4. 4.
    El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína prM y la proteína E proceden de una cepa virulenta.
  5. 5.
    El ácido nucleico de la reivindicación 1, que codifica la SEQ ID NO: 10.
  6. 6.
    El ácido nucleico de la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9.
  7. 7.
    El ácido nucleico de la reivindicación 2, que codifica la SEQ ID NO: 12.
  8. 8.
    El ácido nucleico de la reivindicación 7, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11.
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