KR100304133B1 - C형간염바이러스단백질분해효소의기질로사용되는융합단백질및이를이용한단백질분해효소의활성측정방법 - Google Patents
C형간염바이러스단백질분해효소의기질로사용되는융합단백질및이를이용한단백질분해효소의활성측정방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 특히 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 빠른 시간내에 간단하고, 효율적으로 단백질 분해효소의 활성 특히, C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법은 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위 양쪽으로 최소 4개에서 최대 100개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 그 양쪽에 5,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 가지는 적당한 크기의 단백질을 함유하는 융합 단백질을 기질로 사용하여 단백질 분해효소와 효소-기질 반응을 시켜 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 것이다.
Description
본 발명은 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소의 기질로 사용되는 융합 단백질 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성측정방법에 관한 것으로서, 상세하게는 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소에 의하여 절단되는 기질의 절단부위를 포함하여 양쪽으로 다수개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드의 아미노말단 또는 카르복시 말단 또는 양쪽에 GST(글루타치온-S-전이효소; Glutathione-S-Transferase) 또는 유비퀴틴이 결합된 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소의 기질로 사용되는 융합 단백질에 관한 것이고, 또한, 이 융합 단백질을 기질로 사용하여 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소 또는 C형 간염 바이러스의변형된 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
또한, 상기 융합 단백질을 기질로 사용하여 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소의 활성을 저해하는 저해제의 저해활성을 빠르게 측정할 수 있으며, 이는 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 저해제 후보물질들의 일차검색에 유용하게 사용할 수 있다.
C 형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus)는 비 A 형 또는 비 B 형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요 원인이 되는 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여한다고 알려져 있다(Alter, H. J. et al., 1989, N. Eng. J. Med, 321 : 1494-1500). C 형 간염 바이러스는 전 세계 인구의 1% 가 감염되어 있는 것으로 보고된 바 있으며(Purcell, 1994, FEMS Microbial. Rev, 14 : 181-192 ; van der Poel, 1994, Hepatitis C Virus : Current Studies in Hematology and Blood Transfusion, H. W. Reesink ed., pp.137-193), 특히 아프리카, 일본과 한국에는 전체 인구의 1.5 내지 2.0%가 만성 보균자인 것으로 알려져 있다. 그리고 새롭게 C 형 간염 바이러스에 감염되는 환자의 수가 매년 약 백만명 정도에 이르는 것으로 추정된다 (Alter, H. J., 1988, A. J. Zuckerman ed., Viral Hepatitis and Liver Disease, pp.537-542). 또한 C 형 간염 바이러스에 감염된 환자들 중 약 40-50% 는 간염이 진전되어 만성 간염 환자가 되고, 약 20% 정도는, 더욱 진전되어 간경변 또는 간암 환자가 되는 것으로 알려져 있다 (Dienstag, J.L., 1986, Semin. Liver. Dis, 6 : 67-81). HCV의 감염에 의한 간염이 B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 간염과 구별되는 주요한 특징은 만성간염의 가능성이 HBV 감염에 비하여 훨씬 높다는 것이다. 수혈로 인한 비 A, 비 B형 간염 환자의 과반수 이상이 만성간염으로 진행되며, 약 10 내지 20%의 경우는 간경변을 앓게 된다. HBV에 감염되지 않고 간경변 또는 간암을 앓는 환자의 항-HCV 항체 형성율이 대조군보다 훨씬 높다고 알려져 있다(Ikeda et al.Hepatology 18: 47-53 (1993)). 이 조사에 의하면 HCV 감염환자의 75%가 15년 후에 간암으로 진행된다. 이는 HBV 감염의 27%보다 훨씬 높은 것으로 지금까지 알려진 어느 발암제보다 강한 상관관계를 갖고 있다. 현재 HCV에 대해서는 진단시약이 개발되어 수혈에 의한 감염은 어느 정도 방지가 가능하게 되었지만, 아직 백신이 개발되어 있지 않아서 수혈이외의 경로를 통한 감염 위험은 남아 있다. 그리고 감염후 6개월 이상의 시간이 지나야만 진단시약으로 항체 감지가 가능하므로 감염후 6개월 동안의 혈액은 수혈에 사용될 수 있고, 또한 HCV 감염자의 약 10% 환자에게는 항체가 발견되지 않으므로 이 그룹의 환자 혈액도 수혈에 사용될 수 있다는 위험성을 안고 있다.
C 형 간염 바이러스의 만성적 감염을 효과적으로 치료하기 위하여 보편적인 치료법은 아직까지 개발되어 있지 않으며, 거의 유일하게 인터페론-알파를 C 형 간염 바이러스의 치료제로서 투여하는 것이 시행되고 있다. 그러나 상기 간염 환자에게 인터페론-알파를 투여하는 경우 약 20% 의 환자만이 그 치료 효과를 보인다 (Hoofnagal, J. H., 1994, And. Intern. Med., 39 : 241-275). 또한 세계적으로 가장 널리 발견되는, 특히 아시아, 아메리카, 유럽 지역에서 C 형 간염을 유발하는 주된 바이러스 유형이며, 간경화 또는 간암으로 이행되는 진전율이 높은 C 형 간염 바이러스-1b 형에는 그 효과가 낮아 C 형 간염 바이러스에 의한 간염을 치료하는데 널리 사용할 수 없는 문제점이 있다 (van Doorn, L. J., 1994, review, J. Med. Virol. 43 : 345-356). 또한 최근에 인터페론-내성 서열(Interferon resistance sequence)을 갖는 HCV에 대해서는 효과가 없는 것으로 보고되고 있다. 따라서 C 형 간염 바이러스의 감염에 대한 새로운 치료제 또는 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
C 형 간염 바이러스는 비 A 형 또는 비 B 형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 접종시켜 분리함으로써 회수할 수 있다고 보고되었다(Bradley, D. W. et al., 1988, Gatroenterology, 88 : 773-779). 이렇게 얻어진 C 형 간염 바이러스는 9400 염기로 이루어진 양성가닥 리보핵산 형태의 유전자를 가지고 있으며, 이로부터 3010-3033 개의 아미노산으로 이루어지는 다단백질 (polyprotein)을 만들어 낸다 (Choo, Q. L. et al., 1989, Science, 244 : 359-362, Choo, Q. L. et al., 1991, PNAS, 88 : 2451-2455). 상기와 같은 유전자 구조를 고려할 때 C 형 간염 바이러스는 플래비바이러스 (flaviviruses) 또는 페스티바이러스 (pestiviruses)와 유사하므로, C 형 간염 바이러스는 플래비비리대 (Flaviviridae)에 속하는 새로운 속 (genus)으로 분류되었다 (van Doorn, 1994, review. J. Med. Virol, 43 : 345-356).
C 형 간염 바이러스의 다단백질은 아미노 말단으로부터 core-E1-E2-NS2-NS3- NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 의 순서로 구성되어 있다. 즉, 다단백질상의 아미노 말단에는 바이러스의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)와 외피 (envelope)의 구성요소인 구조 단백질 (core, E1, E2)이 존재하고, 그의 카복시 말단 쪽에는 C 형 간염 바이러스가 증식하는데 필수적인 비구조 단백질들 (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)이 위치하고 있다. 이 전구체 다단백질에 세포내 시그날 펩티다제 (signal peptidase) 및 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 비구조 단백질 2-3 및 비구조 단백질 3이 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 숙성된 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로 단백질 분해효소인 비구조 단백질 NS2-3은 NS3의 아미노말단 부위를 절단하고, 단백질 분해효소인 비구조 단백질 3은 비구조 단백질 3 과 4A 사이, 4A 와 4B 사이, 4B 와 5A 사이, 5A 와 5B 사이에 존재하는 4개의 절단 부위에 작용하는 것으로 밝혀져 있다 (Hijikata et al., 1991, PNAS, 88 : 5547-5551, Bartenschlarger et al., 1994, J. Virol, 68 : 5045-5055, Grakoui et al., 1993, J. Virol, 67 : 1385-95, Tomei et al., 1993, J. Virol, 67 : 4017-4026).
NS3 단백질의 아미노 말단쪽 1/3에 단백질 분해 활성이 있고, 나머지 부분에는 헬리케이즈(Helicase) 활성이 있어서 따로 발현을 시켰을 때 시험관내(in vitro)에서 각각의 활성을 갖음을 확인하였다(D'Souza et al., 1993, J. Gen. Virol. 76, 1729-1736). NS3 단백질은 아미노산 57번째에 히스티딘, 81번째에 아스파테이트 그리고 139번째에 세린이 있어 전형적인 트립신-유사 세린 단백질 분해효소(Trypsin-like serine proteinase)가 갖는 전형적인 활성 부위(catalytic motif)를 가지고 있고 이것은 발견된 수많은 HCV의 변종에 대해서도 완벽하게 일치하고 있다.
NS3 단백질은 몇가지 면에서 트립신-유사 세린 단백질 분해효소와 구분이 되는데 첫번째로 헬리케이즈 단백질과 연결되어 있고, 두번째로 아연과 같은 2가 금속이온을 필요로 하고, 세번째로 분해효소 활성을 나타내는데 주요인자로 NS4A 펩타이드(54개의 아미노산)가 관여를 하는데 NS3과 NS4A가 서로 작용하여 분해효소 활성을 갖는 단백질 구조를 형성하도록 도움을 준다는 것이 알려져 있다(Hijikata et al., 1993, J. Virol. 67, 4665-4675). NS3 단백질중에서 아미노 말단 약 180개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드도 분해효소 활성을 나타낸다(Raffaele D. F., et al., Biochemistry 35(1996) 13282-13287)고 밝혀져 있었고, NS4A 펩타이드가 있고 없음에 따라 그 활성도가 크게 차이가 난다는 것이 알려졌는데, 더우기 NS3 단백질의 아미노 말단 180개 정도의 아미노산만을 발현시켜 정제한 단백질의 경우 낮은 농도에서는 NS4A 펩타이드가 약 1000-2000배 높은 농도로 존재하여야만 최상의 활성도(Vmax)를 보인다는 것이 밝혀졌는데 이는 낮은 농도로 NS3 단백질과 NS4A가 존재할 때에는 NS3, NS4A의 복합(complex) 단백질이 활성구조가 아주 낮은 농도로 존재함으로써 전체 반응속도가 늦고, NS4A 펩타이드가 고농도로 존재할 때는 복합 단백질 분해효소가 대부분 활성 구조로 존재함으로써 높은 반응속도를 보여준다는 것이다. 54개 아미노산의 NS4A 펩타이드 중에서도 21-34번째 아미노산이 단백질 분해효소가 활성구조를 형성하는데 가장 중요하다고 알려져 있다.
이러한 HCV의 구조를 볼 때 새로운 형태의 치료제 또는 치료방법으로는 AIDS 바이러스와 같은 RNA 바이러스의 경우와 같이 치료제로서 단백질 분해효소 또는 RNA 중합효소와 같은 단백질에 대한 저해제가 가장 효과적인 것이라고 예상할 수 있다. 저해제를 개발하기 위해서는 저해제 후보 물질들의 저해활성을 측정하는 일차 검색을 빠르게 수행하는 것이 필요하며, 이를 위해서는 단백질 분해효소의 활성을 빠르게 측정하는 방법이 정립되어 있어야 한다.
종래에 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법으로는 HCV의 전체 제놈 내지 NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B 등의 비구조 단백질 접합 부위를 포함한 부분적인 단백질을 발현시키고 이와 동시에 시스 혹은 트란스로 작용하도록 단백질 분해효소를 발현시킨 후 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상에서 전개되는 패턴의 상이성을 관찰하여 활성여부를 판단하였다(Stempniak et al., Journal of Virology, 71(1997), 2881-2886, Grokoui et al., Journat of Virology, 67(1993), 2832-2843). 이러한 활성측정방법은 초기에 이 바이러스의 구조적 특성 및 단백질 분해효소의 생물학적 역할 등에 대한 좋은 정보를 주었다. 하지만 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하는데는 수많은 저해제 후보물질의 빠른 검색(Screening)이 요구되나 이를 만족하기에는 너무 불필요한 부분이 많이 들어가 있고 또한 다양하게 절단되어 나온 절단물들의 확인을 위해서는 각각의 해당 단백질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 등을 행하여야 하는 단점을 가지고 있다.
또한, NS4A와 NS4B, NS5A와 NS5B 등의 접합 부위에 대한 10 내지 20개의 아미노산 펩타이드를 만들어 이를 기질로 사용하여 단백질 분해효소와 반응시키고 유리된 산물을 HPLC 등에 의해 분석하는 방법(Shimizu et al., Journat of Virology, 70(1996), 127-132, Steinkuhler et al., Journal of Virology, 70(1996), 6694-6700, Bianchi et al., Analytical Biochemistry 237(1996), 239-244)이 사용되고 있다. 이러한 HPLC 분석방법은 정량적으로 활성도를 측정하여 유용한 정보를 줄 수 있는 잇점을 가지고 있다. 그러나 이 기기가 고가이며, 수많은 저해제를 일차적으로 검색(Screening)하는 데는 시간적, 경제적 단점이 되고 있다. 따라서 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여, 빠른 시간내에 경제성을 가진 검색(Screening)방법을 제공할 수 있는 새로운 활성측정방법의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여, 빠른 시간내에 효율적으로 검색(Screening)할 수 있는 방법을 제공할 수 있는 새로운 활성측정방법의 개발하기 위하여 노력한 결과 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 특히 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 빠른 시간내에 간단하고, 효율적으로 단백질 분해효소의 활성 특히, C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 특히 C형 간염 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 저해제를 개발하기 위하여 빠른 시간내에 간단하고, 효율적으로 단백질 분해효소의 활성 특히, C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는데 기질로 사용되는 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 기질로 사용된 GST-NA5A5B-UBep2-2의 접합구조를 나타낸 것이고,
도 2a는 본 발명의 기질로 사용된 GST-NA5A5B-UBep2-2를 정제한 후 SDS-PAGE 상에서 위치 및 순도를 확인한 것으로서,
레인 1은 표준분자량 단백질
레인 2는 정제된 GST-NA5A5B-UBep2-2 기질 단백질을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 기질로 사용된 GST-NA5A5B-UBep2-2를 항 유비퀴틴 항체를 사용하여 유비퀴틴 에피토프가 제대로 실현되었음을 확인한 결과로서,
레인 1은 표준분자량 단백질
레인 2는 대조군 GST 발현 대장균 균질액
레인 3은 GST-NA5A5B-UBep2-2 기질 발현 대장균 균질액을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의해 간염 바이러스 단백질 분해효소와 GST-NA5A5B-UBep2-2 기질을 반응시켜 SDS-PAGE상에서 전개시켜 단백질 분해효소의 활성을 측정한 결과로서,
레인 1은 기질
레인 2는 단백질 분해효소에 의하여 절단된 기질
레인 3은 표준분자량 단백질을 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 융합 단백질은 단백질 분해효소의 기질 단백질(Substrate)의 절단부위 양쪽으로 최소 4개에서 최대 100개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 그 양쪽에 5,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 가지는 적당한 크기의 단백질을 함유한다.
본 발명의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법은 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위 양쪽으로 최소 4개에서 최대 100개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 그 양쪽에 5,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 가지는 적당한 크기의 단백질을 함유하는 융합 단백질을 기질로 사용하여 단백질 분해효소와 효소-기질 반응을 시켜 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 것이다.
상기 본 발명의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법은 단백질 분해효소의 저해제의 저해활성을 측정하는데 응용될 수 있다. 이는 상기의 기질-효소 반응을 저해제가 얼마나 저해하는가를 저해제가 없을 때 단백질 분해효소의 활성도와 저해제가 있을 때 단백질 분해효소의 활성도를 비교함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 단백질 분해효소, 특히 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위 양쪽으로 최소 4개에서 최대 100개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 함유한다. 바람직하기로는 절단부위 양쪽으로 10개 정도의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 함유한다. 구체적으로 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위는 NS3-NS4A, NS4A-NS4B, NS4B-NS5A 또는 NS5A-NS5B, 특히 NS5A-NS5B이다.
본 발명의 융합 단백질은 5,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 가지는 적당한 크기의 단백질을 함유한다. 상기 단백질로는 GST 또는 유비퀴틴이 바람직하다.
본 발명의 융합 단백질은 상기 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위인 NS3-NS4A, NS4A-NS4B, NS4B-NS5A 또는 NS5A-NS5B를 포함하는 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 GST 또는 유비퀴틴이 결합되어 구성(예로서, GST-5A5B 등으로 명명함)되거나 또는 GST-5A5B의 카르복시 말단에 유비퀴틴 또는 유비퀴틴에 대한 항체 인식부위가 결합되어 구성될 수 있다.
상기 본 발명의 융합 단백질은 GST 등의 단백질, C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 기질 단백질의 절단부위인 예컨대, NS5A-NS5B를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 올리고 뉴클레오티드를 유전자 재조합 기술을 사용하여 결합시키고, 이를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
상기 본 발명의 융합 단백질을 기질로 이용하여, 단백질 분해효소 특히, C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소와 효소-기질 반응을 수행하고 그에 따른 산출물을 SDS-아크릴아마이드 젤 상에서 검출함으로써 단백질 분해효소의 활성을 측정할 수 있다. 즉, 상기 본 발명의 융합 단백질로 된 기질에 단백질 분해효소를 첨가하여 기질이 단백질 분해효소에 의해 특이적으로 분해되면 절단부위 이후의 다수개의 아미노산으로 된 폴리펩티드가 본래의 기질로부터 떨어져 나가게 되고 이를 SDS-아크릴아마이드 젤 상에서 관찰하여 단백질 분해효소의 활성정도를 측정할 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질이 GST 및 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 기질의 절단부위의 아미노산 다수개로 이루어진 폴리펩티드가 결합된 것 예컨대, GST-NS5A5B의 카르복시 말단에 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 항체 인지에피토프를 가지는 경우 기질-효소 반응의 정도 즉, 단백질 분해효소 활성도를 효소면역 측정법 등에 의하여 쉽게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합단백질을 기질로 사용하여 단백질 분해효소와 기질-효소반응을 시킴에 있어서, 저해제 또는 저해제 후보물질을 첨가시키면 저해제 또는 저해제 후보물질의 저해활성을 빠르고 쉽게 측정할 수 있다. 이러한 방법은 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 저해제를 개발하기 위하여 많은 저해제 후보물질들의 일차검색(primary screening)에 유용하게 사용할 수 있다.
C 형 간염 바이러스의 다단백질은 아미노 말단으로부터 core-E1-E2-NS2-NS3- NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 의 순서로 구성되어 있다. 이 전구체 다단백질에 세포내 시그날 펩티다제 (signal peptidase) 및 바이러스에 존재하는 단백질 분해효소인 NS 2-3 및 NS 3이 작용하여 상기 전구체 다단백질의 특정 부위를 절단함으로써 9개의 숙성된 바이러스 단백질을 만들어 낸다. 구체적으로 단백질 분해효소인 비구조 단백질 NS2-3은 NS3의 아미노말단 부위를 절단하고, 단백질 분해효소인 비구조 단백질 3은 비구조 단백질 3 과 4A 사이, 4A 와 4B 사이, 4B 와 5A 사이, 5A 와 5B 사이에 존재하는 4개의 절단 부위에 작용한다.
따라서 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소 NS 3의 활성을 측정하는데 상기 다단백질을 기질로 사용하는 경우에는 절단부위가 4개이므로 기질-효소 반응에 의한 산출물이 여러 가지 발생하므로 이를 측정하는데는 많은 시간과 노력이 소모된다.
한편, 다단백질의 절단부위의 양쪽으로 10개 정도로 이루어진 폴리펩티드를 기질로 사용하여 기질-효소 반응의 정도, 즉 단백질 분해효소의 활성도를 측정할 수도 있으나 이 경우에는 단백질 분해후의 산출물들을 검출하기 위해서는 정밀하고 고가인 장비를 사용해야 하고 많은 시간이 소요되는 어려움이 있다.
반면에, 본 발명의 단백질 분해효소의 활성측정방법은 상기의 문제점을 해결할 수 있는 것이다. 즉, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 다단백질 중에서 단백질 분해효소에 의하여 절단되는 부위 양쪽으로 몇개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 GST 또는 유비퀴틴과 같은 단백질에 결합시켜 만든 융합 단백질을 기질로 사용함으로써 기질-효소 반응후에 잘려져 나간 폴리펩티드는 불과 몇개의 아미노산으로 이루어진 것이므로 SDS-PAGE 상에서 이를 검출할 때 효소에 의하여 분해가 된 융합 단백질과 분해가 되지 않은 원래의 융합 단백질만이 검출되므로 양자의 양을 비교하면 단백질 분해효소의 활성도를 아주 빠르게 측정할 수 있는 것이다.
뿐만아니라, 예컨대, GST, 단백질 분해효소에 의해 절단되는 부위를 포함하는 폴리펩티드 및 유비퀴틴 항체 인지 부위가 차례로 결합된 융합 단백질을 기질로 사용하는 경우 상기의 SDS-PAGE 상에서의 검출뿐만아니라 유비퀴틴 항체 인지 부위에 의하여 효소면역 측정법에 의해서도 쉽게 측정할 수 있다.
따라서 본 발명은 단백질 분해효소의 활성을 간단하고 효율적인 방법으로 빠르게 측정할 수 있으므로 단백질 분해효소의 저해제 개발을 위하여 저해제 후보물질들을 일차검색하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이상에서 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법을 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법을 중심으로 기술하였으나 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소와 같이 기질의 여러 부위를 절단하는 활성을 가지는 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 데도 적용할 수 있다. 이는 본 발명의 융합 단백질에서 C형 간염 바이러스의 단백질 분해효소에 의하여 절단되는 부위를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 대신에 해당 단백질 분해효소의 기질중 그 단백질 분해효소에 의하여 절단되는 부위를 포함하는 폴리펩티드를 포함하여 융합 단백질을 구성하고, 그 융합 단백질을 기질로 사용하여 해당 단백질 분해효소와 기질-효소 반응을 시키는 등의 본 발명의 방법을 적용함으로써 해당 단백질 분해효소의 활성을 측정할 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예>
하기 참조예는 재조합 단백질의 발현을 위하여 요구되는 통상적인 조작을 기술하였으며, 실시예는 본 발명의 융합 단백질의 발현 및 단백질 분해효소의 활성측정에 대하여 기술하였다.
<참조예 1> 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 절편 회수
사용된 제한효소와 완충용액은 베링거 만하임(Boehringer Mannheim : BM)사로부터 구입하였으며 멸균된 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 보통 반응부피가 20μl 내지 30μl 이 되도록 하여 37℃의 반응온도에서 2 내지 3시간 동안 반응시켰다.
제한효소 반응에 사용한 10배 완충용액의 조성은 다음과 같다.
10배 BM 완충용액 A : 33mM 트리스 아세테이트, 10mM Mg-아세테이트, 66mM K-아세테이트, 0.5mM 디치오트레이톨, pH 7.0
10배 BM 완충용액 B : 10mM 트리스-HCl, 5mM MgCl2, 100mM NaCl, 2-b-머캡토에탄올, pH 8.0
10배 BM 완충용액 H : 50mM 트리스-HCl, 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM 디치오트레이톨, pH 7.5
DNA 절편의 회수는 전기영동된 아가로즈 젤을 에티듐브로마이드로 염색하여 원하는 절편을 절단한 후 바이오101사의 유전자 클린(Gene clean) Ⅱ 키트를 사용하여 분리해 내었다.
<참조예 2> 접합반응(ligation reaction)
접합반응에는 접합효소를 리가제(Gibco-BRL사)와 10배 접합 완충용액(660μM 트리스-HCl, pH 7.5, 50μM MgCl2, 10mM 디치오에리쓰리톨, 10 mM ATP)을 사용하여 보통 20㎕의 부피에서 10단위의 연결효소를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 이상 반응시켰다.
<참조예 3> 대장균 형질전환
대장균 숙주세포로는 E. coli MC1061을 사용하였다. 숙주세포를 500ml의 액체 배지(1% 박토-트립톤, 5% 효모 추출물, 1% NaCl)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도 값이 0.5 내지 1.0이 될 때까지 37℃에서 진탕배양하였다. 그 후 원심분리를 통해 세포를 수확한 후 차가운 증류수 500ml로 두번 씻어 주었다. 그리고 차가운 10% 글리세롤 용액을 4ml 가하여 세포들을 균일하게 분산시켰다. 상기에서 수득한 세포현탁액 중 50μl을 취하여 접합반응 혼합물 2μl을 가하고 0℃에서 2분간 정치시켰다. 이후 바이오-래드(Bio Rad)사의 일렉트로포레이터(electroporator)를 사용하여 2.5kV의 전기충격을 가한 후 1ml의 2X YT를 넣어주고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 50㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 고체 배지에 넣고 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하여 콜로니가 형성되도록 하였다.
<참조예 4> 올리고 뉴클레오티드의 합성
올리고 뉴클레오티드는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid-phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기로 합성한 후 에탄올로 침전시키고 증류수에 용존시킨 뒤 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.
<참조예 5> 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction ; PCR)
주형 1μg, 5μl의 10배 농도 완충용액(10mM 트리스-HCl, pH 8.8, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.1% 트리톤-X 100), 2㎕의 dNTP 혼합액(dATP, dGTP, dCTP, dTTP가 각각 5 mM), 프라이머 50ng 씩, 0.5㎕의 다이나자임(dynazyme, Fynnazymes Oy)을 넣은 후 증류수를 가하여 총 부피를 50μl로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50μl의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도순환기(Mastercycler 5330, eppendorf사)를 이용하였으며 순환 프로그램은 95℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 30초 순환을 35회 반복하였다. 반응후 반응액에 증류수를 가하여 100㎕로 맞추고 70㎕의 페놀/클로로포름을 넣어 주었다. 이들 혼합액을 잘 섞은 후 원심분리하여 상층액만을 새 튜브에 옮기고 1/10 부피의 3M 나트륨 아세테이트 및 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합하여 다시 원심분리를 통해 PCR 산물을 얻었다. 상기 DNA를 적당량의 증류수에 녹여 다음 실험에 이용하였다.
<실시예 1> 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드 pGST-5A5B-Ubep2-2의 제조
(단계 1) 유비퀴틴을 지닌 플라스미드의 제조
유비퀴틴을 갖는 플라스미드를 만들기 위해 서열 1의 프라이머 ub5(Xba) 및 서열 2의 프라이머 ub3(Pst)를 합성하였다.
상기 프라이머를 이용하여 유비퀴틴 전체 유전자가 들어있는 플라스미드 pET-Ub로부터 유비퀴틴 부분만을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. 얻어진 유비퀴틴 유전자를 BM 완충용액 H에서 제한효소 XbaI과 PstI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리해 내었다. 접합반응에서 사용될 벡터 pTrxFus(Invitorgen)를 BM 완충용액 H에서 제한효소 XbaI과 PstI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리해 내었다.
상기에서 얻어진 유비퀴틴 유전자 10㎕과 절단한 벡터 pTrxFus 4μl에 리가제 10단위체를 가하고 총부피가 20㎕이 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균 E. coli MC1061로 형질전환시켜 원하는 재조합 플라스미드를 찾아 pThio-Ub라 명명하였다.
(단계 2) GST-유비퀴틴 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제조
벡터 pThio-Ub에서 GST 융합 단백질을 발현할 수 있는 pGEX(2T) 벡터로 유비퀴틴 유전자를 옮기기 위하여 서열 3의 프라이머 GST-Ub5(Bam) 및 서열 4의 프라이머 GST-Ub3(Eco)를 합성하였다.
상기 프라이버를 이용하여 pThio-Ub로부터 유비퀴틴 부분만을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. 얻어진 유비퀴틴 유전자를 BM 완충용액 B에서 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리해 내었다. 접합반응에 사용될 벡터 pGEX(2T)(Pharmacia)를 BM 완충용액 B에서 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리해 내었다.
상기에서 얻어진 유비퀴틴 유전자 10㎕와 절단한 벡터 pGEX(2T) 4㎕에 리가제 10단위체를 가하고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균 E. coli MC1061에 형질전환시켜 원하는 재조합 플라스미드를 찾아 pGST-Ub로 명명하였다.
(단계 3) HCV의 비구조단백질 3의 기질인 5A5B 서열을 지니는 GST-유비퀴틴 융합단백질 발현 플라스미드의 제조
플라스미드 pGST-Ub에 HCV의 비구조단백질 3의 기질인 5A5B 서열을 끼워넣기 위하여 서열 5의 프라이머 5A5B(Bam) 및 서열 6의 프라이머 5A5B(Xba)를 합성하였다.
5A5B 서열을 얻기 위해 상기 프라이머를 각각 3㎍씩 사용하고 NaCl을 최종 50μM이 되게 첨가하고 총부피가 100㎕가 되게 증류수를 첨가하였다. 상기 혼합물을 잘 섞은 후 90℃까지 열을 가하고 상온에 정치시켜 서서히 온도가 떨어지도록 하였다. 충분한 시간이 지난 후 혼합물의 온도가 상온까지 떨어졌을 때 접합반응에 사용하였다. 접합반응에 사용될 벡터 pGST-Ub를 BM 완충용액 B에서 제한효소 BamHI과 XbaI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리하였다.
상기에서 얻어진 서열 5㎕와 절단한 벡터 5㎕에 리가제 10단위체를 가하고 총부피가 20μl가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균 E. coli MC1061에 형질전환시켜 원하는 재조합 플라스미드를 찾아 pGST-5A5B-Ub로 명명하였다.
(단계 4) HCV의 비구조단백질 3의 기질인 5A5B 서열과 유비퀴틴 단백질의 항체인식부위를 지니는 GST-유비퀴틴 융합단백질을 발현하는 플라스미드의 제조
플라스미드 pGST-5A5B-Ub에 유비퀴틴 단백질에 대한 항체의 인식부위를 첨가하기 위하여 서열 7의 프라이머 Ubep2-2(Xba) 및 서열 8의 프라이머 Ubep2-2(Eco)를 합성하였다.
항체인식부위를 얻기 위하여 상기 프라이머를 각각 3㎍씩 사용하고 NaCl을 최종 50μM이 되게 첨가하고 총부피가 100㎕가 되게 증류수를 첨가하였다. 상기 혼합물을 잘 섞은 후 90℃까지 열을 가하고 상온에 정치시켜 서서히 온도가 떨어지도록 하였다. 충분한 시간이 지난 후 혼합물의 온도가 상온까지 떨어졌을 때 접합반응에 사용하였다. 접합반응에 사용될 벡터 pGST-5A5b-Ub를 BM 완충용액 H에서 제한효소 XbaI과 EcoRI으로 절단한 후 아가로즈 젤 상에서 분리하였다.
상기에서 얻어진 서열 5㎕와 절단한 벡터 5㎕에 리가제 10단위체를 가하고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균 E. coli MC1061에 형질전환시켜 원하는 재조합 플라스미드를 찾아 pGST-5A5B-Ubep2-2로 명명하였다.
<실시예 2> GST-5A5B-Ubep2 기질 단백질의 발현 및 정제
<단계 1> HCV의 비구조단백질 3의 기질인 5A5B 서열과 유비퀴틴 단백질의 항체 인식부위를 지니는 융합단백질의 유도실험(induction test)
융합단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 대장균 BL/DE3에 형질전환시켜 37℃의 고체 배지에서 하루동안 배양하였다. 다음 날 형성된 콜로니를 60㎍/ml 농도의 앰피실린을 함유하는 2ml의 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서 약 3시간 배양하였다. 여기에 IPTG(Isopropylthiogalactoside)를 최종 농도가 1μM이 되게 첨가하고 다시 37℃에서 3시간 더 배양하였다. 배양이 끝난 후 1ml의 배양액을 취하여 원심분리기를 통해 세포만을 얻었다. 이 세포들을 100㎕의 증류수에 풀어주고 50㎕의 3X 시료 로딩 완충용액(sample loading buffer)를 첨가하여 잘 섞어주었다. 상기에서 얻어진 혼합물을 5분간 끓인 후 얼음에 놓아 식히고 나서 10μl를 취하여 12%의 SDS-PAGE를 통해 융합단백질의 발현 여부를 관찰하였다.
<단계 2> 수용성 융합단백질의 발현 및 정제
상기 단계 1에서 형질전환된 대장균 세포를 엠피실린이 50㎕/ml 첨가된 LB 배지에서 37℃에서 밤새 배양한 후 그 배양액 10ml를 1리터의 LB 배지에 넣어 주고 계속 배양하였다. 37℃에서 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.4 정도가 될 때 최종농도 0.4mM가 되도록 아이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 약 4시간 후에 배양을 멈추고 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 정제에 앞서 세포를 -70℃에서 얼려 세포의 파괴가 쉽게 일어나도록 하였다.
1리터 배양에서 얻어진 재조합 대장균 세포 침전물에 약 100ml의 완충용액 1(25mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.2N NaCl)을 가하여 현탁시킨 후 얼음 중탕안에서 초음파분쇄기(Ultrasonic homogenizer 4710 : Cole-Parmer, USA)로 50%의 출력과 50%의 효율 싸이클(duty-cycle)에서 약 3분간 초음파 처리하여 세포를 파괴시켰다. 2분간 얼음 중탕안에서 방치한 후 상기와 같은 파쇄과정을 2회 반복하여 완전히 세포가 파쇄되도록 하였다. 이렇게 하여 얻은 세포 균질액을 고속 원심분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA-14)로 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 가용성 단백질이 녹아 있는 상층액을 얻었다.
한편으로는 GST가 융합된 단백질을 분리하기 위하여 글루타치온 세파로스 4B 칼럼(Glutathione Sepharose 4B column)을 준비하였다. 이 칼럼을 미리 완충용액 2(0.1M 트리스-HCl, pH 8.5, 0.5M NaCl)로 5배정도 베드 볼륨양으로 씻어주었다. 이어서 완충용액 3(0.1M 나트륨 아세테이트, pH 7.5, 0.5M NaCl)로 5배 정도 베드 볼륨양으로 다시 씻어주었다. 이 과정을 3회 반복하여 칼럼을 충분히 세척한 후 마지막으로 인산염 완충용액(0.14M NaCl, 27 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4) 10 베드볼륨으로 세척하여 최종준비를 마쳤다. 이 평활화한 글루타치온 세파로스 4B 칼럼(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 넣은 후 상기에서 얻은 가용성 단백질이 녹아 있는 상층액을 분당 2ml의 속도로 통과시켰다. 이어서 30 베드볼륨 이상의 인산염 완충용액을 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 그 다음 글루타치온 용출 완충용액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM 환원된 글루타치온)을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2ml의 속도로 용출시켜 흡착되어 있던 단백질들을 수집하였다. 수집된 단백질을 13.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동하여 정제된 단백질의 대략적인 분자량과 순도를 확인하였다. 순도는 95% 이상이었으며 대략적인 분자량은 29,000달톤 정도로 나타났다. 이를 도 2a에 나타내었다. 제1열은 표준 단백질 시료를, 제2열은 용출된 단백질을 나타낸 것이다. 다시 앞에서 수거한 시료를 한외여과기(Amicon Co, USA, MW Cut-off : 10000)에 넣어 단백질의 농도가 2mg/ml 이상이 되게 농축하여 주었다. 농축된 단백질 시료를 디솔팅 칼럼(desalting column : Column PD-10, Pharmacia, Sweden)에 통과시켜 글루타치온이 제거된 단백질만을 었었다. 이 때 사용된 방법은 제조자의 지시에 따라 행하였으며, 사용된 완충용액은 50mM 트리스-HCl, pH 7.5였다.
한편 유비퀴틴 에피토프가 제대로 발현되고 있는지를 확인하기 위하여 GST만을 발현하는 대장균 균질액(Lysate)과 GST-5A5B-Ubep2-2 기질을 발현하는 대장균 균질액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동한 후 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 흡착시킨 후 토끼로부터 유비퀴틴 단백질을 주사하여 얻은 항 유비퀴틴 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다. 이 결과를 도 2b에 나타내었다. GST-5A5B-Ubep2-2 기질만이 유비퀴틴 에피토프를 가지고 있으며, 이는 추후 유비퀴틴 인지 항체를 사용하여 기질 대 효소 반응의 정도를 공지의 효소면역측정법 등에 의해서도 쉽게 측정할 수 있는 장점을 제공할 수 있다.
<실시예 3> 단백질 분해효소와 GST-5A5B-Ubep2-2 기질단백질을 이용한 단백질 분해효소 활성 측정방법
단백질 분해효소의 활성도 측정방법을 확립하기 위하여 먼저 본 발명자들의 선행 특허출원 방법(KR 97-59161호 참조)에 따라 정제된 단백질 분해효소를 먼저 확보하였다. 이 정제된 단백질 분해효소의 분해 활성도는 상기 실시예 2의 단계 2에서 정제된 GST-5A5B-Ubep2-2 기질 단백질을 사용하여 확인하였다.
GST-5A5B-Ubep2-2 기질 단백질은 도 1에서 보는 바와 같이, 20개 아미노산 5A/5B 펩티드의 아미노 말단에 GST 단백질이 붙어 있으며, 카르복시 말단에는 10개의 유비퀴틴 단백질 유래 아미노산을 함유하고 있어서 기질이 단백질 분해효소에 의해 특이적으로 분해되면 20개의 아미노산이 본래의 기질 단백질로부터 떨어져 나가게 되며 이를 SDS-PAGE 상에서 관찰하여 활성정도를 측정하게 된다. 적합한 활성도를 측정하기 위한 세부조건은 50mM 트리스, 10mM DTT, 2% CHAPS {(3-[(3-콜라이도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판-술포네이트)}, 37.5% 글리세롤을 포함하는 pH 7.5의 완충용액에서 기질 6.93μM, C형 단백질 분해효소 145nM을 포함하는 20㎕ 용액에서 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 여기에 반응을 종료시키기 위하여 3X SDS-PAGE 시료 완충용액을 15㎕씩 넣고 80℃에서 5분간 방치한 후 이중 20㎕씩을 따서 13.5%의 SDS-PAGE 상에 로딩한 후 전개시켰다. 도 3은 이의 결과를 나타낸 것이다. 기질을 일정하게 유지시킨 채 단백질 분해효소의 농도를 변화시킴으로써 기질로부터 떨어져 나가며, 따라서 대략 분자량이 2000정도 적어진 새로운 밴드가 나타났다.
한편, 단백질 분해효소에 대한 저해제가 첨가된다면 저해정도에 따라 이러한 분리현상의 많고 적음을 기대할 수 있으며, 이로부터 짧은 시간내에 저해활성 정도 여부를 육안 또는 덴시토미터 등을 사용하여 판별할 수 있는 유용한 저해제 검색방법을 제공할 수 있게 된다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소에 의하여 절단되는 기질의 절단부위를 포함하여 양쪽으로 다수개의 아미노산 반복단위를 가지는 폴리펩티드의 아미노말단 또는 카르복시 말단 또는 양쪽에 GST 또는 유비퀴틴이 결합된 융합 단백질 및 이를 기질 단백질로 이용하여 C형 간염 바이러스 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 SDS-PAGE 상에서 빠르게 그리고 간단하고 효율적으로 단백질 분해효소의 활성을 측정할 수 있다. 또한, 본 발명은 효소면역 측정법을 이용하여 단백질 분해효소의 활성을 더욱 쉽게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질 분해효소의 활성을 저해하는 저해제의 저해활성을 빠르게 그리고 간단하고 효율적으로 측정할 수 있게 한다.
따라서 본 발명은 단백질 분해효소의 저해제 개발을 위하여 많은 저해제 후보 물질들을 일차적으로 검색하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
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Claims (7)
- 단백질 분해효소의 기질 단백질(Substrate)의 절단부위로서 C형 간염 바이러스 다단백질의 NS3-NS4A, NS4A-NS4B, NS4B-NS5A 또는 NS5A-NS5B 절단부위를 포함하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 양말단에 기능성 단백질로서 GST, 유비퀴틴, 또는 유비퀴틴 항체 인식부위를 포함하는 융합단백질.
- 제 1 항에 있어서, GST의 카르복시 말단에 단백질 분해효소의 기질 단백질이 결합되고, 기질 단백질의 카르복시 말단에 유비퀴틴 또는 유비퀴틴의 항체 인식부위가 결합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질 (GST-5A5B-Ub 또는 GST-5A5B-Ubep2-2).
- 제 1항 및 제2항의 융합 단백질을 기질로 이용하여 단백질 분해효소와 기질-효소반응을 시키고, 그 산출물을 SDS-아크릴아마이드 젤 상 또는 단백질이 흡착될 수 있도록 고안된 고형 상에서 검출함으로써 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 활성측정은 효소면역 측정법에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 단백질 분해효소의 활성을 저해하는 저해제 또는 저해제 후보물질을 첨가함으로써 단백질 분해효소의 저해제 또는 저해제 후보물질의 저해활성을 측정하는 방법.
- 제 2항의 융합 단백질 GST-5A5B-Ubep2-2를 발현하는 벡터.
- 융합 단백질 GST-5A5B-Ubep2-2를 발현시키는 제6항의 발현 벡터를 형질전환시킨 형질전환체 (수탁번호: KCTC 0413 BP).
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