CN110088273B - 针对正义链rna病毒引起的感染性疾病的疫苗 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于保护受试者免受由(+)SS RNA病毒引起的疾病的组合物。该组合物包含(i)含有可操纵地连接至真核RNA聚合酶启动子的编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA分子的DNA的载体和载体材料；或(ii)从转染有(i)的载体的真核细胞获得的(+)SS RNA病毒和载体材料。

Description

针对正义链RNA病毒引起的感染性疾病的疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年11月28日提交的第62/426,708号美国临时申请的权益，通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

描述了用于保护受试者免受由正义单链RNA病毒引起的疾病的组合物。

背景技术

病毒是由遗传物质和蛋白质组成的较小的非细胞生物体。存在不同类型的病毒。例如，病毒可以是在宿主细胞核内复制的DNA病毒，或者是在细胞的细胞质中复制的RNA病毒。病毒可以是双链或单链的。此外，单链RNA病毒可以是正(+，有义)链或负(-)链的。这些不同类型的病毒引起多种病毒感染。

当病原性病毒侵入生物体机体时会发生病毒感染。病毒一旦进入就会通过以下方式进行复制：将自身附着到细胞上并对细胞重编程以复制新的病毒直到细胞破裂死亡，使得病毒能够迅速传播，从而引起人和动物中的各种感染性疾病。由病毒引起的感染性疾病包括普通感冒、流感和疣。然而，病毒还会引起严重的疾病，如艾滋病(AIDS)、小痘、疱疹、出血热、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹。

疫苗已经被开发出来并且其已经成功地降低了脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹的发病率。常规的疫苗含有已经减毒过的活病毒。然而，由于这些病毒具有恢复更多致病表型的潜力并且在免疫受损宿主中可能是减毒不足的，因此需要开发在多种病毒系统中诱导持久免疫的安全的免疫原性疫苗。

近年来，已经开发出在体内产生减毒的活病毒的疫苗(Medigen公司)。许多RNA病毒的全长cDNA已被克隆至大肠杆菌质粒中以产生疫苗。然而，在许多情况下，难以制备这类质粒，因为全长病毒cDNA在大肠杆菌中通常是有毒的并且不能被大量制备。

发明内容

本文描述了包含编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA分子的DNA的载体，所述DNA可操纵地连接至合适的启动子以在细胞(尤其是真核细胞)中表达。感染性(+)SS RNA病毒可以是由至少两种不同(+)SS RNA病毒的RNA序列编码的嵌合病毒。

本文还描述了通过将上述载体转染至真核细胞中获得的克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体。

本文描述了包含载体(vector)或克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体和载体材料(carrier)的组合物。还描述了包含载体(vector)和药学上可接受的载体材料(carrier)的药物组合物。

本公开还描述了包含载体的疫苗和包含克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体的疫苗。该疫苗的载体包含编码非病原性和/或减毒(+)SS RNA病毒的RNA分子的DNA。疫苗的克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体是非病原性和/或减毒的(+)SS RNA病毒。此外，本公开还描述了使用疫苗以将受试者免疫并保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的方法。

此外，本公开描述了使用本文描述的载体以制备疫苗并获得克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体的方法。此外，本公开描述了使用载体以获得转染有本文描述的载体的宿主细胞的方法。

附图说明

图1A和1B示出了含有SA-14-14-2JEV菌株的合成性cDNA的pMG8009JEV DNA疫苗的制备。(A)示意性地描绘了包含CMV启动子、全长JEV SA14-14-2合成性cDNA和三个合成性内含子的DNA构建体。CMV启动子、JEV基因和内含子1-3(星号)的位置未按比例示意性地示出。(B)从10个独立的大肠杆菌菌落中分离出的质粒DNA的1％凝胶电泳的结果。将pMG8009转化至化学感受态大肠杆菌Stbl3细胞中，并使其在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上生长。使来自该平板的10个独立菌落在2ml LB培养基中生长，分离出DNA，并重悬于50μl无菌水中。将1μl所得质粒DNA上样于1％TAE琼脂糖凝胶上。

图2A-2C示出了转染有pMG8009质粒的Vero细胞中JEV病毒的表达。(a)通过电穿孔转染有1μg pMG8009质粒的Vero细胞的感染中心测定法(ICA)。(b)使用小鼠抗-JEV(ATCC VR-1259AF)抗体进行的蛋白质印迹。泳道M示出了SeeBlue Plus 2蛋白质分子量标准品(赛默飞)。泳道1示出了转染有pMG8009的Vero细胞中的JEV抗原。泳道2为未转染的Vero细胞。(c)使用抗-JEV小鼠ATCC VR-1259AF进行的间接IFA。图1、2、3分别示出了放大170倍的转染有pMG8009的Vero细胞、未转染的Vero细胞(放大170倍)和放大400倍的转染有pMG8009的Vero细胞。

图3A和3B示出了检测来自转染有pMG8009质粒的Vero细胞的培养基中的JEV病毒。(A)在BHK细胞中的噬斑测定。上图，来自病毒感染的Vero细胞(未电穿孔)的生长培养基的噬斑测定，在用1000PFU感染后第7天取样(图3B中的样品#6)。下图，来自pMG8009转染的Vero细胞(电穿孔后)的生长培养基的噬斑测定，在用10ng DNA转染后第7天取样(图3B中的样品#2)取样。(B)转染有pMG8009的Vero细胞(样品2、3、4)或感染有源自pMG8009的病毒的Vero细胞(样品5和6)的培养基中JEV病毒的生长曲线。样品5和6分别示出了感染有1000PFU的源自pMG8009的疫苗病毒的电穿孔和非电穿孔Vero细胞，以检测电穿孔过程是否影响病毒在Vero细胞中的生长。

图4示出了通过IFA测定的pMG8009JEV疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性。在第0天，使用电穿孔将小鼠肌肉内疫苗接种5μg pMG8009质粒。为了检测抗体，在第21天对小鼠放血。将疫苗接种过的小鼠的血清用于在腔室载玻片中以1:10稀释度并用IFA检测JEV感染的Vero细胞。在与小鼠血清孵育后，用荧光素标记的小鼠IgG抗体(H+L)处理Vero细胞，以将表达JEV抗原的细胞可视化。用含有碘化丙锭核复染物的固封剂覆盖载玻片，并在显微镜下观察。

图5A-5G示出了pMG8009质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，该pMG8009质粒包含编码JEV(菌株SA14-14-2)的全长基因组RNA的cDNA，该cDNA可操纵地连接至CMV立即早期启动子并插入至pUC骨架质粒中。pUC质粒的核苷酸和内含子以大写字母表示。CMV启动子以斜体表示。编码JEV的基因组RNA的cDNA以粗体表示。将内含子加下划线。

具体实施方式

本公开提供了用于预防由RNA病毒(特别是(+)SS RNA病毒)引起的疾病的疫苗。该(+)SS RNA病毒的家族包括星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)和小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、冠状病毒科(Coronoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)。例如，星状病毒科包括人星状病毒(human astrovirus)；杯状病毒科包括诺沃克病毒(Norwalk virus)；小核糖核酸病毒科包括柯萨奇病毒(coxsackievirus)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)和鼻病毒(rhinovirus)；冠状病毒科包括冠状病毒(coronavirus)和SAR病毒；逆转录病毒科包括α逆转录病毒(alpharetrovirus)、β逆转录病毒(betaretrovirus)、δ逆转录病毒(deltaretrovirus)、慢病毒(lentivirus)和泡沫病毒(spumavirus)；披膜病毒科包括风疹病毒属(Rubella virus)和甲病毒属(alpha virus)；和黄病毒科包括丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)和黄病毒属(flavivirus)。

在一些实施方式中，本文描述的疫苗用于预防由甲病毒属引起的疾病。甲病毒属包括巴尔马森林病毒(Barmah Forest virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equineencephalitis virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus奇昆古尼亚病毒)、O'NyongNyong病毒(O’Nyong Nyong virus阿尼昂-尼昂病毒)、罗斯河病毒(Ross River virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、巴拿马病毒(Panama virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西部马脑炎病毒(Western equineencephalitis virus)和辛德毕斯病毒(Sindbis viru)。

在一些实施方式中，本文描述的疫苗用于预防由黄病毒属引起的疾病。黄病毒属包括黄热病病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、西尼罗河病毒(WestNile virus)、寨卡病毒(Zika virus)、蜱传脑炎病毒(tick borne encephalitis virus)和日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)。

众所周知，(+)SS RNA病毒引起多种疾病，其包括病毒性胃肠炎、甲型肝炎、丙型肝炎、登革热、黄热病、西尼罗热、脊髓灰质炎、严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹和口蹄疫。如本文所使用的，术语“由(+)SS RNA病毒引起的疾病”包括由(+)SSRNA病毒引起的感染。

在一些实施方式中，本文描述的疫苗预防脑炎，例如由JEV引起的脑炎。

本文所述的疫苗包含治疗有效量的(i)包含编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA的DNA(如编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA的质粒DNA)的载体；或(ii)从转染有(i)的载体的细胞所获得的克隆纯化的感染性(+)SS RNA病毒同质群体。此外，载体中包含的DNA编码非病原性和/或减毒的(+)SS RNA病毒，并且DNA包括用于在真核细胞中表达的合适的启动子。

如本文所使用的，术语“感染性”病毒是指可以侵入细胞、繁殖(复制)和增殖的病毒。感染性病毒可以引起疾病或不引起注意地增殖。因此，感染性(复制性)病毒可以是致病性的或非病原性的。在一些实施方式中，当将感染性病毒用于疫苗时，其是非病原性的和/或减毒的。感染性(+)SS RNA病毒包括由其全长RNA基因组序列编码的病毒。在具体的实施方式中，本公开提供了产生活病毒以保护受试者免受由(+)SS RNA病毒引起的疾病的感染性DNA疫苗。

与常规DNA疫苗不同的是，疫苗在体内产生DNA启动(DNA-launched)的减毒活病毒。常规的DNA疫苗仅含有编码特定感兴趣基因的DNA序列，而疫苗包含编码(+)SS RNA病毒的完整功能基因组RNA的DNA。此外，与在宿主细胞的细胞质中复制并不进入宿主细胞的细胞核的(+)SS RNA病毒不同，疫苗的DNA进入宿主细胞的细胞核以起始复制。当将疫苗的DNA注射至宿主细胞中时，DNA进入细胞核，转录感染性(+)SSRNA病毒的整个基因组RNA以用于复制。随后转录出的感染性(+)SS RNA病毒的功能基因组RNA被转运至宿主细胞的细胞质中以进行复制和增殖以获得病毒子代。该过程减少了通常在疫苗生产中发现的突变和逆转的可能性。

与常规的DNA疫苗类似，疫苗价格低廉且易于制造。此外，疫苗快速地诱导免疫，因为减毒的活病毒可在受试者的疫苗施用部位产生。而且，由于产生了减毒的活病毒，因此仅需要一个较小剂量以诱导免疫。此外，疫苗在体内产生克隆纯化的减毒(+)SS RNA病毒的遗传稳定且同质的群体，这提高了疫苗的安全性。

此外，技术可用于产生用作疫苗的克隆纯化的减毒(+)SS RNA病毒的遗传稳定且同质的群体。因为(+)SS RNA病毒是从遗传稳定的启动的，因此技术可以将(+)SS RNA病毒的RNA遗传诱变的可能性降低至少约50％、70％、80％、90％或99％。在一些实施方式中，本公开描述了包含减毒(+)SS RNA病毒同质群体的疫苗。

技术是基于使用DNA载体在体外或体内产生疫苗。术语“载体(vector)”和“质粒”在全文中可互换使用。在一些实施方式中，本公开提供了包含编码RNA分子的DNA的载体，该DNA可操纵地连接至合适的启动子以用于在细胞(如真核细胞)中表达。在一些实施方式中，DNA是编码(+)SS RNA病毒全长(基因组)RNA的cDNA分子。在一些实施方式中，RNA分子编码感染性(+)SS RNA病毒。DNA分子包含至少三个内含子。至少一个内含子位于编码(+)SS RNA病毒的非结构蛋白的基因(或DNA的某一区域)中，并且一个内含子位于编码(+)SSRNA病毒的结构蛋白的基因(或DNA的某一区域)中。

本文描述的载体除了包括编码RNA分子的DNA之外还包括调节元件。调节元件包括例如一种或多种启动子、聚A尾、终止子、增强子、核酶、内部核糖体进入位点或核转运元件。启动子包括适合在宿主细胞中表达的那些启动子。在一些实施方式中，启动子适合在真核细胞(例如哺乳动物细胞)中表达。这种启动子的一个实例是真核RNA聚合酶启动子。用于真核细胞中载体表达的启动子的其它实例包括CMV、RSV、SV40、HSV、人Pol I、人Pol II和人Pol III。在具体的实施方式中，启动子是CMV启动子。

载体中的启动子相对于转录起始位点的位置是重要的。例如，启动子可以位于编码RNA分子的DNA的5'末端上游约5至约100个、约10至约50个、或约10至约20个核苷酸处。在一些实施方式中，本文描述的载体包括位于编码RNA分子的DNA的5'末端上游约12至约18个核苷酸处的CMV启动子。在具体的实施方式中，CMV启动子的最佳位置是编码RNA分子的DNA的5'末端上游约15个核苷酸处。

在一些实施方式中，聚A尾位于编码RNA分子的DNA的3'末端下游约0至500个核苷酸处。

在一些实施方式中，载体还包括确保转录出的RNA分子合成并从细胞的细胞核转运至细胞质的元件。

在一些实施方式中，载体中包含的DNA编码用于编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA分子。在具体的实施方式中，感染性(+)SS RNA病毒是非病原性和/或减毒的病毒。

在一些实施方式中，感染性(+)SS RNA病毒是黄病毒属。黄病毒属的实例包括JEV、登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒和寨卡病毒。在一些实施方式中，黄病毒属是JEV。JEV是一种非病原性病毒。在具体的实施方式中，JEV是非病原性和/或减毒的病毒。减毒JEV的一个实例是SA14-14-2菌株，GenBank登录号AF315119。

可以对编码感染性(+)SS RNA病毒的RNA的DNA进行修饰以将菌株减毒或进一步降低菌株的毒性。可以修饰DNA以确保足够的减毒和/或引入其它特征，同时仍保持感染性和所需的治疗效果。毒性降低的优化可以改善疫苗并减少与疫苗接种相关的不利影响。在一些实施方式中，可以通过插入、缺失和/或取代一个或多个核酸来修饰编码感染性(+)SSRNA病毒的RNA的DNA。例如，经修饰的DNA可以与编码感染性(+)SS RNA病毒的野生型序列具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或97％或99％的序列同一性。

此外，iDNA技术的使用产生了天然的减毒病毒。与原始的野生型或天然存在的病毒相比，通过iDNA技术产生的这些病毒是减毒的。此外，这些病毒比通过常规方法(Poirier等人2017)制备的减毒病毒的毒性被进一步降低至少20％，这是基于注射过这种病毒群体的受试者数量确定的。本公开描述了通过本文描述的iDNA技术产生的(+)SS RNA病毒比通过常规方法制备的减毒病毒的毒性被进一步降低至少约5％、10％、15％、20％、25％或30％。

载体中包含的DNA编码非病原性和/或减毒的感染性(+)SS RNA病毒的RNA分子。在一些实施方式中，载体中包含的DNA编码非病原性和/或减毒的感染性JEV、登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。

载体中包含的DNA还可以编码包括至少两种不同(+)SS RNA病毒的RNA的嵌合RNA分子。第二(+)SS RNA病毒的RNA替换编码第一(+)SS RNA病毒全长RNA的一部分。因此，嵌合RNA分子编码感染性嵌合(+)SS RNA病毒，并且可以是非病原性和/或减毒的。在一些实施方式中，载体中包含的DNA编码包括来自相同属的至少两种不同(+)SS RNA病毒的RNA的嵌合(+)SS RNA病毒。例如，第一(+)SS RNA病毒是一种黄病毒属病毒，而第二(+)SS RNA病毒是另一种黄病毒属病毒。作为另一个实例，第一(+)SS RNA病毒是JEV，而第二(+)SS RNA病毒是登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒。在一些实施方式中，DNA编码包含JEV和寨卡病毒的RNA的嵌合RNA分子。其它实例包括编码黄热病病毒与登革热病毒、或黄热病病毒与寨卡病毒、或黄热病病毒与寨卡病毒、或黄热病病毒与西尼罗河病毒的嵌合RNA分子的DNA。这种编码嵌合病毒的DNA载体会诱导免疫应答，并预防任一种黄病毒属病毒或两种或更多种黄病毒属病毒的感染。

嵌合RNA分子可以含有来自第一(+)SS RNA病毒的核酸序列的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。

本公开描述了将内含子插入至编码(+)SS RNA分子的DNA中以改善DNA在宿主细胞中的稳定性并提高宿主细胞中DNA的产量，该宿主细胞特别是大肠杆菌，用于繁殖编码本文所述的(+)SS RNA病毒的iDNA质粒。在一些实施方式中，编码RNA分子的DNA包括三个内含子。术语“内含子”是指编码内含子RNA的DNA片段，其不编码蛋白质并将基因序列隔断，并且随后可通过剪接机制除去以恢复基因序列。内含子可以含有一个终止密码子或几个终止密码子。DNA中终止密码子的实例包括TAA、TAG和TGA。也可以使用其它的已知内含子。在具体的实施方式中，本文描述的DNA中的内含子序列源自小鼠免疫球蛋白H链V区前体基因(Genbank登录号M12880)。

在一些实施方式中，DNA含有至少三个内含子、至少四个内含子、至少五个内含子、至少六个内含子、至少七个内含子、至少八个内含子、至少九个内含子或至少十个内含子。内含子的放置可以是凭经验确定的或通过使用本领域已知的方法(Shahmuradov 2017)预测启动子来确定的。将至少一个内含子插入至编码(+)SS RNA病毒的非结构(NS)蛋白的基因中，并且将至少一个内含子插入至编码结构蛋白的基因中。

(+)SS RNA病毒包含结构基因和非结构基因。例如，黄病毒属的非结构蛋白包括NS1蛋白、NS2A蛋白、NS2B蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、2K蛋白、NS4B蛋白和NS5蛋白。黄病毒属的结构蛋白包括衣壳(Cap)蛋白、膜(prM/M)蛋白和包膜(Env)蛋白。在一些实施方式中，将至少一个内含子插入至编码黄病毒属的NS1蛋白、NS2A蛋白、NS2B蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、2K蛋白、NS4B蛋白或NS5蛋白的基因中，并且将至少一个内含子插入至编码黄病毒属的Cap蛋白、Env蛋白或prM/M蛋白的基因中。黄病毒属的这些结构蛋白和非结构蛋白是由黄病毒属的结构基因和非结构基因编码的多蛋白的一部分。

在一些实施方式中，黄病毒属是减毒的JEV SA14-14-2菌株，并且JEV SA14-14-2菌株的核苷酸序列被提供为GenBank登录号(GB Acc.)AF315119.1。如下表1所示，(GBAcc.AF315119.1)的第96至2477位核苷酸编码结构蛋白(Cap、prM/M和Env)，并且第2478至10391位核苷酸编码非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在其它的实施方式中，将至少一个内含子插入在GB Acc.AF315119.1的第96-2477位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GB Acc.AF315119.1的第2478至10391位核苷酸之间。在具体的实施方式中，将内含子插入在GenBank登录号AF315119提供的JEV菌株SA14-14-2的核苷酸序列第414位(衣壳)、第2213位(包膜)和第3134位核苷酸处。

在一些实施方式中，黄病毒属是黄热病YF17D菌株，并且YF17D菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.X03700.1。如下表1所示，GB Acc.X03700.1的第122至2452位核苷酸编码结构蛋白(Cap、prM/M和Env)，并且第2453至10354位核苷酸编码非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在具体的实施方式中，将至少一个内含子插入在GBAcc.X03700.1的第122至2452位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GBAcc.X03700.1的第2453至10354位核苷酸之间。

在一些实施方式中，黄病毒属是西尼罗河病毒(WNV)的菌株，并且WNV菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.KM659876.1。如下表1所示，GB Acc.KM659876.1的第97至2469位核苷酸编码结构蛋白(Cap、prM/M和Env)，并且第2470至10398位核苷酸编码非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B和NS5)。在具体的实施方式中，将至少一个内含子插入在GBAcc.KM659876.1的第97至2469位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GBAcc.KM659876.1的第2470至10398位核苷酸之间。

在一些实施方式中，黄病毒属是登革热2PDK-53菌株，并且登革热2PDK-53菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.M84728.1。如下表1所示，GB Acc.M84728.1的第100至2421位核苷酸编码结构蛋白(Cap、prM/M和Env)，并且第2422至10269位核苷酸编码非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B和NS5)。在具体的实施方式中，将至少一个内含子插入在GB Acc.M84728.1的第100至2421位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GBAcc.M84728.1的第2422至10269位核苷酸之间。

在一些实施方式中，黄病毒属是寨卡病毒菌株，并且寨卡病毒菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.NC_012532。如下表1所示，GB Acc.NC_012532的第107至2476位核苷酸编码结构蛋白(Cap、prM/M和Env)，并且第2477至10363位核苷酸编码非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B和NS5)。在具体的实施方式中，将至少一个内含子插入在GBAcc.NC_012532的第107至2476位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GB Acc.NC_012532的第2477至10363位核苷酸之间。

作为另一个实例，甲病毒属的非结构蛋白包括nsP1蛋白、nsP2蛋白、nsP3蛋白和nsP4蛋白。甲病毒属的结构蛋白包括衣壳(Cap)蛋白、E3蛋白、E2蛋白、6K蛋白和E1蛋白。在一些实施方式中，将至少一个内含子插入至编码甲病毒属的nsP1蛋白、nsP2蛋白、nsP3蛋白或nsP4蛋白的基因中，并且将至少一个内含子插入至编码甲病毒属的Cap蛋白、E3蛋白、E2蛋白、6K蛋白或E1蛋白的基因中。对于甲病毒属，多个非结构蛋白和多个结构蛋白各自是单个多蛋白的部分，使得多个非结构基因一起编码一种多蛋白，而多个结构基因一起编码第二多蛋白。

在一些实施方式中，甲病毒属是VEEV TC-83菌株，并且VEEV菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.L01443。如下表2所示，GB Acc.L01443的第45至7523位核苷酸编码非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)，并且第7562至11326位核苷酸编码结构蛋白(Cap、E3、E2、6K和E1)。在其它的实施方式中，将至少一个内含子插入在GB Acc.L01443的第45至7523位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GB Acc.L01443的第7562至11326位核苷酸之间。

在一些实施方式中，甲病毒属是CHIKV 181/25菌株，并且CHIKV菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.L37661.3。如下表2所示，GB Acc.L37661.3的第50至7471位核苷酸编码非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)，并且第7450至11283位核苷酸编码结构蛋白(CAP、E3、E2、6K和E1)。在其它的实施方式中，将至少一个内含子插入在GB Acc.L37661.3的第50至7471位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GB Acc.L37661.3的第7540至11283位核苷酸之间。

作为另一个实例，小核糖核酸病毒的非结构蛋白包括P2-A蛋白、P2-B蛋白、P2-C蛋白、P3-A蛋白、P3-B蛋白、P3-C蛋白和P3-D蛋白。小核糖核酸病毒的结构蛋白包括P1-A蛋白、P1-B蛋白、P1-C蛋白和P1-D蛋白。在一些实施方式中，将至少一个内含子插入至编码小核糖核酸病毒的P2-A蛋白、P2-B蛋白、P2-C蛋白、P3-A蛋白、P3-B蛋白、P3-C蛋白或P3-D蛋白的基因中，并且将至少一个内含子插入至编码小核糖核酸病毒的P1-A蛋白、P1-B蛋白、P1-C蛋白或P1-D蛋白的基因中。小核糖核酸病毒的这些结构蛋白和非结构蛋白是由小核糖核酸病毒的结构基因和非结构基因编码的多蛋白的一部分。

在一些实施方式中，小核糖核酸病毒是减毒的人脊髓灰质炎病毒2菌株，并且该人脊髓灰质炎病毒2菌株的核苷酸序列被提供为GB Acc.D00625.1。如下表3所示，GBAcc.D00625.1的第748至3384位核苷酸编码结构蛋白(P1-A、P1-B、P1-C和P1-D)，并且第3385至7362位核苷酸编码非结构蛋白(P2-A、P2-B、P2-C、P3-A、P3-B、P3-C和P3-D)。在其它的实施方式中，将至少一个内含子插入在GB Acc.D00625.1的第748至3384位核苷酸之间，并且将至少一个内含子插入在GB Acc.D00625.1的第3385至7362位核苷酸之间。

在一些实施方式中，(+)SS RNA病毒是减毒的病毒，或经由iDNA技术过程通过其产生而减毒的(或已被进一步降低毒性)。表1、2和3提供了示例性的(+)SS RNA病毒。还存在(+)SS RNA病毒的其它实例以及每种类型的(+)SS RNA病毒的多种菌株。

在一些实施方式中，本文描述的载体中包含的DNA包括编码(+)SS RNA病毒的DNA。在其它实施方式中，编码(+)SS RNA病毒的DNA如GB Acc.AF315119.1、X03700.1、KM659876.1、M84728.1、NC_012532、L01443、L37661.3或D00625.1所示，并且已经被修改为包含至少三个内含子。至少一个内含子是位于编码(+)SS RNA病毒的结构蛋白的DNA区域中，并且至少一个内含子是位于编码非结构蛋白的DNA区域中。

在具体的实施方式中，本文描述的载体中包含的DNA如SEQ ID NO：1所示。

在一些实施方式中，载体中包含的编码(+)SS RNA病毒的DNA在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补链杂交。在一些实施方式中，编码(+)SS RNA的DNA在本文所述的各种严格条件下与SEQ ID NO：1的约第1011至12320位核苷酸或其互补链杂交。Sambrook等人提供了各种严格条件(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆(Molecular Cloning)，实验室手册(A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)，通过引用将其全部内容并入本文。

在一些实施方式中，载体中包含的编码(+)SS RNA病毒的DNA在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与GBAcc.AF315119.1、X03700.1、KM659876.1、M84728.1、NC_012532、L01443、L37661.3或D00625.1所示的DNA或其互补链杂交，并且编码(+)SS RNA病毒的DNA包含至少三个内含子，其中一个内含子位于编码结构蛋白的DNA区域中，并且一个内含子位于编码非结构蛋白的DNA区域中。

在一些实施方式中，载体中包含的编码(+)SS RNA病毒的DNA与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。出于本公开的目的，使用在EMBOSS包(优选3.0.0或更高的版本)的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。

在一些实施方式中，载体中包含的编码(+)SS RNA病毒的DNA与GBAcc.AF315119.1、X03700.1、KM659876.1、M84728.1、NC_012532、L01443、L37661.3或D00625.1所示的DNA具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且编码(+)SS RNA病毒的DNA包含至少三个内含子，其中一个内含子位于编码结构蛋白的DNA区域中，并且一个内含子位于编码非结构蛋白的DNA区域中。

在一些实施方式中，由载体中包含的DNA编码的(+)SS RNA病毒的氨基酸序列与GBAcc.AF315119.1、X03700.1、KM659876.1、M84728.1、NC_012532、L01443、L37661.3或D00625.1所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。编码(+)SS RNA病毒的氨基酸序列的DNA包含至少三个内含子，其中一个内含子位于编码结构蛋白的DNA区域中，并且一个内含子位于编码非结构蛋白的DNA区域中。

本公开还提供了制备大量本文所述的DNA的方法。编码RNA分子的DNA可以被化学合成并克隆至所需的载体中进行复制。用于制备大量DNA的方法包括将含有DNA的载体转化至宿主细胞中，并在能够复制大量含有DNA的载体的条件下培养宿主细胞。用于制备DNA的宿主细胞包括细菌细胞。在一些实施方式中，细菌细胞包括大肠杆菌。也可以使用其它合适的宿主细胞或用于制备DNA的化学方法。

另外地，本公开提供了改善细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中的编码感染性(+)SSRNA病毒的基因组RNA的DNA的稳定性和产量的方法。由于包含感兴趣的cDNA的质粒的不稳定性和/或毒性，一些(+)SS RNA病毒(如包括黄热病病毒或JEV的黄病毒属)的DNA(特别是cDNA)很难作为质粒在大肠杆菌中增殖。在过去，为了提高质粒的产量，已经使用了降低黄病毒属DNA的毒性以及产量的低拷贝质粒。此外，已经插入内含子以改善质粒的稳定性。已经将两个内含子插入至低拷贝JEV cDNA质粒中以改善全长克隆的稳定性(Yamashchikov等人，2001)。然而，期望的是产生高产量的质粒，特别是用于制备疫苗。

本公开提供了利用标准的高拷贝质粒在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中增殖编码(+)SS RNA病毒的cDNA的方法。该方法包括将三个或更多个内含子合并至(+)SS RNA病毒的cDNA中。至少一个内含子位于编码(+)SS RNA病毒的结构蛋白的区域中，并且至少一个内含子位于编码(+)SS RNA病毒的非结构蛋白的区域中。

多个内含子对增强稳定性和实现高产量的有效性是令人惊讶的，因为每个内含子会被认为在转录过程中从RNA中各自被剪接掉以恢复编码感染性(+)SS RNA病毒的原始序列。此外，当存在多个内含子(例如三个或更多个内含子)时，可变剪接的可能性增加，由于一个内含子将与第二个或第三个内含子剪接，导致在这两个内含子之间的基因(或核苷酸)缺失。这种可变剪接的过程导致缺失并产生非功能性病毒。本公开提供了在细菌宿主细胞(如大肠杆菌)中产生稳定质粒的方法。任何质粒或病毒载体可以被用于插入cDNA，例如pcDNA3.1、pBR322、pCI、pUC、pCR、pCR-TOPO、痘苗载体、AAV载体、腺病毒载体和本领域已知用于在细菌宿主细胞中增殖的其它质粒或载体。可以使用软件程序和已知方法来预测细菌宿主的最佳启动子。包含含有至少三个内含子的cDNA的质粒被表征为与对照相比在细菌宿主细胞中的稳定性增强。与对照质粒相比，质粒的产量也增加。对照质粒是包含内含子少于3个且编码(+)SS RNA病毒的基因组RNA的cDNA的质粒。

cDNA还可以包括调节元件，例如，与编码(+)SS RNA病毒的DNA可操纵连接的适于在真核宿主细胞中表达的启动子。

本公开描述了包含本文所述的载体(vector)和载体材料(carrier)的组合物。该组合物可以是包含载体和药学上可接受载体材料的药物组合物。该组合物可以包含有效量的载体。该组合物可以包含治疗有效量的用于预防和治疗疾病的载体。出于治疗性目的，载体中包含的DNA编码非病原性和/或减毒的病毒或嵌合病毒的RNA分子。在具体的实施方式中，将该组合物用作疫苗以保护由(+)SS RNA病毒引起的疾病。

本公开描述了转染有本文描述的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如哺乳动物细胞。原核细胞包括大肠杆菌。真核细胞包括幼仓鼠肾细胞(BHK)、Vero细胞、CHO细胞或MDCK。

本公开还描述了包含从本文描述的载体获得的病毒和载体材料的组合物。本文描述的组合物包含使用技术产生的克隆纯化病毒的同质群体。技术产生病毒同质群体。例如，由技术产生的病毒群体含有较高百分比的核苷酸序列相同的病毒。在一些实施方式中，本文所述的(+)SS RNA病毒同质群体所含有的由相同核苷酸序列编码的病毒比常规方法产生的(+)SS RNA病毒群体多出至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。例如，本文所述的JEV病毒同质群体所含有的由SEQ ID NO：1编码的JEV比通过常规方法产生的JEV群体多出至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

此外，(+)SS RNA病毒的同质群体可以含有大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的病毒准种。

组合物可以包含有效量的病毒和载体材料。该组合物可以是药物组合物，并且包含治疗有效量的病毒和用于治疗和预防疾病的药学上可接受的载体材料。出于治疗性目的，组合物的同质病毒群体包括非病原性病毒、减毒病毒或非病原性减毒的病毒，并且还可包括非病原性活病毒、减毒的活病毒或非病原性减毒的活病毒。在具体的实施方式中，将包含克隆纯化病毒的同质群体的组合物用作疫苗以保护由(+)SS RNA病毒引起的疾病。

载体材料包括利用其以施用本文所述的载体的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。如果需要，该组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以具有溶液剂、混悬剂、乳液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂、其组合等的形式。

药学上可接受的载体材料是指用于包含本文所述的载体的溶媒，其可以被注射至受试者中而没有副作用。药学上可接受的载体材料包括无菌液，如水和油，该油包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、其组合等。合适的药学上可接受的载体材料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、其组合等。合适的药物载体的其它实例描述于E.W.Martin的“雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)”中。

本公开还提供了用于制备克隆纯化的活(+)SS RNA病毒的同质群体的方法。该方法包括将本文所述的载体转染至真核宿主细胞中，在允许生产活(+)SS RNA病毒的条件下培养宿主细胞，并从培养基中分离出活的(+)SS RNA病毒用于培养宿主细胞以获得克隆纯化的活(+)SS RNA病毒同质群体。用于制备克隆纯化的活(+)SS RNA病毒同质群体的真核宿主细胞的实例包括Vero细胞、CHO细胞和MDCK细胞及其它哺乳动物细胞。

在一些实施方式中，可以将上文刚刚描述的方法用于制备用作疫苗以免疫受试者的药物组合物，其包含治疗有效量的克隆纯化的活(+)SS RNA病毒的同质群体。

可以将本文所述的药物组合物配制成疫苗。本文所述的疫苗包含适当配制的本文所述的载体，该载体包括编码感染性非病原性和/或减毒(+)SS RNA病毒全长基因组RNA分子的DNA，该DNA可操纵地连接至适合于在真核细胞中表达的启动子。当将这种DNA注射至受试者体内时，其会启动减毒病毒的有限复制并诱导保护性免疫应答。

本公开描述了使用本文所述的疫苗和组合物来保护受试者免受由(+)SS RNA病毒引起的疾病的方法。受试者包括人和兽医动物(狗、猫、爬行动物、鸟等)，包括牲畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究动物(猴子、大鼠、小鼠、鱼等)。有需要(有此需要)的受试者是需要免受(+)SS RNA病毒引起的疾病而进行疫苗接种或免疫接种的受试者。可以将本文描述的疫苗特别配制为保护哺乳动物受试者(特别是人)免受疾病。

如本文所使用的，术语“针对疾病发挥保护作用(protect against a disease，保护免受疾病)”包括预防和治疗疾病。术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是用于表示获得所需的药理学和/或生理学效果，并且是指凭此将由(+)SS RNA病毒引起的疾病的症状完全消除或改善至任何临床和/或数量上可测量的程度的方法。术语“预防(preventing)”是指凭此将由(+)SS RNA病毒引起的疾病干扰和/或延迟的方法。在一些实施方式中，本文所述的疫苗通过诱导“免疫应答”来保护免受由(+)SS RNA病毒引起的疾病，所述“免疫应答”包括T细胞应答、针对抗原的抗体血清水平增加、针对抗原(如(+)SS RNA病毒多肽)的中和抗体的存在、或其组合。术语“保护(protection)”或“保护性免疫(protective immunity)”包括在免疫接种期间诱导的血清抗体或T细胞应答以针对由(+)SS RNA病毒引起的疾病或死亡发挥(部分或完全)保护作用的能力。

可以以各种方式利用本文所述的疫苗以保护免受由(+)SS RNA病毒引起的疾病。可以通过各种方法将含有本文所述载体的疫苗直接地施用至受试者，所述方法包括电穿孔、脂质转染、基因枪、显微注射、微粒、微胶囊、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀或其它遗传转移方法。在受试者的组织中，通过转录来产生全长感染性(+)SS RNA，其启动体内减毒活(+)SS RNA病毒的产生。(+)SS RNA病毒在体内从在受试者组织中胞释放出来，其启动对于疫苗的有效免疫应答的诱导。

此外，使用技术，可以通过电穿孔或本领域已知的任何其它可接受的方式将载体引入至真核细胞中。通过引入遗传稳定的经测序DNA载体所产生的减毒活病毒是同质病毒群体并且含有较少数量的准种，因此具有优于常规减毒活疫苗的优势。因此，可以将由本文所述的载体所产生的减毒活病毒同质群体配置成适合用于向受试者疫苗施用的药学上可接受的制剂。

疫苗的施用是可以通过通常用于疫苗接种的任何途径(包括局部、皮下、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、口腔、吸入或其组合)进行的。

本文所述的疫苗包括治疗有效量的本文所述的载体或本文所述的克隆纯化(+)SSRNA病毒同质群体。“治疗有效量”是使得疫苗发挥其免疫作用而不会对施用组合物的受试者造成过度负面影响的必要用量。确切的施用量将根据多种因素而变化，如所采用的转录和翻译启动子的强度、所治疗病症的类型、施用方式以及组合物中其它成分。在一些实施方式中，疫苗包含约1ng至约1mg的载体。

与常规的DNA疫苗不同，本文所述的疫苗可通过单次疫苗接种来诱导有效的免疫，而无需多次加强免疫。此外，仅需要低剂量的载体或克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体。在一些实施方式中，可以使用约1ng至约1μg、约10ng至约1μg、或约100ng至约1μg的低剂量的载体或同质病毒群体。此外，与传统的DNA疫苗相比，可以采用约1/5至约1/100的载体、约1/10至约1/100的载体、约1/25至约1/100的载体、或约1/50至约1/100的载体或病毒群体。

在一些实施方式中，可以通过与一种或多种药学上可接受的佐剂或免疫刺激剂(如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”)、白细胞介素2(“IL-2”)、白细胞介素12(“IL-12”)和CpG寡核苷酸)配制来修饰DNA疫苗的免疫原性。为了制备这种组合物，可以使用本领域熟知的方法。在某些实施方式中，DNA是在作为载体的大肠杆菌细胞中产生的，其含有未甲基化的CpG基序，并且其自身构成经由Toll样受体激活免疫系统的免疫刺激分子。

如将由本领域普通技术人员理解的，本文公开的每个实施方式可以包含它的特定描述的元素、步骤、成分或组分，基本上由其组成，或由其组成。因此，术语“包括(include)”或“包含(including)”应被解释为记载：“包括(comprise)、由......组成(consist of)或基本上由......组成(consist essentially of)”。过渡术语“包括(comprise)”或“包含(comprises)”表示包括但不限于并允许包括(即使是大量的)未指明的元素、步骤、成分或组分。过渡短语“由......组成(consisting of)”排除了任何未指明的元素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由......组成(consisting essentially of)”将实施方式的范围限制为指明的元素、步骤、成分或组分以及对实施方式没有实质影响的那些。例如，缺乏实质影响是通过缺乏本文所述疫苗对病毒感染的统计学上显著性保护作用证实的。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分、性质的量(如分子量、反应条件等)的所有数字应被理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。至少且不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，至少应该根据报道的有效数字的数目并通过采用常规的舍入技术来解释每个数值参数。当需要进一步澄清时，术语“约”在与所述数值或范围结合使用时具有由本领域技术人员合理归因于其的含义，即表示比所述值或范围稍微更多或稍微更少，至在规定值的±20％的范围内；在规定值±19％的范围内；在规定值±18％的范围内；在规定值±17％的范围内；在规定值±16％的范围内；在规定值±15％的范围内；在规定值±14％的范围内；在规定值±13％的范围内；在规定值±12％的范围内；在规定值±11％的范围内；在规定值±10％的范围内；在规定值±9％的范围内；在规定值±8％的范围内；在规定值±7％的范围内；在规定值±6％的范围内；在规定值±5％的范围内；在规定值±4％的范围内；在规定值±3％的范围内；在规定值±2％的范围内；或在规定值±1％的范围内。

尽管阐述本发明较宽范围的数值范围和参数是近似值，但是应尽可能精确地报道具体实施例中列出的数值。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量值中存在的标准偏差必然产生的某些误差。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一种(a)”、“一个(an)”、“该(the)”和类似参考应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明确相矛盾。本文中对数值范围的描述仅旨在用作分别提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独描述一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文描述的任一和所有示例或示例性语言(例如，“如(suchas)”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于实践本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

以下实施例说明了示例性实施方式和方法。它们不是旨在、也不是用于解释为对本公开范围的限制。明显的是，除了本文特别描述的方法之外，可以实施这些方法。鉴于本文的教导，许多修改和变化是可能的，因此，它们是在本公开的范围内。

示例性实施方式

1.一种载体，包含编码RNA分子的DNA，DNA可操纵地连接至适于在真核细胞中表达载体或DNA的启动子，其中RNA分子编码感染性正义单链((+)SS)RNA病毒，并且其中DNA包含至少三个内含子。

2.根据实施方式1的载体，其中(+)SS RNA病毒是黄病毒属、甲病毒属、小核糖核酸病毒、风疹病毒属、冠状病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、严重急性呼吸道(SAR)病毒和慢病毒。

3.根据实施方式1或2的载体，其中黄病毒属是日本脑炎病毒(JEV)、登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、丙型肝炎病毒和寨卡病毒。

4.根据实施方式1-3中任一项的载体，其中黄病毒属是JEV。

5.一种载体，包含编码嵌合RNA分子的DNA，DNA可操纵地连接至适于在真核细胞中表达载体或DNA的启动子，其中嵌合RNA分子编码感染性(+)SS RNA病毒，并且其中DNA包含至少三个内含子。

6.根据实施方式5的载体，其中(+)SS RNA病毒是由包含至少两种不同(+)SS RNA病毒的RNA的嵌合RNA分子编码的。

7.根据实施方式5或6的载体，其中至少两种不同(+)SS RNA病毒包括JEV和至少一种其它病毒、黄热病病毒和至少一种其它病毒、以及登革热病毒和至少一种其它病毒。

8.根据实施方式4-7中任一项的载体，其中至少一种其它病毒是寨卡病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒或登革热病毒。

9.根据实施方式4-8中任一项的载体，其中至少两种(+)SS RNA病毒是JEV和寨卡病毒。

10.根据实施方式1-9中任一项的载体，其中至少一个内含子位于编码非结构蛋白的区域中，并且一个内含子位于编码结构蛋白的区域中。

11.根据实施方式1-10中任一项的载体，其中内含子含有一个终止密码子或几个终止密码子。

12.根据实施方式1-11中任一项的载体，其中DNA包含三个内含子。

13.根据实施方式1-12中任一项的载体，其中DNA包含至少四个内含子、至少五个内含子或至少六个内含子。

14.根据权利要求1-13中任一项的载体，其中感染性(+)SS RNA病毒是非病原性病毒。

15.根据实施方式1-14中任一项的载体，其中非病原性病毒是减毒的病毒。

16.根据实施方式1-15中任一项的载体，其中启动子是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子、HSV启动子、人Pol I启动子、人Pol II启动子或人Pol III启动子。

17.根据实施方式1-16中任一项的载体，其中启动子位于转录起始位点上游约12至18个核苷酸处。

18.根据实施方式1-17中任一项的载体，其中启动子位于转录起始位点上游约15个核苷酸处。

19.一种组合物，包含实施方式1-18中任一项的载体和载体材料。

20.一种药物组合物，包含实施方式1-20中任一项的载体和药学上可接受的载体材料。

21.一种疫苗，包含治疗有效量的实施方式1-20中任一项的载体。

22.一种疫苗，包含治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含实施方式1-21中任一项的载体。

23.一种克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体，获得自转染有实施方式1-23中任一项的载体的真核细胞。

24.一种组合物，包含实施方式23的克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体和载体材料。

25.一种药物组合物，包含实施方式23或24的克隆纯化(+)SS RNA病毒同质群体和药学上可接受的载体材料。

26.一种疫苗，包含治疗有效量的克隆纯化活(+)SS RNA病毒同质群体，克隆纯化活(+)SS RNA病毒同质群体获得自转染有实施方式1-25中任一项的载体的细胞。

27.一种制备克隆纯化活(+)SS RNA病毒同质群体的方法，其中该方法包括将实施方式1-26中任一项的载体转染至真核细胞中并且分离出(+)SS RNA病毒，从而获得克隆纯化活(+)SS RNA病毒同质群体。

28.根据实施方式1-27中任一项的方法，其中真核细胞是Vero细胞、CHO细胞或MDCK细胞。

29.一种制备用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的疫苗的方法，其中该方法包括将实施方式1-29中任一项的载体转染至真核细胞中，培养经过转染的真核细胞，并且分离出(+)SS RNA病毒，从而获得疫苗。

30.根据实施方式1-29中任一项的方法，其中真核细胞是Vero细胞、CHO细胞或MDCK细胞。

31.一种保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的方法，其中该方法包括将实施方式1-30中任一项的疫苗施用至受试者。

32.根据实施方式1-31中任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。

33.根据实施方式1-32中任一项的方法，其中哺乳动物是人或兽医动物。

34.一种制备稳定质粒的方法，稳定质粒包含编码感染性(+)SS RNA病毒的基因组RNA的DNA，其中该方法包括将至少三个内含子引入至DNA中，并且其中至少一个内含子位于编码(+)SS RNA病毒的结构蛋白的区域中，并且至少一个内含子位于编码(+)SS RNA病毒的非结构蛋白的区域中。

35.一种制备实施方式1-34中任一项的载体的方法，其中该方法包括将实施方式1-34中任一项的载体转染至宿主细胞中，并且从宿主细胞中分离出载体。

36.一种分离的转染有实施方式1-34中任一项的载体的细胞。

37.一种保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的方法，其中该方法包括施用包含实施方式1-36中任一项的克隆纯化活(+)SS RNA病毒同质群体的疫苗。

实施例

简介。日本脑炎病毒(JEV)是(+)SS RNA病毒。它是亚太地区急性病毒性脑炎的主要病因，主要影响儿童和青年。JEV引起整个亚洲的流行病，并由蚊子三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)传播。四种类型的JEV疫苗已经在世界不同地区获得了许可(CDC，2016；WHO，2015)。在过去几十年间，用组织培养或鼠脑制备了灭活的病毒疫苗，并已将其用于对地方性流行病国家的旅客和居民进行免疫。对这些疫苗成本、功效和安全性特征的担忧促使了包含减毒活疫苗SA14-14-2的替代疫苗、嵌合疫苗YF-JEV以及由组织培养获得的纯化灭活疫苗的开发(霍尔斯特德和托马斯(Halstead and Thomas)，2011)。目前，源自其野生型亲本菌株SA14的减毒菌株SA14-14-2是用于疫苗开发和生产的最常见菌株。然而，尽管可获得临床和实验性JEV疫苗，但由于目前可获得疫苗的局限，仍需要改善JEV疫苗接种。在多种实验方法中，已经开发了表达结构JEV蛋白或非结构JEV蛋白的质粒DNA疫苗。在小鼠模型中，DNA疫苗引发针对致死剂量JEV攻击的可检测的保护作用(Putnak等人，2003)。

最近，已经对DNA启动的减毒活疫苗进行了描述，其将DNA疫苗的化学和遗传稳定性与传统的减毒活疫苗功效相结合(Pushko等人，2016；Tretyakova等人，2014a；Tretyakova等人，2013；Tretyakova等人，2014b)。该平台是基于感染性克隆技术，并且提供可以在体外或体内启动减毒活病毒的质粒DNA(Jiang等人，2015；Lukashevich，2014；Tretyakova等人，2014a；Tretyakova等人，2013；Tretyakova等人，2014b)。DNA启动的减毒活疫苗有时被称为疫苗，以便与标准DNA疫苗区分(Pushko等人，2016；Tretyakova等人，2014a；Tretyakova等人，2013；Tretyakova等人，2014b)。在先前的研究中，已经制备了全长JEV感染性克隆，并将其用于在体外制备DNA启动的病毒，并且以细胞培养研究了JEV复制。已经证实了DNA启动的JEV黄病毒属在体外复制(Mishin等人，2001；Yamshchikov等人，2001)。然而，尚未对DNA启动的减毒活JEV疫苗在体内进行评估。一个潜在原因是难以产生稳定的全长JEV克隆。为了提高质粒的稳定性，已将两个内含子插入至低拷贝JEV cDNA质粒中以改善全长克隆的稳定性(Yamshchikov等人，2001)。

在目前研究中，基于SA14-14-2疫苗的公开序列制备了DNA启动的减毒活JEV疫苗。通过使用SA14-14-2菌株的完全合成性cDNA来制备质粒。通过将三个合成性内含子插入至JEV cDNA的结构基因和非结构基因中，提高了在大肠杆菌中生产的全长质粒的产量。疫苗质粒被初步证实在体外启动JEV疫苗。此外，在BALB/c小鼠中评估了这种新型疫苗的免疫原性和病毒中和反应的诱导。在用500ng或5μg质粒进行单剂量疫苗接种后检测到中和抗体，这表明可以将DNA启动的减毒活疫苗方法用于开发新型JEV疫苗。

材料和方法

细胞系和病毒：非洲绿猴(Vero)细胞系和幼仓鼠肾(BHK)细胞系获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，弗吉尼亚州，马纳萨斯)，并其在37℃和5％CO₂的潮湿培养箱中保持在补充有10％胎牛血清(FBS)和硫酸庆大霉素(10μg/ml)(赛默飞科技(Thermo)，加利福尼亚州，卡尔斯巴德)的αMEM培养基中。

质粒和 的制备：使用合成生物学技术(Wimmer等人，2009)来制备JEV减毒活疫苗菌株SA14-14-2(Genbank登录号AF315119.1)的cDNA全长核苷酸序列。将得到的完整JEV cDNA序列克隆至携带pMB1复制起点的抗卡那霉素高拷贝pUC57质粒(Genscript，新泽西州，皮斯卡塔韦)中。任何其它标准质粒或病毒载体可以被用于插入cDNA，例如，pcDNA3.1、pBR322、pCI、pUC、pCR、pCR-TOPO、痘苗载体、AAV载体、腺病毒载体和本领域已知的其它质粒或载体。CMV主要立即早期启动子被插入至全长SA14-14-2cDNA上游。此外，已将三个合成性内含子插入在预测的细菌启动子下游的JEV序列中，目的是阻止大肠杆菌中潜在毒性蛋白的合成。已经通过使用BPROM软件(SoftBerry，纽约州，芒特基斯科市)预测了大肠杆菌启动子以确定内含子的插入位点。也可以使用其它软件或方法以预测启动子。通过使用标准分子生物学方法将三个嵌合内含子插入至SA14-14-2cDNA的衣壳、包膜和NS1基因中。内含子序列源自于小鼠免疫球蛋白H链V区前体基因(Genbank登录号M12880)或内含子序列的其它来源。结果是，产生了在CMV启动子的转录控制下编码SA14-14-2全长基因组RNA的质粒pMG8009(图1)。该质粒从大肠杆菌菌株Stbl3(赛默飞)中分离出来，通过DNA测序加以证实，定量并储存在-20℃中。

体外转染和测定：通过电穿孔用浓度范围为10ng至1μg的pMG8009或对照质粒DNA转染Vero细胞。基本上如先前(Messer等人，2012；Tretyakova等人，2013)所述进行转染。通过感染中心测定法(ICA)、间接免疫荧光测定法(IFA)和蛋白质印迹来确定经转染的Vero细胞中的病毒产生和SA14-14-2抗原表达。通过在BHK细胞中进行的标准噬斑测定法来检测来自经转染的Vero细胞的在生长培养基中分泌的JEV疫苗病毒。

通过使用转染有pMG8009或感染有活病毒的Vero细胞来进行感染中心测定法(ICA)。以含有10％FBS的完全αMEM将Vero细胞稀释10倍，使其在6孔板中贴壁4小时，并用1％琼脂糖覆盖物覆盖。将板在37℃和5％CO₂中培养3天以形成噬菌斑，使用中性红染色使噬菌斑可视化。

对于间接免疫荧光测定法(IFA)，将转染有pMG8009DNA的Vero细胞种植在含有完全αMEM的8孔腔室载玻片中。在转染后48小时，将细胞用PBS润洗，干燥并用冷丙酮固定，并且使用JEV特异性小鼠抗血清VR-1259AF(ATCC)然后如先前(Pushko等人，2001；Tretyakova等人，2014b)所述使用第二荧光素标记的抗小鼠IgG抗体(H+L)(克尔凯郭尔和佩里(Kirkegaard和Perry)，马里兰州，盖瑟斯堡)进行IFA。将含有碘化丙锭复染物的固封剂(Vector Labs，加利福尼亚，伯林盖姆)用于使细胞核可视化。

采用SDS-PAGE和蛋白质印迹以检测转染有的Vero细胞中的JEV抗原。在转染后第9天收集经转染的Vero细胞，将其溶于含有2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中，通过4-12％SDS-PAGE分离蛋白质。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用VR-1259AF JEV特异性抗血清然后用碱性缀合的二抗进行检测，并用1-组分BCIP/NBT磷酸酶底物(KPL，马里兰州，盖瑟斯堡)进行染色。

最后，通过以BHK细胞进行的标准噬斑测定法来证实生长培养基中的病毒存在性。对于病毒生长曲线，以24小时的时间间隔取样。确定平均值和标准偏差值。每个实验至少进行两次以确保可再现性。

在感染后9天收集来自经转染的细胞的病毒。在收集经转染的病毒后，以3000×g离心10分钟来使疫苗病毒澄清，并在-80℃中冷冻。

免疫和血清学：从大肠杆菌中分离出质粒，并将其配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至0.4mg/ml的终浓度。用异氟烷麻醉4周龄雌性BALB/c小鼠，并将剂量为5μg或500ng的pMG8009疫苗(50μl)肌肉内(i.m.)疫苗接种至大腿内侧、胫骨前肌(NobleLife Sciences，马里兰州，乌班市)。在注射后，如别处(Tretyakova等人，2013)所描述的对动物进行电穿孔。对于体内转染，可以使用多种方法，包括弹道DNA递送(ballistic DNA delivery)(基因枪或类似物)、使用体内转染试剂(PEI、脂质体或类似物)化学转染、电穿孔装置(使用BTX(吉登诺克斯，Gentronics)、TriGrid(Ichor MedicalSystems公司，加利福尼亚，圣地亚哥)、Inovio或在本领域已接受的其它电极或仪器。作为对照，类似地将表达无关基因的质粒电穿孔。疫苗接种后，每天观察动物的感染临床体征。在第3天和第4天收集血清以用于病毒血症检测，并且在第21天(实验1)和第28天(实验2)收集血清以用于抗体应答评估。对于病毒血症检测，以直接噬斑测定法单独地测试血清。可替换地，将每份血清与Vero细胞一起培养10天以扩增血清中的病毒，然后收集。在收集Vero细胞时，观察Vero细胞的细胞病变效应(CPE)，而通过噬斑测定法测试所收集的培养基。

为了确定抗体应答，进行了噬斑减少中和试验(PRNT)、蛋白质印迹和IFA。对于PRNT，将等体积(0.1ml)的含有500PFU/ml且连续两倍稀释的热灭活血清的病毒混悬液在37℃下孵育1小时，并将血清-病毒混合物铺在12孔板的BHK细胞单层上。加入αMEM中的琼脂糖覆盖层，并将板在37℃下孵育3天，然后进行中性红染色和确定噬斑计数。将PRNT₅₀滴度终点表示为与不含血清的孔相比斑块减少50％的血清最高稀释度。

为了通过IFA确定抗体应答，用处于完全αMEM中的腔室玻片中的JEV疫苗病毒(10²PFU/孔)初始感染Vero细胞单层24小时。然后，用丙酮固定经感染的Vero细胞，并且基本上如上所述用作固定化抗原。用来自疫苗接种的实验小鼠的血清检测感染JEV的Vero细胞单层，以检测血清中的JEV特异性抗体。作为对照，采用来自未疫苗接种的小鼠的血清。

实施例1：DNA启动的JEV疫苗的设计和制备：

通过将CMV主要立即早期启动子插入至pUC57质粒中全长合成性JEV cDNA的上游来制备JEV pMG8009疫苗。结果是，pMG8009质粒含有处于CMV启动子下游的JEV菌株SA-14-14-2基因组RNA的全长cDNA拷贝。pUC家族具有来自pMB1序列的突变，其导致拷贝数增加20-35倍，每个细胞具有约500个拷贝(Wu和Liu，2010)。因为RNA的真正5'末端对于黄病毒属复制很重要(Khromykh等人，2001)，因此已将CMV启动子和JEV cDNA的5'之间的距离优化以确保JEV基因组RNA的功能性5'末端的转录。JEV序列的3'末端下游包含核酶。根据先前研究(Yamshchikov等人，2001)，将两个内含子插入至衣壳基因和E基因中可以提高cDNA克隆的稳定性，因此将两个内含子初始地插入至衣壳基因和E基因中，与先前报道的方法类似(Yamshchikov等人，2001)。然而，在大肠杆菌菌株DH5α以及菌株Stbl3中的pUC57骨架的情况下，得到的全长JEV cDNA显示出较低的质粒产生产量，并且不能分离出足够量的DNA。据推测，与其它黄病毒属相似，JEV cDNA含有神秘的细菌启动子，其驱动有毒蛋白质的合成，从而影响大肠杆菌的遗传稳定性和DNA产量(Rice等人，1989；Tretyakova等人，2014b；Yamshchikov等人，2001)。为了提高遗传稳定性并增加质粒产量，将第三个内含子序列插入至全长JEV cDNA中。通过诱变并预测JEV序列内的细菌启动子来选择内含子的插入位点。已经确定了NS1内的多个推定的细菌启动子。因此，将另外的合成性内含子引入至JEV NS1基因中，得到含有在JEV SA-14-14-2cDNA的衣壳基因、E基因和NS1基因中具有三个内含子的全长cDNA的质粒pMG8009(图1A)。从大肠杆菌Stbl3细胞中分离出质粒pMG8009。通过DNA测序来证实所得的pMG8009-JEV。

实施例2：pMG8009在大肠杆菌中的表征：评估了质粒pMG8009在大肠杆菌中的生长和DNA产量。在一个实验中，将pMG8009转化至化学感受态大肠杆菌Stbl3细胞中，并从10个随机菌落中检查DNA产量(图1B)。质粒DNA产量、大小和外观在不同分离物之间是可比较的，并且与亲本质粒相似，这表明pMG8009的均一性和遗传稳定性。来自Stbl3细胞的pMG8009产量约为0.5mg/ml(图1B)。从大肠杆菌Stbl3细胞中分离出pMG8009质粒，得到无菌的无内毒素的DNA，其具有95％的超螺旋级分和～1.8的A260/A280比值。

实施例3：来自 的JEV疫苗病毒在体外的复制：为了在体外启动活JEV疫苗病毒的复制，通过电穿孔用pMG8009质粒转染Vero细胞。通过ICA、IFA和蛋白质印迹分析经转染的Vero细胞的JEV疫苗病毒的表达，而通过噬斑测定法测试来自经转染细胞的培养基。对于ICA，将电穿孔过的Vero细胞的悬浮液种植到6孔板中，并用1％琼脂糖覆盖。在72小时时，检测到斑块，表明来自感染中心(IC)的病毒复制(图2)。pMG8009-JEV的特定感染性被计算为～10³IC/μg。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进一步检查转染细胞中JEV抗原的表达。检测到转染的Vero细胞中的抗原条带(图2B，泳道1)。蛋白质印迹证实了与E蛋白、NS1蛋白和prM蛋白分子量一致的JEV抗原的存在。正如预期的那样，对于未感染的Vero细胞未检测到条带(图2B，泳道2)。此外，在转染后24小时，通过IFA使用小鼠抗JEV抗血清证实了在转染细胞中JEV抗原的表达(图2C)。检测到JEV阳性细胞的聚集(图2c，小图1)，而对于未转染的Vero对照未检测到阳性细胞或聚集(图2c，小图2)。如对于黄病毒属所预期的，在转染细胞的细胞质中发现了JEV抗原的表达(图2C，小图1和3)。

通过噬斑测定法检查了来自转染的Vero细胞的生长培养基中复制性病毒的存在(图3)。评估了pMG8009的逐步加大剂量在体外启动活JEV的能力。用剂量范围为10ng至1μg的pMG8009质粒转染Vero细胞。作为阳性对照，用1000PFU JEV感染Vero细胞(电穿孔或未处理的)。用PBS处理阴性对照。如所预期的，在PBS处理的Vero细胞中未检测到复制性病毒(数据未显示)。在转染有不同量(10-1000ng)的质粒或感染有10³PFU的JEV病毒的Vero细胞的上清液样品中检测到斑块，这表明质粒已启动了活疫苗病毒的复制并且内含子的插入不影响pMG8009启动活JEV疫苗病毒复制的能力(图3A)。有理由认为，与经典的减毒活病毒SA-14-14-2相比，启动的SA-14-14-2疫苗具有更高的遗传稳定性。来自转染/感染细胞的病毒的生长曲线显示在图3B中。在测试的所有DNA剂量下，峰值病毒滴度相似。在用1μg pMG8009转染的细胞的培养基中，在转染后第6天，峰值滴度达到10⁶-10⁷PFU/ml，类似于感染有1000PFU JEV的细胞。该实验表明，就病毒复制动力学而言，1μg DNA与1000PFU病毒相当。然而，当使用10ng或100ng DNA时，随着复制起始延迟，可检测到DNA剂量依赖性。当Vero细胞转染有10ng或100ng pMG8009时，观察到峰值滴度延迟约48-72小时。如图3B所示，仅转染10ng DNA导致JEV病毒复制，在第9天峰值病毒滴度达到约10⁶-10⁷PFU/ml，峰值滴度与转染更高DNA量的那些相似(图3B)。

这些结果表明，在Vero细胞中启动JEV疫苗病毒的的最小剂量低于10ng(图3B)，这与我们关于编码YF黄病毒属(Tretyakova等人，2014b)以及VEEV和CHIKV甲病毒属(Tretyakova等人，2014a；Tretyakova等人，2013)的质粒的结果一致。

实施例4：JEV 疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性：为了确定pMG8009质粒在体内是否具有免疫原性，通过用单剂量的pMG8009质粒注射-电穿孔来疫苗接种BALB/c小鼠。JEV疫苗是基于抗体的诱导，并且1:10的中和滴度被认为是保护性的(Plotkin，2010)。因此，关键的是检测血清抗体(包括中和抗体)反应。通过单次肌肉内注射500ng或5μg的随后电穿孔来疫苗接种小鼠。作为对照，通过注射表达无关基因的无关DNA来疫苗接种小鼠。在疫苗接种后，所有小鼠保持健康，未因疫苗接种而在注射部位检测到病症或不良反应。通过直接噬斑测定或者通过将每种血清与Vero细胞孵育10天以扩增病毒后进行CPE分析和噬斑测定，在第3天和第4天在疫苗接种的小鼠中未检测到病毒血症(表4)。该结果表明在注射后的第3天和第4天无显著存在的复制性疫苗病毒。为了检测血清抗体，使用了IFA和PRNT方法。对于IFA，在腔室载玻片中用100PFU的SA-14-414-2病毒初始地感染Vero细胞，固定，然后用1:10稀释度的经免疫的小鼠血清检测(图4)。通过IFA，疫苗接种有5μg pMG8009的所有实验小鼠均发生血清转化，如图4和表I所示。

表4.疫苗接种有pMG8009DNA疫苗的小鼠中的病毒血症和血清抗体

*对于病毒血症，在第3天和第4天采集血清。括号中示出了测试小鼠/总小鼠的数量。

**对于抗体，在第21天和第28天采集血清。在IFA中，“+”表示阳性反应。在PRNT₅₀中，示出了产生50％斑块减少的血清稀释度。括号中示出了测试小鼠/总小鼠的比值。

还通过间接荧光抗体(IFA)检测了疫苗接种有500ng pMG8009的所有小鼠中的血清转化(表1)。尽管IFA不是定量方法，但是与500ng组相比，在疫苗接种有5μg剂量的小鼠血清中观察到荧光强度增加(数据未显示)。也通过在疫苗接种pMG8009的小鼠血清中的PRNT检测中和抗体(表4)。在5μg疫苗接种组中，大多数小鼠具有10的PRNT₅₀滴度(这与先前(Plotkin，2010)所描述的针对JEV的保护性滴度相似)，而一只小鼠的滴度为40，且一只小鼠的滴度检测不到。在500ng疫苗接种组中，所有小鼠的PRNT₅₀滴度在10至40的范围内。

实施例5：JEV 保护免受JEV感染：已知的是缺乏完整IFN应答的AG129小鼠对强毒性DENV和WNV以及VEEV和YFV疫苗菌株、以及对JEV疫苗菌株SA14-14-2病毒敏感。如上所述或类似地，用JEV质粒对干扰素缺陷型AG129小鼠进行疫苗接种。作为对照，使小鼠接受PBS注射。腹膜内(i.p.)注射JEV减毒活疫苗SA14-14-2以作为感染性病毒攻击。观察并记录发病率或死亡率以确定疫苗接种的保护性作用。在疫苗接种的小鼠中观察到针对攻击的保护作用，而在未疫苗接种的小鼠中未观察到保护作用。

实施例6：兽医疫苗接种：如上所述或类似地，用JEV质粒对猪进行疫苗接种。作为对照，向猪注射PBS。注射野生型强毒性JEV病毒以作为感染性病毒攻击。观察猪中的发病率或死亡率以确定疫苗接种的保护性作用。在疫苗接种的猪中观察到针对攻击的保护作用，而在未接种疫苗的动物中未观察到保护作用。

结论：JEV是黄病毒属家族的成员，并且是日本脑炎(一种由蚊子传播并在猪中增殖的人畜共患疾病)的病因。报道了东南亚和西太平洋的24个国家人群中地方性流行的JEV传播，这使30多亿人面临JEV感染的风险(WHO，2015)。目前还没有针对该疾病的特异性治疗方法，并且当前的治疗方式主要是支持患者克服感染。然而，全世界范围内都可获得预防性疫苗。存在4种主要的JEV疫苗类型，包括灭活的鼠脑源疫苗、灭活的Vero细胞源疫苗、减毒活疫苗和重组活疫苗(WHO，2015)。在过去几年中，由中国制备的减毒活SA14-14-2疫苗已成为在地方性流行国家使用最广泛的疫苗。基于细胞培养的灭活疫苗和基于黄热病疫苗菌株的重组活疫苗也已获得批准，并获得WHO资格预审。在美国，建议对计划在JEV传播季期间在流行地区度过一个月或更长时间的旅客进行疫苗接种。源自灭活Vero细胞培养的IXIARO疫苗是唯一一种获得美国批准的疫苗(CDC，2016)，以28天间隔给予两次剂量。还进行了针对JEV的兽医疫苗接种，可获得用于猪的减毒活疫苗和灭活疫苗(Lutticken等人，2007)。

先前结果已经表明了活的和灭活的JEV疫苗二者对于JEV都是安全有效的，并且还可以引发强烈的交叉免疫性并针对黄病毒属相关的登革热的保护作用(Li等人，2016)。然而，在成人中也存在JEV疫苗促进的登革热病毒感染-增强抗体的现象也有迹象表明JEV疫苗在成人中促进登革热病毒感染来增强抗体(Saito等人，2016)。因此，需要进一步的研究，尽管目前存在疫苗，但是由于目前疫苗的局限性，仍需改善JEV疫苗接种。

已经研究了将针对JEV的DNA疫苗作为传统疫苗的替代品，由于它们成为安全廉价制剂的潜力。已经使用表达JEV蛋白的质粒(Putnak等人，2003)来开发实验性DNA疫苗。表达E蛋白的质粒诱导JEV中和性抗体，其为保护作用重要指标(Konishi等人，1999)。与仅表达E蛋白的构建体(Konishi等人，2003；Wu等人，2006)相比，编码prM和E蛋白的质粒DNA疫苗看上去能提供更加有效的疫苗接种。然而，与其它的标准DNA疫苗类似，与灭活的疫苗(Bharati等人，2005；Kaur等人，2002)相比，编码JEV蛋白的质粒DNA的免疫原性相对更低。可以通过使用先进的佐剂和电穿孔来增强免疫应答。发现表达JEV的prM-E蛋白的DNA疫苗被在肌肉内注射后在小鼠中是有效的；然而，当伴随进行电穿孔时，小鼠模型和猪模型(Sheng等人，2016)中的免疫应答得到改善。已经报道了使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子来增强基于prM-E DNA的疫苗的免疫原性(Zhai等人，2015)。

构造DNA启动的减毒活疫苗以制备针对JEV的新型实验性基于DNA的疫苗。在pMG8009中，将SA-14-14-2菌株的全长合成性cDNA引入至CMV启动子的下游，这导致“感染性”基因组病毒RNA的转录并在真核细胞中启动疫苗病毒。DNA启动的疫苗的优势包括在遗传学和物理学方面的稳定性、易于生产和DNA疫苗纯度高，以及减毒活疫苗的效率高(Pushko等人，2016)。用于疫苗生产的传统细胞底物通常被可通过下一代(NGS)测序和其它方法确定的潜伏病毒污染(Onions等人，2011)。相比之下，无内毒素的DNA可以被分离出来，而没有潜伏病毒或与细胞培养生产相关的杂质。然而，由于在大肠杆菌中的不稳定性(Rice等人，1989；Tretyakova等人，2014b；Tsetsarkin等人，2016；Yamshchikov等人，2001)，众所周知制备全长黄病毒属cDNA非常困难。在当前研究中，通过将三个不同的合成性内含子序列插入至结构和非结构JEV基因中解决了在大肠杆菌中制备全长JEV cDNA克隆的挑战。在先前的研究中，将两个内含子插入至JEV结构基因中，促进了全长克隆的制备(Yamshchikov等人，2001)。发现除了在结构基因中包含两个内含子之外，在非结构基因中包含第三内含子显著改善了cDNA制备，以及具有卡那霉素抗性的pUC骨架的产量。此外，在体内的首次概念验证研究中，证明了500ng或5μg pMG8009质粒的单剂量在小鼠中诱导针对JEV的免疫应答，包括JEV中和性抗体。假设了类似于我们在体外的观察，在体内启动了减毒活病毒。然而，在病毒血症实验中未在小鼠中检测到活病毒。这暗示了较低的病毒血症水平，可以表示活疫苗的安全性优势。先前，也针对黄热病病毒(黄病毒属家族的另一成员)(Jiang等人，2015；Tretyakova等人，2014b)、西尼罗黄病毒属(Hall等人，2003；Yamshchikov，2015；Yamshchikov等人，2015)制备了DNA启动的实验性疫苗，以及针对甲病毒属的疫苗(Tretyakova等人，2014a；Tretyakova等人，2013)。NGS还表明，与源自细胞培养的CHIKV病毒(Hidajat等人，2016)相比，源自的Chikungunya病毒(CHIKV)具有更高的遗传稳定性。此外，JEV感染性克隆可作为载体平台，为其它病毒(包括黄病毒属，如寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒)制备嵌合JEV基疫苗，如先前针对嵌合黄热病基疫苗所示的(Guy等人，2010)。最后，用于SA-14-14-2JEV疫苗的合成性DNA显示了将合成生物学方法(Wimmer等人，2009)成功应用于将经典的减毒活疫苗转化为DNA疫苗形式。这种DNA疫苗不仅可用于表达亚单位疫苗，还可用于表达活疫苗(Pushko等人，2016)。

以上描述的主题仅以说明的方式进行描述，且不应被解释为限制性的。在不遵循举例说明和描述的示例实施例和应用下，并且在不脱离在以下所附权利要求中阐述的本发明的真正精神和范围下，可以对本文描述的主题进行各种修改和改变。

在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用将其整体并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特定地和单独地指出以通过引用并入。尽管已经根据各种实施方式描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，在不脱离其精神下，可以进行各种修改、替换、省略和改变。

参考文献

Bharati,K.,Appaiahgari,M.B.,Vrati,S.,2005.Effect of cytokine-encodingplasmid delivery on immune response to Japanese encephalitis virus DNAvaccine in mice.Microbiol.Immunol.49,349-353.

CDC,2016.Japanese Encephalitis Vaccine.

Guy,B.,Guirakhoo,F.,Barban,V.,Higgs,S.,Monath,T.P.,Lang,J.,2010.Preclinical and clinical development of YFV 17D-based chimeric vaccinesagainst Dengue,West Nile and Japanese encephalitis viruses.Vaccine 28,632-649.

Hall,R.A.,Nisbet,D.J.,Pham,K.B.,Pyke,A.T.,Smith,G.A.,Khromykh,A.A.,2003.DNA vaccine coding for the full-length infectious Kunjin virus RNAprotects mice against the New York strain of West Nile virus.Proc Natl AcadSci U S A 100,10460-10464.

Halstead,S.B.,Thomas,S.J.,2011.New Japanese encephalitis vaccines:alternatives to production in mouse brain.Expert Rev Vaccines 10,355-364.

Hidajat,R.,Nickols,B.,Forrester,N.,Tretyakova,I.,Weaver,S.,Pushko,P.,2016.Next generation sequencing of DNA-launched Chikungunya vaccinevirus.Virology 490,83-90.

Jiang,X.,Dalebout,T.J.,Lukashevich,I.S.,Bredenbeek,P.J.,Franco,D.,2015.Molecular and immunological characterization of a DNA-launched Yellowfever virus 17D infectious clone.J.Gen.Virol.96,804-814.

Kaur,R.,Sachdeva,G.,Vrati,S.,2002.Plasmid DNA immunization againstJapanese encephalitis virus:immunogenicity of membrane-anchored and secretoryenvelope protein.J.Infect.Dis.185,1-12.

Khromykh,A.A.,Meka,H.,Guyatt,K.J.,Westaway,E.G.,2001.Essential roleof cyclization sequences in flavivirus RNA replication.J.Virol.75,6719-6728.

Konishi,E.,Ajiro,N.,Nukuzuma,C.,Mason,P.W.,Kurane,I.,2003.Comparisonof protective efficacies of plasmid DNAs encoding Japanese encephalitis virusproteins that induce neutralizing antibody or cytotoxic T lymphocytes inmice.Vaccine 21,3675-3683.

Konishi,E.,Yamaoka,M.,Khin Sane,W.,Kurane,I.,Takada,K.,Mason,P.W.,1999.The anamnestic neutralizing antibody response is critical for protectionof mice from challenge following vaccination with a plasmid encoding theJapanese encephalitis virus premembrane and envelope genes.J.Virol.73,5527-5534.

Li,J.,Gao,N.,Fan,D.,Chen,H.,Sheng,Z.,Fu,S.,Liang,G.,An,J.,2016.Cross-protection induced by Japanese encephalitis vaccines against differentgenotypes of Dengue viruses in mice.Sci Rep 6,19953.

Lukashevich,P.P.P.P.B.I.S.,2014.Experimental DNA-launched live-attenuated vaccines against infections caused by Flavi-and alphaviruses,in:Igor S.Lukashevich,H.S.(Ed.),Novel Technologies for VaccineDevelopment.Springer Vienna.

Lutticken,D.,Segers,R.P.,Visser,N.,2007.Veterinary vaccines forpublic health and prevention of viral and bacterial zoonotic diseases.Rev SciTech 26,165-177.

Messer,W.B.,Yount,B.,Hacker,K.E.,Donaldson,E.F.,Huynh,J.P.,de Silva,A.M.,Baric,R.S.,2012.Development and characterization of a reverse geneticsystem for studying Dengue virus serotype 3 strain variation andneutralization.PLoS neglected tropical diseases 6,e1486.

Mishin,V.P.,Cominelli,F.,Yamshchikov,V.F.,2001.A'minimal'approach indesign of flavivirus infectious DNA.Virus Res.81,113-123.

Onions,D.,Cote,C.,Love,B.,Toms,B.,Koduri,S.,Armstrong,A.,Chang,A.,Kolman,J.,2011.Ensuring the safety of vaccine cell substrates by massivelyparallel sequencing of the transcriptome.Vaccine 29,7117-7121.

Plotkin,S.A.,2010.Correlates of protection induced byvaccination.Clin Vaccine Immunol 17,1055-1065.

Poirier,E.Z.,Vignuzzi,M.,2017.Virus Population Dynamics DuringInfection.Current Opinion in Virology,23:82-87.

Pushko,P.,Geisbert,J.,Parker,M.,Jahrling,P.,Smith,J.,2001.Individualand bivalent vaccines based on alphavirus replicons protect guinea pigsagainst infection with Lassa and Ebola viruses.J.Virol.75,11677-11685.

Pushko,P.,Lukashevich,I.S.,Weaver,S.C.,Tretyakova,I.,2016.DNA-launched live-attenuated vaccines for biodefense applications.Expert RevVaccines 15,1223-1234.

Putnak,R.,Porter,K.,Schmaljohn,C.,2003.DNA vaccines forflaviviruses.Adv.Virus Res.61,445-468.

Rice,C.M.,Grakoui,A.,Galler,R.,Chambers,T.J.,1989.Transcription ofinfectious Yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by invitro ligation.New Biol 1,285-296.

Saito,Y.,Moi,M.L.,Takeshita,N.,Lim,C.K.,Shiba,H.,Hosono,K.,Saijo,M.,Kurane,I.,Takasaki,T.,2016.Japanese encephalitis vaccine-facilitated Denguevirus infection-enhancement antibody in adults.BMC Infect.Dis.16,578.

Shahmuradov,IA.,Mohamad Razali R.,Bougouffa S.,Radovanovic A,BajicVB,2017,bTSSfinder:a novel tool for the prediction of promoters incyanobacteria and Escherichia coli.Bioinformatics 33(3):334-340.

Sheng,Z.,Gao,N.,Cui,X.,Fan,D.,Chen,H.,Wu,N.,Wei,J.,An,J.,2016.Electroporation enhances protective immune response of a DNA vaccineagainst Japanese encephalitis in mice and pigs.Vaccine 34,5751-5757.

Tretyakova,I.,Hearn,J.,Wang,E.,Weaver,S.,Pushko,P.,2014a.DNA vaccineinitiates replication of live attenuated chikungunya virus in vitro andelicits protective immune response in mice.J.Infect.Dis.209,1882-1890.

Tretyakova,I.,Lukashevich,I.S.,Glass,P.,Wang,E.,Weaver,S.,Pushko,P.,2013.Novel vaccine against Venezuelan equine encephalitis combines advantagesof DNA immunization and a live attenuated vaccine.Vaccine 31,1019-1025.

Tretyakova,I.,Nickols,B.,Hidajat,R.,Jokinen,J.,Lukashevich,I.S.,Pushko,P.,2014b.Plasmid DNA initiates replication of Yellow fever vaccine invitro and elicits virus-specific immune response in mice.Virology 468-470,28-35.

Tsetsarkin,K.A.,Kenney,H.,Chen,R.,Liu,G.,Manukyan,H.,Whitehead,S.S.,Laassri,M.,Chumakov,K.,Pletnev,A.G.,2016.A Full-Length Infectious cDNA Cloneof Zika Virus from the2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform forStudies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.MBio 7.

WHO,2015.Japanese encephalitis.Fact sheet No 386.

Wimmer,E.,Mueller,S.,Tumpey,T.M.,Taubenberger,J.K.,2009.Syntheticviruses:a new opportunity to understand and prevent viraldisease.Nat.Biotechnol.27,1163-1172.

Wu,C.J.,Li,T.L.,Huang,H.W.,Tao,M.H.,Chan,Y.L.,2006.Development of aneffective Japanese encephalitis virus-specific DNA vaccine.Microbes Infect 8,2578-2586.

Wu,Y.C.,Liu,S.T.,2010.A sequence that affects the copy number andstability of pSW200 and ColE1.J.Bacteriol.192,3654-3660.

Yamshchikov,V.,2015.Development of a human live attenuated West Nileinfectious DNA vaccine:conceptual design of the vaccine candidate.Virology484,59-68.

Yamshchikov,V.,Manuvakhova,M.,Rodriguez,E.,2015.Development of ahuman live attenuated West Nile infectious DNA vaccine:Suitability ofattenuating mutations found in SA14-14-2 for WN vaccine design.Virology 487,198-206.

Yamshchikov,V.,Mishin,V.,Cominelli,F.,2001.A new strategy in designof+RNA virus infectious clones enabling their stable propagation inE.coli.Virology 281,272-280.

Zhai,Y.,Zhou,Y.,Li,X.,Feng,G.,2015.Immune-enhancing effect of nano-DNA vaccine encoding a gene of the prME protein of Japanese encephalitisvirus and BALB/c mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.MolMed Rep 12,199-209.

Claims (22)

1.一种载体，包含编码RNA分子的DNA，其中编码所述RNA分子的所述DNA包含用于在真核细胞中表达所述DNA的启动子，其中所述RNA分子编码感染性正义单链((+)SS)RNA病毒，其中所述感染性(+)SS RNA病毒来自日本脑炎病毒JEV，其中所述DNA包含编码JEV SA14-14-2菌株的核酸序列的cDNA和三个内含子，

并且其中编码所述RNA分子的所述DNA的核苷酸序列为与SEQ ID NO：1具有至少99％的序列同一性的核苷酸序列；

所述三个内含子被分别插入在所述编码JEV SA14-14-2菌株的核酸序列的cDNA中的紧邻第414位核苷酸、第2213位核苷酸和第3134位核苷酸之后；

其中所述载体改善所述DNA在宿主细胞中的稳定性并提高所述宿主细胞中所述DNA的产量。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述内含子包含至少一个或多个终止密码子。

3.根据权利要求2所述的载体，其中所述感染性正义单链RNA病毒为减毒的病毒。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述启动子包括CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子、HSV启动子、人Pol I启动子、人Pol II启动子或人Pol III启动子。

5.一种组合物，包含权利要求1至4中任一项所述的载体和载体材料。

6.一种感染性(+)SS RNA病毒，获得自转染有权利要求1至4中任一项所述的载体的真核细胞。

7.一种组合物，包含权利要求6所述的感染性(+)SS RNA病毒和载体材料。

8.一种用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的药物组合物，包含权利要求1至4中任一项所述的载体和药学上可接受的载体材料。

9.一种用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的药物组合物，包含权利要求6所述的感染性(+)SS RNA病毒。

10.一种用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的疫苗组合物，包含治疗有效量的权利要求1至4中任一项所述的载体或权利要求6所述的感染性(+)SS RNA病毒。

11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中所述受试者是哺乳动物。

12.根据权利要求11的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人或兽医动物。

13.一种制备感染性活(+)SS RNA病毒的方法，其中所述方法包括将权利要求1至4中任一项所述的载体转染至真核细胞中并且从经转染的真核细胞分离出所述感染性活(+)SSRNA病毒，从而获得所述感染性活(+)SS RNA病毒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述真核细胞是Vero细胞、CHO细胞或MDCK细胞。

15.一种制备用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的疫苗组合物的方法，其中所述方法包括将权利要求1至4中任一项所述的载体转染至真核细胞中，并且从经转染的真核细胞分离出所述感染性(+)SS RNA病毒，从而获得所述感染性(+)SS RNA病毒。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述真核细胞是Vero细胞、CHO细胞或MDCK细胞。

17.一种制备包含编码感染性(+)SS RNA病毒的基因组RNA的DNA的质粒的方法，

其中所述方法包括：获得编码JEV SA14-14-2菌株的核酸序列的cDNA，其中所述感染性(+)SS RNA病毒来自日本脑炎病毒JEV；和将三个内含子引入所述cDNA，

并且其中编码所述基因组RNA的所述DNA的核苷酸序列为与SEQ ID NO：1具有至少99％的序列同一性的核苷酸序列；

所述三个内含子被分别插入在所述编码JEV SA14-14-2菌株的核酸序列的cDNA中的紧邻第414位核苷酸、第2213位核苷酸和第3134位核苷酸之后；

其中所述内含子含有至少一个终止密码子，

其中所述质粒改善所述DNA在宿主细胞中的稳定性并提高所述宿主细胞中所述DNA的产量。

18.一种制备权利要求1至4中任一项所述的载体的方法，其中所述方法包括将所述载体转染至宿主细胞中，并且从所述宿主细胞中分离出所述载体。

19.一种分离的转染有权利要求1至4中任一项所述的载体的细胞。

20.权利要求1至4中任一项所述的载体、权利要求5、7、8或9中任一项所述的组合物、或者权利要求10、11或12中任一项所述的疫苗组合物在制备用于保护受试者免受由感染性(+)SS RNA病毒引起的疾病的药物中的应用。

21.根据权利要求20的应用，其中所述受试者是哺乳动物。

22.根据权利要求21的应用，其中所述哺乳动物是人或兽医动物。