JPH01285198A - 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 - Google Patents
日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組み換えバキュロウィルスを用いて日本脳炎ウ
ィルスの表面抗原蛋白質を効率よりｙＪ造する方法に関
する。
ィルスの表面抗原蛋白質を効率よりｙＪ造する方法に関
する。
（従来の技術）
日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、ｔＩｌｇｌなマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予
研株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し
、アルコール・プロタミン法により精製、不活化して不
活化日本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている［国立予
防衛生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版（昭
和５２年１月２０日丸善株式会社発行）］。
脳炎ウィルスを有効成分とするワクチンが用いられてお
り、ｔＩｌｇｌなマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予
研株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し
、アルコール・プロタミン法により精製、不活化して不
活化日本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている［国立予
防衛生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版（昭
和５２年１月２０日丸善株式会社発行）］。
このようなワワクシの製造法においては、大量の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えＤＮＡ技術によって原核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。日本脳炎
ウィルスの表面抗原蛋白質（以下、Ｅ蛋白質と称するこ
とがある）を酵母を宿主とする遺伝子操作によって発現
させようとする試みもなされている（第３４回日本ウィ
ルス学会予稿集第９１頁昭和６１年１０月）が、本来の
Ｅ蛋白質の産生には成功しなかった。
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
えＤＮＡ技術によって原核細胞又は、真核細胞で抗原蛋
白質を作らせる事が検討されるようになった。日本脳炎
ウィルスの表面抗原蛋白質（以下、Ｅ蛋白質と称するこ
とがある）を酵母を宿主とする遺伝子操作によって発現
させようとする試みもなされている（第３４回日本ウィ
ルス学会予稿集第９１頁昭和６１年１０月）が、本来の
Ｅ蛋白質の産生には成功しなかった。
本発明者らは、最近、生ワクチンとして用いられている
ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡを組み込んで発現させることに成功し
た。しかし、この組み換えウィルスは生ワクチンとして
有望ではあるが、発現させた蛋白質を回収して、ワクチ
ンや診断試薬として利用するには産生量が少ないという
問題がある。
ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡを組み込んで発現させることに成功し
た。しかし、この組み換えウィルスは生ワクチンとして
有望ではあるが、発現させた蛋白質を回収して、ワクチ
ンや診断試薬として利用するには産生量が少ないという
問題がある。
一方、昆虫ウィルスベクターを用いて昆虫細胞で外来遺
伝子を発現させる方法が提案されるようになり（特開昭
６０−３７９８８号、同６１−５７８７＠＞。これらの
方法での発現蛋白量は、他の発現系より著しく高いと報
告されている。
伝子を発現させる方法が提案されるようになり（特開昭
６０−３７９８８号、同６１−５７８７＠＞。これらの
方法での発現蛋白量は、他の発現系より著しく高いと報
告されている。
しかしながら、トガウィルス科ワラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−重鎖ＲＮＡをゲノム（ウィル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノシストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、Ｅ蛋白質、及び５種類の非構成蛋白質へとプロセッシ
ング（−本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで
切断されて各々の蛋白質ができる事をいう）されるとい
う特徴をもつため、Ｅ蛋白質をコードするｃＤＮＡをバ
キュロウィルスに組み込んで発現させることは操作上困
難であり、従って、これまでにその発現例については全
く報告されていない。
る日本脳炎ウィルスは、−重鎖ＲＮＡをゲノム（ウィル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウィルスの感染細胞内
においてモノシストロニックにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、Ｅ蛋白質、及び５種類の非構成蛋白質へとプロセッシ
ング（−本のポリペブタイドが細胞内のプロテアーゼで
切断されて各々の蛋白質ができる事をいう）されるとい
う特徴をもつため、Ｅ蛋白質をコードするｃＤＮＡをバ
キュロウィルスに組み込んで発現させることは操作上困
難であり、従って、これまでにその発現例については全
く報告されていない。
（発明が解決しようとする問題点）
そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、日本脳炎
ウィルスＥ蛋白質を大量に製造する方法の開発を目積し
て鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムＲ
ＮＡを鋳型としｍｔＪしたｃＤＮＡよりＥ蛋白質をコー
ドする領域を選択し、バキュロウィルスのプロモーター
に連結し、バキュロウィルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込めば、感染昆虫細胞においてワクチンや診断
試薬として利用可能な日本脳炎ウィルスＥ蛋白質が大量
に発現することを見い出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。
ウィルスＥ蛋白質を大量に製造する方法の開発を目積し
て鋭意検討を進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムＲ
ＮＡを鋳型としｍｔＪしたｃＤＮＡよりＥ蛋白質をコー
ドする領域を選択し、バキュロウィルスのプロモーター
に連結し、バキュロウィルスの増殖に非必須なゲノム領
域に組み込めば、感染昆虫細胞においてワクチンや診断
試薬として利用可能な日本脳炎ウィルスＥ蛋白質が大量
に発現することを見い出し、この知見に基づいて本発明
を完成するに至った。
（問題点を解決するための手段）
カクシて本発明によれば、日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質
をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスの増殖に非必
須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュロウィルス
を昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した
日本脳炎ウィルスＥ蛋白質を回収する方法が提供される
。
をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスの増殖に非必
須なゲノム領域に組み込んだ組み換えバキュロウィルス
を昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現した
日本脳炎ウィルスＥ蛋白質を回収する方法が提供される
。
本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ拳カリフ
オルニカ＜ ＡＵｔＯＯｒａＤｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ ） 、トリコブルシア◆二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕ
ｓｉａ ｎｉ ） 、ラキプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉ
ｐｌｕｓｉａ ｏｕ） 、ガレリア・メＯネラ（Ｇａｌ
ｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ） 、或いはボン
ピツクス・モリ（Ｂｏｘｉｂｙｘ ｍｏｒｉ ）などが
例示される。これらのウィルスのなかでもオートグラコ
ア・カリフオルニカ（以下、ＡＣＮＰＶと略す）が好適
である。これらのウィルスは従来から広く研究されてき
たものであり、そのサンプルは米国コネチカット州のエ
ール大学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめの多
くの入手源から得ることができる。
ルスはバキュロウィルスに分類されるウィルスであれば
いかなるものでもよく、例えばオートグラファ拳カリフ
オルニカ＜ ＡＵｔＯＯｒａＤｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ ） 、トリコブルシア◆二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕ
ｓｉａ ｎｉ ） 、ラキプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉ
ｐｌｕｓｉａ ｏｕ） 、ガレリア・メＯネラ（Ｇａｌ
ｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ） 、或いはボン
ピツクス・モリ（Ｂｏｘｉｂｙｘ ｍｏｒｉ ）などが
例示される。これらのウィルスのなかでもオートグラコ
ア・カリフオルニカ（以下、ＡＣＮＰＶと略す）が好適
である。これらのウィルスは従来から広く研究されてき
たものであり、そのサンプルは米国コネチカット州のエ
ール大学アーボヴイラスリサーチユニットをはじめの多
くの入手源から得ることができる。
また、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
ｃＤＮＡは、例えば前記中山予研株やＪａＯＡｒ株（米
国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリサーチ
ユニット） 、５ａｏａＶａｌａ株（同所）を用いてＷ
４製することができる。
ｃＤＮＡは、例えば前記中山予研株やＪａＯＡｒ株（米
国コネチカット州のエール大学アーボヴイラスリサーチ
ユニット） 、５ａｏａＶａｌａ株（同所）を用いてＷ
４製することができる。
例えば上記Ｓａｇａｙａｍａ株から調製されたＥ蛋白質
を］−ドするｃＤＮＡは第４図に示すごとき全部で１５
００塩基対から構成されているが、本発明においては、
［記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を有する範囲におい
て、修飾されたｃＤＮＡ （即ち、塩基配列が置換、挿
入、欠失したもの）であってもよい。もちろん、実質的
に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸配列が異なる程
度にＩ３Ｅ飾されたものであってもよい。
を］−ドするｃＤＮＡは第４図に示すごとき全部で１５
００塩基対から構成されているが、本発明においては、
［記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を有する範囲におい
て、修飾されたｃＤＮＡ （即ち、塩基配列が置換、挿
入、欠失したもの）であってもよい。もちろん、実質的
に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸配列が異なる程
度にＩ３Ｅ飾されたものであってもよい。
組み換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウ
ィルスの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。
ィルスの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。
この場合、前記領域にバキュロウィルス内で機能するプ
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な＆１１限酵素切断配列を有する
合成リンカ−を挿入することが好ましい。
ロモーターを存在させることが必要であり、さらにプロ
モーターの下流に適当な＆１１限酵素切断配列を有する
合成リンカ−を挿入することが好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領領域は、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子（Ｌ。
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子（Ｌ。
Ｋ、ミラーら、サイエンス２１９巻１９８３年頁７１５
〜７２１）など、外来性ＤＮＡの挿入による変異を受け
ても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を言
う。
〜７２１）など、外来性ＤＮＡの挿入による変異を受け
ても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない領域を言
う。
因みにポリヘトリンは、およそ２９，０００ダルトンの
分子量の蛋白質であり、ＡｃＮＰＶゲノムのＥｃｏＲＩ
−Ｉ断片上にその遺伝子が存在する事が示されており（
Ｇ、Ｅ、スミスらＪ。
分子量の蛋白質であり、ＡｃＮＰＶゲノムのＥｃｏＲＩ
−Ｉ断片上にその遺伝子が存在する事が示されており（
Ｇ、Ｅ、スミスらＪ。
Ｖｉｒｏｌ、 ４５巻、１９８３年頁２１５−２２５
）、ポリヘトリン遺伝子のＤＮＡ配列はＧ、Ｅ、スミス
らの論文（ＶｉｒｏｌｏＯＶ １３１巻１９８３年頁
５６１−５６５）に示されている。
）、ポリヘトリン遺伝子のＤＮＡ配列はＧ、Ｅ、スミス
らの論文（ＶｉｒｏｌｏＯＶ １３１巻１９８３年頁
５６１−５６５）に示されている。
また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、ＩＯＫポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものならい
かなる塩基配列のものでも良く、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター、ＩＯＫポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
第一の組み換えベクターの作製は常法（例えば特開昭６
０−３７９８８号、同６１−５７８７号など）に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するＤＮＡをバキュロウィルスＡＣ
ＮＰＶから単離し、精製する。次いでＥｃｏＲＩＩＩＩ
Ｉａエンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン遺
伝子を含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ−Ｉ断片及びそ
の他の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片
を、その後適当なり０−ニングプラスミドのＥＣｏＲＩ
部位にクローン化する。
０−３７９８８号、同６１−５７８７号など）に従って
行うことができ、例えば次のようにして行われる。ポリ
ヘトリン遺伝子を有するＤＮＡをバキュロウィルスＡＣ
ＮＰＶから単離し、精製する。次いでＥｃｏＲＩＩＩＩ
Ｉａエンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘトリン遺
伝子を含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ−Ｉ断片及びそ
の他の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片
を、その後適当なり０−ニングプラスミドのＥＣｏＲＩ
部位にクローン化する。
この系の場合にはポリヘトリン遺伝子のプロモーターが
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
非必須領域内に存在しており、このプロモーターが第二
の組み換えベクターにおいても有効に機能する。
また発現量を増加させるためには、ポリヘトリン遺伝子
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の５′非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの３′非翻
訳領域が続いているベクターを用いることが好ましい。
プロモーターとポリヘトリン遺伝子の５′非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘトリンの３′非翻
訳領域が続いているベクターを用いることが好ましい。
このようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高
くなる事が示されている〈松浦らＪ、 ｇｅｎ、 Ｖｉ
ｒｏｌ ６８巻１９８７年頁１２３３−１２５０）。
くなる事が示されている〈松浦らＪ、 ｇｅｎ、 Ｖｉ
ｒｏｌ ６８巻１９８７年頁１２３３−１２５０）。
ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質等にわかれる。
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質等にわかれる。
従って、全ウィルスゲノムに対するｃＤＮＡを挿入すれ
ば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入す
る必要はない。また挿入するｃＤＮＡがＥ蛋白質をコー
ドする領域に加え、その上流に翻訳開始コドンになりう
る配列（例えばＡＴＧ＞を有する場合にも同様である。
ば人為的に翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンを挿入す
る必要はない。また挿入するｃＤＮＡがＥ蛋白質をコー
ドする領域に加え、その上流に翻訳開始コドンになりう
る配列（例えばＡＴＧ＞を有する場合にも同様である。
しかし、Ｅ蛋白質をコードするｃＤＮＡのみを組み込も
うとするときはプロモーターの下流に存在する制限酵素
切断点を利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び
両者間に制限酵素切断配列を有する合成リンカ−を組み
込むことが必要である。
うとするときはプロモーターの下流に存在する制限酵素
切断点を利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び
両者間に制限酵素切断配列を有する合成リンカ−を組み
込むことが必要である。
挿入する翻訳終止コドンは、Ｅ蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡの読み取り枠がいずれであっても合致するように読
み取り枠をずらせて３ケ所に設けることが望ましい。
ＮＡの読み取り枠がいずれであっても合致するように読
み取り枠をずらせて３ケ所に設けることが望ましい。
挿入するｃＤＮＡはＥ蛋白質をコードする領域を含むも
のであればその他に他の蛋白質をコードするＷＡ域を含
むものであってもよい。ワラビウィルス属に属するウィ
ルスについては、Ｅ蛋白質をコードする領域の上流にマ
トリックス蛋白質（以下Ｍ蛋白質と称する）、プレマト
リックス蛋白質（以下ＰｒｅＭ蛋白質と称する）、コア
蛋白質く以下Ｃ蛋白質と称する）をコードする領域が存
在しているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡの全部又は一部がＥ蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの上流に結合したものを用いてもよい。
のであればその他に他の蛋白質をコードするＷＡ域を含
むものであってもよい。ワラビウィルス属に属するウィ
ルスについては、Ｅ蛋白質をコードする領域の上流にマ
トリックス蛋白質（以下Ｍ蛋白質と称する）、プレマト
リックス蛋白質（以下ＰｒｅＭ蛋白質と称する）、コア
蛋白質く以下Ｃ蛋白質と称する）をコードする領域が存
在しているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコー
ドするｃＤＮＡの全部又は一部がＥ蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの上流に結合したものを用いてもよい。
用いられるベクターの具体例としては、例えばＤＢＲ３
２２、ＤＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、Ｅ
）ＵＯ３、ｐｕｃｓ、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９などのごと
きプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのごと
きファージ、ｐＨ０７９（ジーン、１１．２９Ｌ １９
８０年）などのごときコスミドが例示される。
２２、ＤＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、Ｅ
）ＵＯ３、ｐｕｃｓ、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９などのごと
きプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのごと
きファージ、ｐＨ０７９（ジーン、１１．２９Ｌ １９
８０年）などのごときコスミドが例示される。
本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコ
ードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作製
される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参照）
に従えば良く、例えば第１のベクターのプロモーターの
下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利用し
て日本脳炎ウィルス由来のｃＤＮＡ断片を挿入すれば良
い。
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコ
ードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作製
される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参照）
に従えば良く、例えば第１のベクターのプロモーターの
下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利用し
て日本脳炎ウィルス由来のｃＤＮＡ断片を挿入すれば良
い。
これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
本発明においては、次に、バキュロウィルスのゲノムＤ
ＮＡと第二の組み換えベクターを混合したのち、昆虫培
養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノムＤＮ
Ａの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウ
ィルスを構築する。
ＮＡと第二の組み換えベクターを混合したのち、昆虫培
養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノムＤＮ
Ａの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えバキュロウ
ィルスを構築する。
ここで用いられる昆虫培養細胞はバキュロウィルスが増
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などが例示される。
殖可能なものであればよく、その具体例として、例えば
スボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などが例示される。
組み換えバキュロウィルスの構築に当たっては常法に従
えば良く、例えば特開昭６０−３７９８８号の実施例の
記述に準じて以下のごとき手順に従って実施できる。即
ち第二の組み換えベクターとバキュロウィルスＤＮＡを
トランスフェクションし、得られる組み換えバキュロウ
ィルスを含むウィルス集団を回収し、それをり、Ｅ、ボ
ルフマンら（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ １９巻１９７６年頁
８２０−８３２）に記載されている標準的ＡｃＮＰＶポ
リへドリンプラークアツセイにかけ、発達したプラーク
群のうちから封入体を生成しないプラークを組み換えウ
ィルス候補株として選択し、そのプラークからウィルス
を採取する。これら候補株の内から日本脳炎ウィルスの
Ｅ蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれたウィル
スを選択する方法は、該ＤＮＡをプローブとするパイプ
リダイゼーション法を利用してプラークを純化するか、
あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血清又はモノク
ローナル抗体を用いるイムノアッセイを利用すればよい
。
えば良く、例えば特開昭６０−３７９８８号の実施例の
記述に準じて以下のごとき手順に従って実施できる。即
ち第二の組み換えベクターとバキュロウィルスＤＮＡを
トランスフェクションし、得られる組み換えバキュロウ
ィルスを含むウィルス集団を回収し、それをり、Ｅ、ボ
ルフマンら（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ １９巻１９７６年頁
８２０−８３２）に記載されている標準的ＡｃＮＰＶポ
リへドリンプラークアツセイにかけ、発達したプラーク
群のうちから封入体を生成しないプラークを組み換えウ
ィルス候補株として選択し、そのプラークからウィルス
を採取する。これら候補株の内から日本脳炎ウィルスの
Ｅ蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれたウィル
スを選択する方法は、該ＤＮＡをプローブとするパイプ
リダイゼーション法を利用してプラークを純化するか、
あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血清又はモノク
ローナル抗体を用いるイムノアッセイを利用すればよい
。
こうして純化した組み換えバキュロウィルスを感染しや
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間侵、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。
すい昆虫細胞に感染させ、常法に従って適当な生育条件
下で培養させ、適当な培養時間侵、該細胞を集めて破砕
し、抽出液を作る。この抽出液から発現蛋白質を適当な
方法で回収する。
培養に使用する昆虫細胞はバキュロウィルスが増殖可能
なものであればとくに制限されないが、とくにスボドプ
テラ・フルギベルダが好ましい。
なものであればとくに制限されないが、とくにスボドプ
テラ・フルギベルダが好ましい。
また適当な培養条件は予備実験により容易に決定できる
が、具体的には１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。
が、具体的には１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８
℃で培養することが望ましい。細胞からの発現蛋白質の
回収は常法の生化学的な精製方法であれば、特に限定さ
れないが、日本脳炎ウィルスに対する抗体を使ったアフ
イニテイクロマトの方法が好ましい。
以上、本発明について説明したが、本発明の−実施Ｂ様
の概略を図示すると第１図に示すとおりである。
の概略を図示すると第１図に示すとおりである。
かくして本発明によれば、バキュロウィルスの増殖に非
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来のＥ蛋白質を
コードするｃＤＮＡがプロモーターの制御下に組み込ま
れた組み換えバキュロウィルスが得られ、この組み換え
ウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細胞を培養す
ることにより日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質を得ることが
できる。
必須なゲノム領域に日本脳炎ウィルス由来のＥ蛋白質を
コードするｃＤＮＡがプロモーターの制御下に組み込ま
れた組み換えバキュロウィルスが得られ、この組み換え
ウィルスを昆虫細胞に感染させて、該感染細胞を培養す
ることにより日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質を得ることが
できる。
このＥ蛋白質はワクチンや診断試薬として有用である。
（実施例）
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
日本脳炎ウィルスＥ蛋白質をコードするｃＤＮＡの作製
（１） 日本脳炎ウィルスからのＲＮＡゲノムの抽出
蚊由来株化細胞Ｃ６／ ３６ （Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉ
ｒｏｌ。
蚊由来株化細胞Ｃ６／ ３６ （Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉ
ｒｏｌ。
１追 ５３１−５４４ （１９７８））に日本脳炎ウィ
ルス５ａｌｌｌａＶａｌａ株を感染させ、ウィルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィ
ルスゲノムＲＮＡ （約１１Ｋｂｐ）は精製ウィルスか
らフェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離
した。
ルス５ａｌｌｌａＶａｌａ株を感染させ、ウィルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウィルスを精製した。ウィ
ルスゲノムＲＮＡ （約１１Ｋｂｐ）は精製ウィルスか
らフェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離
した。
（り 日本脳炎ウィルスのｃＤＮＡのクローニング（第
２図参照） （１）でＩＩ＠ｉＬ、たウィルスゲノムＲＮＡにポリ（
Ａ）ポリメラーゼ（宝酒造）を使って、ポリ（Ａ）を付
加し、それを鋳型とし、オリゴｄ （Ｔ＞をプライマー
に用いて、４種（Ａ−Ｇ−Ｃ４Ｔ）のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファース
トストランドｃＤＮＡを合成した。次に大腸菌ＲＮａｓ
ｅＨと、４１！！（Ａ−Ｇ・Ｃ−Ｔ）のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸と大１１ｉ１ＤＮＡポリメラーゼを
使って二本鎖ｃＤＮＡを作成しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎ＜ｌ ［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ ｊａｂ 、 （１９８２） １ｇ）、２１１
〜２４６）、ターミナルトランスフェラーゼでｄＧ鎖を
付加した。一方、プラスミドｐＬＪＣ９（ファルマシア
製）を制限酵素ＰＳｔＩで消化後、ターミナルトランス
フェラーゼでｄＧ［を付加し、これと、前記ｃＤＮＡを
混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した。この
組換えプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル
に導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌からプラスミ
ドをとり出し、インサートｃＤＮＡの長さをアガロース
ゲルで比較し、もつとも長いインサートｃＤＮＡについ
て５′側の配列分析（Ｇｅｎｅ １９ Ｄ、２６９
（１９８２））をおこなった。その配列分析の結果より
、２Ｏ−ｆｆＬｅｒの合成オリゴヌクレオチド（５’
−ｄＡＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣＡ −３
’ ）をプライマーとし、ウィルスゲノムＲＮＡを鋳型
にして、再度上記の方法でｃＤＮＡを作成し、プラスミ
ドｐＵｃ９にライゲーションし、多数の形質転換菌を得
た。得られた形質転換菌の中から目的の表面抗原蛋白質
をコードするｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドを含む
形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
２図参照） （１）でＩＩ＠ｉＬ、たウィルスゲノムＲＮＡにポリ（
Ａ）ポリメラーゼ（宝酒造）を使って、ポリ（Ａ）を付
加し、それを鋳型とし、オリゴｄ （Ｔ＞をプライマー
に用いて、４種（Ａ−Ｇ−Ｃ４Ｔ）のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、ファース
トストランドｃＤＮＡを合成した。次に大腸菌ＲＮａｓ
ｅＨと、４１！！（Ａ−Ｇ・Ｃ−Ｔ）のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸と大１１ｉ１ＤＮＡポリメラーゼを
使って二本鎖ｃＤＮＡを作成しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎ＜ｌ ［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ ｊａｂ 、 （１９８２） １ｇ）、２１１
〜２４６）、ターミナルトランスフェラーゼでｄＧ鎖を
付加した。一方、プラスミドｐＬＪＣ９（ファルマシア
製）を制限酵素ＰＳｔＩで消化後、ターミナルトランス
フェラーゼでｄＧ［を付加し、これと、前記ｃＤＮＡを
混合し、ライゲーション反応を行ない環状化した。この
組換えプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル
に導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌からプラスミ
ドをとり出し、インサートｃＤＮＡの長さをアガロース
ゲルで比較し、もつとも長いインサートｃＤＮＡについ
て５′側の配列分析（Ｇｅｎｅ １９ Ｄ、２６９
（１９８２））をおこなった。その配列分析の結果より
、２Ｏ−ｆｆＬｅｒの合成オリゴヌクレオチド（５’
−ｄＡＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣＡ −３
’ ）をプライマーとし、ウィルスゲノムＲＮＡを鋳型
にして、再度上記の方法でｃＤＮＡを作成し、プラスミ
ドｐＵｃ９にライゲーションし、多数の形質転換菌を得
た。得られた形質転換菌の中から目的の表面抗原蛋白質
をコードするｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドを含む
形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
尚、日本脳炎ウィルスのｃＤＮＡクローンの作成方法に
ついては、日本脳炎ウィルスＪａＯＡｒＳ ９８２株を
使い、同様な方法で作成した例がｃｅｎｅ且 Ｄ、１９
５−２０１ （１９８６）に記載されている。
ついては、日本脳炎ウィルスＪａＯＡｒＳ ９８２株を
使い、同様な方法で作成した例がｃｅｎｅ且 Ｄ、１９
５−２０１ （１９８６）に記載されている。
（３） 日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質をコードす
るｃＤＮＡ（４１１８）を含む組み換えプラスミドｐＪ
Ｅ４１１８のスクリーニング〈第２図及び第３図参照） （２）で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニドＯセルＯ−スフイルターにレプリカする。レプリ
カしたフィルターを０．２％ＮＰ−４０（界面活性剤、
半片化学）でゆるやかに洗浄した後、抗ＪＥＩｌｈ清で
イムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジテ
ィブに反応する形質転換菌を１株得て、その株が保有す
るプラスミドをｐＪＥ４１１８とした。次いでプラスミ
ドｐＪＥ４１１８を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏ
ｎｉｎｏ Ｄ７Ｓ 〜９５［前記］）に従い調製し、制
限酵素ＰＳｔＩでｐＵＣ９に挿入されたｃＤＮＡを切り
出し、これをＤＮＡプローブとして、（２）で得た各種
形質転換菌をコロニーハイプリダイビーシコン法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ０ｎｉｎｌ） ｐ３８２〜３８７
［前記］）によってスクリーニングし、Ｅ）ＪＥ４１
１８のインサートｃＤＮＡ（４１１８）と重なりあうｃ
ＤＮＡをもつプラスミドを選び出した。そうやって選び
出したｃＤＮＡ （２−２０）をプラスミドより回収し
、ｉｌｌ限酵素でその位置関係を決定した（第３図参照
）ところ、ｃＤＮＡ （２−２０）はｃＤＮＡ （４１
１８）のＮ末端と部分的に重なり合っていることが判明
した。
るｃＤＮＡ（４１１８）を含む組み換えプラスミドｐＪ
Ｅ４１１８のスクリーニング〈第２図及び第３図参照） （２）で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育させ
、ニドＯセルＯ−スフイルターにレプリカする。レプリ
カしたフィルターを０．２％ＮＰ−４０（界面活性剤、
半片化学）でゆるやかに洗浄した後、抗ＪＥＩｌｈ清で
イムノスクリーニングしたところ、弱いながらもポジテ
ィブに反応する形質転換菌を１株得て、その株が保有す
るプラスミドをｐＪＥ４１１８とした。次いでプラスミ
ドｐＪＥ４１１８を常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏ
ｎｉｎｏ Ｄ７Ｓ 〜９５［前記］）に従い調製し、制
限酵素ＰＳｔＩでｐＵＣ９に挿入されたｃＤＮＡを切り
出し、これをＤＮＡプローブとして、（２）で得た各種
形質転換菌をコロニーハイプリダイビーシコン法（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ０ｎｉｎｌ） ｐ３８２〜３８７
［前記］）によってスクリーニングし、Ｅ）ＪＥ４１
１８のインサートｃＤＮＡ（４１１８）と重なりあうｃ
ＤＮＡをもつプラスミドを選び出した。そうやって選び
出したｃＤＮＡ （２−２０）をプラスミドより回収し
、ｉｌｌ限酵素でその位置関係を決定した（第３図参照
）ところ、ｃＤＮＡ （２−２０）はｃＤＮＡ （４１
１８）のＮ末端と部分的に重なり合っていることが判明
した。
（４） 表面抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基
配列の解明（第４図参照）。
配列の解明（第４図参照）。
組み換えプラスミドＥ）ＪＥ４１１８と、ＤＪＥ２−２
０をＩＩＩ限醇素、ＰＳｔ工で切断し、それぞれ約２．
５Ｋｂｐ、約１．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。これら
の断片についてＭ１３ファージを用いるメツシングらの
方法（ジーン１９、ｐ２６９（１９８２）、サイエンス
２４１ Ｅ）１２０５（１９８１））により、ｃＤＮＡ
（４１１８）の場合は５′側から、ｃＤＮＡ （２−２
０＞の場合は３′側から配列分析を行なった。
０をＩＩＩ限醇素、ＰＳｔ工で切断し、それぞれ約２．
５Ｋｂｐ、約１．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。これら
の断片についてＭ１３ファージを用いるメツシングらの
方法（ジーン１９、ｐ２６９（１９８２）、サイエンス
２４１ Ｅ）１２０５（１９８１））により、ｃＤＮＡ
（４１１８）の場合は５′側から、ｃＤＮＡ （２−２
０＞の場合は３′側から配列分析を行なった。
その結果、両者が重なり合う部分のｃＤＮＡ配列は第４
図中の第５番アミノ酸の第３コドンから第１１６番アミ
ノ酸までの３３４塩暴である事が判明した。この塩基配
列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２９ ７２６−７３３ （１９８５））で
ある黄熱病ウィルス（日本脳炎ウィルスと部属近縁）の
Ｅ蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィルス
のＥ蛋白質は第４図に示す＋１番目から第５００番目の
アミノ酸までであると判断された。
図中の第５番アミノ酸の第３コドンから第１１６番アミ
ノ酸までの３３４塩暴である事が判明した。この塩基配
列から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２２９ ７２６−７３３ （１９８５））で
ある黄熱病ウィルス（日本脳炎ウィルスと部属近縁）の
Ｅ蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィルス
のＥ蛋白質は第４図に示す＋１番目から第５００番目の
アミノ酸までであると判断された。
同様に、日本脳炎ウィルスのＭ蛋白質は第４図に示す第
一７５番目から第一１番目のアミノ酸まで、またＰｒｅ
Ｍ蛋白質は第一１６７６７番目第一７６番目までと判断
された。さらに、ＰｒｅＭ蛋白質の５′側は日本脳炎ウ
ィルスのＣ蛋白質の一部をコードしていると判断された
。
一７５番目から第一１番目のアミノ酸まで、またＰｒｅ
Ｍ蛋白質は第一１６７６７番目第一７６番目までと判断
された。さらに、ＰｒｅＭ蛋白質の５′側は日本脳炎ウ
ィルスのＣ蛋白質の一部をコードしていると判断された
。
（５） 日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質をコードす
るｃＤＮＡの作製（第３図及び第４図参照）ｃＤＮＡ
（４１１８）はＥ蛋白質のＮ末端の５アミノ酸が欠けて
いる。そこでｃＤＮＡ （２−２０）を用いて、Ａａｔ
ｌ［サイトの位置でつなぎ合わせて、Ｅ蛋白質を完全に
カバーするｃＤＮＡ（２０３）を得た。
るｃＤＮＡの作製（第３図及び第４図参照）ｃＤＮＡ
（４１１８）はＥ蛋白質のＮ末端の５アミノ酸が欠けて
いる。そこでｃＤＮＡ （２−２０）を用いて、Ａａｔ
ｌ［サイトの位置でつなぎ合わせて、Ｅ蛋白質を完全に
カバーするｃＤＮＡ（２０３）を得た。
次いでｃＤＮＡ （２０３＞を）ｌ ｉ ｎｄｌとＥＣ
０ＲＶｔ’処理し約２．７Ｋｂｐ（７）ｃＤＮＡ断片（
Ｊ３）を回収した。この断片はＥ蛋白質をコードする領
域に加えてＭ蛋白質及びｐｒｅＭ＠白賀をコードする領
域を含んでいる。
０ＲＶｔ’処理し約２．７Ｋｂｐ（７）ｃＤＮＡ断片（
Ｊ３）を回収した。この断片はＥ蛋白質をコードする領
域に加えてＭ蛋白質及びｐｒｅＭ＠白賀をコードする領
域を含んでいる。
実施例２
バキュロウィルスの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込
んだ第一の組み換えベクター １）ＡＣＹＭＳｌの作ｙＪ（第５〜７図参照）（１）
ポリヘトリン遺伝子の３′末端を欠失させたプラスミ
ドＤＡＣＲＰ６１の作製（第５図参照）第一の組み換え
ベクターを構成するために、まずＡｃＮＰＶ （野性株
）のポリヘトリン遺伝子を含むＤＮＡｌｌ１片をプラス
ミドＥ）ＵＯ３のＥＣｏＲＩ部位にり０−ン化した。Ａ
ＣＮＰＶのＤＮＡはＧ、Ｅ、スミス及びＭ、Ｄ、サマー
ズ（ＶｉｒｏｌｏＯｙ ８９巻１９７８年頁５１７−
５２７）により説明されているように、ウィルスから抽
出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分離によ
り精製した。次にこのＤＮＡを制限酵素Ｅ ＣＯ，ＲＩ
により完全消化した。７．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｉ断
片をアガロースゲルにより回収後、ｐＬＩｃ８のＥＣｏ
ＲＩ部位にりＯ−ン化してｐＡｃＥｃｏＲＩ−Ｉを作製
した。この組換えプラスミドＥ）ＡＣＥＣＯＲＩ−Ｉは
３個のＢａｍＨＩＩ！識部位を有する（第５図参照）。
んだ第一の組み換えベクター １）ＡＣＹＭＳｌの作ｙＪ（第５〜７図参照）（１）
ポリヘトリン遺伝子の３′末端を欠失させたプラスミ
ドＤＡＣＲＰ６１の作製（第５図参照）第一の組み換え
ベクターを構成するために、まずＡｃＮＰＶ （野性株
）のポリヘトリン遺伝子を含むＤＮＡｌｌ１片をプラス
ミドＥ）ＵＯ３のＥＣｏＲＩ部位にり０−ン化した。Ａ
ＣＮＰＶのＤＮＡはＧ、Ｅ、スミス及びＭ、Ｄ、サマー
ズ（ＶｉｒｏｌｏＯｙ ８９巻１９７８年頁５１７−
５２７）により説明されているように、ウィルスから抽
出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分離によ
り精製した。次にこのＤＮＡを制限酵素Ｅ ＣＯ，ＲＩ
により完全消化した。７．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｉ断
片をアガロースゲルにより回収後、ｐＬＩｃ８のＥＣｏ
ＲＩ部位にりＯ−ン化してｐＡｃＥｃｏＲＩ−Ｉを作製
した。この組換えプラスミドＥ）ＡＣＥＣＯＲＩ−Ｉは
３個のＢａｍＨＩＩ！識部位を有する（第５図参照）。
１つは、ポリヘトリン遺伝子中に、１つはＥｃｏＲＩ−
Ｉ断片中にポリヘトリン遺伝子のはるか下流に、及び１
つはｏＬＪＣ８のポリリンカー中におけるものである。
Ｉ断片中にポリヘトリン遺伝子のはるか下流に、及び１
つはｏＬＪＣ８のポリリンカー中におけるものである。
後者２つのＢａｍＨＩ認識部位は、Ｇ、Ｅ、スミスら（
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ ａｉｏ
ＩＯｏｙ ３巻１９８３年頁２１５６−２１６５＞が
記載している方法に準じてＤＡＣＥＣＯＲＩ−Ｉから除
去せしめ、ｐＡＣｌｏｌを作成した。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ ａｉｏ
ＩＯｏｙ ３巻１９８３年頁２１５６−２１６５＞が
記載している方法に準じてＤＡＣＥＣＯＲＩ−Ｉから除
去せしめ、ｐＡＣｌｏｌを作成した。
次にｐＡＣｌｏｌをポリヘトリン遺伝子中にあるＫｐｎ
Ｉ部位で切断し、０．５単位のＢａｊ３１エキソヌクレ
アーゼで末端から欠失させていき、その後Ｅ、Ｃ０１ｉ
ＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗ断片）を用いて
末端を修復した。プラスミドＤＮＡを精製し、ホスホリ
ル化３ａｍＨＩリンカ−（５’−ｐｃＧＧＡＴｃｃＧ−
３ ’ ）０．５μびを１００μ１反応混合物中に１０
単位の７４ＤＮＡリガーゼと共に添加した。室温で２時
間インキュベーション後、ＤＮＡを精製した。
Ｉ部位で切断し、０．５単位のＢａｊ３１エキソヌクレ
アーゼで末端から欠失させていき、その後Ｅ、Ｃ０１ｉ
ＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗ断片）を用いて
末端を修復した。プラスミドＤＮＡを精製し、ホスホリ
ル化３ａｍＨＩリンカ−（５’−ｐｃＧＧＡＴｃｃＧ−
３ ’ ）０．５μびを１００μ１反応混合物中に１０
単位の７４ＤＮＡリガーゼと共に添加した。室温で２時
間インキュベーション後、ＤＮＡを精製した。
次いで、ＤＮＡベレットを１００μオの反応液中で再び
ＢａｍＨＩで消化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロ
ースゲル電気泳動後回収し、精製した。ＤＮＡ＠Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌ＪＭ１
０９細胞を形質転換（アンピシリン耐性）させた。数個
の形質転換株からプラスミドを調製し、各々からＥＣ０
ＲＶとＨｉｎｆＩで切り出される断片をメツシングらの
方法（ジーン１９巻１９８２年９．２６９ ）により配
列分析を行なった。この中の一つが第５図に示すように
ポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流１３番目の
塩基まで欠失しているものである事が判明し、これをｐ
ＡｃＲＰ６１と命名した（第５図）。
ＢａｍＨＩで消化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロ
ースゲル電気泳動後回収し、精製した。ＤＮＡ＠Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌ＪＭ１
０９細胞を形質転換（アンピシリン耐性）させた。数個
の形質転換株からプラスミドを調製し、各々からＥＣ０
ＲＶとＨｉｎｆＩで切り出される断片をメツシングらの
方法（ジーン１９巻１９８２年９．２６９ ）により配
列分析を行なった。この中の一つが第５図に示すように
ポリヘトリン遺伝子の翻訳停止コドンの下流１３番目の
塩基まで欠失しているものである事が判明し、これをｐ
ＡｃＲＰ６１と命名した（第５図）。
（２） ポリヘトリン遺伝子を欠失させたプラスミド
ＤＡＣＥＩの作製（第６図参照） ｐＡｃＥｃｏＲｌ−ＩをＢａｍＨＩで切断し、０．５１
位のＢａＪ３１エキソヌクレアーゼで末端から欠失させ
、その後Ｅ、ｃｏ ｌ ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＩ
ｅｎＯ’ｌｌ断片）を用いて末端を修復した。
ＤＡＣＥＩの作製（第６図参照） ｐＡｃＥｃｏＲｌ−ＩをＢａｍＨＩで切断し、０．５１
位のＢａＪ３１エキソヌクレアーゼで末端から欠失させ
、その後Ｅ、ｃｏ ｌ ｉ ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＩ
ｅｎＯ’ｌｌ断片）を用いて末端を修復した。
プラスミドＤＮＡを精製し、前述のホスホリル化Ｂａｍ
ＨＩリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼと共に反応液に添加
した。室温で２時間インキュベーション後、ＤＮＡを精
製した。次いでＤＮＡベレットを１００μオの反応液中
で再びＢａｍＨＩで消化させた。消化ＤＮＡを０．７％
アガロースゲル電気泳動後回収し、精製した。ＤＮＡを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌
ＪＭ１０９細胞を形質転換させた。数個の形質転換株か
らプラスミドを調製し、各々からＥＣ０ＲＶと３μｍＨ
Ｉで切り出される断片を配列分析した。多数のプラスミ
ドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドン（Ａ
ＴＧ）の王までが欠失している断片を含むプラスミドを
選択し、これをｐＡｃＥｌと命名した（第６図参照）。
ＨＩリンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼと共に反応液に添加
した。室温で２時間インキュベーション後、ＤＮＡを精
製した。次いでＤＮＡベレットを１００μオの反応液中
で再びＢａｍＨＩで消化させた。消化ＤＮＡを０．７％
アガロースゲル電気泳動後回収し、精製した。ＤＮＡを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション後、大腸菌
ＪＭ１０９細胞を形質転換させた。数個の形質転換株か
らプラスミドを調製し、各々からＥＣ０ＲＶと３μｍＨ
Ｉで切り出される断片を配列分析した。多数のプラスミ
ドのなかからポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドン（Ａ
ＴＧ）の王までが欠失している断片を含むプラスミドを
選択し、これをｐＡｃＥｌと命名した（第６図参照）。
（３） 第一の組み換えベクターＤＡＣＹＭＳ１の作
製（第７図参照） 先のＤＡＣＲＰ６１をＸｈｏＩと３μｍＨＩｔ’切断し
、第７図において矢印で示した長い方の断片を０．７％
アガロースゲル電気泳動後回収した。
製（第７図参照） 先のＤＡＣＲＰ６１をＸｈｏＩと３μｍＨＩｔ’切断し
、第７図において矢印で示した長い方の断片を０．７％
アガロースゲル電気泳動後回収した。
一方、ｐＡＣＥｌをＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断し、第
７図において矢印で示した短い方の断片を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動後回収した。それら２つの断片を７
４ＤＮＡライゲースによって接続して得たプラスミドを
Ｅ）ＡＣＹＭＩと命名した。次にｐＡＣＹＭｌをＢａｍ
ＨＩで切断し、そこにＢａｍＨＩ−８ｍａＩ−ＢａｍＨ
Ｉの合成リンカ−（５’ −ＤＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ
−３’ ）を挿入して作製したプラスミドをｐＡＣＹＭ
Ｓｌと命名した（第７図参照）。こうして作製したｐＡ
ＣＶＭＳｌはＥＣ０ＲＩ−Ｉ断片中にポリへドリンプロ
モーター、ポリヘトリン遺伝子の５′非翻訳領域、Ｂａ
ｍＨＩ−８ｍａＩ−ＢａｍＨＩ認識部位、ポリヘトリン
遺伝子の３′非翻訳領域が続いていることになる。
７図において矢印で示した短い方の断片を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動後回収した。それら２つの断片を７
４ＤＮＡライゲースによって接続して得たプラスミドを
Ｅ）ＡＣＹＭＩと命名した。次にｐＡＣＹＭｌをＢａｍ
ＨＩで切断し、そこにＢａｍＨＩ−８ｍａＩ−ＢａｍＨ
Ｉの合成リンカ−（５’ −ＤＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ
−３’ ）を挿入して作製したプラスミドをｐＡＣＹＭ
Ｓｌと命名した（第７図参照）。こうして作製したｐＡ
ＣＶＭＳｌはＥＣ０ＲＩ−Ｉ断片中にポリへドリンプロ
モーター、ポリヘトリン遺伝子の５′非翻訳領域、Ｂａ
ｍＨＩ−８ｍａＩ−ＢａｍＨＩ認識部位、ポリヘトリン
遺伝子の３′非翻訳領域が続いていることになる。
実施例３
日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質をコードするｃＤＮＡを挿
入した第二の組み換えベクターの作製（第８図参照）。
入した第二の組み換えベクターの作製（第８図参照）。
実施例１の（５）テ得たｃＤＮＡ （Ｊ３）をＥ、Ｃ０
１ｉＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＯＷＩｉ片）で末端
を修ｖＩ後、制限酵素ＳｍａＩで切断したＤＡＣＹＭＳ
ＩとＴ４ＤＮＡリガーゼを使って接続後、ＪＭ１０９を
形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミドを精
製し、ｐＡＣＹＭＳＩのＳｍａＩ部位に、前記ｃＤＮＡ
（Ｊ３）が正方向（ポリへドリンプロモーターの転写
方向と同方向にｃＤＮＡの翻訳方向が向いている場合を
正方向という）に挿入されているプラスミドを適当な制
限酵素を用いた切断パターンの結果より選択する。こう
して得た第２の組み換えベクターをｐＡＣＹＭＪ３と命
名した。
１ｉＤＮＡポリメラーゼ（ＫｌｅｎＯＷＩｉ片）で末端
を修ｖＩ後、制限酵素ＳｍａＩで切断したＤＡＣＹＭＳ
ＩとＴ４ＤＮＡリガーゼを使って接続後、ＪＭ１０９を
形質転換する。数個の形質転換株より、プラスミドを精
製し、ｐＡＣＹＭＳＩのＳｍａＩ部位に、前記ｃＤＮＡ
（Ｊ３）が正方向（ポリへドリンプロモーターの転写
方向と同方向にｃＤＮＡの翻訳方向が向いている場合を
正方向という）に挿入されているプラスミドを適当な制
限酵素を用いた切断パターンの結果より選択する。こう
して得た第２の組み換えベクターをｐＡＣＹＭＪ３と命
名した。
実施例４
組み換えバキュロウィルスの作出
Ｆ、Ｌ、グラハムらの論文（ＶｉｒｏｌｏｏＶ５２巻１
９７３年４５６−４６７頁）に記載されている方法に準
じ、ＡｃＮＰＶのゲノムＤＮＡ １μグを１〜１０μ
りのｐＡＣＹＭＪ３と混合し、１５μｇ／Ｉ１１の仔ウ
シ胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥＰＥＳ （Ｎ−２−ヒト
Ｏキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
）緩衝液（ＤＨ７，０）で９５０μオにした。混合物を
スターラーで撹拌しながら５０ｍの２．５ＭＣａ Ｇ
１２を滴下し、沈殿を室温で３０分間形成させた。１ｄ
の沈殿したＤＮＡを昆虫綱ｒＩＩＳ、フルギペルダに６
０ｍ培養プレート内の２ｍの培地内において添加した。
９７３年４５６−４６７頁）に記載されている方法に準
じ、ＡｃＮＰＶのゲノムＤＮＡ １μグを１〜１０μ
りのｐＡＣＹＭＪ３と混合し、１５μｇ／Ｉ１１の仔ウ
シ胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥＰＥＳ （Ｎ−２−ヒト
Ｏキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
）緩衝液（ＤＨ７，０）で９５０μオにした。混合物を
スターラーで撹拌しながら５０ｍの２．５ＭＣａ Ｇ
１２を滴下し、沈殿を室温で３０分間形成させた。１ｄ
の沈殿したＤＮＡを昆虫綱ｒＩＩＳ、フルギペルダに６
０ｍ培養プレート内の２ｍの培地内において添加した。
４時間後、細胞単相を培地で洗浄し、１０％ウシ胎児血
清を含む２Ｉ１１の培地を加えて、３日間インキュベー
トした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、この
培地中には組み換え及び非組み換えＡｃＮＰＶが混じっ
ている。これら混合集団より、組み換えＡＣＮＰＶを単
離するため、集めた培地を適当に希釈し、単層培養した
Ｓ、フルギベルダに感染させ、プラークを形成せしめた
。ウィルス封入体を形成しないプラークを選び、そのプ
ラークからウィルスを回収し、これをＰＢＳに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイゼーションをするため、ナイ
ロン又はニトロセルロースメンプレンにスポットし、一
部は、再びＳ、フルギベルダに感染させ、ウィルスを増
やした。
清を含む２Ｉ１１の培地を加えて、３日間インキュベー
トした。その後、培地を滅菌ピペットで集めるが、この
培地中には組み換え及び非組み換えＡｃＮＰＶが混じっ
ている。これら混合集団より、組み換えＡＣＮＰＶを単
離するため、集めた培地を適当に希釈し、単層培養した
Ｓ、フルギベルダに感染させ、プラークを形成せしめた
。ウィルス封入体を形成しないプラークを選び、そのプ
ラークからウィルスを回収し、これをＰＢＳに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイゼーションをするため、ナイ
ロン又はニトロセルロースメンプレンにスポットし、一
部は、再びＳ、フルギベルダに感染させ、ウィルスを増
やした。
スポットしたメンブレンは０．５Ｎ ＮａＯＨで１０
分間、１Ｍトリス塩１’！！緩衝液で５分の処理を３回
繰返した後、１．５Ｍ ＮａＧ１ ０．５Ｍトリス塩
ｆｌｌｌｉｌ液で５分処理した。２倍５ＳＣ（１倍８８
Ｇ、０．１５Ｍ ＮａＣＪ、０．０１５Ｍ クエン
酸ナトリウム〉で飽和させ、８０℃、２時間焼きつけた
。４倍ＳＥＴ （０，６Ｍ ＮａＣｊ、０．０８Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ、４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７，８）
）−ｉｏ倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−〇、１％ＳＤＳで６８℃
、２時間処理した。４倍５ＥＴ−１０倍０ｅｎｈａｒｄ
ｔ−０，１％５ＤＳ−０，１％Ｎａ４Ｐ２０．−５０μ
９／ｍｅ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレーショ
ンによって３２Ｐで標識した日本脳炎ウィルスのＥ蛋白
質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブリダイゼ
ーションした。洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
ィルス液を、再度、適当に希釈してＳ、フルギベルダに
感染させ、プラークを出現させた。出現するプラークに
ついて上記と同様な操作をおこない、出現するプラーク
が全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒化するまで
純化の操作をくり返した。こうして得られたウィルスは
目的の組み換えバキュロウィルスであり、ＡｃＪ３と命
名した。
分間、１Ｍトリス塩１’！！緩衝液で５分の処理を３回
繰返した後、１．５Ｍ ＮａＧ１ ０．５Ｍトリス塩
ｆｌｌｌｉｌ液で５分処理した。２倍５ＳＣ（１倍８８
Ｇ、０．１５Ｍ ＮａＣＪ、０．０１５Ｍ クエン
酸ナトリウム〉で飽和させ、８０℃、２時間焼きつけた
。４倍ＳＥＴ （０，６Ｍ ＮａＣｊ、０．０８Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＣＩ、４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７，８）
）−ｉｏ倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−〇、１％ＳＤＳで６８℃
、２時間処理した。４倍５ＥＴ−１０倍０ｅｎｈａｒｄ
ｔ−０，１％５ＤＳ−０，１％Ｎａ４Ｐ２０．−５０μ
９／ｍｅ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレーショ
ンによって３２Ｐで標識した日本脳炎ウィルスのＥ蛋白
質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブリダイゼ
ーションした。洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
ィルス液を、再度、適当に希釈してＳ、フルギベルダに
感染させ、プラークを出現させた。出現するプラークに
ついて上記と同様な操作をおこない、出現するプラーク
が全て、ドツトハイブリダイゼーションで黒化するまで
純化の操作をくり返した。こうして得られたウィルスは
目的の組み換えバキュロウィルスであり、ＡｃＪ３と命
名した。
実施例５
組み換えバキュロウィルスによる日本脳炎ウィルスＥ蛋
白質の製造 Ｓ、フルギベルダの細胞を単相において５×１０６細胞
／Ｉｄの密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当
り５ ｐ、 ｆ、ｕ、のＡＣＪ３を含む培地を加えて２
３℃で感染させた。感染後２日間細胞を培養し、感染細
胞内において日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質を発現させた
。発現蛋白質の確認はＥ蛋白質に対する抗血清を用いた
ウェスタンプロット法（バーネットｊ１．Ｈ，＾ｎａ＋
ｙｔ、 ＢｉＯＣｈｅｍ、１１２巻（１９８１）１９５
−２０３頁）でおこなった。その結果、ＡＣＪ３の感染
細胞は、分子量的５３０００ダルトンの蛋白質を産生じ
ていることが判明した。５３０００ダルトンという分子
量は、日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質のアミノ酸配列（第
４図）から推定される分子量と同一である。
白質の製造 Ｓ、フルギベルダの細胞を単相において５×１０６細胞
／Ｉｄの密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当
り５ ｐ、 ｆ、ｕ、のＡＣＪ３を含む培地を加えて２
３℃で感染させた。感染後２日間細胞を培養し、感染細
胞内において日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質を発現させた
。発現蛋白質の確認はＥ蛋白質に対する抗血清を用いた
ウェスタンプロット法（バーネットｊ１．Ｈ，＾ｎａ＋
ｙｔ、 ＢｉＯＣｈｅｍ、１１２巻（１９８１）１９５
−２０３頁）でおこなった。その結果、ＡＣＪ３の感染
細胞は、分子量的５３０００ダルトンの蛋白質を産生じ
ていることが判明した。５３０００ダルトンという分子
量は、日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質のアミノ酸配列（第
４図）から推定される分子量と同一である。
ＡＣＪ３に挿入されているｃＤＮＡ （Ｊ３）はＥ以外
にＰｒｅＭ、Ｍ及びＮＳ１ （非構成蛋白）の一部を含
んでいたにも拘らず５３０００ダルトンの蛋白質が発現
しているということは、感染細胞で発現した蛋白質が日
本脳炎ウィルス本来のＥ蛋白質と同様なプロセスを受け
て、５３０００ダルトンのＥ蛋白質になったと容易に推
察される。
にＰｒｅＭ、Ｍ及びＮＳ１ （非構成蛋白）の一部を含
んでいたにも拘らず５３０００ダルトンの蛋白質が発現
しているということは、感染細胞で発現した蛋白質が日
本脳炎ウィルス本来のＥ蛋白質と同様なプロセスを受け
て、５３０００ダルトンのＥ蛋白質になったと容易に推
察される。
このＡｃＪ３の感染細胞で発現させたＥ蛋白質は、日本
脳炎ウィルスのＥ蛋白質に対する抗血清と反応するので
、抗原性を有していることは明らかであり、従ってワク
チン・診Ｉｇｉ試薬となり得るものである。感染細胞に
おけるＥ蛋白質の生産量は、わずか２００感染細胞から
の抽出液であってもウェスタンプロット法で検出できる
ことから相当なレベルのＥ蛋白質が作られていることが
判る。尚、ＡｃＪ３のかわりに野性型バキュロウィルス
を同様にＳ、フルギベルダの細胞に感染させて、細胞内
の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白質は認めら
れなかった。
脳炎ウィルスのＥ蛋白質に対する抗血清と反応するので
、抗原性を有していることは明らかであり、従ってワク
チン・診Ｉｇｉ試薬となり得るものである。感染細胞に
おけるＥ蛋白質の生産量は、わずか２００感染細胞から
の抽出液であってもウェスタンプロット法で検出できる
ことから相当なレベルのＥ蛋白質が作られていることが
判る。尚、ＡｃＪ３のかわりに野性型バキュロウィルス
を同様にＳ、フルギベルダの細胞に感染させて、細胞内
の蛋白質を調べたが、抗血清と反応する蛋白質は認めら
れなかった。
第１図は本発明の操作手順、第２図は日本脳炎ウィルス
のｃＤＮＡのクローニング手順、第３図はｃＤＮＡの制
限酵素サイトの位置関係、第４図み換えベクターｐＡｃ
ＹＭｓ１の構築手順、第８図はＥ蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを含む第二の組み換えベクターｐＡＣＹＭＪ３の
構築手順をそれぞれ示す。
のｃＤＮＡのクローニング手順、第３図はｃＤＮＡの制
限酵素サイトの位置関係、第４図み換えベクターｐＡｃ
ＹＭｓ１の構築手順、第８図はＥ蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを含む第二の組み換えベクターｐＡＣＹＭＪ３の
構築手順をそれぞれ示す。
Claims (4)
- （１）バキユロウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に
、日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡの全部又は一部を組み込んだ組み換えバキユロウイ
ルスを昆虫細胞に感染させ、該昆虫細胞を培養し、発現
した日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質を回収することを
特徴とする日本脳炎ウィルス表面抗原蛋白質の製造法。 - （２）表面抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡの全部又は
一部が日本脳炎ウィルスのマトリックス蛋白質をコード
するｃＤＮＡの全部又は一部とともに組み込まれている
特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （３）表面抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡの全部又は
一部が日本脳炎ウィルスのプレマトリツクス蛋白質及び
マトリックス蛋白質をコードするｃＤＮＡの全部又は一
部とともに組み込まれている特許請求の範囲第１項記載
の製造法。 - （４）日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする
ｃＤＮＡが第４図のアミノ酸配列又はそれと実質的に同
一機能を有するポリペプチドをコードするものである特
許請求の範囲第１〜３項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63115316A JP2511494B2 (ja) | 1988-05-12 | 1988-05-12 | 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 |
| US07/349,560 US5229293A (en) | 1988-05-12 | 1989-05-05 | Recombinant baculovirus |
| GB8910381A GB2218421B (en) | 1988-05-12 | 1989-05-05 | A process for producing envelope protein of japanese encephalitis virus using recombinant baculovirus; envelope proteins,recombinant baculovirus and vaccines |
| KR1019890006364A KR900018373A (ko) | 1988-05-12 | 1989-05-11 | 재조합 바쿨로바이러스, 이 바이러스를 사용하는 일본 뇌염바이러스의 외포 단백질 및 그 단백질의 제조방법. |
| FR8906311A FR2631238B1 (fr) | 1988-05-12 | 1989-05-12 | Baculovirus recombinant, procede de production de la proteine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise a l'aide dudit virus, et cette proteine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63115316A JP2511494B2 (ja) | 1988-05-12 | 1988-05-12 | 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01285198A true JPH01285198A (ja) | 1989-11-16 |
| JP2511494B2 JP2511494B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=14659594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63115316A Expired - Lifetime JP2511494B2 (ja) | 1988-05-12 | 1988-05-12 | 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5229293A (ja) |
| JP (1) | JP2511494B2 (ja) |
| KR (1) | KR900018373A (ja) |
| FR (1) | FR2631238B1 (ja) |
| GB (1) | GB2218421B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0499485A (ja) * | 1990-08-14 | 1992-03-31 | Norin Suisanshiyou Kachiku Eisei Shikenjo | 組換えバキュロウイルス |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02156896A (ja) * | 1988-12-09 | 1990-06-15 | Tokyo Met Gov Shinkei Kagaku Sogo Kenkyusho | 日本脳炎ウイルスの非構成蛋白質の製造法 |
| FR2665710A1 (fr) * | 1990-08-10 | 1992-02-14 | Pasteur Institut | Baculovirus recombinant exprimant les proteines e et ns1 de virus appartenant aux flaviviridae ou de virus apparentes aux flaviviridae, applications diagnostiques et therapeutiques. |
| DE69435224D1 (de) * | 1993-09-15 | 2009-09-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Rekombinante Alphavirus-Vektoren |
| JPH07250127A (ja) * | 1994-03-10 | 1995-09-26 | Fujitsu Ltd | 送信タイミング調整装置 |
| AUPN503495A0 (en) * | 1995-08-25 | 1995-09-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Recombinant helicoverpa baculoviruses expressing heterologous DNA |
| US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| AU778988B2 (en) | 1998-06-04 | 2004-12-23 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| CA2359075A1 (en) | 1999-02-19 | 2000-08-24 | Michigan State University | An antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid |
| US6307653B1 (en) * | 1999-03-24 | 2001-10-23 | Tellium, Inc | Optical matrix protection system |
| AU5329300A (en) | 1999-06-10 | 2001-01-02 | Michigan State University | Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof |
| US7419668B1 (en) | 1999-09-02 | 2008-09-02 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses |
| AU7108700A (en) | 1999-09-02 | 2001-03-26 | Michigan State University | Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses |
| CA2941182A1 (en) * | 2000-02-16 | 2001-08-23 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| ZA200700168B (en) | 2001-10-10 | 2010-02-24 | Novo Nordisk As | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
| AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| CN102180944A (zh) | 2001-10-10 | 2011-09-14 | 诺和诺德公司 | 肽的重构和糖缀合 |
| WO2005108560A2 (en) * | 2004-05-04 | 2005-11-17 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthesis and purification of west nile virus virus-like particles |
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| CN113637694A (zh) | 2013-03-15 | 2021-11-12 | 武田疫苗股份有限公司 | 用于疫苗中的登革热病毒嵌合式构建物的组合物及方法 |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
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1988
- 1988-05-12 JP JP63115316A patent/JP2511494B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-05 US US07/349,560 patent/US5229293A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-05 GB GB8910381A patent/GB2218421B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-11 KR KR1019890006364A patent/KR900018373A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-05-12 FR FR8906311A patent/FR2631238B1/fr not_active Expired - Fee Related
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| US5229293A (en) | 1993-07-20 |
| FR2631238B1 (fr) | 1994-10-28 |
| FR2631238A1 (fr) | 1989-11-17 |
| GB2218421A (en) | 1989-11-15 |
| GB2218421B (en) | 1992-12-02 |
| JP2511494B2 (ja) | 1996-06-26 |
| GB8910381D0 (en) | 1989-06-21 |
| KR900018373A (ko) | 1990-12-21 |
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