JPH06181792A - フラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒子の製造方法、およびそれに用いる組み換えウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ワクチンとしての利用価値の高いＳＨＡ粒子
と同様の性質を示すＳＨＡ様粒子の多量の産生。 【構成】 ワラビウイルス科のＥタンパク質とプロテア
ーゼをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えウイル
スを作出し、これを培養することによりＳＨＡ様粒子を
得ることにより上記目的が達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フラビウイルス科に属
するウイルス由来の表面抗原タンパク質（以下Ｅタンパ
ク質という）を含む構造物粒子の製造方法、およびそれ
に使用される組み換えウイルスに関する。

【０００２】

【従来の技術】日本脳炎ウイルスやデングウイルスなど
に代表されるフラビウイルスは、一本鎖ＲＮＡをゲノム
（ウイルスの遺伝情報を担う本体）としたウイルスであ
る。このＲＮＡをもとに翻訳された一本のポリペプチド
が感染細胞内において、シグナラーゼやプロテアーゼに
よって切断され１０個のタンパク質となることが知られ
ている。１０個のタンパク質とは、順にＣ、ｐｒＭ
（Ｍ）、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４、６４９−６８８（１９９
０））。これらのタンパク質のうちｐｒＭ（Ｍ）タンパ
ク質は、ｐｒｅＭとＭに分けて表現されることもある。
またＮＳ３タンパク質のアミノ末端側の領域はプロテア
ーゼ活性を担うドメインである事が知られている（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、６５、６０４２ー６０５０（１９９
１））。

【０００３】また、フラビウイルス感染培養細胞や乳の
みマウス脳に感染したフラビウイルスは子孫ウイルス以
外に非感染性ヘマグルチニン（以下ＳＨＡと略す）粒子
を細胞外に放出することが知られている（”Ｔｈｅ Ｔ
ｏｇａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐｐ５０３−５２９、Ｒ．
Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ．，Ｉｎｃ．）。

【０００４】現在、フラビウイルスの代表例である日本
脳炎ウイルスに対するワクチンは、健康なマウス脳内に
日本脳炎ウイルス北京株を接種し、発症したマウスから
脳を無菌的に採取し、アルコール・プロタミン法により
精製、不活化してワクチン原液を得ている（国立予防衛
生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版、昭和５
２年１月２０日丸善株式会社発行）が、このようなワク
チンの製造法においては、大量の日本脳炎ウイルスその
ものを取り扱うわけで、ワクチン製造担当者にとっては
危険性が極めて高い上、製造コストも高かった。

【０００５】また、ワクチンは、ウイルスそのものを用
いる以外に、ウイルスの抗原性を有する抗原タンパク質
を用いて製造することもできる。このような観点から、
組み換えＤＮＡ技術によって原核細胞や真核細胞を用い
て抗原タンパク質を製造する方法が検討されている。特
にワクチニアウイルスやバキュロウイルスをベクターと
して作製した組み換えウイルスは、正しくプロセスされ
た抗原性のよいＥタンパク質を発現することを我々は見
いだした（特開昭６４−７４９８２、特開平１−２８５
１９８）。

【０００６】Ｅタンパク質はヘマグルチニン活性を示す
タンパク質であり、前述のＳＨＡ粒子はヘマグルチニン
活性を示することから、この粒子がＥタンパク質を有す
ることがわかる。このＳＨＡ粒子は、フラビウイルスが
培養細胞や乳のみマウス脳に感染すると、感染細胞から
子孫ウイルスと共に放出される非感染性の粒子であり、
その直径は１４ｎｍのリング状あるいはドーナツ状、そ
の沈降係数は７０Ｓである（”Ｔｈｅ Ｔｏｇａ Ｖｉ
ｒｕｓｅｓ”ｐｐ５０３−５２９、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅ
ｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．，Ｉ
ｎｃ．など）。

【０００７】このようなＳＨＡ粒子を有効成分としたワ
クチンは、ウイルスと類似の構造を有するために、高い
抗原性を有することが期待される。しかし、前述方法に
従って組み換えワクチニアウイルスや組み換えバキュロ
ウイルスを用いてＥタンパク質を製造する場合には、フ
ラビウイルス科に属するウイルスのＥタンパク質からな
る構造物粒子が、組み換えウイルス感染細胞の培養上清
に少量放出されるのみで、ほとんどのＥタンパク質は組
み換えウイルス感染細胞に内包されてしまい、効率よく
多量の構造物粒子を得る事が出来なかった。

【０００８】なお、この構造物粒子は、ＳＨＡ粒子と同
様にヘマグルチニン活性を有し、非感染性であるが、Ｓ
ＨＡ粒子そのものであるか否かは、ＳＨＡ粒子の同定方
法が確定していない現在では、不明である。そこで、本
願では、ＳＨＡ粒子と同様の性質を示す粒子を総称して
ＳＨＡ様粒子と表現する。もちろん、ＳＨＡ様粒子の中
にはＳＨＡ粒子も含まれる。

【０００９】本発明者らは、かかるＳＨＡ様粒子を効率
よく取得する方法について検討を進めた結果、最近組み
換えワクチニアウイルスを細胞に感染させる前に予めフ
ラビウイルスに属するウイルスを感染させておくと感染
細胞の培養上清にＥタンパク質からなるＳＨＡ様粒子が
多量に放出されることを見いだした（特願平４−４３６
８２号）。しかしこの製造方法にはフラビウイルス科に
属するウイルスを予め感染させねばならない為、操作の
過程でウイルスに感染する危険性があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
かかる従来技術や知見の下で、組み換えウイルス感染細
胞の培養上清にフラビウイルス科に属するウイルスのＥ
タンパク質を大量に産生させる方法の開発を目指して鋭
意検討を進めた結果、フラビウイルスのＥタンパク質と
プロテアーゼをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換
えウイルスを細胞に感染させた場合、あるいはフラビウ
イルスのＥタンパク質を発現する組み換えウイルスとフ
ラビウイルスのプロテアーゼを発現する組み換えウイル
スを細胞に重感染させた場合に、その培養上清に多量の
フラビウイルス科に属するウイルスのＥタンパク質を含
む非感染性の構造物粒子を産生することを見い出し、本
発明を完成させるに至った。

【００１１】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、第一の発明として、フラビウイルスウイルス科に属
するウイルス由来のＥタンパク質を発現する組み換えウ
イルス（１）とプロテアーゼを発現する組み換えウイル
ス（２）とを宿主細胞に感染させ、該細胞を培養し、そ
の培養上清からフラビウイルス科に属するウイルスのＥ
タンパク質を含む非感染性の構造物粒子を単離すること
を特徴とする該粒子の製造方法（第一の製造方法）が提
供される。

【００１２】また、第二の発明として、フラビウイルス
科に属するウイルス由来のＥタンパク質とプロテアーゼ
とを発現する組み換えウイルス（３）を宿主に感染さ
せ、該細胞を培養し、その培養上清からフラビウイルス
科に属するウイルスの表面抗原タンパク質を含む感染性
の構造物粒子を単離することを特徴とする該粒子の製造
方法（第二の製造方法）が提供される。

【００１３】さらに、第三の発明として、第二の製造方
法で用いられる新規な組み換えウイルス（３）、即ち、
フラビウイルス科に属するウイルス由来のＥタンパク質
を実質的に全部コードするｃＤＮＡ（ａ）とプロテアー
ゼを実質的に全部コードするｃＤＮＡ（ｂ）とを親ウイ
ルスの増殖に非必須なゲノム領域に組み込んだ組み換え
ウイルスが提供される。

【００１４】本発明の第一の製造方法においては、フラ
ビウイルス科に属するウイルスのＥタンパク質を発現す
る組み換えウイルス（１）とプロテアーゼを発現する組
み換えウイルス（２）が用いられる。組み換えウイルス
（１）は、少なくともフラビウイルス科に属するウイル
スのＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ａ）を親ウイ
ルスの非必須領域に組み込んだものである。このような
ｃＤＮＡは、公知の技術（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ” Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を用いて調製することができ
る。

【００１５】また、ｃＤＮＡの由来となるフラビウイル
スは、フラビウイルスに属するウイルスであれば特に限
定されず、その具体例として、日本脳炎ウイルス、デン
グウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス
などが挙げられる。

【００１６】例えば日本脳炎ウイルスＳａｇａｙａｍａ
株（米国コネチカツト州のエール大学アーボウイルスリ
サーチユニツト）から調製されたｃＤＮＡ５０３７は特
開昭６４−７４９８２号の実施例で開示されているが、
本発明においては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を
有する範囲において、修飾されたｃＤＮＡ（即ち、塩基
配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい。も
ちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸
配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい。

【００１７】Ｅタンパク質の発現のためには、Ｅタンパ
ク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡに加え、Ｅタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡの上流に、Ｃタンパク質
のカルボキシ末端側約６２アミノ酸程度以上のペプチド
をコードするｃＤＮＡをｐｒＭ（Ｍ）タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡと一連に組み込むことが粒子の製造効率
の向上の点からは好ましい。

【００１８】組み換えウイルスの作製に供されるウイル
ス（親ウイルス）は特に限定されないが、好ましくはワ
クチニアウイルスまたはバキュロウイルスに分類される
ウイルスである。ワクチニアウイルスとしては、ＷＲ株
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４９，
ｐ．８５７（１９８４））、リスター株、リスター株の
温度感受性変異株（米国特許第４，５６７，１４７号、
特開昭６２−４４１７８号参照）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ株、ＬＣ１６ｍ８株な
どの種痘ワクチン株) などが例示される。

【００１９】これらのウイルスの中でも孵化鶏卵しょう
尿膜上でのポックスサイズが３ｍｍ以下でかつウサギ腎
臓細胞での増殖不能温度が４１℃以下のものが好適であ
り、その具体例としては前記特開昭６２−４４１７８号
記載の弱毒痘そう株ＬＡ株および、ＬＢ株（ＣＮＴＭ−
１−４２３）、前記ＬＣ１６ｍ８株などが弱毒性であり
安全性の面で有利である。

【００２０】バキュロウイルスとしてはオートグラフア
・カルフオルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉｃａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉ
ｐｌｕｓｉａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌ
ｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、あるいはボンビッ
クス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などが例示され
る。

【００２１】これらのウイルスの中でもオートグラフア
・カリフオルニカ（以下、ＡｃＮＰＶと略す）が好適で
ある。これらのウイルスは従来から広く研究されてきた
ものであり、そのサンプルは米国コネチカット州のエー
ル大学アーボヴィラスリサーチユニットをはじめ多くの
入手源から得ることができる。

【００２２】組み換えウイルス（１）の作製方法は特に
限定されないが、例えば、以下の方法によって作製する
ことができる。

【００２３】まず親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領
域が組み込まれ、さらにその領域内に親ウイルスで働く
プロモーター遺伝子が挿入された第一の組み換えベクタ
ーが作製される。第一の組み換えベクターの具体例とし
ては、例えば特開昭６４−７４９８２号の実施例で開示
されたプラスミドｐＡＫ８または特開平１−２８５１９
８号の実施例で開示されたプラスミドｐＡｃＹＭＳ１な
どが例示される。

【００２４】次いでＥタンパク質の実質的に全部をコー
ドするｃＤＮＡが第一の組み換えベクターのプロモータ
ーの後ろに挿入された第二の組み換えベクターが作製さ
れる。

【００２５】プロモーターは、挿入されるｃＤＮＡの転
写を調節するために有効である。組み込むプロモーター
は、親ウイルス内で機能する限りにおいて特に限定され
ないが、ワクチニアウイルスを使用する場合、好ましく
は７．５Ｋプロモーターの２倍以上、より好ましくは１
０倍以上、特に好ましくは１５倍以上の活性を有するプ
ロモーターである。このようなプロモーターの具体例と
しては、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０、７７１−７８
４（１９８２）記載の合成プロモーターや、７．５Ｋプ
ロモーターの約２０倍の活性を持つ合成プロモーターＳ
L （配列番号１）が挙げられる。

【化１】 配列番号１：合成プロモーターＳL P-R3R:5'-GGATCCCCACCATGGTGCTGGTCGAGATGGAACCCCCC-3'

【００２６】バキュロウイルスを使用する場合、好まし
くはポリヘドリン遺伝子のプロモーター、より好ましく
はポリヘドリン遺伝子プロモーター以上の活性を持つプ
ロモーターである。

【００２７】次ぎに、ベクターＤＮＡと親ウイルスゲノ
ムＤＮＡ間に相同組み換えを起こさせて組み換えウイル
スを作製する。組み換えウイルスの作製にあたっては常
法に従えば良い。例えば、組み換えワクチニアウイルス
の作製にあたっては、ワクチニアウイルスを感染させた
動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入し、組み
換えワクチニアウイルスを作製する。例えば”ＤＮＡ
ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．ＩＩ ａ ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｐｐ．１９１−２１１、（Ｄ．
Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬプレス、オックスフォー
ド、ワシントン）の記述に従って実施できる。

【００２８】すなわちワクチニアウイルスを感染させた
宿主細胞にリン酸カルシウム共沈法により第二の組み換
えベクターを移入させ、得られる組み換えウイルスを含
むウイルス集団をチミジンキナーゼ欠損細胞に感染させ
ＢＵｄＲ存在下生育してくるプラークを選択し、組み換
えウイルス候補株とする。これら候補株の中から日本脳
炎ウイルスのｃＤＮＡが組み込まれたウイルスを選択す
る方法は、該ｃＤＮＡをプローブとするハイブリダイゼ
ーション法を利用してプラーク純化をすれば良い。

【００２９】組み換えバキュロウイルスの作製にあたっ
ても常法に従えば良く、例えば特開昭６０−３７９８８
号の実施例の記述に準じて実施できる。即ち、Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａ ｆｕｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞に
カルシウム共沈法によりバキュロウイルスのゲノムＤＮ
Ａと第二の組み換えベクター移入させ、培養後、得られ
る組み換えウイルスを含むウイルス集団から組み換えウ
イルスを選択する。日本脳炎ウイルスのｃＤＮＡが組み
込まれた組み換えウイルスを選択する方法は、該ｃＤＮ
Ａをプローブとするハイブリダイゼーション法などを利
用してプラーク純化をすれば良い。

【００３０】このような組み換えウイルス（１）の例と
しては、組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６株、ＬＡ
Ｊ４株（特開昭６４−７４９８２号公報記載、日本脳炎
ウイルスのＥタンパク質を発現する）や組み換えバキュ
ロウイルスＡｃＪ３株（特開平１−２８５１９８号公報
記載、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質を発現する）な
どが挙げられる。特に、Ｃタンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡとｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に全部を
コードするｃＤＮＡとＥタンパク質の実質的に全部をコ
ードするｃＤＮＡとＮＳ１タンパク質の一部をコードす
るｃＤＮＡとを組み込んだ組み換えウイルスが好まし
く、そのような組み換えウイルスの具体例としては、組
み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６株や組み換えバキュ
ロウイルスＡｃＪ３株が挙げられる。

【００３１】一方、組み換えウイルス（２）は、少なく
ともフラビウイルス科に属するウイルスのプロテアーゼ
の実質的に全部をコードするｃＤＮＡを親ウイルスの非
必須領域に組み込んだものである。ｃＤＮＡとして、プ
ロテアーゼをコードするｃＤＮＡ（ｂ）を用いること以
外は、前記の組み換えウイルス（１）と同様にして得ら
れる。

【００３２】プロテアーゼタンパク質の発現のために
は、プロテアーゼの実質的に全部をコードするｃＤＮＡ
に加えて、その上流にＮＳ２Ｂタンパク質をコードする
ｃＤＮＡを連結することが好ましい。また、プロテアー
ゼドメインはＮＳ３タンパク質のアミノ末端側にあるた
め、必ずしも、ＮＳ３タンパク質全部をコードするｃＤ
ＮＡを用いる必要はない。

【００３３】このような組み換えウイルス（２）の例と
して、黄熱病ウイルスのプロテアーゼを発現する組み換
えワクチニアウイルス株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、６
０４２−６０５０（１９９１））、デングＩＶ型ウイル
スのプロテアーゼを発現する組み換えワクチニアウイル
ス（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、２４６７−６４７５（１
９９１））、日本脳炎ウイルスを発現する組み換えワク
チニアウイルスＬＡＪＮＳ２ｂ＋３株（本願明細書実施
例１参照）などが挙げられる。特に、ＮＳ２Ｂタンパク
質の実質的に全部をコードする遺伝子とプロテアーゼド
メインの実質的に全部をコードする遺伝子を組み込んだ
組み換えウイルスが好ましく、そのような組み換えウイ
ルスの具体例としては、組み換えワクチニアウイルスＬ
ＡＪＮＳ２ｂ＋３株が挙げられる。

【００３４】本発明の第一の製造方法においては、親ウ
イルスの感染しうる細胞を宿主細胞として、２種の組み
換えウイルスを重感染させることが必要である。培養に
用いる動物細胞は、親ウイルスが感染する限りにおいて
特に限定されないが、例えばワクチニアウイルスではサ
ル腎細胞由来樹立培養株Ｖｅｒｏ細胞、バキュロウイル
スではＳｆ細胞などが挙げられる。

【００３５】組み換えウイルスを感染させた後の動物細
胞の適当な培養条件は、予備実験により容易に決定でき
るが、具体的には、Ｖｅｒｏ細胞場合は５％牛胎児血清
を含むイーグルＭＥＭ培地で３７℃で培養することが好
ましく、Ｓｆ細胞の場合は２８℃で培養することが好ま
しい。

【００３６】そして、適当な培養時間後、培養上清から
超遠心分離などの方法により構造物粒子を回収する。回
収した構造物粒子中のＥタンパク質量はＥＬＩＳＡ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂ
ｅｎｔ ａｓｓａｙ）法で測定する事が出来る。超遠心
分離により得られた沈澱物をさらに密度勾配遠心分離す
れば、フラビウイルスのＥタンパク質を含む沈降係数１
００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、好ましくは沈降係
数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子（ＳＨＡ様粒子）を
得ることができる。

【００３７】本発明の第二の製造方法では、Ｅタンパク
質とプロテアーゼとを同時に発現しうる組み換えウイル
ス（３）を宿主細胞に感染させ、感染した細胞を培養
し、粒子を回収する。

【００３８】この方法で使用される第三の発明の組み換
えウイルス（３）は、少なくともフラビウイルス科に属
するウイルスのＥタンパク質の実質的に全部をコードす
るｃＤＮＡ（ａ）とプロテアーゼの実質的に全部をコー
ドするｃＤＮＡ（ｂ）を親ウイルスの非必須領域に組み
込んだものである。

【００３９】この組み換えウイルスの作製は、ｃＤＮＡ
（ａ）と（ｂ）を同じ親ウイルスにに組み込むこと以外
は組み換えウイルス（１）、（２）の場合に準じて行わ
れる。かかる組み換えウイルス（３）の具体例として
は、Ｃタンパク質のカルボキシ末端側（６２アミノ酸
分）をコードするｃＤＮＡ（ｃ）、ｐｒＭ（Ｍ）タンパ
ク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡ（ｄ）、Ｅタ
ンパク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡ、ＮＳ２
Ｂタンパク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡ
（ｅ）とＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインとを
一連に組み込んだ組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ１
４−ＳL （本願明細書実施例１参照）や、同様のｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えバキュロウイルスが挙げられ
る。

【００４０】このような組み換えウイルス（３）を宿主
細胞に感染させ、培養し、粒子を精製する方法は、前述
の２種の組み換えウイルス（１）と（２）とを用いた場
合と同様の方法で行うことができる。また、組み換えウ
イルス（３）を用いる場合には、Ｅタンパク質とプロテ
アーゼを同時に発現するので、一種の組み換えウイルス
で効率よくＥタンパク質を含む非感染性の粒子を得るこ
とができる。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、ウイルスの増殖に非必
須なゲノム領域にフラビウイルス科に属するウイルス由
来の少なくともＥタンパク質をコードするｃＤＮＡとプ
ロテアーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込ん
だ組み換えウイルス、およびフラビウイルスのＥタンパ
ク質を含む非感染性の構造物粒子、好ましくは沈降係数
１００Ｓ以下の非感染性の構造物粒子、更に好ましくは
沈降係数約７０Ｓの非感染性の構造物粒子（ＳＨＡ様粒
子）を得ることができる。この非感染性の構造物粒子
は、コンポーネントワクチンとして利用できると期待さ
れる。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 （参考例１） 日本脳炎ウイルス由来のプロテアーゼタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング

【００４３】蚊由来株化細胞Ｃ６／３６（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．、４０、５３１−５４４（１９７８））に
日本脳炎ウイルスＳａｇａｙａｍａ株を感染させ、ウイ
ルスを増殖させた後、培養上清とポリエチレングリコー
ルとを混合し遠心分離により日本脳炎ウイルスを精製し
た。ウイルスゲノムＲＮＡ（約１１ｋｂｐ）は精製ウイ
ルスからフェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱さ
せ分離た。

【００４４】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６１、４９７−５１
０（１９８７）（著者：Ｈ．Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら）に
報告された日本脳炎ウイルスの塩基配列を基に下記の３
本のオリゴヌクレオチド（配列番号２、３、４）を作製
した。

【００４５】配列番号２、３、４はそれぞれ以下の通り
である。

【００４６】

【化２】 配列番号２ 5'-GGGAGCCCTCTCAAAGCTTCTGCC-3'

【００４７】

【化３】 配列番号３ 5'-CCCCGCTCTTTGGAGGCACATTGC-3'

【００４８】

【化４】 配列番号４ 5'-CCCATCTTCCCTATACCCTTTCGC-3'

【００４９】上記３本のオリゴヌクレオチドをそれぞれ
プライマーとし、ウイルスＲＮＡを鋳型として、４種
（Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔ）のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸と、逆転写酵素を働かせて、ファーストストランドｃ
ＤＮＡをそれぞれ合成した。次に大腸菌ＲＮａｓｅＨ
と、４種（Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔ）のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを使って二本鎖
ｃＤＮＡを作製し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．、（１９８２）ｐ．２１１〜２４６）、ターミナル
トランスフェラーゼでｄＣ鎖を付加した。

【００５０】一方、プラスミドｐＵＣ９（ファルマシア
製）を制限酵素ＰｓｔＩで消化後、ターミナルトランス
フェラーゼでｄＧ鎖を付加し、これと、前記ｃＤＮＡを
混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した。この
組み換えプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセ
ルに導入し、それぞれ形質転換菌を得た。得られた形質
転換菌の中から目的のｃＤＮＡを含む組み換えプラスミ
ドを含む形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。

【００５１】それぞれのｃＤＮＡを作製するのに用いた
配列番号２、３、４のオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡ
カイネースで末端をラジオアイソトープで標識し、それ
をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションでプ
ローブと反応するコロニーをそれぞれ複数個選んだ。次
にそれからプラスミドを取り出し、挿入されたｃＤＮＡ
の長さを比較し、それぞれのグループの中で最も長いｃ
ＤＮＡを選択した（選択したｃＤＮＡクローンをそれぞ
れ２１４２、１０８５、２０４１と命名した）。制限酵
素による切断パターンよりクローニングした３つのクロ
ーンは図１に示す位置関係にあることがわかった。

【００５２】（参考例２） 日本脳炎ウイルス由来のＮ
Ｓ２Ｂタンパク質、ＮＳ３タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫＪＮＳ２Ｂ
＋３）の作製

【００５３】特開昭６４−７４９８２号の実施例で開示
されたｐＡＫ８を制限酵素ＮｃｏＩと制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、そこに合成ヌクレオチドアダプター
（配列番号５）を挿入し、ｐＡＫ１１を作製した。

【００５４】

【化５】 配列番号５ 5'-CATGGGGTGGCCA-3' 3'-CCCACCGGTTCGA-5'

【００５５】また参考例１で得られたｃＤＮＡクローン
２０４１を制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで二重切断し、約０．９６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ま
たｃＤＮＡクローン１０８５を制限酵素ＢａｍＨＩと制
限酵素ＰｓｔＩで二重切断して約０．６５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで二重切断したプラスミドｐＡＫ８に挿入し、プ
ラスミドｐＪＥ４９２１／６５２９を作製した。

【００５６】ｐＡＫ１１を制限酵素ＢａｌＩと制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し、参考例１で得られたｃＤＮＡクロ
ーン２１４２を制限酵素ＢａｌＩと制限酵素ＰｓｔＩで
切断して得られる約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＪ
Ｅ４９２１／６５２９を制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断して得られる約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断
片を挿入してプラスミドｐＡＫＪＮＳ２Ｂ＋３を作製し
た。

【００５７】（参考例３） 日本脳炎ウイルス由来のＣ
タンパク質の一部、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、Ｅタンパ
ク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えベクタ
ー（ｐＡＫＪ６−ＳL ）の作製

【００５８】特開昭６４−７４９８２号公報、第２４
頁、実施例１（７）３記載のｐＡＫＪ６（プロモーター
が７．５Ｋプロモーターであり、日本脳炎ウイルスのｐ
ｒＭ（Ｍ）、Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡを含ん
でいる。）を制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＳａｌＩで処
理し、配列番号１記載の合成プロモーターＳL を、７．
５Ｋプロモーターの代わりに挿入し、約６．２Ｋｂｐの
プラスミドを得た。このプラスミドをｐＡＫＪ６−ＳL
と命名した。

【００５９】（参考例４） 日本脳炎ウイルス由来のＣ
タンパク質の一部、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、表面抗原
（Ｅ）タンパク質、ＮＳ２Ｂタンパク質、およびＮＳ３
タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫＪ１４−ＳL
）の作製

【００６０】参考例３で作製されたプラスミドｐＡＫＪ
６−ＳL を制限酵素ＢｇｌＩＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、そこに合成ヌクレオチドアダプター（配列
番号６）を挿入し、ｐＳＡＫＪ６を作製した。

【００６１】

【化６】 配列番号６ 5'-GATCTAACAAGAAGAGAGGGTGGCCAGA-3' 3'-ATTGTTCTTCTCTCCCACCGGTCTTCGA-5'

【００６２】ｐＳＡＫＪ６を制限酵素ＢａｌＩと制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで二重切断し、参考例２で作製したプ
ラスミドｐＡＫＪＮＳ２Ｂ＋３を制限酵素ＢａｌＩと制
限酵素ＨＩｎｄＩＩＩで切断して得られた約０．９３ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＡＫＪ１４
−ＳL を作製した。

【００６３】（実施例１） 組み換えワクチニアウイル
スの作製

【００６４】２５ｃｍ2 のカルチャーボトルに培養され
たＲＫ−１３細胞に弱毒痘そうウイルス株（特開昭６２
−４４１７８号公報記載の弱毒痘そう株ＬＡ（ウサギ腎
細胞における増殖不能温度４１℃、孵化鶏卵しょう尿膜
上でのポックサイズ２〜３ｍｍ）を０．１ｐ．ｆ．ｕ．
／細胞の割合で接種し、４５分後、参考例２または参考
例３または参考例４で得た組み換えプラスミドｐＡＫＪ
ＮＳ２ｂ＋３またはｐＡＫＪ６−ＳL またはｐＡＫＪ１
４−ＳL の１０μｇを２．２ｍｌの滅菌水に溶解し、樋
高ら（蛋白・核酸・酵素、２７、３４０（１９８５））
の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈物をつく
り、その０．５ｍｌを感染ＲＫ−１３細胞上にそれぞれ
滴下した。３０分間、３７℃、７％ＣＯ₂ インキュベー
ターに静置し、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ
４．５ｍｌを加えた。その３時間後、培養液を交換し、
４８時間、３７℃、７％ＣＯ₂ インキュベーター内で培
養し、培養細胞ごとに３度凍結融解した。

【００６５】組み換え体選択のために、直径１０ｃｍの
ペトリ皿に培養されたＴＫ−１４３細胞に上記のウイル
ス液を接種し、３０分後、１％アガロース、５％牛胎児
血清、２５μｇ／ｍｌのＢＵｄＲ加イーグルＭＥＭを積
層し、３日間培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラ
ルレッドで染色した。出現したプラークからパスツール
ピペットでウイルスを抜取り、これを２％ゼラチンを含
むＰＢＳに懸濁し、一部はドットハイブリダイゼーショ
ンをするため、セルロースメンブレンにスポットし、残
りは−２０℃で保存した。スポットしたメンブレンは、
０．５Ｎ水酸化ナトリウムで１０分間、１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間の処理を３回繰り返し
たのち、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で５分間処理した。２倍ＳＳＣ
（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム）で飽和させ、８０℃、２時間焼き付けた。

【００６６】４倍ＳＥＴ（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０
８Ｍトリス−塩酸、４ｍＭ ＥＤＴＡ、（ｐＨ７．
８））−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％ＳＤＳで６
８℃、２時間処理した。４倍ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ4 −５
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレー
ションによって32Ｐで標識した日本脳炎ウイルスのＥタ
ンパク質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブリ
ダイゼーションした。

【００６７】洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
イルス液を再度ＴＫ- １４３の細胞に接種し、３０分
後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌ
のＢＵｄＲを含むイーグルＭＥＭを積層し、３日間培養
後、感染細胞を０．０１％ニュートラルレッドで染色し
た。

【００６８】出現したプラークについて、上記と同様な
操作を行い、出現するすべてのプラークがドットハオブ
リダイゼーションで黒化するまで純化の操作を繰り返し
た。こうして得られたウイルスは、それぞれ目的の組み
換えワクチニアウイルスである。これらの組み換えワク
チニアウイルスをそれぞれＬＡＪＮＳ２ｂ＋３、ＬＡＪ
６−ＳL 、ＬＡＪ１４−ＳL と命名した。

【００６９】（実施例２） 組み換えワクチニアウイル
スＬＡＪ１４−ＳL を感染させた細胞の培養上清中に放
出された構造物粒子中のＥタンパク質量の測定

【００７０】直径６ｃｍのペトリ皿に培養されたＶｅｒ
ｏ細胞に組み換えウイルスＬＡＪ１４−ＳL を２ｐ．
ｆ．ｕ．／細胞の割合で感染させ、５％牛胎児血清を含
むイーグルＭＥＭ培地３ｍｌを加え、１８時間、３７
℃、７％ＣＯ₂ インキュベーター内で培養した。

【００７１】この培養上清をポアサイズ０．２μｍのフ
ィルターで濾過し、１５０，０００×ｇ、２時間の超遠
心分離を行なった。得られた沈澱物をＰＢＳバッファー
洗浄後、１０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．８）１００
μｌで懸濁し更に同バッファーで２倍ずつ段階希釈して
いき、マイクロタイタープレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ
ずつ乗せ４℃終夜放置してコーティングした。

【００７２】１次抗体として１：１０，０００倍希釈し
たモノクローナル抗体２０４（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，２６６３−２６７２）を、２次抗体としてア
ルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ
社製）を用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡにおけ
るエンドポイント（吸光度０．１）を示す希釈度からＥ
タンパク質の発現量を測定した。

【００７３】（実施例３） 組み換えワクチニアウイル
スＬＡＪ６−ＳL とＬＡＪＮＳ２ｂ＋３を重感染させた
細胞の培養上清に放出された構造物粒子中のＥタンパク
質量の測定

【００７４】直径６ｃｍのペトリ皿に培養されたＶｅｒ
ｏ細胞に組み換えウイルスＬＡＪ６−ＳL とＬＡＪＮＳ
２ｂ＋３をともに２ｐ．ｆ．ｕ．／細胞の割合で重感染
させ、５％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地３ｍｌ
を加え、１８時間、３７℃、７％ＣＯ₂ インキュベータ
ー内で培養した。

【００７５】この培養上清を実施例２と同様に、ポアサ
イズ０．２μｍのフィルターで濾過し、１５０，０００
×ｇ、２時間の超遠心分離を行なった。得られた沈澱物
をＰＢＳバッファー洗浄後、１０ｍＭ炭酸バッファー
（ｐＨ９．８）１００μｌで懸濁し更に同バッファーで
２倍ずつ段階希釈していきマイクロタイタープレートに
５０μｌ／ｗｅｌｌずつ乗せ４℃終夜放置してコーティ
ングした。

【００７６】１次抗体として１：１０，０００倍希釈し
たモノクローナル抗体２０４（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，２６６３−２６７２）を、２次抗体としてア
ルカリフォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ
社製）を用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡにおけ
るエンドポイント（吸光度０．１）を示す希釈度からＥ
タンパク質の発現量を測定した。

【００７７】（比較例１） ＬＡＪ６−ＳL を単独感染
させた細胞の培養上清に放出された構造物粒子中のＥタ
ンパク質量との比較

【００７８】直径６ｃｍのペトリ皿に培養されたＶｅｒ
ｏ細胞に組み換えウイルスＬＡＪ６−ＳL を２ｐ．ｆ．
ｕ．／細胞の割合で感染させ、５％牛胎児血清を含むイ
ーグルＭＥＭ培地３ｍｌを加え、１８時間、３７℃、７
％ＣＯ₂ インキュベーター内で培養した。

【００７９】実施例２や実施例３と同様の方法により、
培養上清に放出された構造物粒子中のＥタンパク質量を
測定した。

【００８０】ＥＬＩＳＡにおけるエンドポイント（吸光
度０．１）を示す希釈度について実施例２、実施例３、
比較例１の結果をまとめて表１に示す。

【００８１】

【表１】

【００８２】表１で示されたエンドポイントの希釈度は
Ｅタンパク質量の相対比を表しているので、日本脳炎ウ
イルスのＥタンパク質とプロテアーゼタンパク質をコー
ドするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えウイルスを細胞に
感染させた場合、あるいは日本脳炎ウイルスのＥタンパ
ク質をコードする組み換えウイルスと日本脳炎ウイルス
のプロテアーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡを組み
込んだ組み換えウイルスを細胞に重感染させた場合に、
その培養上清にＥタンパク質を含む非感染性の構造物粒
子を多量に産生することがわかった。

【００８３】

【図面の簡単な説明】

【図１】日本脳炎ウイルスのゲノム構造とクローニング
した３つのｃＤＮＡクローンの領域を示した説明図であ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成４年９月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】プロモーターは、挿入されるｃＤＮＡの転
写を調節するために有効である。組み込むプロモーター
は、親ウイルス内で機能する限りにおいて特に限定され
ないが、ワクチニアウイルスを使用する場合、好ましく
は７．５Ｋプロモーターの２倍以上、より好ましくは１
０倍以上、特に好ましくは１５倍以上の活性を有するプ
ロモーターである。このようなプロモーターの具体例と
しては、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０、７７１−７８
４（１９８２）記載の合成プロモーターや、特願平４−
０４３６８２号に配列番号１として開示の７．５Ｋプロ
モーターの約２０倍の活性を持つ合成プロモーターＳ_Ｌ
が挙げられる。尚、参考までに同配列を以下に示す。

【化１】 配列番号１：合成プロモーターＳＬ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県川崎市川崎区夜光一丁目２番１号 日本ゼオン株式会社研究開発センター内 (72)発明者 保井 孝太郎 東京都立川市若葉町２−26−32

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フラビウイルスウイルス科に属するウイ
   ルス由来の表面抗原タンパク質を発現する組み換えウイ
   ルス（１）と、フラビウイルスウイルス科に属するウイ
   ルス由来のプロテアーゼを発現する組み換えウイルス
   （２）とを同時に感染させた細胞を培養し、その培養上
   清からフラビウイルス科に属するウイルスの表面抗原タ
   ンパク質を含む非感染性の構造物粒子を単離することを
   特徴とする該粒子の製造方法。
2. 【請求項２】 フラビウイルス科に属するウイルス由来
   の表面抗原タンパク質とプロテアーゼとを発現する組み
   換えウイルス（３）を宿主細胞に感染させ、その細胞を
   培養し、その培養上清からフラビウイルス科に属するウ
   イルスの表面抗原タンパク質を含む非感染性の構造物粒
   子を単離することを特徴とする該粒子の製造方法。
3. 【請求項３】 フラビウイルス科に属するウイルス由来
   の表面抗原タンパク質を実質的に全部コードするｃＤＮ
   Ａ（ａ）とプロテアーゼを実質的に全部コードするｃＤ
   ＮＡ（ｂ）とを親ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
   に組み込んだ組み換えウイルス。
4. 【請求項４】 組み換えウイルスが、フラビウイルス科
   に属するウイルス由来のコアタンパク質の少なくともカ
   ルボキシ末端側の一部をコードするｃＤＮＡ（ｃ）とｐ
   ｒＭ（Ｍ）タンパク質を実施的に全部コードするｃＤＮ
   Ａ（ｄ）とＮＳ２Ｂタンパク質を実質的に全部コードす
   るｃＤＮＡ（ｅ）とをさらに組み込んだものである請求
   項３記載の組み換えウイルス。