JPH01285198A - 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 - Google Patents
日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は組み換えバキュロウィルスを用いて日本脳炎ウ
ィルスの表面抗原蛋白質を効率よりyJ造する方法に関
する。
ィルスの表面抗原蛋白質を効率よりyJ造する方法に関
する。
(従来の技術)
日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、tIlglなマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予
研株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し
、アルコール・プロタミン法により精製、不活化して不
活化日本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている[国立予
防衛生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂2版(昭
和52年1月20日丸善株式会社発行)]。
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、tIlglなマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予
研株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し
、アルコール・プロタミン法により精製、不活化して不
活化日本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている[国立予
防衛生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂2版(昭
和52年1月20日丸善株式会社発行)]。
このようなワワクシの製造法においては、大量の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えDNA技術によって原核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。日本脳炎
ウィルスの表面抗原蛋白質(以下、E蛋白質と称するこ
とがある)を酵母を宿主とする遺伝子操作によって発現
させようとする試みもなされている(第34回日本ウィ
ルス学会予稿集第91頁昭和61年10月)が、本来の
E蛋白質の産生には成功しなかった。
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えDNA技術によって原核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。日本脳炎
ウィルスの表面抗原蛋白質(以下、E蛋白質と称するこ
とがある)を酵母を宿主とする遺伝子操作によって発現
させようとする試みもなされている(第34回日本ウィ
ルス学会予稿集第91頁昭和61年10月)が、本来の
E蛋白質の産生には成功しなかった。
本発明者らは、最近、生ワクチンとして用いられている
ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルスのE蛋白質をコ
ードするcDNAを組み込んで発現させることに成功し
た。しかし、この組み換えウィルスは生ワクチンとして
有望ではあるが、発現させた蛋白質を回収して、ワクチ
ンや診断試薬として利用するには産生量が少ないという
問題がある。
ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルスのE蛋白質をコ
ードするcDNAを組み込んで発現させることに成功し
た。しかし、この組み換えウィルスは生ワクチンとして
有望ではあるが、発現させた蛋白質を回収して、ワクチ
ンや診断試薬として利用するには産生量が少ないという
問題がある。
一方、昆虫ウィルスベクターを用いて昆虫細胞で外来遺
伝子を発現させる方法が提案されるようになり(特開昭
60−37988号、同61−5787@>。これらの
方法での発現蛋白量は、他の発現系より著しく高いと報
告されている。
伝子を発現させる方法が提案されるようになり(特開昭
60−37988号、同61−5787@>。これらの
方法での発現蛋白量は、他の発現系より著しく高いと報
告されている。
しかしながら、トガウィルス科ワラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−重鎖RNAをゲノム(ウィル
スの遺伝情報を担う本体)とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノシストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、E蛋白質、及び5種類の非構成蛋白質へとプロセッシ
ング(−本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで
切断されて各々の蛋白質ができる事をいう)されるとい
う特徴をもつため、E蛋白質をコードするcDNAをバ
キュロウィルスに組み込んで発現させることは操作上困
難であり、従って、これまでにその発現例については全
く報告されていない。
る日本脳炎ウィルスは、−重鎖RNAをゲノム(ウィル
スの遺伝情報を担う本体)とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノシストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、E蛋白質、及び5種類の非構成蛋白質へとプロセッシ
ング(−本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで
切断されて各々の蛋白質ができる事をいう)されるとい
う特徴をもつため、E蛋白質をコードするcDNAをバ
キュロウィルスに組み込んで発現させることは操作上困
難であり、従って、これまでにその発現例については全
く報告されていない。
(発明が解決しようとする問題点)
そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、日本脳炎
ウィルスE蛋白質を大量に製造する方法の開発を目積し
て鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムR
NAを鋳型としmtJしたcDNAよりE蛋白質をコー
ドする領域を選択し、バキュロウィルスのプロモーター
に連結し、バキュロウィルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込めば、感染昆虫細胞においてワクチンや診断
試薬として利用可能な日本脳炎ウィルスE蛋白質が大量
に発現することを見い出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。
ウィルスE蛋白質を大量に製造する方法の開発を目積し
て鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムR
NAを鋳型としmtJしたcDNAよりE蛋白質をコー
ドする領域を選択し、バキュロウィルスのプロモーター
に連結し、バキュロウィルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込めば、感染昆虫細胞においてワクチンや診断
試薬として利用可能な日本脳炎ウィルスE蛋白質が大量
に発現することを見い出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。
(問題点を解決するための手段)
カクシて本発明によれば、日本脳炎ウィルスのE蛋白質
をコードするcDNAをバキュロウィルスの増殖に非必
須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュロウィルス
を昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した
日本脳炎ウィルスE蛋白質を回収する方法が提供される
。
をコードするcDNAをバキュロウィルスの増殖に非必
須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュロウィルス
を昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した
日本脳炎ウィルスE蛋白質を回収する方法が提供される
。
本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ拳カリフ
オルニカ< AUtOOraDhacaliforni
ca ) 、トリコブルシア◆二(Trichoplu
sia ni ) 、ラキプルシア・オウ(Rachi
plusia ou) 、ガレリア・メOネラ(Gal
leria mellonella ) 、或いはボン
ピツクス・モリ(Boxibyx mori )などが
例示される。これらのウィルスのなかでもオートグラコ
ア・カリフオルニカ(以下、ACNPVと略す)が好適
である。これらのウィルスは従来から広く研究されてき
たものであり、そのサンプルは米国コネチカット州のエ
ール大学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめの多
くの入手源から得ることができる。
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ拳カリフ
オルニカ< AUtOOraDhacaliforni
ca ) 、トリコブルシア◆二(Trichoplu
sia ni ) 、ラキプルシア・オウ(Rachi
plusia ou) 、ガレリア・メOネラ(Gal
leria mellonella ) 、或いはボン
ピツクス・モリ(Boxibyx mori )などが
例示される。これらのウィルスのなかでもオートグラコ
ア・カリフオルニカ(以下、ACNPVと略す)が好適
である。これらのウィルスは従来から広く研究されてき
たものであり、そのサンプルは米国コネチカット州のエ
ール大学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめの多
くの入手源から得ることができる。
また、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
cDNAは、例えば前記中山予研株やJaOAr株(米
国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリサーチ
ユニット) 、5aoaVala株(同所)を用いてW
4製することができる。
cDNAは、例えば前記中山予研株やJaOAr株(米
国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリサーチ
ユニット) 、5aoaVala株(同所)を用いてW
4製することができる。
例えば上記Sagayama株から調製されたE蛋白質
を]−ドするcDNAは第4図に示すごとき全部で15
00塩基対から構成されているが、本発明においては、
[記cDNAと実質的に同一の機能を有する範囲におい
て、修飾されたcDNA (即ち、塩基配列が置換、挿
入、欠失したもの)であってもよい。もちろん、実質的
に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸配列が異なる程
度にI3E飾されたものであってもよい。
を]−ドするcDNAは第4図に示すごとき全部で15
00塩基対から構成されているが、本発明においては、
[記cDNAと実質的に同一の機能を有する範囲におい
て、修飾されたcDNA (即ち、塩基配列が置換、挿
入、欠失したもの)であってもよい。もちろん、実質的
に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸配列が異なる程
度にI3E飾されたものであってもよい。
組み換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウ
ィルスの増殖に非必須なりNA領領域組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。
ィルスの増殖に非必須なりNA領領域組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。
この場合、前記領域にバキュロウィルス内で機能するプ
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な&11限酵素切断配列を有する
合成リンカ−を挿入することが好ましい。
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な&11限酵素切断配列を有する
合成リンカ−を挿入することが好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりNA領領域は、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子(L。
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子(L。
K、ミラーら、サイエンス219巻1983年頁715
〜721)など、外来性DNAの挿入による変異を受け
ても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を言
う。
〜721)など、外来性DNAの挿入による変異を受け
ても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を言
う。
因みにポリヘトリンは、およそ29,000ダルトンの
分子量の蛋白質であり、AcNPVゲノムのEcoRI
−I断片上にその遺伝子が存在する事が示されており(
G、E、スミスらJ。
分子量の蛋白質であり、AcNPVゲノムのEcoRI
−I断片上にその遺伝子が存在する事が示されており(
G、E、スミスらJ。
Virol、 45巻、1983年頁215−225
)、ポリヘトリン遺伝子のDNA配列はG、E、スミス
らの論文(ViroloOV 131巻1983年頁
561−565)に示されている。
)、ポリヘトリン遺伝子のDNA配列はG、E、スミス
らの論文(ViroloOV 131巻1983年頁
561−565)に示されている。
また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、IOKポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、IOKポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
第一の組み換えベクターの作製は常法(例えば特開昭6
0−37988号、同61−5787号など)に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するDNAをバキュロウィルスAC
NPVから単離し、精製する。次いでEcoRIIII
Iaエンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン遺
伝子を含む7.3キロベースEcoRI−I断片及びそ
の他の適当な断片を生成する。上記EcoRI−I断片
を、その後適当なり0−ニングプラスミドのECoRI
部位にクローン化する。
0−37988号、同61−5787号など)に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するDNAをバキュロウィルスAC
NPVから単離し、精製する。次いでEcoRIIII
Iaエンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン遺
伝子を含む7.3キロベースEcoRI−I断片及びそ
の他の適当な断片を生成する。上記EcoRI−I断片
を、その後適当なり0−ニングプラスミドのECoRI
部位にクローン化する。
この系の場合にはポリヘトリン遺伝子のプロモーターが
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
また発現量を増加させるためには、ポリヘトリン遺伝子
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の5′非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの3′非翻
訳領域が続いているベクターを用いることが好ましい。
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の5′非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの3′非翻
訳領域が続いているベクターを用いることが好ましい。
このようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高
くなる事が示されている〈松浦らJ、 gen、 Vi
rol 68巻1987年頁1233−1250)。
くなる事が示されている〈松浦らJ、 gen、 Vi
rol 68巻1987年頁1233−1250)。
ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質等にわかれる。
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質等にわかれる。
従って、全ウィルスゲノムに対するcDNAを挿入すれ
ば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入す
る必要はない。また挿入するcDNAがE蛋白質をコー
ドする領域に加え、その上流に翻訳開始コドンになりう
る配列(例えばATG>を有する場合にも同様である。
ば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入す
る必要はない。また挿入するcDNAがE蛋白質をコー
ドする領域に加え、その上流に翻訳開始コドンになりう
る配列(例えばATG>を有する場合にも同様である。
しかし、E蛋白質をコードするcDNAのみを組み込も
うとするときはプロモーターの下流に存在する制限酵素
切断点を利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び
両者間に制限酵素切断配列を有する合成リンカ−を組み
込むことが必要である。
うとするときはプロモーターの下流に存在する制限酵素
切断点を利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び
両者間に制限酵素切断配列を有する合成リンカ−を組み
込むことが必要である。
挿入する翻訳終止コドンは、E蛋白質をコードするcD
NAの読み取り枠がいずれであっても合致するように読
み取り枠をずらせて3ケ所に設けることが望ましい。
NAの読み取り枠がいずれであっても合致するように読
み取り枠をずらせて3ケ所に設けることが望ましい。
挿入するcDNAはE蛋白質をコードする領域を含むも
のであればその他に他の蛋白質をコードするWA域を含
むものであってもよい。ワラビウィルス属に属するウィ
ルスについては、E蛋白質をコードする領域の上流にマ
トリックス蛋白質(以下M蛋白質と称する)、プレマト
リックス蛋白質(以下PreM蛋白質と称する)、コア
蛋白質く以下C蛋白質と称する)をコードする領域が存
在しているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコー
ドするcDNAの全部又は一部がE蛋白質をコードする
cDNAの上流に結合したものを用いてもよい。
のであればその他に他の蛋白質をコードするWA域を含
むものであってもよい。ワラビウィルス属に属するウィ
ルスについては、E蛋白質をコードする領域の上流にマ
トリックス蛋白質(以下M蛋白質と称する)、プレマト
リックス蛋白質(以下PreM蛋白質と称する)、コア
蛋白質く以下C蛋白質と称する)をコードする領域が存
在しているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコー
ドするcDNAの全部又は一部がE蛋白質をコードする
cDNAの上流に結合したものを用いてもよい。
用いられるベクターの具体例としては、例えばDBR3
22、DBR325、pBR327、pBR328、E
)UO3、pucs、pUC9、pUC19などのごと
きプラスミド、λファージ、M13ファージなどのごと
きファージ、pH079(ジーン、11.29L 19
80年)などのごときコスミドが例示される。
22、DBR325、pBR327、pBR328、E
)UO3、pucs、pUC9、pUC19などのごと
きプラスミド、λファージ、M13ファージなどのごと
きファージ、pH079(ジーン、11.29L 19
80年)などのごときコスミドが例示される。
本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスのE蛋白質をコ
ードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作製
される。挿入方法もまた常法(例えば前記各公報参照)
に従えば良く、例えば第1のベクターのプロモーターの
下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利用し
て日本脳炎ウィルス由来のcDNA断片を挿入すれば良
い。
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスのE蛋白質をコ
ードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作製
される。挿入方法もまた常法(例えば前記各公報参照)
に従えば良く、例えば第1のベクターのプロモーターの
下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利用し
て日本脳炎ウィルス由来のcDNA断片を挿入すれば良
い。
これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
本発明においては、次に、バキュロウィルスのゲノムD
NAと第二の組み換えベクターを混合したのち、昆虫培
養細胞に移入し、ベクターDNAとウィルスゲノムDN
Aの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウ
ィルスを構築する。
NAと第二の組み換えベクターを混合したのち、昆虫培
養細胞に移入し、ベクターDNAとウィルスゲノムDN
Aの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウ
ィルスを構築する。
ここで用いられる昆虫培養細胞はバキュロウィルスが増
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda )などが例示される。
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera
frugiperda )などが例示される。
組み換えバキュロウィルスの構築に当たっては常法に従
えば良く、例えば特開昭60−37988号の実施例の
記述に準じて以下のごとき手順に従って実施できる。即
ち第二の組み換えベクターとバキュロウィルスDNAを
トランスフェクションし、得られる組み換えバキュロウ
ィルスを含むウィルス集団を回収し、それをり、E、ボ
ルフマンら(J、 Virol 19巻1976年頁
820−832)に記載されている標準的AcNPVポ
リへドリンプラークアツセイにかけ、発達したプラーク
群のうちから封入体を生成しないプラークを組み換えウ
ィルス候補株として選択し、そのプラークからウィルス
を採取する。これら候補株の内から日本脳炎ウィルスの
E蛋白質をコードするDNA断片が組み込まれたウィル
スを選択する方法は、該DNAをプローブとするパイプ
リダイゼーション法を利用してプラークを純化するか、
あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血清又はモノク
ローナル抗体を用いるイムノアッセイを利用すればよい
。
えば良く、例えば特開昭60−37988号の実施例の
記述に準じて以下のごとき手順に従って実施できる。即
ち第二の組み換えベクターとバキュロウィルスDNAを
トランスフェクションし、得られる組み換えバキュロウ
ィルスを含むウィルス集団を回収し、それをり、E、ボ
ルフマンら(J、 Virol 19巻1976年頁
820−832)に記載されている標準的AcNPVポ
リへドリンプラークアツセイにかけ、発達したプラーク
群のうちから封入体を生成しないプラークを組み換えウ
ィルス候補株として選択し、そのプラークからウィルス
を採取する。これら候補株の内から日本脳炎ウィルスの
E蛋白質をコードするDNA断片が組み込まれたウィル
スを選択する方法は、該DNAをプローブとするパイプ
リダイゼーション法を利用してプラークを純化するか、
あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血清又はモノク
ローナル抗体を用いるイムノアッセイを利用すればよい
。
こうして純化した組み換えバキュロウィルスを感染しや
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間侵、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間侵、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。
培養に使用する昆虫細胞はバキュロウィルスが増殖可能
なものであればとくに制限されないが、とくにスボドプ
テラ・フルギベルダが好ましい。
なものであればとくに制限されないが、とくにスボドプ
テラ・フルギベルダが好ましい。
また適当な培養条件は予備実験により容易に決定できる
が、具体的には10%ウシ胎児血清を含む培地で、28
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。
が、具体的には10%ウシ胎児血清を含む培地で、28
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。
以上、本発明について説明したが、本発明の−実施B様
の概略を図示すると第1図に示すとおりである。
の概略を図示すると第1図に示すとおりである。
かくして本発明によれば、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来のE蛋白質を
コードするcDNAがプロモーターの制御下に組み込ま
れた組み換えバキュロウィルスが得られ、この組み換え
ウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細胞を培養す
ることにより日本脳炎ウィルスのE蛋白質を得ることが
できる。
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来のE蛋白質を
コードするcDNAがプロモーターの制御下に組み込ま
れた組み換えバキュロウィルスが得られ、この組み換え
ウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細胞を培養す
ることにより日本脳炎ウィルスのE蛋白質を得ることが
できる。
このE蛋白質はワクチンや診断試薬として有用である。
(実施例)
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例1
日本脳炎ウィルスE蛋白質をコードするcDNAの作製
(1) 日本脳炎ウィルスからのRNAゲノムの抽出
蚊由来株化細胞C6/ 36 (J、 Gen、 Vi
rol。
蚊由来株化細胞C6/ 36 (J、 Gen、 Vi
rol。
1追 531−544 (1978))に日本脳炎ウィ
ルス5alllaVala株を感染させ、ウィルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィ
ルスゲノムRNA (約11Kbp)は精製ウィルスか
らフェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離
した。
ルス5alllaVala株を感染させ、ウィルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィ
ルスゲノムRNA (約11Kbp)は精製ウィルスか
らフェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離
した。
(り 日本脳炎ウィルスのcDNAのクローニング(第
2図参照) (1)でII@iL、たウィルスゲノムRNAにポリ(
A)ポリメラーゼ(宝酒造)を使って、ポリ(A)を付
加し、それを鋳型とし、オリゴd (T>をプライマー
に用いて、4種(A−G−C4T)のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファース
トストランドcDNAを合成した。次に大腸菌RNas
eHと、41!!(A−G・C−T)のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸と大11i1DNAポリメラーゼを
使って二本鎖cDNAを作成しくMo1ecular
C1onin<l [ColdSpring Har
bor jab 、 (1982) 1g)、211
〜246)、ターミナルトランスフェラーゼでdG鎖を
付加した。一方、プラスミドpLJC9(ファルマシア
製)を制限酵素PStIで消化後、ターミナルトランス
フェラーゼでdG[を付加し、これと、前記cDNAを
混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した。この
組換えプラスミドを大腸菌HB101コンピテントセル
に導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌からプラスミ
ドをとり出し、インサートcDNAの長さをアガロース
ゲルで比較し、もつとも長いインサートcDNAについ
て5′側の配列分析(Gene 19 D、269
(1982))をおこなった。その配列分析の結果より
、2O−ffLerの合成オリゴヌクレオチド(5’
−dATTCCGTACCATGCAGTCCA −3
’ )をプライマーとし、ウィルスゲノムRNAを鋳型
にして、再度上記の方法でcDNAを作成し、プラスミ
ドpUc9にライゲーションし、多数の形質転換菌を得
た。得られた形質転換菌の中から目的の表面抗原蛋白質
をコードするcDNAを含む組み換えプラスミドを含む
形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
2図参照) (1)でII@iL、たウィルスゲノムRNAにポリ(
A)ポリメラーゼ(宝酒造)を使って、ポリ(A)を付
加し、それを鋳型とし、オリゴd (T>をプライマー
に用いて、4種(A−G−C4T)のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファース
トストランドcDNAを合成した。次に大腸菌RNas
eHと、41!!(A−G・C−T)のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸と大11i1DNAポリメラーゼを
使って二本鎖cDNAを作成しくMo1ecular
C1onin<l [ColdSpring Har
bor jab 、 (1982) 1g)、211
〜246)、ターミナルトランスフェラーゼでdG鎖を
付加した。一方、プラスミドpLJC9(ファルマシア
製)を制限酵素PStIで消化後、ターミナルトランス
フェラーゼでdG[を付加し、これと、前記cDNAを
混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した。この
組換えプラスミドを大腸菌HB101コンピテントセル
に導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌からプラスミ
ドをとり出し、インサートcDNAの長さをアガロース
ゲルで比較し、もつとも長いインサートcDNAについ
て5′側の配列分析(Gene 19 D、269
(1982))をおこなった。その配列分析の結果より
、2O−ffLerの合成オリゴヌクレオチド(5’
−dATTCCGTACCATGCAGTCCA −3
’ )をプライマーとし、ウィルスゲノムRNAを鋳型
にして、再度上記の方法でcDNAを作成し、プラスミ
ドpUc9にライゲーションし、多数の形質転換菌を得
た。得られた形質転換菌の中から目的の表面抗原蛋白質
をコードするcDNAを含む組み換えプラスミドを含む
形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
尚、日本脳炎ウィルスのcDNAクローンの作成方法に
ついては、日本脳炎ウィルスJaOArS 982株を
使い、同様な方法で作成した例がcene且 D、19
5−201 (1986)に記載されている。
ついては、日本脳炎ウィルスJaOArS 982株を
使い、同様な方法で作成した例がcene且 D、19
5−201 (1986)に記載されている。
(3) 日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質をコードす
るcDNA(4118)を含む組み換えプラスミドpJ
E4118のスクリーニング〈第2図及び第3図参照) (2)で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニドOセルO−スフイルターにレプリカする。レプリ
カしたフィルターを0.2%NP−40(界面活性剤、
半片化学)でゆるやかに洗浄した後、抗JEIlh清で
イムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジテ
ィブに反応する形質転換菌を1株得て、その株が保有す
るプラスミドをpJE4118とした。次いでプラスミ
ドpJE4118を常法(Molecular C1o
nino D7S 〜95[前記])に従い調製し、制
限酵素PStIでpUC9に挿入されたcDNAを切り
出し、これをDNAプローブとして、(2)で得た各種
形質転換菌をコロニーハイプリダイビーシコン法(Mo
lecular Cl0ninl) p382〜387
[前記])によってスクリーニングし、E)JE41
18のインサートcDNA(4118)と重なりあうc
DNAをもつプラスミドを選び出した。そうやって選び
出したcDNA (2−20)をプラスミドより回収し
、ill限酵素でその位置関係を決定した(第3図参照
)ところ、cDNA (2−20)はcDNA (41
18)のN末端と部分的に重なり合っていることが判明
した。
るcDNA(4118)を含む組み換えプラスミドpJ
E4118のスクリーニング〈第2図及び第3図参照) (2)で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニドOセルO−スフイルターにレプリカする。レプリ
カしたフィルターを0.2%NP−40(界面活性剤、
半片化学)でゆるやかに洗浄した後、抗JEIlh清で
イムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジテ
ィブに反応する形質転換菌を1株得て、その株が保有す
るプラスミドをpJE4118とした。次いでプラスミ
ドpJE4118を常法(Molecular C1o
nino D7S 〜95[前記])に従い調製し、制
限酵素PStIでpUC9に挿入されたcDNAを切り
出し、これをDNAプローブとして、(2)で得た各種
形質転換菌をコロニーハイプリダイビーシコン法(Mo
lecular Cl0ninl) p382〜387
[前記])によってスクリーニングし、E)JE41
18のインサートcDNA(4118)と重なりあうc
DNAをもつプラスミドを選び出した。そうやって選び
出したcDNA (2−20)をプラスミドより回収し
、ill限酵素でその位置関係を決定した(第3図参照
)ところ、cDNA (2−20)はcDNA (41
18)のN末端と部分的に重なり合っていることが判明
した。
(4) 表面抗原蛋白質をコードするcDNAの塩基
配列の解明(第4図参照)。
配列の解明(第4図参照)。
組み換えプラスミドE)JE4118と、DJE2−2
0をIII限醇素、PSt工で切断し、それぞれ約2.
5Kbp、約1.0KbpのDNA断片を得た。これら
の断片についてM13ファージを用いるメツシングらの
方法(ジーン19、p269(1982)、サイエンス
241 E)1205(1981))により、cDNA
(4118)の場合は5′側から、cDNA (2−2
0>の場合は3′側から配列分析を行なった。
0をIII限醇素、PSt工で切断し、それぞれ約2.
5Kbp、約1.0KbpのDNA断片を得た。これら
の断片についてM13ファージを用いるメツシングらの
方法(ジーン19、p269(1982)、サイエンス
241 E)1205(1981))により、cDNA
(4118)の場合は5′側から、cDNA (2−2
0>の場合は3′側から配列分析を行なった。
その結果、両者が重なり合う部分のcDNA配列は第4
図中の第5番アミノ酸の第3コドンから第116番アミ
ノ酸までの334塩暴である事が判明した。この塩基配
列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知(Sci
ence 229 726−733 (1985))で
ある黄熱病ウィルス(日本脳炎ウィルスと部属近縁)の
E蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィルス
のE蛋白質は第4図に示す+1番目から第500番目の
アミノ酸までであると判断された。
図中の第5番アミノ酸の第3コドンから第116番アミ
ノ酸までの334塩暴である事が判明した。この塩基配
列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知(Sci
ence 229 726−733 (1985))で
ある黄熱病ウィルス(日本脳炎ウィルスと部属近縁)の
E蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィルス
のE蛋白質は第4図に示す+1番目から第500番目の
アミノ酸までであると判断された。
同様に、日本脳炎ウィルスのM蛋白質は第4図に示す第
一75番目から第一1番目のアミノ酸まで、またPre
M蛋白質は第一16767番目第一76番目までと判断
された。さらに、PreM蛋白質の5′側は日本脳炎ウ
ィルスのC蛋白質の一部をコードしていると判断された
。
一75番目から第一1番目のアミノ酸まで、またPre
M蛋白質は第一16767番目第一76番目までと判断
された。さらに、PreM蛋白質の5′側は日本脳炎ウ
ィルスのC蛋白質の一部をコードしていると判断された
。
(5) 日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質をコードす
るcDNAの作製(第3図及び第4図参照)cDNA
(4118)はE蛋白質のN末端の5アミノ酸が欠けて
いる。そこでcDNA (2−20)を用いて、Aat
l[サイトの位置でつなぎ合わせて、E蛋白質を完全に
カバーするcDNA(203)を得た。
るcDNAの作製(第3図及び第4図参照)cDNA
(4118)はE蛋白質のN末端の5アミノ酸が欠けて
いる。そこでcDNA (2−20)を用いて、Aat
l[サイトの位置でつなぎ合わせて、E蛋白質を完全に
カバーするcDNA(203)を得た。
次いでcDNA (203>を)l i ndlとEC
0RVt’処理し約2.7Kbp(7)cDNA断片(
J3)を回収した。この断片はE蛋白質をコードする領
域に加えてM蛋白質及びpreM@白賀をコードする領
域を含んでいる。
0RVt’処理し約2.7Kbp(7)cDNA断片(
J3)を回収した。この断片はE蛋白質をコードする領
域に加えてM蛋白質及びpreM@白賀をコードする領
域を含んでいる。
実施例2
バキュロウィルスの増殖に非必須なりNA領領域組み込
んだ第一の組み換えベクター 1)ACYMSlの作yJ(第5〜7図参照)(1)
ポリヘトリン遺伝子の3′末端を欠失させたプラスミ
ドDACRP61の作製(第5図参照)第一の組み換え
ベクターを構成するために、まずAcNPV (野性株
)のポリヘトリン遺伝子を含むDNAll1片をプラス
ミドE)UO3のECoRI部位にり0−ン化した。A
CNPVのDNAはG、E、スミス及びM、D、サマー
ズ(ViroloOy 89巻1978年頁517−
527)により説明されているように、ウィルスから抽
出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分離によ
り精製した。次にこのDNAを制限酵素E CO,RI
により完全消化した。7.3KbpのEcoRI−I断
片をアガロースゲルにより回収後、pLIc8のECo
RI部位にりO−ン化してpAcEcoRI−Iを作製
した。この組換えプラスミドE)ACECORI−Iは
3個のBamHII!識部位を有する(第5図参照)。
んだ第一の組み換えベクター 1)ACYMSlの作yJ(第5〜7図参照)(1)
ポリヘトリン遺伝子の3′末端を欠失させたプラスミ
ドDACRP61の作製(第5図参照)第一の組み換え
ベクターを構成するために、まずAcNPV (野性株
)のポリヘトリン遺伝子を含むDNAll1片をプラス
ミドE)UO3のECoRI部位にり0−ン化した。A
CNPVのDNAはG、E、スミス及びM、D、サマー
ズ(ViroloOy 89巻1978年頁517−
527)により説明されているように、ウィルスから抽
出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分離によ
り精製した。次にこのDNAを制限酵素E CO,RI
により完全消化した。7.3KbpのEcoRI−I断
片をアガロースゲルにより回収後、pLIc8のECo
RI部位にりO−ン化してpAcEcoRI−Iを作製
した。この組換えプラスミドE)ACECORI−Iは
3個のBamHII!識部位を有する(第5図参照)。
1つは、ポリヘトリン遺伝子中に、1つはEcoRI−
I断片中にポリヘトリン遺伝子のはるか下流に、及び1
つはoLJC8のポリリンカー中におけるものである。
I断片中にポリヘトリン遺伝子のはるか下流に、及び1
つはoLJC8のポリリンカー中におけるものである。
後者2つのBamHI認識部位は、G、E、スミスら(
Mo1ecular andCellular aio
IOoy 3巻1983年頁2156−2165>が
記載している方法に準じてDACECORI−Iから除
去せしめ、pAClolを作成した。
Mo1ecular andCellular aio
IOoy 3巻1983年頁2156−2165>が
記載している方法に準じてDACECORI−Iから除
去せしめ、pAClolを作成した。
次にpAClolをポリヘトリン遺伝子中にあるKpn
I部位で切断し、0.5単位のBaj31エキソヌクレ
アーゼで末端から欠失させていき、その後E、C01i
DNAポリメラーゼ(にlenow断片)を用いて
末端を修復した。プラスミドDNAを精製し、ホスホリ
ル化3amHIリンカ−(5’−pcGGATccG−
3 ’ )0.5μびを100μ1反応混合物中に10
単位の74DNAリガーゼと共に添加した。室温で2時
間インキュベーション後、DNAを精製した。
I部位で切断し、0.5単位のBaj31エキソヌクレ
アーゼで末端から欠失させていき、その後E、C01i
DNAポリメラーゼ(にlenow断片)を用いて
末端を修復した。プラスミドDNAを精製し、ホスホリ
ル化3amHIリンカ−(5’−pcGGATccG−
3 ’ )0.5μびを100μ1反応混合物中に10
単位の74DNAリガーゼと共に添加した。室温で2時
間インキュベーション後、DNAを精製した。
次いで、DNAベレットを100μオの反応液中で再び
BamHIで消化させた。消化DNAを0.7%アガロ
ースゲル電気泳動後回収し、精製した。DNA@T4D
NAリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌JM1
09細胞を形質転換(アンピシリン耐性)させた。数個
の形質転換株からプラスミドを調製し、各々からEC0
RVとHinfIで切り出される断片をメツシングらの
方法(ジーン19巻1982年9.269 )により配
列分析を行なった。この中の一つが第5図に示すように
ポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流13番目の
塩基まで欠失しているものである事が判明し、これをp
AcRP61と命名した(第5図)。
BamHIで消化させた。消化DNAを0.7%アガロ
ースゲル電気泳動後回収し、精製した。DNA@T4D
NAリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌JM1
09細胞を形質転換(アンピシリン耐性)させた。数個
の形質転換株からプラスミドを調製し、各々からEC0
RVとHinfIで切り出される断片をメツシングらの
方法(ジーン19巻1982年9.269 )により配
列分析を行なった。この中の一つが第5図に示すように
ポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流13番目の
塩基まで欠失しているものである事が判明し、これをp
AcRP61と命名した(第5図)。
(2) ポリヘトリン遺伝子を欠失させたプラスミド
DACEIの作製(第6図参照) pAcEcoRl−IをBamHIで切断し、0.51
位のBaJ31エキソヌクレアーゼで末端から欠失させ
、その後E、co l i DNAポリメラーゼ(KI
enO’ll断片)を用いて末端を修復した。
DACEIの作製(第6図参照) pAcEcoRl−IをBamHIで切断し、0.51
位のBaJ31エキソヌクレアーゼで末端から欠失させ
、その後E、co l i DNAポリメラーゼ(KI
enO’ll断片)を用いて末端を修復した。
プラスミドDNAを精製し、前述のホスホリル化Bam
HIリンカ−をT4DNAリガーゼと共に反応液に添加
した。室温で2時間インキュベーション後、DNAを精
製した。次いでDNAベレットを100μオの反応液中
で再びBamHIで消化させた。消化DNAを0.7%
アガロースゲル電気泳動後回収し、精製した。DNAを
T4DNAリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌
JM109細胞を形質転換させた。数個の形質転換株か
らプラスミドを調製し、各々からEC0RVと3μmH
Iで切り出される断片を配列分析した。多数のプラスミ
ドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドン(A
TG)の王までが欠失している断片を含むプラスミドを
選択し、これをpAcElと命名した(第6図参照)。
HIリンカ−をT4DNAリガーゼと共に反応液に添加
した。室温で2時間インキュベーション後、DNAを精
製した。次いでDNAベレットを100μオの反応液中
で再びBamHIで消化させた。消化DNAを0.7%
アガロースゲル電気泳動後回収し、精製した。DNAを
T4DNAリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌
JM109細胞を形質転換させた。数個の形質転換株か
らプラスミドを調製し、各々からEC0RVと3μmH
Iで切り出される断片を配列分析した。多数のプラスミ
ドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドン(A
TG)の王までが欠失している断片を含むプラスミドを
選択し、これをpAcElと命名した(第6図参照)。
(3) 第一の組み換えベクターDACYMS1の作
製(第7図参照) 先のDACRP61をXhoIと3μmHIt’切断し
、第7図において矢印で示した長い方の断片を0.7%
アガロースゲル電気泳動後回収した。
製(第7図参照) 先のDACRP61をXhoIと3μmHIt’切断し
、第7図において矢印で示した長い方の断片を0.7%
アガロースゲル電気泳動後回収した。
一方、pACElをXhoIとBamHIで切断し、第
7図において矢印で示した短い方の断片を0.7%アガ
ロースゲル電気泳動後回収した。それら2つの断片を7
4DNAライゲースによって接続して得たプラスミドを
E)ACYMIと命名した。次にpACYMlをBam
HIで切断し、そこにBamHI−8maI−BamH
Iの合成リンカ−(5’ −DGATCCCCGGG
−3’ )を挿入して作製したプラスミドをpACYM
Slと命名した(第7図参照)。こうして作製したpA
CVMSlはEC0RI−I断片中にポリへドリンプロ
モーター、ポリヘトリン遺伝子の5′非翻訳領域、Ba
mHI−8maI−BamHI認識部位、ポリヘトリン
遺伝子の3′非翻訳領域が続いていることになる。
7図において矢印で示した短い方の断片を0.7%アガ
ロースゲル電気泳動後回収した。それら2つの断片を7
4DNAライゲースによって接続して得たプラスミドを
E)ACYMIと命名した。次にpACYMlをBam
HIで切断し、そこにBamHI−8maI−BamH
Iの合成リンカ−(5’ −DGATCCCCGGG
−3’ )を挿入して作製したプラスミドをpACYM
Slと命名した(第7図参照)。こうして作製したpA
CVMSlはEC0RI−I断片中にポリへドリンプロ
モーター、ポリヘトリン遺伝子の5′非翻訳領域、Ba
mHI−8maI−BamHI認識部位、ポリヘトリン
遺伝子の3′非翻訳領域が続いていることになる。
実施例3
日本脳炎ウィルスのE蛋白質をコードするcDNAを挿
入した第二の組み換えベクターの作製(第8図参照)。
入した第二の組み換えベクターの作製(第8図参照)。
実施例1の(5)テ得たcDNA (J3)をE、C0
1iDNAポリメラーゼ(KlenOWIi片)で末端
を修vI後、制限酵素SmaIで切断したDACYMS
IとT4DNAリガーゼを使って接続後、JM109を
形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミドを精
製し、pACYMSIのSmaI部位に、前記cDNA
(J3)が正方向(ポリへドリンプロモーターの転写
方向と同方向にcDNAの翻訳方向が向いている場合を
正方向という)に挿入されているプラスミドを適当な制
限酵素を用いた切断パターンの結果より選択する。こう
して得た第2の組み換えベクターをpACYMJ3と命
名した。
1iDNAポリメラーゼ(KlenOWIi片)で末端
を修vI後、制限酵素SmaIで切断したDACYMS
IとT4DNAリガーゼを使って接続後、JM109を
形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミドを精
製し、pACYMSIのSmaI部位に、前記cDNA
(J3)が正方向(ポリへドリンプロモーターの転写
方向と同方向にcDNAの翻訳方向が向いている場合を
正方向という)に挿入されているプラスミドを適当な制
限酵素を用いた切断パターンの結果より選択する。こう
して得た第2の組み換えベクターをpACYMJ3と命
名した。
実施例4
組み換えバキュロウィルスの作出
F、L、グラハムらの論文(VirolooV52巻1
973年456−467頁)に記載されている方法に準
じ、AcNPVのゲノムDNA 1μグを1〜10μ
りのpACYMJ3と混合し、15μg/I11の仔ウ
シ胸腺DNAを含む、1−HEPES (N−2−ヒト
Oキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸
)緩衝液(DH7,0)で950μオにした。混合物を
スターラーで撹拌しながら50mの2.5MCa G
12を滴下し、沈殿を室温で30分間形成させた。1d
の沈殿したDNAを昆虫綱rIIS、フルギペルダに6
0m培養プレート内の2mの培地内において添加した。
973年456−467頁)に記載されている方法に準
じ、AcNPVのゲノムDNA 1μグを1〜10μ
りのpACYMJ3と混合し、15μg/I11の仔ウ
シ胸腺DNAを含む、1−HEPES (N−2−ヒト
Oキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸
)緩衝液(DH7,0)で950μオにした。混合物を
スターラーで撹拌しながら50mの2.5MCa G
12を滴下し、沈殿を室温で30分間形成させた。1d
の沈殿したDNAを昆虫綱rIIS、フルギペルダに6
0m培養プレート内の2mの培地内において添加した。
4時間後、細胞単相を培地で洗浄し、10%ウシ胎児血
清を含む2I11の培地を加えて、3日間インキュベー
トした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、この
培地中には組み換え及び非組み換えAcNPVが混じっ
ている。これら混合集団より、組み換えACNPVを単
離するため、集めた培地を適当に希釈し、単層培養した
S、フルギベルダに感染させ、プラークを形成せしめた
。ウィルス封入体を形成しないプラークを選び、そのプ
ラークからウィルスを回収し、これをPBSに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイゼーションをするため、ナイ
ロン又はニトロセルロースメンプレンにスポットし、一
部は、再びS、フルギベルダに感染させ、ウィルスを増
やした。
清を含む2I11の培地を加えて、3日間インキュベー
トした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、この
培地中には組み換え及び非組み換えAcNPVが混じっ
ている。これら混合集団より、組み換えACNPVを単
離するため、集めた培地を適当に希釈し、単層培養した
S、フルギベルダに感染させ、プラークを形成せしめた
。ウィルス封入体を形成しないプラークを選び、そのプ
ラークからウィルスを回収し、これをPBSに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイゼーションをするため、ナイ
ロン又はニトロセルロースメンプレンにスポットし、一
部は、再びS、フルギベルダに感染させ、ウィルスを増
やした。
スポットしたメンブレンは0.5N NaOHで10
分間、1Mトリス塩1’!!緩衝液で5分の処理を3回
繰返した後、1.5M NaG1 0.5Mトリス塩
flllil液で5分処理した。2倍5SC(1倍88
G、0.15M NaCJ、0.015M クエン
酸ナトリウム〉で飽和させ、80℃、2時間焼きつけた
。4倍SET (0,6M NaCj、0.08M
Tris−CI、4mM EDTA(pH7,8)
)−io倍Denhardt−〇、1%SDSで68℃
、2時間処理した。4倍5ET−10倍0enhard
t−0,1%5DS−0,1%Na4P20.−50μ
9/me変性サケ精子DNAとニックトランスレーショ
ンによって32Pで標識した日本脳炎ウィルスのE蛋白
質のcDNAを入れて68℃、14時間ハイブリダイゼ
ーションした。洗浄後、メンブレンとX線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
ィルス液を、再度、適当に希釈してS、フルギベルダに
感染させ、プラークを出現させた。出現するプラークに
ついて上記と同様な操作をおこない、出現するプラーク
が全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒化するまで
純化の操作をくり返した。こうして得られたウィルスは
目的の組み換えバキュロウィルスであり、AcJ3と命
名した。
分間、1Mトリス塩1’!!緩衝液で5分の処理を3回
繰返した後、1.5M NaG1 0.5Mトリス塩
flllil液で5分処理した。2倍5SC(1倍88
G、0.15M NaCJ、0.015M クエン
酸ナトリウム〉で飽和させ、80℃、2時間焼きつけた
。4倍SET (0,6M NaCj、0.08M
Tris−CI、4mM EDTA(pH7,8)
)−io倍Denhardt−〇、1%SDSで68℃
、2時間処理した。4倍5ET−10倍0enhard
t−0,1%5DS−0,1%Na4P20.−50μ
9/me変性サケ精子DNAとニックトランスレーショ
ンによって32Pで標識した日本脳炎ウィルスのE蛋白
質のcDNAを入れて68℃、14時間ハイブリダイゼ
ーションした。洗浄後、メンブレンとX線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
ィルス液を、再度、適当に希釈してS、フルギベルダに
感染させ、プラークを出現させた。出現するプラークに
ついて上記と同様な操作をおこない、出現するプラーク
が全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒化するまで
純化の操作をくり返した。こうして得られたウィルスは
目的の組み換えバキュロウィルスであり、AcJ3と命
名した。
実施例5
組み換えバキュロウィルスによる日本脳炎ウィルスE蛋
白質の製造 S、フルギベルダの細胞を単相において5×106細胞
/Idの密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当
り5 p、 f、u、のACJ3を含む培地を加えて2
3℃で感染させた。感染後2日間細胞を培養し、感染細
胞内において日本脳炎ウィルスのE蛋白質を発現させた
。発現蛋白質の確認はE蛋白質に対する抗血清を用いた
ウェスタンプロット法(バーネットj1.H,^na+
yt、 BiOChem、112巻(1981)195
−203頁)でおこなった。その結果、ACJ3の感染
細胞は、分子量的53000ダルトンの蛋白質を産生じ
ていることが判明した。53000ダルトンという分子
量は、日本脳炎ウィルスのE蛋白質のアミノ酸配列(第
4図)から推定される分子量と同一である。
白質の製造 S、フルギベルダの細胞を単相において5×106細胞
/Idの密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当
り5 p、 f、u、のACJ3を含む培地を加えて2
3℃で感染させた。感染後2日間細胞を培養し、感染細
胞内において日本脳炎ウィルスのE蛋白質を発現させた
。発現蛋白質の確認はE蛋白質に対する抗血清を用いた
ウェスタンプロット法(バーネットj1.H,^na+
yt、 BiOChem、112巻(1981)195
−203頁)でおこなった。その結果、ACJ3の感染
細胞は、分子量的53000ダルトンの蛋白質を産生じ
ていることが判明した。53000ダルトンという分子
量は、日本脳炎ウィルスのE蛋白質のアミノ酸配列(第
4図)から推定される分子量と同一である。
ACJ3に挿入されているcDNA (J3)はE以外
にPreM、M及びNS1 (非構成蛋白)の一部を含
んでいたにも拘らず53000ダルトンの蛋白質が発現
しているということは、感染細胞で発現した蛋白質が日
本脳炎ウィルス本来のE蛋白質と同様なプロセスを受け
て、53000ダルトンのE蛋白質になったと容易に推
察される。
にPreM、M及びNS1 (非構成蛋白)の一部を含
んでいたにも拘らず53000ダルトンの蛋白質が発現
しているということは、感染細胞で発現した蛋白質が日
本脳炎ウィルス本来のE蛋白質と同様なプロセスを受け
て、53000ダルトンのE蛋白質になったと容易に推
察される。
このAcJ3の感染細胞で発現させたE蛋白質は、日本
脳炎ウィルスのE蛋白質に対する抗血清と反応するので
、抗原性を有していることは明らかであり、従ってワク
チン・診Igi試薬となり得るものである。感染細胞に
おけるE蛋白質の生産量は、わずか200感染細胞から
の抽出液であってもウェスタンプロット法で検出できる
ことから相当なレベルのE蛋白質が作られていることが
判る。尚、AcJ3のかわりに野性型バキュロウィルス
を同様にS、フルギベルダの細胞に感染させて、細胞内
の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白質は認めら
れなかった。
脳炎ウィルスのE蛋白質に対する抗血清と反応するので
、抗原性を有していることは明らかであり、従ってワク
チン・診Igi試薬となり得るものである。感染細胞に
おけるE蛋白質の生産量は、わずか200感染細胞から
の抽出液であってもウェスタンプロット法で検出できる
ことから相当なレベルのE蛋白質が作られていることが
判る。尚、AcJ3のかわりに野性型バキュロウィルス
を同様にS、フルギベルダの細胞に感染させて、細胞内
の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白質は認めら
れなかった。
第1図は本発明の操作手順、第2図は日本脳炎ウィルス
のcDNAのクローニング手順、第3図はcDNAの制
限酵素サイトの位置関係、第4図み換えベクターpAc
YMs1の構築手順、第8図はE蛋白質をコードするc
DNAを含む第二の組み換えベクターpACYMJ3の
構築手順をそれぞれ示す。
のcDNAのクローニング手順、第3図はcDNAの制
限酵素サイトの位置関係、第4図み換えベクターpAc
YMs1の構築手順、第8図はE蛋白質をコードするc
DNAを含む第二の組み換えベクターpACYMJ3の
構築手順をそれぞれ示す。
Claims (4)
- (1)バキユロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に
、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードするcD
NAの全部又は一部を組み込んだ組み換えバキユロウイ
ルスを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現
した日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質を回収することを
特徴とする日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質の製造法。 - (2)表面抗原蛋白質をコードするcDNAの全部又は
一部が日本脳炎ウィルスのマトリックス蛋白質をコード
するcDNAの全部又は一部とともに組み込まれている
特許請求の範囲第1項記載の製造法。 - (3)表面抗原蛋白質をコードするcDNAの全部又は
一部が日本脳炎ウィルスのプレマトリツクス蛋白質及び
マトリックス蛋白質をコードするcDNAの全部又は一
部とともに組み込まれている特許請求の範囲第1項記載
の製造法。 - (4)日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
cDNAが第4図のアミノ酸配列又はそれと実質的に同
一機能を有するポリペプチドをコードするものである特
許請求の範囲第1〜3項記載の製造法。
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---|---|---|---|
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US07/349,560 US5229293A (en) | 1988-05-12 | 1989-05-05 | Recombinant baculovirus |
GB8910381A GB2218421B (en) | 1988-05-12 | 1989-05-05 | A process for producing envelope protein of japanese encephalitis virus using recombinant baculovirus; envelope proteins,recombinant baculovirus and vaccines |
KR1019890006364A KR900018373A (ko) | 1988-05-12 | 1989-05-11 | 재조합 바쿨로바이러스, 이 바이러스를 사용하는 일본 뇌염바이러스의 외포 단백질 및 그 단백질의 제조방법. |
FR8906311A FR2631238B1 (fr) | 1988-05-12 | 1989-05-12 | Baculovirus recombinant, procede de production de la proteine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise a l'aide dudit virus, et cette proteine |
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---|---|---|---|
JP63115316A JP2511494B2 (ja) | 1988-05-12 | 1988-05-12 | 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 |
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JP2511494B2 JP2511494B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=14659594
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---|---|
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FR (1) | FR2631238B1 (ja) |
GB (1) | GB2218421B (ja) |
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AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
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1988
- 1988-05-12 JP JP63115316A patent/JP2511494B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-05 US US07/349,560 patent/US5229293A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-05 GB GB8910381A patent/GB2218421B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-11 KR KR1019890006364A patent/KR900018373A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 FR FR8906311A patent/FR2631238B1/fr not_active Expired - Fee Related
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GB2218421B (en) | 1992-12-02 |
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KR900018373A (ko) | 1990-12-21 |
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