KR100291102B1 - 씨형간염바이러스의단백질분해효소유전자및대장균에서의발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 아미노산 서열을 가지는 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해 효소 단백질, 이를 코딩하는 DNA, 이 DNA 서열을 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 형질전환된 대장균을 배양함으로써 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

씨(C)형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 유전자 및 대장균에서의 발현

제 1 도는 합성 유비퀴틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 연결 과정을 도시하고,

제 2 도는 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해 효소 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타내고,

제 3-A 도 및 제 3-B 도는 유비퀴틴 유전자와 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 유전자의 연결 전략 및 제조된 발현 벡터를 도시하고,

제 4-A 도 및 제 4-B 도는 각각 본 발명의 대장균 발현 벡터를 이용하여 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소를 발현시킨후 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 및 웨스턴 블로팅한 결과를 도시한다.

본 발명은 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 단백질, 이를 코딩하는 DNA, 이 DNA 서열을 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 형질전환된 대장균을 배양함으로써 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근까지 바이러스성 간염은 A 형 간염바이러스(HAV), B 형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으나 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90% 를 차지하는 비A비B형 간염(NANBH) 바이러스가 확인되었다(Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 간염환자가 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H.J., in A.J.Zuckerman(ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York (1988)), 이중 약 40-50% 가 만성간염으로 진전되고, 또 이중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J.L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(986)).

브래들리(Bradley) 등은 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스(이하 HCV 라 함)의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D.W. et al., Gastroenterology 88, 773-779(1985)), 츄(Choo)등은 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000 개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010-3011 개의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q.L., et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA88, 2451-2455(1991)).

C 형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비바이러스(flavivirus) 및 페스티바이러스(pestivirus)의 유전자 구조와 유사성을 가지며, 이들의 유연관계로 미루어 C 형 간염 바이러스의 다단백질(polyprotein)은 아미노 말단으로 부터 핵(core)-외피1(envelope 1)-외피2/비구조1(E2/NS1)-비구조2(NS2)-비구조3(NS3)-비구조4(NS4)-비구조5(NS5) 순서로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(Choo, Q.L., et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88, 2451-2455(1991); Takamizawa, A., et al., J. Virol. 65, 1105-1113(1991); Kato, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6524-6528(1990)).

외피1 및 외피2/비구조1 단백질(이하 외피2 단백질이라 함)은 생체외(in vitro) 실험을 통해 분자량이 각각 33,000, 72,000 달톤의 크기를 갖는 당단백질임이 밝혀졌고(Houghton, M., et al., Hepatology 14, 381-388(1991); Hijkata, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)), 플라비바이러스의 백신으로 추정되는 비구조1 단백질 및 페스티바이러스의 백신으로 추정되는 gp53/55 단백질과 상당한 구조적 유사성을 가지고 있어 C 형 간염 바이러스의 백신개발 및 치료제 개발에 1차적 목표가 되어왔다(Spete, R.R. et al., Virology 188, 819-830(1992)).

한편, 구조 유전자가 코딩하는 구조 단백질은 다단백질 전이과정에서 전이됨과 동시에 숙주세포내의 인지효소(signalase)에 의해 절단되어 핵 단백질, 외피1, 외피2 또는 비구조1 단백질로 생성되며(L. Markoff, J. Virol. 63, 3345-3352(1989)), 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들은 비구조 3 의 일부 유전자가 코딩하는 바이러스 단백질 분해효소에 의해 절단되어 각각의 비구조 단백질로 생성되는 것으로 추정된다(T. J. Chambers, Annu. Rev. Microbiol. 44, 649-688(1980)).

플라비 바이러스의 경우, 비구조 3 (NS3) 단백질이 바이러스 단백질 분해효소임이 밝혀졌으며 라이신 또는 알지닌 및 글라이신, 세린 또는 알라닌 사이를 절단하는 세린형 단백질 분해효소임이 밝혀진바 있다(T. J. Chambers, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 8902-8998(1990)).

이와같은 바이러스 단백질 분해효소는 이들 효소의 저해제를 개발함으로써 바이러스 감염의 한 치료방법을 제공할 수 있다. 예컨대 사람면역결핍증 바이러스(Human Immunodeficiency Virus) 경우 바이러스 단백질 분해효소(HIV protease)에 대한 저해제(inhibitor)를 개발함으로써 후천성면역결핍증 치료에 중요한 전기가 되었다(Z. Hostomsky, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, 1056-1063(1989)). HIV 단백질 분해효소(HIV protease)는 p55 gag 전구체를 핵 구조 단백질인 p17, p24, p8, p7 순으로 절단하는 것으로 추정되고 있으며 맥퀴드(McQuade) 등은 HIV 단백질 분해 효소의 저해제로 설계한 합성 펩타이드를 HIV 에 감염된 혈액세포에 첨가한 결과 p24 단백질의 생성이 70% 까지 감소함을 보고한 바 있다(T. J. McQuade, et. al. Science 247, 454-456(1990)).

한편 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는것으로 보고되었다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 11(1975)). 지금까지 동물세포로 부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends in Biochem. Sci. 16, 343(1985))

효모의 유비퀴틴 시스템에서는 76개의 아미노산으로 구성된 유비퀴틴이 다른 형태의 유비퀴틴 보다 세포내에서의 절단공정이 매우 빠르며 알지닌-글리신 다음을 아주 효율적으로 절단하는 것으로 알려져 있다(Ozkaynak, et al., Nature 312, 663-666(1987)). 또한 바흐메어(Bachmair)등은 세포내에 존재하는 효소에 의해 유비퀴틴에 결합된 외래 단백질이 알지닌-글리신-글리신 다음에서 아주 정확하게 절단된다고 보고한 바 있다(Bachmair, et al., Science 234, 178-186(1986)).

대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴과 융합된 상태로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합 단백질 그대로 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백분해 효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호할 수 있어 매우 유용하며 항 유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고 정제에도 유용하게 사용할 수 있다.

따라서 단백질 분해 효소 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합시켜 대장균내에서 발현시킴으로써 단백질 형태로 얻을 수 있으며 유비퀴틴 단백질과 분리시켜 본 발명의 단백질 분해효소 단백질을 대량 얻을 수 있다.

본 발명의 목적은 제 2 도의 아미노산 서열을 갖는 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소를 제공하는데 있으며 아울러 이를 코딩하는 DNA, 이 DNA 서열을 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 이 미생물을 배양함을 포함하는, 한국형 C 형 간염 바이러스 단백질 분해효소의 제조방법을 제공하는데 있다.

또한 유비퀴틴 시스템을 이용하여 대량으로 HCV 단백질 분해효소를 제공하기 위해 유비퀴틴이 융합된 단백질 분해효소를 코딩하는 제조합 DNA, 이를 포함하는 발현벡터, 이 벡터로 형질전환된 효모 및 이 효모를 배양함을 포함하는, 한국형 C 형 간염 단백질 분해효소 단백질을 제공하는데 있다.

더 나아가 이 단백질 분해효소의 저해제를 개발함으로써 C 형 간염의 예방 및 치료에 기여하는데 있다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 한국형 C 형 간염 바이러스 단백질 분해효소는 제 2 도에서 도시한 바와 같은 아미노산 서열을 가진다(1991년 6월 10일자로 출원된 대한민국 특허출원 제 91-9510 호 참조).

본 발명의 단백질 분해 효소의 아미노산 서열은 종래의 펩티드 합성법에 따라 합성할 수도 있으나 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이 유전공학의 방법으로 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하여 이 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 생산할 수 있다.

본 발명의 단백질 분해효소의 아미노산 서열은 단백질의 활성 및 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산으로 치환된 아미노산 서열도 포함한다.

또한 본 발명의 단백질 분해 효소는 그 발현 및 분리-정제가 효과적으로 이루어지게 하는 특정 단백질과의 제조합 단백질 형태로 제조할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 제조되는 유비퀴틴과의 제조합 단백질을 바람직한 예로 들 수 있다.

본 발명의 단백질 분해효소를 코딩하는 DNA 는 공지 방법에 따라 cDNA 라이브러리로부터 직접 얻거나 화학적 방법으로 합성할 수 있다. 예컨대 마테우치(Matteucci)등의 포스포아미다이트(phosphoamidite) 고체 지지방법(J. Am. Chem. Soc. 103: 3185(1981))등 알려진 여러 방법들 중 어느 것을 사용해서도 할 수 있다.

일반적으로 코돈의 축퇴(degeneracy)로 인하여 하나의 아미노산에 해당하는 코돈이 다수 존재하므로 본 발명의 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열은 부분적으로 약간씩 다를 수 있다.

본 발명의 단백질 분해 효소 유전자를 클로닝하기 위하여 한국형 C 형 간염 바이러스의 cDNA 단편에 대한 염기 서열 정보로 부터 PCR 용 시발체를 고안 합성하고 이들 프라이머를 이용하여 한국형 C 형 간염 바이러스 cDNA(ATCC 75008, 이하 KHCV-LBCI DNA 라 칭함)을 주형으로 중합효소 연쇄반응에 의하여 단백질 분해 효소 유전자를 증폭한다.

한편, 인공 합성한 유비퀴틴 유전자와 상기의 단백질 분해 효소 유전자를 결합시켜 제조합 단백질 유전자를 대량 증폭할 수 있다.

상기 제조된 재조합 단백질 유전자를 코딩하는 DNA 은 적절한 벡터 및 숙주세포를 이용하는 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 세포 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. 예컨대 본 출원인이 고안한 pYLBC-A/G-HGH(KFCC 10667, 1988년 12월 27일 기탁) 또는 ptrpH-UB-CORE14(ATCC 68641, 1991년 6월 27일 기탁)을 이용하여 효모에서 발현시킨다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 형질 전환은 하기 참조예 4 에 따라 수행하고 얻어진 형질전환된 미생물을 적절한 조건에서 배양하여 본 발명의 단백질 분해 효소 단백질을 얻는다. 이를 폴리아크릴 아마이드젤에서 전기 영동하여 확인하여 C 형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로블린으로 웨스팅 블롯팅(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350(1979))하여 유전자 산물이 한국형 C 형 간염 바이러스의 항체와 특이적으로 반응하는 것을 확인한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지 않는다. 하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1] 제한효소를 사용한 DNA 의 절단.

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완층용액을 50㎕ 내지 100㎕ 의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃ 에서 1 내지 2 시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃ 에서 15 분간 열처리하고, 내열성인 제한효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1: 100mM 비스 트리스 프로판-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2: 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3: 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4: 200mM 트리스-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 포타슘 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2] 페놀 추출과 에탄올 침전

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵산을 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심분리(15,000xG, 5분)시켜 상층액을 새튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로포름과 이수부탄올 비율 24:1(v/v))으로 상층액을 추출하여 0.1 부피의 3M 소듐 아세테이트와 2.5 부피의 100% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃ 에서 30 분간 또는 -20℃ 에서 약 2 시간이상 정치한후 원심분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3] 연결 반응(ligation)

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M 디티오트레이톨, 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10 단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA 의 연결에는 100 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃ 에서 적어도 5 시간이상 또는 4℃ 에서 14 시간이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃ 에서 15 분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4] 대장균 형질전환

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖ 의 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm 에서의 광학밀도(O.D.) 값이 0.25 내지 0.5 에 달할때까지 37℃ 에서 배양한다. 그후 원심분리(2,500xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖ 의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하고 여기에 50㎖ 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음위에서 30 분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖ 에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃ 에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖ 에 연결 반응 용액 10㎕ 를 가하여 0℃ 에서 40 분간 정치시킨 후 42℃ 에서 1 분동안 열처리하였다. 이를 2.0㎖ 의 액체 LB 배지에 가하여 37℃ 에서 1 시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. M13 벡터 DNA 는 열처리 한 후 100㎕ 의 JM105 세포, 15㎕ 의 100mM IPTG(이소프로필티오갈락토사이드), 25㎕ 의 4% X-Gal 및 48℃ 로 미리 데워놓은 3㎖ 의 2배 연성 고체 YT 배치(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토아가)위에 도말하였다.

[참조예 5] 올리고머의 합성

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C18 컬럼인 SEP-PAK(waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴:물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260mm 에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6] 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎍ 의 10배 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕ 의 dNTP 혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕ 의 Ampli Taq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕ 로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕ 의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃ 에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2 분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃ 에서 10 분간 추가반응시켰다.

[실시예 1] 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 유전자의 증폭

(단계 1)

기존에 클로닝된 한국형 HCV 의 cDNA(KHCV-LBCl, 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 91-9510 호, 기탁번호 ATCC 75008, 기탁일 1991. 5. 14)의 단백질 분해 효소 유전자를 합성 유비퀴틴 유전자와 결합시키고(이하, 유비퀴틴에 결합된 한국형 HCV 단백질 분해효소를 'UB-PRO'로 언급함), 이를 대장균 발현 벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

시발체 PPROUBI 5' -CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGGAAGGAGATACTTCTGGG-3'

(5' -말단의 25개 염기가 유비퀴틴 유전자의 3' -말단의 25개 염기와 서로 중복되며 나머지 부위는 KHCV-LBCl의 3361 번째 염기부터 3380번째 염기를 포함함);

시발체 PPROSAL 5' -GACTAGTGTAAGTGGGCCACTTGGAAT-3'

(KHCV-LBCl 의 4029번째 염기뒤에 종료코오돈을 갖고 있으며 동시에 제한효소 SalI 인식부위를 가짐).

(단계 2)

반응튜브에 KHCV-LBCl DNA 50ng 을 주형으로 하여 시발체 PPROUBI 2㎍ 및 PPROSAL 2㎍ 을 넣은 다음, 10㎕의 10배 중합 완충용액, 10㎕ 의 10mM dNTP, 2.5 단위의 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕ 로 한 후 참조예 6과 같이 중합 효소 연쇄반응을 25회 실시하였다.

(단계 3)

상기 단계 2 에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리 아크릴아마이드 젤에서 분리한 결과 670 염기쌍의 DNA 가 증폭되었음을 확인하였고, 동일 조건의 폴리 아크릴 아마이드 젤로부터 분리정제하였다. 이 DNA 단편을 단편 PRO 로 명명하였다.

[실시예 2] 유비퀴틴 유전자의 합성

(단계 1)

기존에 공지된 유비퀴틴 유전자의 염기서열 정보(Ozkaynak, et al., EMBO, J. 6, 1429-1439(1987))를 이용하여 다음과 같은 3개의 올리고뉴클레오티드를 참조예 5 의 방법으로 합성하였다.

UBI1 : 5' -AAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCTAGAGGTTGAATCTTCCGACACTA TTGACAACGTCAA-3',

UBI2 : 5' -ATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGA CGTTGTCAATAGTGTC-3'

UBI3 : 5'- GTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGTTGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATC TTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3'

올리고뉴클레오티드 UBI1 은 5' -말단에 제한효소 Ndel 인식부위(5' -CATATG-3')를 갖도롤 인위적으로 설계하였으며, 올리고뉴클레오티드 UBI2 와 약 20개 염기가 서로 중복되어 있다 올리고뉴클레오티드 UBI3 는 3' -말단에 아미노산 염기서열은 변하지 않도록 하면서 제한효소 SacII 인식부위(5' -CCGCGG-3')를 갖도록 고안하였다(제 1 도).

(단계 2)

상기 단계 1 에서 합성한 3개의 올리고뉴클레오티드, 즉 2㎍ 의 UBI1 0.02㎍ 의 UBI2, 2㎍ 의 UBI3 에 10㎕ 의 10 배 PCR 완충용액, 10㎍ 의 2mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), 2.5 단위 Taq 중합 효소를 넣고 총부피가 100㎕ 가 되도록 증류수를 가한 다음 참조예 6 에서 기술한 바에 따라 실시하였다. 이후 PCR 반응 산물을 5% 폴리 아크릴아미드젤에서 분리하여 약 240 염기쌍의 DNA 를 추출 정제한 후 20㎕ 의 TE 용액에 용존시켰다. 이 단편을 단편 Ub 로 명명하였다.

[실시예 3] 대장균에서의 발현벡터 제조

(제 1 방법)

실시예 1 및 2 에서 얻은 단편 Ub 및 PRO 를 다음과 같이 PCR 반응으로 서로 결합시켰다. 반응튜브에 50ng 의 단편 PRO, 50ng 의 단편 Ub, 2㎍ 의 시발체 UBI1, 2㎍ 의 시발체 PPROSAL 를 넣은 다음 10㎍ 의 10배 농도 중합효소 완충용액, 10㎕ 의 dNTP(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP), 2.5 단위의 Taq 중합효소를 넣고 총 부피가 100㎕ 가 되도록 증류수를 가한 후 참조예 6의 조건으로 PCR 반응을 25회 실시하여 PCR 산물을 분리정제한 다음 PCR 산물을 NEB 완충용액 3 의 조건하에서 제한효소 NdeI 과 SalI 으로 절단하였다. 이 DNA 단편을 UBPRO 라 명명하였다.

한편, 플라스미드 ptrp322H-HGH(KFCC 10667) 2㎍ 을 제한효소 PstI 와 제한효소 SalI 으로 완전 절단하고, 또한 동일 플라스미드 2㎍ 을 제한효소 PstI 과 제한효소 NdeI 으로 NEB 완충용액 4 의 조건하에서 완전절단하여 0.7% 아가로오스 젤로 약 1.5Kb 및 0.8Kb 단편을 각각 분리정제하였다. 이들 단편을 각각 단편 PL 및 단편 PT 로 명명하였다.

이들 단편 PL 및 PT 와 단편 UB PRO 를 다음과 같이 접합반응으로 접합시켰다. 접합 반응 튜브에 100ng 의 단편 UBPRO 와 상기에서 얻은 100ng 의 단편 PL, 약 100ng 의 단편 PT, 2㎕ 의 10배 농도 접합 반응 완충용액, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕ 가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 이 벡터로 대장균 HB101(ATCC 33694)을 형질전환시켜 단편 UBPRO 를 함유하고 있는 ptrPH-UB-PRO 를 얻었다(제 3-A 도).

(제 2 방법)

발현벡터를 하기 위한 또다른 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(ACC68641, 대한민국 특허 제 91-13603 호) 2㎍ 을 제한효소 SacII 과 SalI 을 NEB 완충용액 3 조건하에서 완전절단하여 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 2.7kb 분리정제하였다. 이하 이 단편을 단편 ptrpH-UB-T2/L 로 명명하였다. 실시예 1 의 단계 2 에서 얻은 단편 PRO 를 제한효소 SalI 과 제한효소 SacII 로 완충용액 3 의 조건하에서 완전 절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕ 의 TE 용액에 용존하였다. 이때 생성된 단편을 단편 PRO-T2/L 이라 명명하였으며, 이를 다음과 같이 접합반응시켰다.

상기에서 얻은 100ng 의 단편 PRO-T2/L 과 100ng 의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕ 의 10배 접합반응용액, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 반응 튜브에 넣고 총 부피가 20㎕ 가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 생성된 벡터로 대장균 HB101(ATCC 33694)을 형질전환시켜 단편 PRO 를 함유하고 있는 ptrpH-UB-PRO 를 얻었다(제 3-B 도).

[실시예 4] C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 유전자 발현 유도

상기 실시예 3 에서 얻은 발현벡터 ptrpH-UB-PRO 로 대장균 W3110(ATCC373350을 형질전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 50㎍/㎖ 의 엠피실린이 함유된 액체 LB 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 12 시간동안 진탕 배양한 다음, 이중 5㎖ 을 100㎖ 의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 글루코스, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit B₁, 40㎍/㎖ 엠피실린)으로 옮겨서 37℃ 에서약 3 내지 4 시간동안 진탕 배양하여 배양액의 O.D. 값이 650nm 에서 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(IAA)을 최종농도 1.4mM 이 되게 첨가하여 재조합된 단백질 분해효소 유전자가 발현되도록 하였다. IAA 를 첨가한지 2 시간후에 세포배양액을 원심분리기(Beckman J6 B, Rotor JS4.2)를 이용하여 3000rpm 으로 25 분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수집하였다.

얻어진 박테리아 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 유전자 산물을 발현시킨 결과 KHCV 의 단백질 분해효소 유전자 산물이 유비퀴틴 단백질과 융합되어 발현되었다. 이후 겔상에서 분리된 단백질을 토윈의 방법(Towin, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4750(1979))에 따라 니트로 셀룰로스 필터로 전달(blot)시켰다. 이 필터를 0.5% 젤라틴, 0.2% 트윈 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH7.0, 0.15M 염화 나트륨)에 넣고 상온에서 2 시간동안 약하게 흔들어 주어 차단(blocking)시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS 에 한국인 C 형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린(IgG, 8.2mg/㎖)을 1:200 으로 희석시켜 첨가하고 상온에서 1 시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS 로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20 을 함유한 PBS 에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항-사람 면역 글로불린(Bio-Rad Lab., Anti-Human IgG-HRP)을 1:200 으로 희석시켜 첨가한 다음 상온에서 1 시간동안 진탕시켜 반응시키고 0.2% 트윈 20 을 하유한 PBS 로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하였다. 이 필터를 400㎍/㎖ 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 발색시켰다(제 4-B 도 참조). 그 결과 발현된 단백질이 한국인 C 형 간염에 감염된 환자 항체에 특이하게 반응함을 확인할 수 있었다.

제 4-A 및 4-B 도에서 제 1 열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균이며 제 2 열은 ptrpH-UB-PRO 를 함유한 대장균이며 제 3 열은 단백질 표준 분자량을 나타낸다.

Claims (6)

1. 하기 아미노산 서열을 포함하는 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해 효소 또는 이를 포함하는 유비퀴틴과의 융합 재조합 단백질.
2. 제 1 항의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
3. 제 2 항의 DNA 를 포함하는 발현 벡터.
4. 제 3 항에 있어서, ptrpH-UB-PRO 인 발현벡터.
5. 제 3 항 또는 제 4 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
6. 제 5 항의 대장균을 배양하는 것을 포함하는 한국형 C 형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 제조방법.