JP2511494B2 - 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 - Google Patents

日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えバキユロウイルスを用いて日本脳炎
ウイルスの表面抗原蛋白質を効率よく製造する方法に関
する。
（従来の技術） 日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日
本脳炎ウイルスを有効成分とするワクチンが用いられて
おり、健康なマウス脳内に日本脳炎ウイルス中山予研株
を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、ア
ルコール・プロタミン法により精製、不活化して不活化
日本脳炎ウイルスワクチン原液を得ている［国立予防衛
生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版（昭和52
年１月20日丸善株式会社発行）］。
このようなワクチンの製造法においては、大量の日本
脳炎ウイルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造
担当者にとつては危険性が極めて高い上、製造コストも
高かつた。
ワクチンとしては、ウイルスそのものでなく、ウイル
スの抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み
換えDNA技術によつて原核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになつた。日本脳炎
ウイルスの表面抗原蛋白質（以下、Ｅ蛋白質と称するこ
とがある）を酵母を宿主とする遺伝子操作によつて発現
させようとする試みもなされている（第34回日本ウイル
ス学会予稿集第91頁昭和61年10月）が、本来のＥ蛋白質
の産生には成功しなかつた。
本発明者らは、最近、生ワクチンとして用いられてい
るワクチニアウイルスに日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質を
コードするcDNAを組み込んで発現させることに成功し
た。しかし、この組み換えウイルスは生ワクチンとして
有望ではあるが、発現させた蛋白質を回収して、ワクチ
ンや診断試薬として利用するには産生量が少ないという
問題がある。
一方、昆虫ウイルスベクターを用いて昆虫細胞で外来
遺伝子を発現させる方法が提案されるようになり（特開
昭60−37988号、同61−5787号）。これらの方法での発
現蛋白量は、他の発現系より著しく高いと報告されてい
る。
しかしながら、トガウイルス科フラビウイルス属に属
する日本脳炎ウイルスは、一本鎖RNAをゲノム（ウイル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウイルスの感染細胞内
においてモノシストロニツクにゲノムから翻訳された一
本のポリペプタイドがコア蛋白質、マトリツクス蛋白
質、Ｅ蛋白質、及び５種類の非構成蛋白質へとプロセツ
シング（一本のポリペプタイドが細胞内のプロテアーゼ
で切断されて各々の蛋白質ができる事をいう）されると
いう特徴をもつため、Ｅ蛋白質をコードするcDNAをバキ
ユロウイルスに組み込んで発現させることは操作上困難
であり、従つて、これまでにその発現例については全く
報告されていない。
（発現が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、日本脳
炎ウイルスＥ蛋白質を大量に製造する方法の開発を目指
して鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウイルスのゲノム
RNAを鋳型とし調製したcDNAよりＥ蛋白質をコードする
領域を選択し、バキユロウイルスのプロモーターに連結
し、バキユロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に組
み込めば、感染昆虫細胞においてワクチンや診断試薬と
して利用可能な日本脳炎ウイルスＥ蛋白質が大量に発現
することを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成
するに至つた。
（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白
質をコードするcDNAをバキユロウイルスの増殖に非必須
なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキユロウイルスを
昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した日
本脳炎ウイルスＥ蛋白質を回収する方法が提供される。
本発明において組み換えウイルスの作製に供されるウ
イルスはバキユロウイルスに分類されるウイルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばオートグラフア・カリ
フオルニカ（Autographa californica）、トリコプルシ
ア・ニ（Trichoplusia ni）、ラキブルシア・オウ（Rac
hiplusia ou）、ガレリア・メロネラ（Galleria mellon
ella）、或いはボンビツクス・モリ（Bombyx mori）な
どが例示される。これらのウイルスのなかでもオートグ
ラフア・カリフオルニカ（以下、AcNPVと略す）が好適
である。これらのウイルスは従来から広く研究されてき
たものであり、そのサンプルは米国コネチカツト州のエ
ール大学アーボヴイラスリサーチユニツトをはじめの多
くの入手源から得ることができる。
また、日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質をコードす
るcDNAは、例えば前記中山予研株やJaOAr株（米国コネ
チカツト州のエール大学アーボヴイラスリサーチユニツ
ト）、Sagayama株（同所）を用いて調製することができ
る。
例えば上記Sagayama株から調製されたＥ蛋白質をコー
ドするcDNAは第４図に示すごとき全部で1500塩基対から
構成されているが、本発明においては上記cDNAと実質的
に同一の機能を有する範囲において、修飾されたcDNA
（即ち、塩基配列が置換、挿入、欠失したもの）であつ
てもよい。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎ
り、アミノ酸配列が異なる程度に修飾されたものであつ
てもよい。
すなわち、第４図に示すアミノ酸配列によりコードさ
れる日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質に対する抗血清
反応と実質的に同一の反応性を示すポリペプチドをコー
ドするcDNAであれば、この発明において使用できること
は言うまでもない。
組み換えウイルスの作製に当たつては、まずバキユロ
ウイルスの増殖に非必須なDNA領域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。この場合、前記領域に
バキユロウイルス内で機能するプロモーターを存在させ
ることが必要であり、さらにプロモーターの下流に適当
な制限酵素切断配列を有する合成リンカーを挿入するこ
とが好ましい。
ここで言う増殖に非必須なDNA領域とは、例えばバキ
ユロウイルスのポリヘドリン遺伝子（L.Kミラーら、サ
イエンス219巻1983年頁715〜721）など、外来性DNAの挿
入による変異を受けても実質上ウイルスの増殖に影響を
及ぼさない領域を言う。
因みにポリヘドリンは、およそ29.000ダルトンの分子
量の蛋白質であり、AcNPVゲノムのEcoRI−Ｉ断片上にそ
の遺伝子が存在する事が示されており（G.E.スミスらj.
virol.45巻、1983年頁215−225）、ポリヘドリン遺伝子
のDNA配列はG.E.スミスらの論文（Virology 131巻1983
年頁561−565）に示されている。
また、バキユロウイルス内で機能するプロモーターと
は、合成・天然を問わずバキユロウイルスが保有する転
写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものなら
いかなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は、例えばバキユロウイルスのポリヘドリンをコードす
る遺伝子のプロモーター、10Kポリペプチドをコードす
るバキユロウイルス遺伝子のプロモーターなどが例示さ
れる。
第一の組み換えベクターの作製は常法（例えば特開昭
60−37988号、同61−5787号など）に従つて行うことが
でき、例えば次のようにして行われる。ポリヘドリン遺
伝子を有するDNAをバキユロウイルスAcNPVから単離し、
精製する。次いでEcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化
すると、ポリヘドリン遺伝子を含む7.3キロベースEcoRI
−Ｉ断片及びその他の適当な断片を生成する。上記EcoR
I−Ｉ断片を、その後適当なクローニングプラスミドのE
coRI部位にクローン化する。
この系の場合にはポリヘドリン遺伝子のプロモーター
が非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第
二の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
また発現量を増加させるためには、ポリヘドリン遺伝
子プロモーターとポリヘドリン遺伝子の５′非翻訳領域
の直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘドリンの構
造遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘドリンの３′非
翻訳領域が続いているベクターを用いることが好まし
い。このようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極め
て高くなる事が示されている（松浦らJ.gen.Virol68巻1
987年頁1233−1250）。
ところで日本脳炎ウイルスの蛋白質は先に述べたよう
にモノシストロニツクに合成された後、プロセツシング
されて表面抗原蛋白質等にわかれる。従つて、全ウイル
スゲノムに対するcDNAを挿入すれば人為的に翻訳開始コ
ドン及び翻訳終止コドンを挿入する必要はない。また挿
入するcDNAがＥ蛋白質をコードする領域に加え、その上
流に翻訳開始コドンになりうる配列（例えばATG）を有
する場合にも同様である。しかし、Ｅ蛋白質をコードす
るcDNAのみを組み込もうとするときはプロモーターの下
流に存在する制限酵素切断点を利用し、翻訳開始コド
ン、翻訳終止コドン及び両者間に制限酵素切断配列を有
する合成リンカーを組み込むことが必要である。
挿入する翻訳終止コドンは、Ｅ蛋白質をコードするcD
NAの読み取り枠がいずれであつても合致するように読み
取り枠をずらせて３ケ所に設けることが望ましい。
挿入するcDNAはＥ蛋白質をコードする領域を含むもの
であればその他に他の蛋白質をコードする領域を含むも
のであつてもよい。フラビウイルス属に属するウイルス
については、Ｅ蛋白質をコードする領域の上流にマトリ
ツクス蛋白質（以下Ｍ蛋白質と称する）、プレマトリツ
クス蛋白質（以下PreM蛋白質と称する）、コア蛋白質
（以下Ｃ蛋白質と称する）をコードする領域が存在して
いるが、本発明においてはこれらの蛋白質をコードする
cDNAの全部又は一部がＥ蛋白質をコードするcDNAの上流
に結合したものを用いてもよい。
用いられるベクターの具体例としては、例えばpBR32
2、pBR325、pBR327、pBR328、pUC7、pUC8、pUC9、pUC19
などのごときプラスミド、λフアージ、M13フアージな
どのごときフアージ、pHC79（ジーン、11、291、1980
年）などのごときコスミドが例示される。
本発明においては、次いで、第一の組み換えベクター
のプロモーターの下流に日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質を
コードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作
製される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参
照）に従えば良く、例えば第１のベクターのプロモータ
ーの下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利
用して日本脳炎ウイルス由来のcDNA断片を挿入すれば良
い。
これら第一及び第二の組み換えベクターの構築に当た
つては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、
使用するプラスミドベクターも目的に相応しいものであ
る限り特に限定されるものではない。
本発明においては、次に、バキユロウイルスのゲノム
DNAと第二の組み換えベクターを混合したのち、昆虫培
養細胞に移入し、ベクターDNAとウイルスゲノムDNAの間
に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキユロウイルス
を構築する。
ここで用いられる昆虫培養細胞はバキユロウイルスが
増殖可能なものであればよく、その具体例として、例え
ばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperd
a）などが例示される。
組み換えバキユロウイルスの構築に当たつては常法に
従えば良く、例えば特開昭60−37988号の実施例の記述
に準じて以下のごとき手順に従つて実施できる。即ち第
二の組み換えベクターとバキユロウイルスDNAをトラン
スフエクシヨンし、得られる組み換えバキユロウイルス
を含むウイルス集団を回収し、それをL.E.ボルクマンら
（J.Virol 19巻1976年頁820−832）に記載されている標
準的AcNPVポリヘドリンプラークアツセイにかけ、発達
したプラーク群のうちから封入体を生成しないプラーク
を組み換えウイルス候補株として選択し、そのプラーク
からウイルスを採取する。これら候補株の内から日本脳
炎ウイルスのＥ蛋白質をコードするDNA断片が組み込ま
れたウイルスを選択する方法は、該DNAをプローブとす
るハイブリダイゼーシヨン法を利用してプラークを純化
するか、あるいは、日本脳炎ウイルスに対する抗血清又
はモノクローナル抗体を用いるイムノアツセイを利用す
ればよい。
こうして純化した組み換えバキユロウイルスを感染し
やすい昆虫細胞に感染させ、常法に従つて適当な生育条
件下で培養させ、適当な培養時間後、該細胞を集めて破
砕し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当
な方法で回収する。
培養に使用する昆虫細胞はバキユロウイルスが増殖可
能なものであればとくに制限されないが、とくにスポド
プテラ・フルギペルダが好ましい。また適当な培養条件
は予備実験により容易に決定できるが、具体的には10％
ウシ胎児血清を含む培地で、28℃で培養することが望ま
しい。細胞からの発現蛋白質の回収は常法の生化学的な
精製方法であれば、特に限定されないが、日本脳炎ウイ
ルスに対する抗体を使つたアフイニテイクロマトの方法
が好ましい。
以上、本発明について説明したが、本発明の一実施態
様の概略を図示すると第１図に示すとおりである。
かくして本発明によれば、バキユロウイルスの増殖に
非必須なゲノム領域に日本脳炎ウイルス由来のＥ蛋白質
をコードするcDNAがプロモーターの制御下に組み込まれ
た組み換えバキユロウイルスが得られ、この組み換えウ
イルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細胞を培養する
ことにより日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質を得ることがで
きる。このＥ蛋白質はワクチンや診断試薬として有用で
ある。
（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
実施例１ 日本脳炎ウイルスＥ蛋白質をコードするcDNAの作製 （１）日本脳炎ウイルスからのRNAゲノムの抽出蚊由来
株化細胞C6/36（J.Gen.Virol.40 531−544（1978））に
日本脳炎ウイルスSagayama株を感染させ、ウイルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウイルスを精製した。ウイ
ルスゲノムRNA（約11Kbp）は精製ウイルスからフエノー
ル抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離した。
（２）日本脳炎ウイルスのcDNAのクローニング（第２図
参照） （１）で調製したウイルスゲノムRNAにポリ（Ａ）ポ
リメラーゼ（宝酒造）を使つて、ポリ（Ａ）を付加し、
それを鋳型とし、オリゴｄ（Ｔ）をプライマーに用い
て、４種（Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｔ）のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、フアーストスト
ランドcDNAを合成した。次に大腸菌RNaseHと、４種（Ａ
・Ｇ・Ｃ・Ｔ）のデオキシリボヌクレオシド三リン酸と
大腸菌DNAポリメラーゼを使つて二本鎖cDNAを作成し（N
olecular Cloning［ColdSpring Harbor Lab,（1982）］
p.211〜246）、ターミナルトランスフエラーゼでdC鎖を
付加した。一方、プラスミドpUC9（フアルマシア製）を
制限酵素PstIで消化後、ターミナルトランスフエラーゼ
でdG鎖を付加し、これと、前記cDNAを混合し、ライゲー
シヨン反応を行ない環状化した。この組換えプラスミド
を大腸菌HB101コンピテントセルに導入し、形質転換菌
を得た。形質転換菌からプラスミドをとり出し、インサ
ートcDNAの長さをアガロースゲルで比較し、もつとも長
いインサートcDNAについて５′側の配列分析（Gene 19
p.269（1982））をおこなつた。その配列分析の結果よ
り、20−merの合成オリゴヌクレオチド（５′−dATTCCG
TACCATGCAGTCCA−３′）をプライマーとし、ウイルスゲ
ノムRNAを鋳型にして、再度上記の方法でcDNAを作成
し、プラスミドpUC9にライゲーシヨンし、多数の形質転
換菌を得た。得られた形質変換菌の中から目的の表面抗
原蛋白質をコードするcDNAを含む組み換えプラスミドを
含む形質変換菌を以下に述べる方法で選択した。
尚、日本脳炎ウイルスのcDNAクローンの作成方法につ
いては。日本脳炎ウイルスJaOArs982株を使い、同様な
方法で作成した例がGene48 p.195−201（1986）に記載
されている。
（３）日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質をコードするcD
NA（4118）を含む組み換えプラスミドpJE4118のスクリ
ーニング（第２図及び第３図参照） （２）で得られた形質変換菌を寒天プレートで生育さ
せ、ニトロセルロースフイルターにレプリカする。レプ
リカしたフイルターを0.2％NP−40（界面活性剤、半井
化学）でゆるやかに洗浄した後、抗JE血清でイムノスク
リーニングしたところ、弱いながらもポジテイブに反応
する形質転換菌を１株得て、その株が保有するプラスミ
ドをpJE4118とした。次いでプラスミドpJE4118を常法
（Molecular Cloning p75〜95［前記］）に従い調製
し、制限酵素PstIでpUC9に挿入されたcDNAを切り出し、
これをDNAプローブとして、（２）で得た各種形質転換
菌をコロニーハイブリダイゼーシヨン法（Molecular Cl
oning p382〜387［前記］）によつてスクリーニング
し、pJE4118のインサートcDNA（4118）と重なりあうcDN
Aをもつプラスミドを選び出した。そうやつて選び出し
たcDNA（２−20）をプラスミドより回収し、制限酵素で
その位置関係を決定した（第３図参照）ところ、cDNA
（２−20）はcDNA（4118）のＮ末端と部分的に重なり合
つていることが判明した。
（４）表面抗原蛋白質をコードするcDNAの塩基配列の解
明（第４図参照）。
組み換えプラスミドPJE4118と、pJE2−20を制限酵
素、PstIで切断し、それぞれ約2.5Kbp、約1.0KbpのDNA
断片を得た。これらの断片についてM13ファージを用い
るメツシングらの方法（ジーン19、p269（1982）、サイ
エンス241p1205（1981））により、cDNA（4118）の場合
は５′側から、cDNA（２−20）の場合は３′側から配列
分析を行なつた。
その結果、両者が重なり合う部分のcDNA配列は第４図
中の第５番アミノ酸の第３コドンから第116番アミノ酸
までの334塩基である事が判明した。この塩基配列から
推定されるアミノ酸配列と、すでに公知（Science229 7
26−733（1985））である黄熱病ウイルス（日本脳炎ウ
イルスと同属近縁）のＥ蛋白質のアミノ酸配列の比較か
ら、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質は第４図に示す＋１番
目から第500番目のアミノ酸までであると判断された。
同様に、日本脳炎ウイルスのＭ蛋白質は第４図に示す
第−75番目から第−１番目のアミノ酸まで、またPreM蛋
白は第−167番目から第−76番目までと判断された。さ
らに、PreM蛋白質の５′側は日本脳炎ウイルスのＣ蛋白
質の一部をコードしていると判断された。
（５）日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質をコードするcD
NAの作製（第３図及び第４図参照） cDNA（4118）はＥ蛋白質のＮ末端の５アミノ酸が欠け
ている。そこでcDNA（２−20）を用いて、AatIIサイト
の位置でつなぎ合わせて、Ｅ蛋白質を完全にカバーする
cDNA（203）を得た。
次いでcDNA（203）をHindIIIとEcoRVで処理し約2.7Kb
pのcDNA断片（J3）を回収した。この断片はＥ蛋白質を
コードする領域に加えてＭ蛋白質及びPreM蛋白質をコー
ドする領域を含んでいる。
実施例２ バキユロウイルスの増殖に非必須なDNA領域を組み込
んだ第一の組み換えベクターpAcYMS1の作製（第５〜７
図参照） （１）ポリヘドリン遺伝子の３′末端を欠失させたプラ
スミドpAcRP61の作製（第５図参照） 第一の組み換えベクターを構成するために、まずAcNP
V（野性株）のポリヘドリン遺伝子を含むDNA断片をプラ
スミドpUC8のEcoRI部位にクローン化した。AcNPVのDNA
はG.E.スミス及びM.D.サマーズ（Virology 89巻1978年
頁517−527）により説明されているように、ウイルスか
ら抽出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分離
により精製した。次にこのDNAを制限酵素EcoRIにより完
全消化した。7.3KbpのEcoRI−Ｉ断片をアガロースゲル
により回収後、pUC8のEcoRI部位にクローン化してpAcEc
oRI−Ｉを作製した。この組換えプラスミドpAcEcoRI−
Ｉは３個のBamHI認識部位を有する（第５図参照）。１
つは、ポリヘドリン遺伝子中に、１つはEcoRI−Ｉ断片
中にポリヘドリン遺伝子のはるか下流に、及び１つはpU
C8のポリリンカー中におけるものである。後者２つのBa
mHI認識部位は、G.E.スミスら（Molecular and Cellula
r Biology 3巻1983年頁2156−2165）が記載している方
法に準じてpAcEcoRI−Ｉから除去せしめ、pAc101を作成
した。
次にpAc101をポリヘドリン遺伝子中にあるKpnI部位で
切断し、0.5単位のBal31エキソヌクレアーゼで末端から
欠失させていき、その後E.ccli DNAポリメラーゼ（Klen
ow断片）を用いて末端を修復した。プラスミドDNAを精
製し、ホスホリル化BamHIリンカー（５′−pCGGATCCG−
３′）0.5μｇを100μｌ反応混合物中に10単位のT4DNA
リガーゼと共に添加した。室温で２時間インキユベーシ
ヨン後、DNAを精製した。次いで、DNAペレツトを100μ
ｌの反応液中で再びBamHIで消化させた。消化DNAを0.7
％アガロースゲル電気泳動後回収し、精製した。DNAをT
4DNAリガーゼを用いてライゲーシヨン後、大腸菌JM109
細胞を形質転換（アンピシリン耐性）させた。数個の形
質転換株からプラスミドを調製し、各々からEcoRVとHin
fIで切り出される断片をメツシングらの方法（ジーン19
巻1982年p.269）により配列分析を行なつた。この中の
一つが第５図に示すようにポリヘドリン遺伝子の翻訳停
止コドンの下流13番目の塩基まで欠失しているものであ
る事が判明し、これをpAcRP61と命名した（第５図）。
（２）ポリヘドリン遺伝子を欠失させたプラスミドpAcE
1の作製（第６図参照） pAcEcoR1−ＩをBamHIで切断し、0.5単位のBal31エキ
ソヌクレアーゼで末端から欠失させ、その後E.coliDNA
ポリメラーゼ（Klenow断片）を用いて末端を修復した。
プラスミドDNAを精製し、前述のホスホリル化BamHIリン
カーをT4DNAリガーゼと共に反応液に添加した。室温で
２時間インキユベーシヨン後、DNAを精製した。次いでD
NAペレツトを100μｌの反応液中で再びBamHIで消化させ
た。消化DNAを0.7％アガロースゲル電気泳動後回収し、
精製した。DNAをT4DNAリガーゼを用いてライゲーシヨン
後、大腸菌JM109細胞を形質転換させた。数個の形質転
換株からプラスミドを調製し、各々からEcoRVとBamHIで
切り出される断片を配列分析した。多数のプラスミドの
なかからポリヘドリン遺伝子の翻訳開始コドン（ATG）
のＴまでが欠失している断片を含むプラスミドを選択
し、これをpAcE1と命名した（第６図参照）。
（３）第一の組み換えベクターpAcYMS1の作製（第７図
参照） 先のpAcRP61をXhoIとBamHIで切断し、第７図において
矢印で示した長い方の断片を0.7アガロースゲル電気泳
動後回収した。一方、pAcE1をXhoIとBamHIで切断し、第
７図において矢印で示した短い方の断片を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動後回収した。それら２つの断片をT4DN
Aライゲースによつて接続して得たプラスミドをpAcYM1
と命名した。次にpAcYM1をBamHIで切断し、そこにBamHI
−SmaI−BamHIの合成リンカー（５′−pGATCCCCGGG−
３′）を挿入して作製したプラスミドをpAcYMS1と命名
した（第７図参照）。こうして作製したpAcYMS1はEcoRI
−Ｉ断片中にポリヘドリンプロモーター、ポリヘドリン
遺伝子の５′非翻訳領域、BamHI−SmaI−BamHI認識部
位、ポリヘドリン遺伝子の３′非翻訳領域が続いている
ことになる。
実施例３ 日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質をコードするcDNAを挿入し
た第二の組み換えベクターの作製（第８図参照）。
実施例１の（５）で得たcDNA（J3）をE.coliDNAポリ
メラーゼ（Klenow断片）で末端を修復後、制限酵素SmaI
で切断したpAcYMS1とT4DNAリガーゼを使つて接続後、JM
109を形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミ
ドを精製し、pAcYMS1のSmaI部位に、前記cDNA（J3）が
正方向（ポリヘドリンプロモーターの転写方向と同方向
にcDNAの翻訳方向が向いている場合を正方向という）に
挿入されているプラスミドを適当な制限酵素を用いた切
断パターンの結果より選択する。こうして得た第２の組
み換えベクターをpAcYMJ3と命名した。
実施例４ 組み換えバキユロウイルスの作出 F.L.グラハムらの論文（Virology52巻1973年456−467
頁）に記載されている方法に準じ、AcNPVのゲノムDNA 1
μｇを１〜10μｇのpAcYMJ3と混合し、15μg/mlの仔ウ
シ胸腺DNAを含む、 １−HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸）緩衝液（pH7.0）で950μ
ｌにした。混合物をスターラーで撹拌しながら50mlの2.
5M CaCl2を滴下し、沈殿を室温で30分間形成させた。1mlの
沈殿したDNAを昆虫細胞S.フルギペルダに60ml培養プレ
ート内の2mlの培地内において添加した。４時間後、細
胞単相を培地で洗浄し、10％ウシ胎児血清を含む2mlの
培地を加えて、３日間インキユベートした。その後、培
地を滅菌ピペツトで集めるが、この培地中には組み換え
及び非組み換えAcNPVが混じつている。これら混合集団
より、組み換えAcNPVを単離するため、集めた培地を適
当に希釈し、単層培養したS.フルギペルダに感染させ、
プラークを形成せしめた。ウイルス封入体を形成しない
プラークを選び、そのプラークからウイルスを回収し、
これをPBSに懸濁し、一部ドツトハイブリダイゼーシヨ
ンをするため、ナイロン又はニトロセルロースメンブレ
ンにスポツトし、一部は、再びS.フルギペルダに感染さ
せ、ウイルスを増やした。
スポツトしたメンブレンは0.5N NaOHで10分間、1Mト
リス塩酸緩衝液で５分の処理を３回繰返した後、1.5M N
aCl 0.5Mトリス塩酸緩衝液で５分処理した。２倍SSC
（１倍SSC、0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム）
で飽和させ、80℃、２時間焼きつけた。４倍SET（0.6M
NaCl、0.08M Tris−Cl、4mM EDTA（pH7.8））−10倍Den
hardt−0.1％SDSで68℃、２時間処理した。４倍SET−10
倍Denhardt−0.1％SDS−0.1％Na4P2O7−50μg/ml変性サ
ケ精子DNAとニツクトランスレーシヨンによつて32Ｐで
標識した日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質のcDNAを入れて68
℃、14時間ハイブリダイゼーシヨンした。洗浄後、メン
ブレンとＸ線フイルムを重ね、オートラジオグラフイー
を行い、フイルムが黒化するスポツトを選択した。黒化
したスポツトに対応するウイルス液を、再度、適当に希
釈してS.フルギペルダに感染させ、プラークを出現させ
た。出現するプラークについて上記と同様な操作をおこ
ない、出現するプラークが全て、ドツトハイブリダイゼ
ーシヨンで黒化するまで純化の操作をくり返した。こう
して得られたウイルスは目的の組み換えバキユロウイル
スであり、AcJ3と命名した。
実施例５ 組み換えバキユロウイルスによる日本脳炎ウイルスＥ蛋
白質の製造 S.フルギペルダの細胞を単相において５×106細胞/ml
の密度ままで生育させ、生育培地を除去し、細胞当り5
p.f.u.のAcJ3を含む培地を加えて23℃で感染させた。感
染後２日間細胞を培養し、感染細胞内において日本脳炎
ウイルスのＥ蛋白質を発現させた。発現蛋白質の確認は
Ｅ蛋白質に対する抗血清を用いたウエスタンブロツト法
（バーネツト、W.N.Analyt.Biochem.112巻（1981）195
−203頁）でおこなつた。その結果、AcJ3の感染細胞
は、分子量約53000ダルトンの蛋白質を産生しているこ
とが判明した。53000ダルトンという分子量は、日本脳
炎ウイルスのＥ蛋白質のアミノ酸配列（第４図）から推
定される分子量と同一である。
AcJ3に挿入されているcDNA（J3）はＥ以外にPreM,M及
びNS1（非構成蛋白）の一部を含んでいたにも拘らず530
00ダルトンの蛋白質が発現しているということは、感染
細胞で発現した蛋白質が日本脳炎ウイルス本来のＥ蛋白
質と同様なプロセスを受けて、53000ダルトンのＥ蛋白
質になつたと容易に推察される。このAcJ3の感染細胞で
発現させたＥ蛋白質は、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質に
対する抗血清と反応するので、抗原性を有していること
は明らかであり、従つてワクチン・診断試薬となり得る
ものである。感染細胞におけるＥ蛋白質の生産量は、わ
ずか200感染細胞からの抽出液であつてもウエスタンブ
ロツト法で検出できることから相当なレベルのＥ蛋白質
が作られていることが判る。尚、AcJ3のかわりに野性型
バキユロウイルスを同様にS.フルギペルダの細胞に感染
させて、細胞内の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する
蛋白質は認められなかつた。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の操作手順、第２図は日本脳炎ウイルス
のcDNAのクローニング手順、第３図はcDNAの制限酵素サ
イトの位置関係、第４図はＥ蛋白質をコードする領域を
含むcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列、第５図〜第７図
は第一の組み換えベクターpAcYMS1の構築手順、第８図
はＥ蛋白質をコードするcDNAを含む第二の組み換えベク
ターpAcYMJ3の構築手順をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 保井 孝太郎 東京都立川市若葉町２―26―32 (72)発明者 佐藤 隆則 神奈川県横浜市港北区太尾町873 (56)参考文献 特開 昭62−286930（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−37988（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−5787（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バキュロウィルスの増殖に非必須なゲノム
    領域に、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質、プレマト
    リックス蛋白質及びマトリックス蛋白質をコードするcD
    NAを組み込んだ組み換えバキュロウィルスを昆虫細胞に
    感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した日本脳炎ウィ
    ルス表面抗原蛋白質を回収することを特徴とする日本脳
    炎ウィルス表面抗原蛋白質の製造法。
  2. 【請求項２】日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコー
    ドするcDNAが下記のアミノ酸配列又は表面抗原タンパク
    質に対する抗血清と実質的に同一の反応性を有するポリ
    ペプチドをコードするものである特許請求の範囲第１項
    記載の製造法：
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02156896A (ja) * 1988-12-09 1990-06-15 Tokyo Met Gov Shinkei Kagaku Sogo Kenkyusho 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法
FR2665710A1 (fr) * 1990-08-10 1992-02-14 Pasteur Institut Baculovirus recombinant exprimant les proteines e et ns1 de virus appartenant aux flaviviridae ou de virus apparentes aux flaviviridae, applications diagnostiques et therapeutiques.
JPH0499485A (ja) * 1990-08-14 1992-03-31 Norin Suisanshiyou Kachiku Eisei Shikenjo 組換えバキュロウイルス
ATE440957T1 (de) * 1993-09-15 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante alphavirus vektoren
JPH07250127A (ja) * 1994-03-10 1995-09-26 Fujitsu Ltd 送信タイミング調整装置
AUPN503495A0 (en) 1995-08-25 1995-09-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant helicoverpa baculoviruses expressing heterologous DNA
AU778988B2 (en) * 1998-06-04 2004-12-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US7227011B2 (en) * 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US6344337B1 (en) 1999-02-19 2002-02-05 Board Of Trustees Of Michigan State University Antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid
US6307653B1 (en) * 1999-03-24 2001-10-23 Tellium, Inc Optical matrix protection system
WO2000076538A1 (en) 1999-06-10 2000-12-21 Michigan State University Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof
AU7108700A (en) 1999-09-02 2001-03-26 Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
US7419668B1 (en) 1999-09-02 2008-09-02 Board Of Trustees Of Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
ATE526411T1 (de) * 2000-02-16 2011-10-15 Us Gov Health & Human Serv Avirulente, immunogene flavivirus-chimäre
EP2305311A3 (en) 2001-10-10 2011-07-20 BioGeneriX AG Glycoconjugation of peptides
ES2516041T3 (es) 2001-10-10 2014-10-30 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH)
MXPA05010773A (es) 2003-04-09 2005-12-12 Neose Technologies Inc Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos.
EP1742963A2 (en) * 2004-05-04 2007-01-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Synthesis and purification of west nile virus virus-like particles
EP1912665B1 (en) 2005-07-28 2011-01-26 Pfizer Products Inc. Vaccine against feline calicivirus (fcv) comprising a fcv capsid protein or an isolated fcv capsid protein comprising protein sequence seq id no: 13 or protein sequences having at least 95% identity thereto.
SG10201913435TA (en) 2013-03-15 2020-03-30 Takeda Vaccines Inc Compositions and methods for dengue virus chimeric constructs in vaccines
IL281177B2 (en) 2018-09-05 2024-03-01 Takeda Vaccines Inc Dengue fever vaccine unit dose and its administration
US11426461B2 (en) 2018-09-05 2022-08-30 Takeda Vaccines, Inc. Methods for preventing dengue and hepatitis A
US11464815B2 (en) 2018-09-05 2022-10-11 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine unit dose and administration thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE58011B1 (en) * 1983-05-27 1993-06-16 Texas A & M Univ Sys Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4745051A (en) * 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
DK518384A (da) * 1984-01-31 1985-07-01 Idaho Res Found Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse
AU599348B2 (en) * 1985-12-18 1990-07-19 Microgenesys, Inc. Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom
JPH0768267B2 (ja) * 1986-06-05 1995-07-26 財団法人阪大微生物病研究会 フラビウイルス抗原
EP0251467A3 (en) * 1986-06-20 1988-07-20 Abbott Laboratories Compositions and methods of use for a major outer capsid protein (vp7) of rotavirus sa-11
NZ221702A (en) * 1986-09-08 1989-02-24 Bishop David H L Expression of human hepatitis b antigens in insects and cultured insect cells using recombinant baculoviruses
ZA876696B (en) * 1986-09-09 1988-05-25 Genetics Inst Method for producing a heterologous protein in insect cells
IL84154A0 (en) * 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
JPH084508B2 (ja) * 1987-09-16 1996-01-24 国立予防衛生研究所長 組み換えワクチニアウイルス
JPH02156896A (ja) * 1988-12-09 1990-06-15 Tokyo Met Gov Shinkei Kagaku Sogo Kenkyusho 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
FR2631238B1 (fr) 1994-10-28
GB8910381D0 (en) 1989-06-21
GB2218421B (en) 1992-12-02
JPH01285198A (ja) 1989-11-16
GB2218421A (en) 1989-11-15
FR2631238A1 (fr) 1989-11-17
US5229293A (en) 1993-07-20
KR900018373A (ko) 1990-12-21

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