JPH05276941A - フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法 - Google Patents
フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法Info
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- JPH05276941A JPH05276941A JP4043682A JP4368292A JPH05276941A JP H05276941 A JPH05276941 A JP H05276941A JP 4043682 A JP4043682 A JP 4043682A JP 4368292 A JP4368292 A JP 4368292A JP H05276941 A JPH05276941 A JP H05276941A
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- protein
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 日本脳炎の生ワクチンを大量製造する方法
を提供。 【構成】 フラビウイルス科に属するウイルスを予め
感染させた細胞にフラビウイルス科に属するウイルス由
来のｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に全部と表面抗原
タンパク質を実質的に全部をコードするｃＤＮＡを組み
込んだ組み換えワクチニアウイルスを感染させ、培養す
ることにより大量に非感染性の構造物粒子をうる。
を提供。 【構成】 フラビウイルス科に属するウイルスを予め
感染させた細胞にフラビウイルス科に属するウイルス由
来のｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に全部と表面抗原
タンパク質を実質的に全部をコードするｃＤＮＡを組み
込んだ組み換えワクチニアウイルスを感染させ、培養す
ることにより大量に非感染性の構造物粒子をうる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、予めフラビウイルス科
に属するウイルスを感染させた細胞にフラビウイルス科
に属するウイルス由来のｐｒＭ（Ｍ）タンパク質と表面
抗原タンパク質（以下Ｅタンパク質という）をコードす
るｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスを
感染させ、培養上清からフラビウイルス科に属するウイ
ルスのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子を単離
することを特徴とする非感染性の構造物粒子、好ましく
は沈降係数が１００Ｓ以下である非感染性の構造物粒子
の製造方法に関する。
に属するウイルスを感染させた細胞にフラビウイルス科
に属するウイルス由来のｐｒＭ（Ｍ）タンパク質と表面
抗原タンパク質（以下Ｅタンパク質という）をコードす
るｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスを
感染させ、培養上清からフラビウイルス科に属するウイ
ルスのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子を単離
することを特徴とする非感染性の構造物粒子、好ましく
は沈降係数が１００Ｓ以下である非感染性の構造物粒子
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在フラビウイルスのワクチンとしては
黄熱病ウイルスの弱毒生ワクチン、不活化日本脳炎ウイ
ルスを有効成分とするワクチンが実用化されているが、
より安全で効果的なワクチンが求められている。例えば
現行の日本脳炎ワクチンは、健康なマウス脳内に日本脳
炎ウイルス北京株を接種し、発症したマウスから脳を無
菌的に採取し、アルコール・プロタミン法により精製、
不活化してワクチン原液を得ている（国立予防衛生研究
所学友会編「日本のワクチン」改訂２版、昭和５２年１
月２０日丸善株式会社発行）。
黄熱病ウイルスの弱毒生ワクチン、不活化日本脳炎ウイ
ルスを有効成分とするワクチンが実用化されているが、
より安全で効果的なワクチンが求められている。例えば
現行の日本脳炎ワクチンは、健康なマウス脳内に日本脳
炎ウイルス北京株を接種し、発症したマウスから脳を無
菌的に採取し、アルコール・プロタミン法により精製、
不活化してワクチン原液を得ている（国立予防衛生研究
所学友会編「日本のワクチン」改訂２版、昭和５２年１
月２０日丸善株式会社発行）。
【０００３】このようなワクチンの製造法においては、
大量の日本脳炎ウイルスそのものを取り扱うわけで、ワ
クチン製造担当者にとっては危険性が極めて高い上、製
造コストも高かった。
大量の日本脳炎ウイルスそのものを取り扱うわけで、ワ
クチン製造担当者にとっては危険性が極めて高い上、製
造コストも高かった。
【０００４】フラビウイルスは、一本鎖ＲＮＡをゲノム
（ウイルスの遺伝情報を担う本体）としたウイルスであ
る。このＲＮＡをもとに翻訳された一本のポリペプチド
が感染細胞内において、シグナラーゼやプロテアーゼに
よって切断され１０個のタンパク質となることが知られ
ている。１０個のタンパク質とは、順にＣ、ＰｒＭ
（Ｍ）、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４４、６４９−６８８（１９９
０））。これらのタンパク質のうちｐｒＭ（Ｍ）は、ｐ
ｒｅＭとＭに分けて表現されることもある。
（ウイルスの遺伝情報を担う本体）としたウイルスであ
る。このＲＮＡをもとに翻訳された一本のポリペプチド
が感染細胞内において、シグナラーゼやプロテアーゼに
よって切断され１０個のタンパク質となることが知られ
ている。１０個のタンパク質とは、順にＣ、ＰｒＭ
（Ｍ）、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４４、６４９−６８８（１９９
０））。これらのタンパク質のうちｐｒＭ（Ｍ）は、ｐ
ｒｅＭとＭに分けて表現されることもある。
【０００５】フラビウイルス感染培養細胞や乳のみマウ
ス脳に感染したフラビウイルスは子孫ウイルス以外に非
感染性へマグルチニン（以下ＳＨＡと略す）粒子を細胞
外に放出する。
ス脳に感染したフラビウイルスは子孫ウイルス以外に非
感染性へマグルチニン（以下ＳＨＡと略す）粒子を細胞
外に放出する。
【０００６】ワクチンは、ウイルスそのもの以外に、ウ
イルスの抗原性を有する抗原タンパク質を用いて製造す
ることもできる。このような観点から、組み換えＤＮＡ
技術によって原核細胞や真核細胞を用いて抗原タンパク
質を製造する方法が検討されている。特にワクチニアウ
イルスやバキュロウイルスをベクターとして作製した組
み換えウイルスは、正しくプロセスされた抗原性のよい
Ｅタンパク質を発現することを我々は見い出した（特開
昭６４−７４９８２、特開平１−２８５１９８）。
イルスの抗原性を有する抗原タンパク質を用いて製造す
ることもできる。このような観点から、組み換えＤＮＡ
技術によって原核細胞や真核細胞を用いて抗原タンパク
質を製造する方法が検討されている。特にワクチニアウ
イルスやバキュロウイルスをベクターとして作製した組
み換えウイルスは、正しくプロセスされた抗原性のよい
Ｅタンパク質を発現することを我々は見い出した（特開
昭６４−７４９８２、特開平１−２８５１９８）。
【０００７】Ｅタンパク質はヘマグルチニン活性を示す
タンパク質であり、前述のＳＨＡ粒子はヘマグルチニン
活性を示すことから、この粒子がＥタンパク質を有する
ことがわかる。このＳＨＡ粒子は、フラビウイルスが培
養細胞や乳のみマウス脳に感染すると、感染細胞から子
孫ウイルスと共に放出される非感染性の粒子であり、そ
の直径は１４nmのリング状あるいはドーナツ状の形状を
示し、そしの沈降係数は７０Ｓである（“Ｔｈｅ Ｔｏ
ｇａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐｐ５０３−５２９、Ｒ．Ｗ．
Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｎｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ．，Ｉｎｃ．など）。
タンパク質であり、前述のＳＨＡ粒子はヘマグルチニン
活性を示すことから、この粒子がＥタンパク質を有する
ことがわかる。このＳＨＡ粒子は、フラビウイルスが培
養細胞や乳のみマウス脳に感染すると、感染細胞から子
孫ウイルスと共に放出される非感染性の粒子であり、そ
の直径は１４nmのリング状あるいはドーナツ状の形状を
示し、そしの沈降係数は７０Ｓである（“Ｔｈｅ Ｔｏ
ｇａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐｐ５０３−５２９、Ｒ．Ｗ．
Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｎｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ．，Ｉｎｃ．など）。
【０００８】このようなＳＨＡ粒子を有効成分としたワ
クチンは、ウイルスと類似の構造を有するために、高い
抗原性を有することが期待される。
クチンは、ウイルスと類似の構造を有するために、高い
抗原性を有することが期待される。
【０００９】前述の組み換えワクチニアウイルスや組み
換えバキュロウイルスを用いたＥタンパク質の製造方法
において、フラビウイルス科に属するウイルスのＥタン
パク質からなる構造物粒子が、組み換えウイルス感染細
胞培養上清にごく少量放出される。しかし、ほとんどの
構造物粒子は、組み換えウイルス感染細胞に内包されて
しまい、多量の粒子を得るためには抽出・精製という工
程を必要とし、操作が煩雑である。
換えバキュロウイルスを用いたＥタンパク質の製造方法
において、フラビウイルス科に属するウイルスのＥタン
パク質からなる構造物粒子が、組み換えウイルス感染細
胞培養上清にごく少量放出される。しかし、ほとんどの
構造物粒子は、組み換えウイルス感染細胞に内包されて
しまい、多量の粒子を得るためには抽出・精製という工
程を必要とし、操作が煩雑である。
【００１０】この構造物粒子は、ＳＨＡ粒子と同様にヘ
マグルチニン活性を有し、非感染性であるが、ＳＨＡ粒
子そのものであるか否かは、ＳＨＡ粒子の同定方法が確
定していない現在では、不明である。そこで、本願で
は、ＳＨＡ粒子と同様の性質を示す粒子を総称してＳＨ
Ａ様粒子と表現する。もちろん、ＳＨＡ様粒子の中には
ＳＨＡ粒子も含まれる。
マグルチニン活性を有し、非感染性であるが、ＳＨＡ粒
子そのものであるか否かは、ＳＨＡ粒子の同定方法が確
定していない現在では、不明である。そこで、本願で
は、ＳＨＡ粒子と同様の性質を示す粒子を総称してＳＨ
Ａ様粒子と表現する。もちろん、ＳＨＡ様粒子の中には
ＳＨＡ粒子も含まれる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
かかる従来技術や知見の下で、組み換えワクチニアウイ
ルス感染細胞の培養上清にフラビウイルス科に属するウ
イルスのＥタンパク質を大量に産生させる方法の開発を
目指して鋭意検討を進めた結果、フラビウイルスのｐｒ
Ｍ（Ｍ）とＥタンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込
んだ組み換えワクチニアウイルスを予めフラビウイルス
を感染させた細胞に重感染させると、その培養上清に多
量の本質的にフラビウイルス科に属するウイルスのＥタ
ンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好ましくはＥタ
ンパク質を構成タンパク質のひとつとする沈降係数１０
０Ｓ以下の粒子を産生することを見い出し、本発明を完
成させるに至った。
かかる従来技術や知見の下で、組み換えワクチニアウイ
ルス感染細胞の培養上清にフラビウイルス科に属するウ
イルスのＥタンパク質を大量に産生させる方法の開発を
目指して鋭意検討を進めた結果、フラビウイルスのｐｒ
Ｍ（Ｍ）とＥタンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込
んだ組み換えワクチニアウイルスを予めフラビウイルス
を感染させた細胞に重感染させると、その培養上清に多
量の本質的にフラビウイルス科に属するウイルスのＥタ
ンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好ましくはＥタ
ンパク質を構成タンパク質のひとつとする沈降係数１０
０Ｓ以下の粒子を産生することを見い出し、本発明を完
成させるに至った。
【００１２】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、フラビウイルス科に属するウイルスを予め感染させ
た細胞に、フラビウイルスのｐｒＭ（Ｍ）、Ｅタンパク
質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニ
アウイルスを感染させて培養し、その培養上清から超遠
心分離によって本質的にフラビウイルス科に属するウイ
ルスのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好ま
しくは沈降係数１００以下の非感染性の構造物粒子を製
造する方法が提供される。
ば、フラビウイルス科に属するウイルスを予め感染させ
た細胞に、フラビウイルスのｐｒＭ（Ｍ）、Ｅタンパク
質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニ
アウイルスを感染させて培養し、その培養上清から超遠
心分離によって本質的にフラビウイルス科に属するウイ
ルスのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好ま
しくは沈降係数１００以下の非感染性の構造物粒子を製
造する方法が提供される。
【００１３】本発明において組み換えワクチニアウイル
スの作製に供されるウイルスはワクチニアウイルスに分
類されるウイルスであればいかなるものでもよく、例え
ばＷＲ株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
４９，ｐ．８５７（１９８４））、リスター株、リスタ
ー株の温度感受性変異株（米国特許第４，５６７，１４
７号、特開昭６２−４４１７８号参照）、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ株、ＬＣ１６ｍ
８株などの種痘ワクチン株）などが例示される。
スの作製に供されるウイルスはワクチニアウイルスに分
類されるウイルスであればいかなるものでもよく、例え
ばＷＲ株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
４９，ｐ．８５７（１９８４））、リスター株、リスタ
ー株の温度感受性変異株（米国特許第４，５６７，１４
７号、特開昭６２−４４１７８号参照）、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ株、ＬＣ１６ｍ
８株などの種痘ワクチン株）などが例示される。
【００１４】これらのウイルスの中でも孵化鶏卵しょう
尿膜上でのポックスサイズが３mm以下でかつウサギ腎臓
細胞での増殖不能温度が４１℃以下のものが好適であ
り、その具体例としては前記特開昭６２−４４１７８号
記載の弱毒痘そう株ＬＡ株および、ＬＢ株（ＣＮＴＭ−
１−４２３）、前記ＬＣ１６ｍ８株などが弱毒性であり
安全性の面で有利である。
尿膜上でのポックスサイズが３mm以下でかつウサギ腎臓
細胞での増殖不能温度が４１℃以下のものが好適であ
り、その具体例としては前記特開昭６２−４４１７８号
記載の弱毒痘そう株ＬＡ株および、ＬＢ株（ＣＮＴＭ−
１−４２３）、前記ＬＣ１６ｍ８株などが弱毒性であり
安全性の面で有利である。
【００１５】また、本発明においてワクチニアウイルス
に組み込まれるｃＤＮＡは、少なくともフラビウイルス
に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、およびＥ
タンパク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡであれ
ば特に限定されず、このようなｃＤＮＡは、公知の技術
（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
９））を用いて調製することができる。
に組み込まれるｃＤＮＡは、少なくともフラビウイルス
に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、およびＥ
タンパク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡであれ
ば特に限定されず、このようなｃＤＮＡは、公知の技術
（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８
９））を用いて調製することができる。
【００１６】また、ｃＤＮＡの由来となるフラビウイル
スは、フラビウイルス科に属するウイルスの中から任意
に選択することができるが、その具体例として、日本脳
炎ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス
などが挙げられる。
スは、フラビウイルス科に属するウイルスの中から任意
に選択することができるが、その具体例として、日本脳
炎ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス
などが挙げられる。
【００１７】例えば日本脳炎ウイルスＳａｇａｙａｍａ
株（米国コネチカット州のエール大学アーボウイルスリ
サーチユニット）から調製されたｃＤＮＡ５０３７は特
開昭６４−７４９８２号の実施例で開示されているが、
本発明においては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を
有する範囲において、修飾されたｃＤＮＡ（即ち、塩基
配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい。も
ちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸
配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい。
株（米国コネチカット州のエール大学アーボウイルスリ
サーチユニット）から調製されたｃＤＮＡ５０３７は特
開昭６４−７４９８２号の実施例で開示されているが、
本発明においては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を
有する範囲において、修飾されたｃＤＮＡ（即ち、塩基
配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい。も
ちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸
配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい。
【００１８】フラビウイルス科に属するウイルスのｐｒ
Ｍ（Ｍ）タンパク質とＥタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスの作製方法
は特に限定されないが、例えば、以下の方法によって作
製することができる。
Ｍ（Ｍ）タンパク質とＥタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスの作製方法
は特に限定されないが、例えば、以下の方法によって作
製することができる。
【００１９】まずワクチニアウイルスの増殖に非必須な
ＤＮＡ領域が組み込まれた、さらにそのＤＮＡ領域にフ
ラビウイルスのタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入
された第一の組み換えベクターが作製される。第一の組
み換えベクターの具体例としては、例えば日本脳炎ウイ
ルスのｃＤＮＡが挿入された特開昭６４−７４９８２号
の実施例で開示されたプラスミドｐＡＫＪ６が例示され
る。
ＤＮＡ領域が組み込まれた、さらにそのＤＮＡ領域にフ
ラビウイルスのタンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入
された第一の組み換えベクターが作製される。第一の組
み換えベクターの具体例としては、例えば日本脳炎ウイ
ルスのｃＤＮＡが挿入された特開昭６４−７４９８２号
の実施例で開示されたプラスミドｐＡＫＪ６が例示され
る。
【００２０】次いで第一の組み換えベクターに、ワクチ
ニアウイルスで作用するプロモーターをフラビウイルス
科に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質とＥタン
パク質をコードする。ｃＤＮＡの前に挿入した第二の組
み換えベクターが作製される。
ニアウイルスで作用するプロモーターをフラビウイルス
科に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質とＥタン
パク質をコードする。ｃＤＮＡの前に挿入した第二の組
み換えベクターが作製される。
【００２１】プロモーターは、挿入されるｃＤＮＡの転
写を調節するために有効である。ワクチニアウイルスが
本来有するプロモーターの支配下に、フラビウイルスに
属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質をコードする
ｃＤＮＡとＥタンパク質をコードするｃＤＮＡが組み込
めれば、特にプロモーターを組み込む必要はない。しか
し、それ以外の場合は、プロモーターをフラビウイルス
に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質とＥタンパ
ク質をコードするｃＤＮＡと共に組み込むことが好まし
い。
写を調節するために有効である。ワクチニアウイルスが
本来有するプロモーターの支配下に、フラビウイルスに
属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質をコードする
ｃＤＮＡとＥタンパク質をコードするｃＤＮＡが組み込
めれば、特にプロモーターを組み込む必要はない。しか
し、それ以外の場合は、プロモーターをフラビウイルス
に属するウイルスのｐｒＭ（Ｍ）タンパク質とＥタンパ
ク質をコードするｃＤＮＡと共に組み込むことが好まし
い。
【００２２】組み込むプロモーターは、ワクチニアウイ
ルス内で機能する限りにおいて特に限定されないが、好
ましくは７．５Ｋプロモーターの２倍以上、より好まし
くは１０倍以上、特に好ましくは１５倍以上の活性を有
するプロモーターである。このようなプロモーターの具
体例としては、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０、７７１
−７８４（１９８２）記載の合成プロモーターや、７．
５Ｋプロモーターの約２０倍の活性を持つ下記の合成プ
ロモーターＳL （配列番号１）が挙げられる。
ルス内で機能する限りにおいて特に限定されないが、好
ましくは７．５Ｋプロモーターの２倍以上、より好まし
くは１０倍以上、特に好ましくは１５倍以上の活性を有
するプロモーターである。このようなプロモーターの具
体例としては、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０、７７１
−７８４（１９８２）記載の合成プロモーターや、７．
５Ｋプロモーターの約２０倍の活性を持つ下記の合成プ
ロモーターＳL （配列番号１）が挙げられる。
【化１】
【００２３】次ぎに、予めワクチニアウイルスを感染さ
せた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入し、
ベクターＤＮＡとウイルスゲノムＤＮＡ間に相同組み換
えを起こさせ、組み換えワクチニアウイルスを作製す
る。組み換えワクチニアウイルスの作製にあたっては常
法（例えば“ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．ＩＩａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｐｐ．１９
１−２１１，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬプレス、
オックスフォード、ワシントン）の記述に従って実施で
きる。
せた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入し、
ベクターＤＮＡとウイルスゲノムＤＮＡ間に相同組み換
えを起こさせ、組み換えワクチニアウイルスを作製す
る。組み換えワクチニアウイルスの作製にあたっては常
法（例えば“ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．ＩＩａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｐｐ．１９
１−２１１，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬプレス、
オックスフォード、ワシントン）の記述に従って実施で
きる。
【００２４】すなわちワクチニアウイルスを感染させた
ＲＫ１３細胞にリン酸カルシウム共沈法により第二の組
み換えベクターを移入させ、得られる組み換えウイルス
を含むウイルス集団をチミジンキナーゼ欠損細胞に感染
させＢＵｄＲ存在下生育してくるプラークを選択し、組
み換えウイルス候補株とする。これら候補株の中から日
本脳炎ウイルスのｃＤＮＡが組み込まれたウイルスを選
択する方法は、該ｃＤＮＡをプローブとするハイブリダ
イゼーション法を利用してプラーク純化をすれば良い。
ＲＫ１３細胞にリン酸カルシウム共沈法により第二の組
み換えベクターを移入させ、得られる組み換えウイルス
を含むウイルス集団をチミジンキナーゼ欠損細胞に感染
させＢＵｄＲ存在下生育してくるプラークを選択し、組
み換えウイルス候補株とする。これら候補株の中から日
本脳炎ウイルスのｃＤＮＡが組み込まれたウイルスを選
択する方法は、該ｃＤＮＡをプローブとするハイブリダ
イゼーション法を利用してプラーク純化をすれば良い。
【００２５】このようにして純化した組み換えワクチニ
アウイルスを細胞、通常哺乳動物細胞に感染させるが、
本発明においては、組み換えワクチニアウイルスを感染
させる前に、この細胞にフラビウイルス科に属するウイ
ルスを感染させる（以下、前感染という）必要がある。
用いるウイルスは、フラビウイルス科に属するウイルス
であれば特に限定されない。具体例としては、デングウ
イルス、日本脳炎ウイルスなどが挙げられるが、前感染
したウイルスの量が少ない方が目的とする構造物粒子の
単離が容易であり、その観点からはウイルスの増殖が遅
いデングウイルスがより好適である。
アウイルスを細胞、通常哺乳動物細胞に感染させるが、
本発明においては、組み換えワクチニアウイルスを感染
させる前に、この細胞にフラビウイルス科に属するウイ
ルスを感染させる（以下、前感染という）必要がある。
用いるウイルスは、フラビウイルス科に属するウイルス
であれば特に限定されない。具体例としては、デングウ
イルス、日本脳炎ウイルスなどが挙げられるが、前感染
したウイルスの量が少ない方が目的とする構造物粒子の
単離が容易であり、その観点からはウイルスの増殖が遅
いデングウイルスがより好適である。
【００２６】培養に用いる哺乳動物細胞は、フラビウイ
ルスおよびワクチニアウイルスが感染する限りにおいて
特に限定されないが、特にサル腎細胞由来樹立培養株Ｖ
ｅｒｏ細胞が好ましい。
ルスおよびワクチニアウイルスが感染する限りにおいて
特に限定されないが、特にサル腎細胞由来樹立培養株Ｖ
ｅｒｏ細胞が好ましい。
【００２７】前感染所定の時間が経過した後、さらに組
み換えワクチニアウイルスを重感染させ、常法により適
当な条件下で培養させる。前感染から組み換えワクチニ
アウイルスを感染させるまでの時間は、前感染に用いた
ウイルスにより多少異なるが、通常５時間以上経過後、
好ましくは、１０〜４８時間後、更に好ましくは、２０
〜３６時間後である。
み換えワクチニアウイルスを重感染させ、常法により適
当な条件下で培養させる。前感染から組み換えワクチニ
アウイルスを感染させるまでの時間は、前感染に用いた
ウイルスにより多少異なるが、通常５時間以上経過後、
好ましくは、１０〜４８時間後、更に好ましくは、２０
〜３６時間後である。
【００２８】前感染せずに組み換えワクチニアウイルス
を感染させたり、前感染から組み換えワクチニアウイル
スの感染までの時間が短すぎると細胞上清中に放出され
るＥタンパク質がきわめて少なくなる。また、前感染か
ら組み換えワクチニアウイルスを感染させるまでの時間
が長すぎると前感染させたウイルスの産生量が増加して
目的とする構造物粒子の精製が困難になるという問題を
生じる。
を感染させたり、前感染から組み換えワクチニアウイル
スの感染までの時間が短すぎると細胞上清中に放出され
るＥタンパク質がきわめて少なくなる。また、前感染か
ら組み換えワクチニアウイルスを感染させるまでの時間
が長すぎると前感染させたウイルスの産生量が増加して
目的とする構造物粒子の精製が困難になるという問題を
生じる。
【００２９】前感染した細胞に組み換えワクチニアウイ
ルスを感染させた後の細胞の適当な培養条件は、予備実
験により容易に決定できるが、通常は、培地として５％
牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭを用い、培養温度は３
７℃で培養することが望ましい。
ルスを感染させた後の細胞の適当な培養条件は、予備実
験により容易に決定できるが、通常は、培地として５％
牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭを用い、培養温度は３
７℃で培養することが望ましい。
【００３０】そして、適当な培養時間後、培養上清から
超遠心分離などの方法により構造物粒子を回収する。超
遠心分離により得られた沈澱物をさらに密度勾配遠心分
離すれば、フラビウイルスのＥタンパク質を含む沈降係
数１００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、好ましくは沈
降係数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子（ＳＨＡ様粒
子）を得ることができる。
超遠心分離などの方法により構造物粒子を回収する。超
遠心分離により得られた沈澱物をさらに密度勾配遠心分
離すれば、フラビウイルスのＥタンパク質を含む沈降係
数１００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、好ましくは沈
降係数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子（ＳＨＡ様粒
子）を得ることができる。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、本質的にフラビウイル
スのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好まし
くは沈降係数１００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、更
に好ましくは沈降係数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子
（ＳＨＡ様粒子）を得ることができる。このような非感
染性の構造物粒子は、ワクチンとして利用できると期待
される。
スのＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒子、好まし
くは沈降係数１００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、更
に好ましくは沈降係数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子
（ＳＨＡ様粒子）を得ることができる。このような非感
染性の構造物粒子は、ワクチンとして利用できると期待
される。
【００３２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 （参考例１） プロモーター、および日本脳炎ウイルス
由来ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質およびＥタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫ
Ｊ６−ＳL ）の作製
に説明する。 （参考例１） プロモーター、および日本脳炎ウイルス
由来ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質およびＥタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫ
Ｊ６−ＳL ）の作製
【００３３】特開昭６４−７４９８２号公報、第２４
頁、実施例１（７）３記載のｐＡＫＪ６（前述、プロモ
ーターが７．５Ｋプロモーターであり、日本脳炎ウイル
スのｐｒＭ（Ｍ）、Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ
を含んでいる。）を制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩで処理
し、配列番号１に記載のプロモーターＳL を、７．５Ｋ
プロモーターの代わりに挿入し、約６．２Ｋｂｐのプラ
スミドを得た。このプラスミドをｐＡＫＪ６−ＳL と命
名した。
頁、実施例１（７）３記載のｐＡＫＪ６（前述、プロモ
ーターが７．５Ｋプロモーターであり、日本脳炎ウイル
スのｐｒＭ（Ｍ）、Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ
を含んでいる。）を制限酵素ＰｓｔＩとＳａｌＩで処理
し、配列番号１に記載のプロモーターＳL を、７．５Ｋ
プロモーターの代わりに挿入し、約６．２Ｋｂｐのプラ
スミドを得た。このプラスミドをｐＡＫＪ６−ＳL と命
名した。
【００３４】このプラスミドに組み込まれた合成プロモ
ーターのプロモーター活性は、７．５Ｋプロモーターの
約２０倍である。
ーターのプロモーター活性は、７．５Ｋプロモーターの
約２０倍である。
【００３５】（参考例２） 組み換えワクチニアウイル
スの作製 ２５cm2 のカルチャーボトルに培養されたＲＫ−１３細
胞に弱毒痘そうウイルス株（特開昭６２−４４１７８号
公報記載の弱毒痘そう株ＬＡ、ウサギ腎細胞における増
殖不能温度４１℃、孵化鶏卵しょう尿膜上でのポックサ
イズ２〜３mm）を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞の割合で接
種し、４５分後、参考例１で得た組み換えプラスミドｐ
ＡＫＪ６−ＳL を１０μｇを２．２ｍｌの滅菌水に溶解
し、樋高ら（蛋白・核酸・酵素・２７、３４０（１９８
５））の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈物
をつくり、その０．５ｍｌを感染ＲＫ−１３細胞上に滴
下した。３０分間、３７℃、７％ＣＯ2 インキュベータ
ーに静置し、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ４．
５ｍｌを加えた。その３時間後、培養液を交換し、４８
時間、３７℃、７％ＣＯ2 インキュベーター内で培養
し、培養細胞ごとに３度凍結融解した。
スの作製 ２５cm2 のカルチャーボトルに培養されたＲＫ−１３細
胞に弱毒痘そうウイルス株（特開昭６２−４４１７８号
公報記載の弱毒痘そう株ＬＡ、ウサギ腎細胞における増
殖不能温度４１℃、孵化鶏卵しょう尿膜上でのポックサ
イズ２〜３mm）を０．１ｐ．ｆ．ｕ．／細胞の割合で接
種し、４５分後、参考例１で得た組み換えプラスミドｐ
ＡＫＪ６−ＳL を１０μｇを２．２ｍｌの滅菌水に溶解
し、樋高ら（蛋白・核酸・酵素・２７、３４０（１９８
５））の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈物
をつくり、その０．５ｍｌを感染ＲＫ−１３細胞上に滴
下した。３０分間、３７℃、７％ＣＯ2 インキュベータ
ーに静置し、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ４．
５ｍｌを加えた。その３時間後、培養液を交換し、４８
時間、３７℃、７％ＣＯ2 インキュベーター内で培養
し、培養細胞ごとに３度凍結融解した。
【００３６】組み換え体選択のために、１０cmペトリ皿
に培養されたＴＫ−１４３細胞に上記のウイルス液を接
種し、３０分後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２
５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ加イーグルＭＥＭを積層し、３日
間培養後、感染細胞を０．０１％中性紅で染色した。出
現したプラークからパスツールピペットでウイルスを抜
取り、これを２％ゼラチンを含むＰＢＳに懸濁し、一部
はドットハイブリダイゼーションをするため、セルロー
スメンブレンにスポットし、残りは−２０℃で保存し
た。スポットしたメンブレンは、０．５Ｎ水酸化ナトリ
ウムで１０分間、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）
で５分間の処理を３回繰り返したのち、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）で５分
間処理した。２倍ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和させ、８０℃、２
時間焼き付けた。
に培養されたＴＫ−１４３細胞に上記のウイルス液を接
種し、３０分後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２
５μｇ／ｍｌＢＵｄＲ加イーグルＭＥＭを積層し、３日
間培養後、感染細胞を０．０１％中性紅で染色した。出
現したプラークからパスツールピペットでウイルスを抜
取り、これを２％ゼラチンを含むＰＢＳに懸濁し、一部
はドットハイブリダイゼーションをするため、セルロー
スメンブレンにスポットし、残りは−２０℃で保存し
た。スポットしたメンブレンは、０．５Ｎ水酸化ナトリ
ウムで１０分間、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）
で５分間の処理を３回繰り返したのち、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）で５分
間処理した。２倍ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和させ、８０℃、２
時間焼き付けた。
【００３７】４倍ＳＥＴ（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０
８Ｍトリス−塩酸、４ｍＭ ＥＤＴＡ、（pH７．８））
−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％ＳＤＳで６８℃、
２時間処理した。４倍ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ
−０．１％ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ4 −５０μｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレーション
によって32Ｐで標識した日本脳炎ウイルスのＥタンパク
質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブリダイゼ
ーションした。
８Ｍトリス−塩酸、４ｍＭ ＥＤＴＡ、（pH７．８））
−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％ＳＤＳで６８℃、
２時間処理した。４倍ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ
−０．１％ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ4 −５０μｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレーション
によって32Ｐで標識した日本脳炎ウイルスのＥタンパク
質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブリダイゼ
ーションした。
【００３８】洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
イルス液を再度ＴＫ- １４３の細胞に接種し、３０分
後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌ
ＢＵｄＲ加イーグルＭＥＭを積層し、３日間培養後、感
染細胞を０．０１％中性紅で染色した。
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
イルス液を再度ＴＫ- １４３の細胞に接種し、３０分
後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌ
ＢＵｄＲ加イーグルＭＥＭを積層し、３日間培養後、感
染細胞を０．０１％中性紅で染色した。
【００３９】出現したプラークについて、上記と同様な
操作を行い、出現するプラークがすべて、ドットハイブ
リダイゼーションで黒化するまで純化の操作を繰り返し
た。こうして得られたウイルスは、目的の組み換えワク
チニアウイルスである。この組み換えワクチニアウイル
スをＬＡＪ６−ＳL と命名した。
操作を行い、出現するプラークがすべて、ドットハイブ
リダイゼーションで黒化するまで純化の操作を繰り返し
た。こうして得られたウイルスは、目的の組み換えワク
チニアウイルスである。この組み換えワクチニアウイル
スをＬＡＪ６−ＳL と命名した。
【００４０】（実施例１） 組み換えワクチニアウイル
スによるＥタンパク質の発現と培養上清中のＥタンパク
質の測定 ワクチニアウイルスの感染２４時間前に、Ｖｅｒｏ細胞
にデング２型ウイルスをｍ．ｏ．ｉ．２で予め感染させ
た。
スによるＥタンパク質の発現と培養上清中のＥタンパク
質の測定 ワクチニアウイルスの感染２４時間前に、Ｖｅｒｏ細胞
にデング２型ウイルスをｍ．ｏ．ｉ．２で予め感染させ
た。
【００４１】この前感染させたＶｅｒｏ細胞４×１０6
に、参考例２で得た組み換えワクチニアウイルス（ＬＡ
Ｊ６−ＳL ）およびＬＡＪ６（参考例１で使用したｐＡ
ＫＪ６から得られる組み換えワクチニアウイルス、特開
昭６４−７４９８２号公報、第２４〜２７頁、実施例１
（８）参照）をｍ．ｏ．ｉ．２で感染させ１８時間培養
した。
に、参考例２で得た組み換えワクチニアウイルス（ＬＡ
Ｊ６−ＳL ）およびＬＡＪ６（参考例１で使用したｐＡ
ＫＪ６から得られる組み換えワクチニアウイルス、特開
昭６４−７４９８２号公報、第２４〜２７頁、実施例１
（８）参照）をｍ．ｏ．ｉ．２で感染させ１８時間培養
した。
【００４２】これらの培養上清をポアサイズ０．２μｍ
のフィルターで濾過し、１５０，０００×ｇ、２時間の
超遠心分離を行なった。得られた沈澱物をＰＢＳバッフ
ァー洗浄後、１０ｍＭ炭酸バッファー（pH９．８）１０
０μｌで懸濁し更に同バッファーで２倍ずつ段階希釈し
ていきＥＬＩＳＡプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ乗
せ４℃終夜放置してコーティングした。
のフィルターで濾過し、１５０，０００×ｇ、２時間の
超遠心分離を行なった。得られた沈澱物をＰＢＳバッフ
ァー洗浄後、１０ｍＭ炭酸バッファー（pH９．８）１０
０μｌで懸濁し更に同バッファーで２倍ずつ段階希釈し
ていきＥＬＩＳＡプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ乗
せ４℃終夜放置してコーティングした。
【００４３】１次抗体として１：１０，０００倍希釈し
たモノクローナル抗体２０４（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，２６６３−２６７２）を、２次抗体としてア
ルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧ
Ｏ，Ｉｎｃ．）を用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳ
Ａにおけるエンドポイント（吸光度０．１）を示す希釈
度からＥタンパク質の発現量を測定した。
たモノクローナル抗体２０４（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，２６６３−２６７２）を、２次抗体としてア
ルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧ
Ｏ，Ｉｎｃ．）を用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳ
Ａにおけるエンドポイント（吸光度０．１）を示す希釈
度からＥタンパク質の発現量を測定した。
【００４４】（比較例１） 前感染なしの組み換えワク
チニアウイルスによるＥタンパク質の発現と培養上清中
のＥタンパク質の測定 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスの感染に使
用するＶｅｒｏ細胞として予め前感染させていないもの
を用いる以外は実施例１と同様の方法により、Ｅタンパ
ク質を発現させ、Ｅタンパク質量を測定した。
チニアウイルスによるＥタンパク質の発現と培養上清中
のＥタンパク質の測定 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスの感染に使
用するＶｅｒｏ細胞として予め前感染させていないもの
を用いる以外は実施例１と同様の方法により、Ｅタンパ
ク質を発現させ、Ｅタンパク質量を測定した。
【００４５】（比較例２） デング２型ウイルスと同時
に組み換えワクチニアウイルスを宿主細胞に感染させた
場合のＥタンパク質の発現と培養上清中のＥタンパク質
の測定 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスをＶｅｒｏ
細胞に感染させるときに同時にデング２型ウイルスを感
染させること（以下、同時感染という。）以外は実施例
１と同様の方法により、Ｅタンパク質を発現させ、Ｅタ
ンパク質量を測定した。
に組み換えワクチニアウイルスを宿主細胞に感染させた
場合のＥタンパク質の発現と培養上清中のＥタンパク質
の測定 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスをＶｅｒｏ
細胞に感染させるときに同時にデング２型ウイルスを感
染させること（以下、同時感染という。）以外は実施例
１と同様の方法により、Ｅタンパク質を発現させ、Ｅタ
ンパク質量を測定した。
【００４６】ＥＬＩＳＡにおけるエンドポイント（吸光
度０．１）を示す希釈度について実施例１、比較例１、
２の結果をまとめて表１に示す。
度０．１）を示す希釈度について実施例１、比較例１、
２の結果をまとめて表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】表１から明らかなように、デング２型ウイ
ルスを前感染させておくと、前感染させなかった場合や
同時感染させた場合と比較して、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク
質をコードするｃＤＮＡおよびＥタンパク質をコードす
るｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスは
効率よくＥタンパク質を細胞外へ放出することがわかっ
た。とくに、７．５Ｋプロモーターよりも強いプロモー
ター活性を有する組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６
−ＳL 感染細胞外のＥタンパク質の量が飛躍的に増大し
た。
ルスを前感染させておくと、前感染させなかった場合や
同時感染させた場合と比較して、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク
質をコードするｃＤＮＡおよびＥタンパク質をコードす
るｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウイルスは
効率よくＥタンパク質を細胞外へ放出することがわかっ
た。とくに、７．５Ｋプロモーターよりも強いプロモー
ター活性を有する組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６
−ＳL 感染細胞外のＥタンパク質の量が飛躍的に増大し
た。
【００４９】（実施例２） 培養上清中の粒子状Ｅタン
パク質の精製 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６−
ＳL を感染させた細胞の培養上清をポアサイズ０．２μ
ｍのフィルターで濾過し、１５０，０００×ｇ、２時間
の超遠心分離を行った。沈澱物をＰＢＳバッファーで懸
濁し、３−３０％アンギオコンレイ（第一製薬製）、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（pH８．０）、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌの密度勾配遠心分離を１５０，０００×ｇ、１時
間の条件で行った。遠心後遠心チューブの底から一定量
ずつ分画し、各フラクションを十分なＰＢＳバッファー
で希釈後再度超遠心分離して沈降させた。
パク質の精製 参考例２で得た組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６−
ＳL を感染させた細胞の培養上清をポアサイズ０．２μ
ｍのフィルターで濾過し、１５０，０００×ｇ、２時間
の超遠心分離を行った。沈澱物をＰＢＳバッファーで懸
濁し、３−３０％アンギオコンレイ（第一製薬製）、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（pH８．０）、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌの密度勾配遠心分離を１５０，０００×ｇ、１時
間の条件で行った。遠心後遠心チューブの底から一定量
ずつ分画し、各フラクションを十分なＰＢＳバッファー
で希釈後再度超遠心分離して沈降させた。
【００５０】各フラクションの沈澱物を実施例１と同様
な方法でＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＥＬＩ
ＳＡにてＥタンパク質がどのフラクションに沈降したか
を確認した。その結果を図１に示す。またコントロール
としてデング２型ウイルスを密度勾配遠心分離で分画し
た場合も図１に示す。
な方法でＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＥＬＩ
ＳＡにてＥタンパク質がどのフラクションに沈降したか
を確認した。その結果を図１に示す。またコントロール
としてデング２型ウイルスを密度勾配遠心分離で分画し
た場合も図１に示す。
【００５１】図１から組み換えワクチニアウイルス感染
細胞培養上清中のＥタンパク質はデングウイルスよりも
遅く沈降する、即ちデングウイルスよりも小さい沈降係
数の粒子であることが判った。フラビウイルスの沈降係
数は小さいものでおよそ１３０Ｓであるが、ウイルスよ
り遅く沈降する粒子状Ｅタンパク質の沈降係数はおよそ
７０Ｓであった。尚、ワクチニアウイルスの沈降係数は
フラビウイルスよりも更に大きい。
細胞培養上清中のＥタンパク質はデングウイルスよりも
遅く沈降する、即ちデングウイルスよりも小さい沈降係
数の粒子であることが判った。フラビウイルスの沈降係
数は小さいものでおよそ１３０Ｓであるが、ウイルスよ
り遅く沈降する粒子状Ｅタンパク質の沈降係数はおよそ
７０Ｓであった。尚、ワクチニアウイルスの沈降係数は
フラビウイルスよりも更に大きい。
【００５２】
【図１】密度勾配遠心分離した各フラクション中のＥタ
ンパク質の分布パターンを示した説明図である。
ンパク質の分布パターンを示した説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 斡司 神奈川県川崎市川崎区夜光一丁目２番１号 日本ゼオン株式会社研究開発センター内 (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県川崎市川崎区夜光一丁目２番１号 日本ゼオン株式会社研究開発センター内 (72)発明者 保井 孝太郎 東京都立川市若葉町２−26−32 (72)発明者 宮本 道子 東京都府中市本宿町１−32−１ サンライ ズビル−202
Claims (4)
- 【請求項１】 フラビウイルス科に属するウイルスを予
め感染させた細胞にフラビウイルス科に属するウイルス
由来のｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に全部と表面抗
原タンパク質を実質的に全部をコードするｃＤＮＡを組
み込んだ組み換えワクチニアウイルスを感染させ、培養
上清からフラビウイルス科に属するウイルスのＥタンパ
ク質を含む非感染性の構造物粒子を単離することを特徴
とする非感染性の構造物粒子の製造方法。 - 【請求項２】 予め感染させるウイルスがデング２型ウ
イルスである請求項１記載の製造方法。 - 【請求項３】 ワクチニアウイルスに組み込むｃＤＮＡ
が日本脳炎ウイルスのタンパク質をコードするものであ
る請求項１または２記載の製造方法。 - 【請求項４】 得られる非感染性の構造物粒子が沈降係
数１００Ｓ以下の粒子である請求項１、２、または３記
載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4043682A JPH05276941A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4043682A JPH05276941A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276941A true JPH05276941A (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=12670614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4043682A Pending JPH05276941A (ja) | 1992-02-28 | 1992-02-28 | フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05276941A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999063095A1 (en) * | 1998-06-04 | 1999-12-09 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7094411B2 (en) | 2000-02-16 | 2006-08-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US7521177B2 (en) | 1998-06-04 | 2009-04-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Flavivirus detection methods employing recombinant antigens comprising a Japanese encephalitis (JEV) signal sequence |
| US9783579B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-10-10 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions and methods for dengue virus chimeric constructs in vaccines |
| US11426461B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-08-30 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis A |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| US11590221B2 (en) | 2018-09-05 | 2023-02-28 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
-
1992
- 1992-02-28 JP JP4043682A patent/JPH05276941A/ja active Pending
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8221768B2 (en) | 1998-06-04 | 2012-07-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Chimeric flavivirus immunogens comprising the Japanese encephalitis virus (JEV) prM signal sequence |
| US8728488B2 (en) | 1998-06-04 | 2014-05-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Methods of inducing an immune response in a host by administering flavivirus immunogens comprising extracellular viral particles composed of the premembrane (prM) and envelope (E) antigens |
| US7521177B2 (en) | 1998-06-04 | 2009-04-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Flavivirus detection methods employing recombinant antigens comprising a Japanese encephalitis (JEV) signal sequence |
| US7632510B2 (en) | 1998-06-04 | 2009-12-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Methods of inducing flavivirus immune responses through the administration of recombinant flaviviruses comprising an engineered japanese encephalitis virus signal sequence |
| WO1999063095A1 (en) * | 1998-06-04 | 1999-12-09 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7662394B2 (en) | 1998-06-04 | 2010-02-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleic acids encoding chimeric Flavivirus immunogens comprising the Japanese encephalitis virus (JEV) PRM signal sequence |
| US8232379B2 (en) | 1998-06-04 | 2012-07-31 | The United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Nucleic acids encoding chimeric flavivirus immunogens comprising the Japanese encephalitis virus (JEV) prM signal sequence |
| US8105609B2 (en) | 1998-06-04 | 2012-01-31 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Flavivirus immunogens comprising extracellular viral particles composed of the premembrane (prM) and envelope (E) antigens |
| US7641909B2 (en) | 2000-02-16 | 2010-01-05 | The United States of America as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, Certers for Disease Control and Prevention | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US8025887B2 (en) | 2000-02-16 | 2011-09-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US8673316B2 (en) | 2000-02-16 | 2014-03-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US7094411B2 (en) | 2000-02-16 | 2006-08-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US9463233B2 (en) | 2000-02-16 | 2016-10-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| US9783579B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-10-10 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions and methods for dengue virus chimeric constructs in vaccines |
| US11426461B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-08-30 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis A |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| US11590221B2 (en) | 2018-09-05 | 2023-02-28 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
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