KR100274190B1 - B형 간염 바이러스의 특이항원인 ubhbvcore 단백질의 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HBV의 핵 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HBV의 핵 단백질과 유비퀴틴의 융합단백질을 생산하는 발현 벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 사용하여 HBV의 핵 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 유비퀴틴에 융합된 HBV의 핵 단백질에 관한 것이다.

Description

B형 간염 바이러스의 특이항원인 UBHBVCORE 단백질의 발현

제1도는 B형 간염 바이러스의 핵(CORE) 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 B형 간염 바이러스의 핵 유전자의 연결 전략 및 생성된 발현 벡터를 도시한 것이고,

제3도의 A는 UBHBVCORE 유전자의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3도의 B는 UBHBVCORE 유전자의 발현물을 B형 간염환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 B형 간염 바이러스(이하“HBV”라 함)의 핵(CORE) 단백질, 그의 생산을 위한 발현 벡터 및 상기 벡터를 사용한 HBV 핵 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HBV의 핵 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HBV의 핵 단백질과 유비퀴틴의 융합단백질을 생산하는 발현 벡터, 상기 발현벡터를 사용하여 HBV의 핵 단백질과 유비퀴틴의 융합 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 유비퀴틴에 융합된 HBV의 핵 단백질에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나비리대(Hepadna-viridae)의 일종으로 여러가지 간질환, 특히 간암 발생의 가장 중요한 요인중의 하나로 알려져 있다. HBV는 1963년 브로치(Brauch, S. Blumberg)에 의해 혈청에서 처음 발견된 이래로 많은 연구자들에 의해 유전자 재조합 기술을 이용하여 분자 생물학, 면역학 및 생화학적 관점에서 활발하게 연구되어 왔다(Tiollas, P., Science 213, 406-411(1981)). HBV는 약 3.2kb의 이중가닥 DNA를 가지고 있으며 외피 단백질을 코딩하는 S 유전자, 핵 단백질을 코딩하는 C 유전자, DNA 중합효소를 코딩하는 P 유전자, 그리고 정확한 기능이 밝혀지지 않는 X 단백질을 코딩하는 X 유전자로 구성된 4개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지고 있음이 알려져 있다(Ganem, D. et al., Ann. Rev. Biochem. 56, 651-693(1987). HBV에 의해 간염된 환자의 혈청으로부터 두가지 형태의 바이러스 입자가 분리되었는데 그중 하나는 이중나선 DNA가 없는 22nm 입자이고 또다른 하나는 이중나선 DNA를 감싸고 있는 핵과 외피로 구성된 42nm의 데인입자로 밝혀졌다(Robinson, W. S., Annu. Rev. Microbio. 31, 357(1977)).

일반적으로 B형 간염의 진단에 사용되는 혈청학적 표지로는 표면항원(HBS Ag), 표면항체(Anti-HBS Ag), 핵항체(Anti-HBC Ag), 핵항체 IgM(Anti-HBC IgM), e 항원(HBe Ag) 및 e 항체(Anti-HBe Ag)의 6종류가 있다. 상기 표면항원은 B형 간염의 발병시에 검출되는 것으로서 B형 간염의 간염 여부를 진단하는데 필요한 표지이고, 표면항체는 B형 간염에서의 회복단계에서 검출되는 것으로서 B형 간염에서의 회복여부를 진단하는데 필요한 표지이며, 핵항체는 바이러스 입자의 핵을 구성하는 핵 항원에 대한 항체로서 감염 초기에 바이러스 증식을 나타내는 인자의 하나로서 작용하며, 이는 바이러스의 증식기에 혈청내에서는 e 항원이, 그리고 간 조직내에서는 핵 항원이 대량 합성된다는 보고(Hoofnagle, J. H. et al., Ann. Inter. Med. 94, 744-748(1981); Hoofnagle, J. H. et al., Hepatology 7, 758-763(1987))에 의해 뒷받침된다.

특히 이 핵 항체는 바이러스 감염 후 표면 항원이 생성되기 전까지의 시기에 만들어지는 것으로 알려져 있으므로, 간염의 초기 회복단계에서 검출되는 것으로서 B형 간염의 초기 회복 여부를 진단하는데 필요한 표지가 되며, 핵항체 IgM은 핵항체 발현 초기에만 나타나기 때문에 급성 간염을 진단하는데 필요한 표지이다. 특히 HBV에 감염된 사람의 거의 100%에서 핵항체 IgM과 IgG가 관찰되어 이러한 항체의 존재유무는 HBV 감염여부를 결정짓는 매우 중요하고도 민감한 표지가 될 수 있음이 알려져 왔다(Hoofnagle, J. H. et al., Hepatology 7, 758-763(1987)).

상기의 핵항원은 환자의 간조직 또는 혈장으로부터 순수 분리된 다음 그 면역학적 특성 및 생화학적 특성들이 연구되어 왔다(Budkowska, A. J. Infec. Dis. 135, 463-467(1977); Ohori, H., et al., J. Gen. Virol. 65, 405-414(1984); Ohori, H., et al,, Inter-virology 13, 74-82(1980)). 그러나 이와 같은 방법으로는 충분한 양의 시료를 얻기 힘들었고 간조직으로부터의 오염물질로 인한 문제점들이 계속되어 왔다. 특히 혈장으로부터 HBV 핵항원을 얻는 머크(Merck)사의 방법(대한민국 특허출원 공고 제82-1148호)은 혈장반출법(plasma phoresis)을 이용하는 방법으로서 먼저 초기 시료의 확보가 크게 제한을 받고 장시간 고속 원심분리 등의 까다로운 절차를 거치는 방법으로서 안전하게 대량의 핵항원을 얻는 방법으로는 적절치 못하다.

한편으로 이러한 문제점을 해결하고자 유전자 재조합 대장균으로부터 핵항원을 대량으로 발현시킨 방법들이 많은 연구자들에 의해 개발되어 왔다(Pasek, M. T., et al., Nature 282, 575-579(1979); Stahl, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1606-1610(1982)).

한편 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되었다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 11(1975)). 지금까지 동물세포로 부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci. 10, 343(1985)). 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 최근에는 효모에서 UBP 1 이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비퀴틴 융합 단백질로 부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질만을 얻을 수 있게 되었다(Tobias, J.W. et al., J. Biological Chemistry 266, 12021-12028(1991)).

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 한국형 B형 간염환자의 진단에 있어서, 감지도 및 특이도가 더 높고 저렴한 가격의 진단시약을 개발하고자 노력하던 중, 한국형 HBV의 핵(CORE) 유전자를 유전공학적인 방법으로 재조합 대장균에서 유비퀴틴과의 융합 단백질(UBHBVCORE)로서 대량 발현시키는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 한국형 HBV에 대한 진단시약 및 백신의 개발에 기여할 수 있는 HBV의 핵 단백질이 유비퀴틴에 융합된 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HBV의 핵 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HBV의 핵 단백질과 유비퀴틴의 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 HBV의 핵 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 한국형 B형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 염기서열 정보(본 출원인이 선 출원한 대한민국 특허출원 제86-671호 참조)로부터 핵 단백질을 코딩하는 핵 유전자의 5′ 말단과 3′ 말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 시발체를 합성한다. 이들 시발체는 유비퀴틴 유전자의 3′말단과 접합이 가능하도록 5′말단에 제한효소 인식 부위가 존재하며, 이에 대응되는 시발체에는 종료 코오돈과 제한 효소의 인식부위를 삽입하여 유비퀴틴의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 한다. 이들 시발체들을 이용하여 B형 간염 바이러스의 cDNA 인 pHBVadr(대한민국 특허출원 제86-671호 참조)을 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 핵 유전자를 증폭하며, 이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 플라스미드 ptrpH-UB-KHCV(ATCC 68640, ATCC 68641, ATCC 68642)(본 출원인이 선출원한 대한민국 특허출원 제91-13603호 참조)의 KHCV 유전자와 치환하여 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상기의 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 세포로부터 발현된 핵 단백질을 15% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기 영동한 후, 한국형 B형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린으로 웨스턴-블롯팅함으로써 분자량 29,000 달톤의 핵단백질과 유비퀴틴의 융합 단백질이 한국형 B형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지 않는다.

하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소를 사용한 DNA의 절단]

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충 용액을 50㎕ 내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃에서 1 내지 2시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃에서 15분간 열처리하고, 내열성인 제한효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵산을 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심분리(15,000xG, 5분)시켜 상층액을 새튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로포름과 이소부탄을 비율 24:1(v/v)으로 상층액을 추출하여 0.1부피의 3M 소듐 아세테이트와 2.5부피의 100% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃에서 30분간 또는 -20℃에서 약 2시간이상 정치한 후 원심분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[연결 반응(ligation)]

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M 디티오트레이톨, 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10 단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA의 연결에는 100 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃에서 적어도 5시간이상 또는 4℃에서 14시간이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃에서 15분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질전환]

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖의 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm에서의 광학밀도(O.D.) 값이 0.25 내지 0.5에 달할때까지 37℃에서 배양한다. 그후 원심분리(2,500xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하고 여기에 50㎖ 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음위에서 30분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖에 연결 반응 용액 10㎕를 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨 후 42℃에서 1분동안 열처리 하였다. 이를 2.0㎖의 액체 LB 배지에 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎕/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. M13벡터 DNA는 열처리 한 후 100㎕의 JM105 세포, 15㎕의 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎕의 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃로 미리 데워놓은 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토아가)위에 도말하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아클리아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산 EDTA-No₂)을 이용한 전기 영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C18 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴:물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260mm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6]

[중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎕의 10배 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP 혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎕, 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다.

[실시예 1]

[한국형 B형 간염 바이러스의 핵 유전자의 증폭]

[단계 1]

[기존에 클로닝된 한국형 B형 간염바이러스의 cDNA]

(pHBVadr, 본 출원인의 대한민국 특허출원 제86-761호)의 일부인 핵 유전자를 유비퀴틴이 결합된 trp 프로모터를 갖고 있는 대장균 발현벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

이 시발체는 제한효소 Sacll 인식 부위를 가지고 있으며 한국형 B형 간염 바이러스의 핵 유전자의 1번째 염기부터 21번째 염기를 포함하고 있다.

이 시발체는 핵 유전자의 3′-말단에 해독을 종료시키는 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Sall 인식부위를 가지고 있다.

[단계 2]

반응튜브에 시발체 PCORET2 2㎕, 시발체 PCORESAL 2㎍를 넣고 주형으로 pHBVadr 유전자를 50ng 넣은다음 10㎕의 10배 농도 중합효소완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5단위의 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6에서와 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다(Saiki, R.K.et.al., Science 239, 487(1988)).

[단계 3]]

상기 단계 2에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아미드 젤에서 분리한 결과 약 550 염기쌍의 DNA가 증폭된 것을 확인하였으며 이를 동일조건의 폴리아크릴아미드 젤로 분리 정제하였다. 이 DNA 단편을 단편 HBVCORE로 명명하였다.

[실시예 2]

[대장균 발현 벡터의 제조]

본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제91-13603호, ATCC 68642, 1991년 7월 1일자로 기탁) 2㎍을 제한효소 Sacll와 제한효소 Sall으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단한 후 0.7% 아가로스젤에서 분리하여 약 2.7kb 단편을 분리정제하였다. 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L로 명명하였다.

한편 실시예 1의 단계 3에서 얻은 DNA 단편 2㎍을 제한효소 Sacll와 제한효소 Sall으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1에서와 같이 완전절단 한 후 튜브에 절단된 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 10배 농도 연결반응용액, 10단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 이를 사용하여 E.coli W3110(ATCC 37339)를 형질전환시켜 단편 HBVCORE를 함유한 ptrpH-UB-HBVCORE를 포함하는 재조합 대장균을 얻어 이를 1993년 4월 22일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 ATCC 69287로 기탁하였다(제2도)

[실시예 3]

[HBVCORE 유전자의 발현]

상기 실시예 2에서 얻은 B형 간염바이러스의 핵 유전자를 함유하고 있는 재조합 대장균 세포를 50㎕/㎖의 암피실린이 함유된 액체 루리아(Luria)배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖ 씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂,PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎕/㎖ Vit. B₁, 40㎕/㎖ 암피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 배양액의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3정도가 될때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖가 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[HBVCORE 단백질 발현의 확인 및 B형 간염 환자 혈청과의 반응]

실시예 3의 세포침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아클리아미드 젤에서 전기영동하였고(제3-A도), 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., pore size 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 B형 간염환자들의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종 농도 16㎍/㎖가 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 필터를 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01mg/ml, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과는 제3-B도에 나타내었으며, 제3도로부터 UBHBVCORE 단백질을 약 29,000 달톤 정도의 크기로 발현되고 B형 간염 환자의 혈청과 특이적으로 반응함을 확인하였다. 제3-A도 및 제3-B도에서 제1열은 본 발명의 벡터를 함유하지 않은 대장균을 나타내며 제2,3열은 ptrpH-UB-HBVCORE를 함유한 대장균을 나타낸다.

본 발명을 통해 HBV의 특이항원인 핵 단백질을 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있게 되었으며, 이를 이용하여 보다 정확한 B형 간염 진단방법의 개발이 가능하게 되었다.

Claims (8)

1. 유비퀴틴에 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 B형 간염 바이러스의 핵 단백질이 융합된 재조합 단백질.
2. 제1항의 재조합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
3. 제2항에 있어서, 한국형 B형 간염 바이러스의 핵 단백질을 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
4. 제2항 또는 제3항의 DNA를 포함하는 발현벡터.
5. 제4항에 있어서, ptrpH-UB-HBVCORE인 발현벡터.
6. 제4항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
7. 제6항에 있어서, ptrpH-UB-HBVCORE로 형질전환된 대장균(ATCC 69287).
8. 제6항 또는 제7항의 대장균을 배양함을 포함하는, 유비퀴틴에 융합된 B형 간염 바이러스의 핵 단백질의 제조방법.