JP3280384B2 - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）のｎｓ３プロテアーゼの蛋白分解活性のインビトロにおける再生方法 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）のｎｓ３プロテアーゼの蛋白分解活性のインビトロにおける再生方法

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Description

【発明の詳細な説明】
発明の説明 本発明は,HCV蛋白質NS4Aもしくはそれに含まれる配列
が，セリンプロテアーゼ活性，もっと一般的にいえばHC
V NS3に伴う酵素活性の補因子として働く能力を利用し
て,HCV NS3蛋白質に伴うセリンプロテアーゼ活性を再
構成する方法をその課題とするものである． 既に知られているように,C型肝炎ウイルス（HCV）は
非Ａ非Ｂ肝炎（NANB）の主要な病原因子である.HCVは少
なくとも，輸血後NANBウイルス性肝炎の90％および散発
性NANB肝炎の50％の原因となっていると推定されてい
る．献血者の選択および輸血に使用される血液の免疫学
的特性の検査は著しく進歩はしたものの，輸血を受けた
患者の間では，いまだに高レベルの急性HCV感染（全世
界で毎年百万例もしくはそれ以上の感染）が認められて
いる.HCV感染個体のおよそ50％は,5〜40年の範囲の期間
内に肝硬変を発症している．さらに，最近の臨床研究で
は，慢性HCV感染と肝細胞癌の発症の間に相関のあるこ
とが示唆されている． HCVは，エンベロープがあるウイルスで，約9.4kbのRN
A＋鎖ゲノムを有する．このウイルスはフラビウイルス
科に属す．この科の他のメンバーには，フラビウイルス
およびペスチウイルスがある.HCVのRNAゲノムは最近マ
ッピングされた．世界各地で単離されたHCVゲノムから
の配列を比較した結果，これらの配列は，きわめて不均
質であることが明らかにされている.HCVゲノムの大部分
は,9030〜9099塩基の間で変動するオープンリーディン
グフレーム（ORF）によって占められている．このORFは
一本鎖のウイルスポリプロテインをコードし，その長さ
は3010〜3033アミノ酸長で変動できる．ウイルスの感染
周期時には，ポリプロテインはウイルスの複製に必要な
個々の遺伝子産物へ蛋白分解的プロセッシングを受け
る.HCVの構造蛋白質をコードする遺伝子はORFの5'−末
端に位置し，一方，非構造蛋白質をコードする領域はOR
Fの残部を占めている． 構造蛋白質は,C（核,21kDa）,E1（エンベロープ,gp3
7），ならびにE2（NS1,gp61）から構成される.Cはおそ
らくウイルスのヌクレオカプシドを形成する21kDaの非
グリコシル化蛋白質である．蛋白質E1はほぼ37kDaの糖
蛋白質で，外側のウイルスエンベロープの構造蛋白質で
あろうと考えられている.61kDaのもう一つの膜糖蛋白で
あるE2は，おそらくウイルスの外側エンベロープの第２
の構造蛋白質と思われる． 非構造領域は,24kDaの疎水性蛋白質,NS2（p24）に始
まるが，その機能はまだわかっていない．ポリプロテイ
ン中でNS2に続く68kDaの蛋白質,NS3は２つの機能性ドメ
イン，すなわち，最初の200アミノ末端アミノ酸中のセ
リンプロテアーゼドメイン，およびカルボキシ末端に位
置するRNA依存性ATPアーゼドメインを有することが予測
される.NS4に相当する遺伝子領域はそれぞれ６および26
kDaの２つの疎水性蛋白質,NS4A（p6）およびNS4B（p2
6）をコードするが，それらの機能はまだ解明されてい
ない.NS5に相当する遺伝子もまた，それぞれ56および65
kDaの２つの蛋白質であるNS5A（p56）およびNS5B（p6
5）をコードしている．すべてのRNA依存性RNAポリメラ
ーゼ中に存在するアミノ酸配列は,NS5領域内に認めるこ
とができる．これは,NS5領域がウイルス複製機構の部分
を含むことを示唆している． 様々な分子生物学的研究から，宿主細胞の小胞体と会
合するプロテアーゼであるシグナルペプチダーゼが非構
造領域，すなわちC/E1,E1/E2ならびにE2/NS2における蛋
白分解的プロセッシングに関与することが指示されてい
る.NS3中に含まれるセリンプロテアーゼはNS3とNS4Aの
間,NS4AとNS4Bの間,NS4BとNS5Aの間およびNS5AとNS5Bの
間の接合部の切断に関与している．とくに，このセリン
プロテアーゼによって行われる切断では，容易に切断可
能な結合のアミノ末端側（位置P1）にシステインまたは
スレオニンの残基を，またカルボキシ末端側（位置P
1'）にアラニンまたはセリン残基を残すことが見出され
ている.HCVの第２のプロテアーゼ活性はNS2とNS3の間の
切断に関与するものと思われる．このプロテアーゼ活性
は，セリンプロテアーゼドメインを含有するNS2の部分
およびNS3の部分の両者からなる領域中に含まれている
が，同一の触媒機構を使用していない． 以上の説明に照らして見れば,NS3プロテアーゼには，
抗−HCV治療薬の開発のターゲットとしての可能性が考
えられる．しかしながら，このような薬剤の探索には，
インビトロにおいてNS3によって発揮されるセリンプロ
テアーゼ活性はきわめて低く阻害剤のスクリーニングは
不可能であるという事情が支障になってきた． この重大な限界は，予想外に，本発明の方法を適用す
ることによって克服できることが，今回見出されたので
ある．この方法は，以下の説明から明らかなようにその
他の利点も提供する． 本発明は,HCVのプロテアーゼNS3の蛋白分解活性をイ
ンビトロで再生する方法において,NS3に含有される配列
およびNS4Aに含有される配列の両者を反応混合物に使用
することを特徴とする方法である． 至適なセリンプロテアーゼ活性は,NS4AがNS3と1:1の
比で存在する場合に得られる． NS3およびNS4Aはまた,NS3−NS4A前駆体として反応混
合物中に導入することもできる．この前駆体は自己蛋白
分解現象により等モル量のNS3およびNS4Aを産生するか
らである． 前駆体中のNS3とNS4Aの間の切断部位を突然変異させ
ることも可能で，その結果,NS4AはNS3と共有結合したま
ま残存する.NS3の蛋白分解活性に影響しない配列はつい
でこの蛋白分解されない前駆体から除去できる． 本発明はまた，配列番号:1および配列番号:2に記載の
配列またはそれらに含まれる配列もしくはそれから誘導
される配列を有する蛋白質からなることを特徴とする新
規な組成物材料に拡張される.RNAウイルスはすべて高度
な変異性を示すので，これらの配列はHCV単離体が異な
ると変動する可能性があることを理解すべきである．こ
の新規な組成物材料は数種の非構造性HCV蛋白質の蛋白
分解的成熟を達成するのに必要な蛋白分解活性を有する
ものである． 本発明はまたその課題として，治療目的のために,NS3
に伴う酵素活性を阻害する化合物を，たとえばNS3とNS4
Aの間の相互作用の阻害剤を含めて，同定可能な酵素ア
ッセイを提供するための上記組成物材料の使用を包含す
る． ここまでは本発明を一般的に説明してきた．本発明の
目的，特徴，利点および操作方法を明瞭に理解できるよ
うに，以下の実施例によって，本発明の特定の実施態様
をさらに詳細に説明する． 図面は，培養細胞中およびインビトロにおいてHCV N
S3プロテアーゼを活性化する方法（例１および例２）に
用いられたプラスミドベクターを例示するものである． 例１ 培養細胞におけるHCV NS3セリンプロテアーゼの活性化
方法 プラスミドベクターは,NS3,NS4Aならびに他の非構造
性HCV蛋白質のHeLa細胞内での発現のために，構築され
た．構築されたプラスミドを図式的に図１に例示する.H
CV BK単離体（HCV−BK）のゲノムに相当するcDNAの選
ばれたフラグメントを，プラスミドベクターpCite−１
（登録商標,Novagen）中のバクテリオファージT7のプロ
モーターの下流にクローン化した．この発現ベクターに
は,CAP構造の不存在下でもプロモーターT7から転写され
たメッセンジャーRNAの効率的な翻訳が保証されるよう
に，脳心筋炎ウイルスの内部リボソームエントリー部位
を含有させた． HCV−BK cDNAのさまざまなフラグメントを，分子生
物学的慣用手段として知られている方法を用い，プラス
ミドpCite−１（登録商標）中にクローン化した.pCite
（NS3）はヌクレオチド3351〜5175（ポリプロテインの
アミノ酸1007〜1615）からなるHCV−BKゲノムの部分を
含有する.pCite（NS4B/5A）は，ヌクレオチド5652〜746
7（アミノ酸1774〜2380）からなるHCV−BKの部分を含有
する.pCite（NS3/4A）はヌクレオチド3711〜5465（アミ
ノ酸991〜1711）からなるHCV−BKゲノムの部分を含有す
る.pCite（NS4A）はヌクレオチド5281〜5465（アミノ酸
1649〜1711）からなるHCV−BKの部分を含有する.pCite
（NS5AB）はヌクレオチド6224〜9400（アミノ酸1965〜3
010）からなるHCV−BKゲノムの一部分を含有する．上記
の番号表示は,Takamizawaら,Structure and organizati
on of the hepatitis C virus genome isolated from h
uman carriers,（1991）,J.Virol.65,1105−1113におい
てHCV−BKに与えられたゲノムおよびポリプロテインの
順序と一致する． HCVポリプロテインの各種部分の効率的な発現を達成
するために,HeLa細胞をvTF7−3,インフェクトされた細
胞の細胞質中でのバクテリオファージT7のRNAポリメラ
ーゼの合成を可能にする組換えワクシニアウイルスでイ
ンフェクトした．インフェクション後，これらの細胞を
ついで図中に記載の中から選択されたプラスミドベクタ
ーによってトランスフェクトした．このようにしてイン
フェクトされ，トランスフェクトされたHeLa細胞を，つ
いで［35S］メチオニンで代謝的に標識し，各種プラス
ミドによってコードされた組換え蛋白質は,NS3,NS4また
はNS5Aを認識するポリクローナルウサギ抗体による免疫
沈降法によって同定することが可能であった．本実施例
中に記載の組換えHCV蛋白質の分析方法は,L.Tomeiら,NS
3 is a serine protease required for processing of
hepatitis C virus polyprotein,J.Virol.（1993）,67,
1017−1026およびそれに言及されている文献中に既に記
載されている． プラスミドpCite（NS3）をvTF7−３でインフェクトし
たHeLa細胞にトランスフェクトすることにより,HCV NS
3プロテアーゼの触媒ドメインを含有する蛋白質の合成
を観察することが可能である.pCite（NS4B5A）は,NS4B
とNS5Bの間の接合部に,NS3に伴うセリンプロテアーゼ活
性による加水分解が期待されるペプチド結合を含有する
HCVポリプロテインの部分をコードしている．しかしな
がら,pCiteNS3がpCiteNSA4B5Aとコトランスフェクトさ
れた場合には，蛋白分解的切断の形跡は認められない．
これに反して,NS3セリンプロテアーゼドメインがNS4Aと
結合して発現された場合は,pCite（NSB5A）によってコ
ードされる前駆体の蛋白分解的切断を正常に起こすこと
ができる.NS3セリンプロテアーゼドメインと4Aの共発現
はたとえば，等モル量のプラスミドpCite（NS3）とpCit
e（NS4A）でのトランスフェクション,NS3およびNS4Aの
両者を含有する前駆体をコードするプラスミド［pCite
（NS34A）］のトランスフェクション，または蛋白分解
に関連のないすべての配列が削除されている後者のプラ
スミドの誘導体［pCite（NS34A）］のトランスフェクシ
ョンもしくは蛋白分解に関連のないすべての配列が削除
されている後者のプラスミドの誘導体［pCite（NS3Δin
t1237−1635）］のトランスフェクションによって達成
できる.HeLa細胞中で一過性に発現されるNS4Aは，した
がって，他の場合には認められないNS3に伴う蛋白分解
活性を活性化することができる． 例２ インビトロ翻訳検定におけるHCVセリンNS3プロテアーゼ
の活性化方法 図１に記載のプラスミドはまた，ファージT7の精製RN
Aポリメラーゼ酵素（Promega）を用いるそれぞれのHCV
蛋白質をコードするmRNAのインビトロ合成にも使用する
ことができる． 一般的には,pCite−１（登録商標）由来のプラスミド
を，適当な制限酵素を用いて線状化し，ついで製造業者
（Promega）によって供給されているプロトコールを用
いて転写する．これらの合成mRNAは以後，イヌ膵臓ミク
ロソーム膜の存在下ウサギ網状赤血球の抽出物中におい
て，相当する蛋白質を合成するために使用できた．網状
赤血球抽出物，イヌ膵臓ミクロソーム膜は，他の必要材
料と同様，上述のインビトロ蛋白質合成法の説明書も供
給しているPromegaから購入した． pCite（NS3）から転写されたmRNAを含むインビトロ翻
訳混合物を組み込めば,NS3セリンプロテアーゼ全ドメイ
ンを含有する期待される分子量（68kDa）の蛋白質の合
成を観察することができる.pCite（NS5AB）から転写さ
れたmRNAはNS5AおよびNS5Bを含有し，したがってNS3に
伴う蛋白分解活性の基質である115kDaの前駆体の合成を
誘導する． しかしながら,NS3セリンプロテアーゼドメインおよび
NS5AとNS5Bの間の接合部に相当する部位を有する基質の
２つの蛋白質が同一の反応混合物中で合成された場合に
は,NS3の蛋白分解活性の明瞭な証明は得られない． これに反して,pCite（NS34A）から転写されたmRNA
は，約76kDaの前駆体蛋白質に翻訳され，これはインビ
トロで蛋白分解的に自己プロセッシングされて，それぞ
れNS3およびNS4Aを含有する70kDaおよび6kDaの２種の蛋
白質の等モル量を与える． pCite（NS34A）から転写されたmRNAに加え,pCite（NS
5AB）から転写されたmRNAがインビトロ翻訳混合物中に
包含されている場合には,NS3とNS4Aの間の部位での自己
蛋白分解に加えて，それぞれNS5AおよびNS5Bを含有する
56kDaおよび65kDaの２種の新たな蛋白質の発生が観察で
きる．これらの蛋白質はNS5AおよびNS5Bを含有する前駆
体のNS3による蛋白分解産物である．同様にpCite（NS3
Δint1237−1635）から転写されたmRNAが,pCite（NS5A
B）から転写されたmRNAと共翻訳される場合には,NS5AB
前駆体から蛋白分解によって産生される56kDaおよび65k
Daの蛋白質産物が得られる． この結果は，インビトロにおいては,NS3の単独のプロ
テアーゼドメインはNS5AおよびNS5Bを含む基質上でプロ
テアーゼ活性を発揮できないと要約することができる．
しかしながら,NS4Aを含む他の蛋白質配列がNS3プロテア
ーゼドメインに加えて存在する場合には,NS3のセリンプ
ロテアーゼ活性が明瞭になる． 例３ NS4A配列を含む合成ペプチドを用いたHCV NS3プロテア
ーゼの活性化方法 配列番号:3の配列を含む合成ペプチドを固相上で合成
した．この配列は配列番号:2のＣ−末端部分に由来す
る．ペプチドの合成は本分野の熟練者によく知られてい
る方法に従い固相上で行われた．このペプチドでは，カ
ルボキシ末端のシステインがα−アミノ酪酸（Abu）で
置換されている． このペプチドを，プラスミドpCite（NS3）およびpCit
e（NS5AB）から転写されたmRNAが同時に組み込まれたイ
ンビトロ翻訳混合物中に添加した． このようにしてNS3のセリンプロテアーゼドメインに
伴う蛋白分解活性を観察することが可能となり，これに
より，蛋白質NS5AおよびNS5Bを含む２つの産物への基質
の蛋白分解的切断が生じた．この活性は,NS3セリンプロ
テアーゼドメインと配列番号:3の配列を有する合成ペプ
チドが同時に存在することに依存する． 例４ ペプチド基質に対する組換えHCV NS3セリンプロテアー
ゼの検出方法 図１および例４に記載のプラスミドpT7−７ NS3（10
27−1206）は，配列番号:1のアミノ酸１〜180からなる
蛋白質フラグメントの大腸菌内発現を可能にするために
構築された．このフラグメントは，実験的に決定された
NS3のセリンプロテアーゼドメインを含有する．上述のN
S3フラグメントをコードするHCV cDNAのフラグメント
を,T7RNAポリメラーゼプロモーターφ10およびT7遺伝子
10蛋白質の翻訳開始部位を含有する発現ベクター,pT7−
７プラスミド［Studier ＆ Moffatt,Use of bacterioph
age T7 RNA polymerase to direct selective high−le
vel expression of cloned genes,（1986）,J.Mol.Bio
l.189,113−130］中にクローン化した．上に特定された
NS3セリンプロテアーゼドメインをコードするcDNAフラ
グメントは，バクテリオファージT7プロモータの下流
に,T7遺伝子10蛋白質の最初のATGコドンとインフレーム
に，分子生物学的慣用手段として知られている方法を用
いて，クローン化した.pT7−７プラスミドはまた，β−
ラクタマーゼ酵素の遺伝子も含有し，これはpT7−７誘
導プラスミドでトランスフォームされた大腸菌の選択マ
ーカーとして使用できる． プラスミドpT7−７ NS3（1027−1206）をついで,T7
プロモーター含有発現ベクターにクローン化された遺伝
子の高レベル発現に通常用いられる大腸菌株BL21（DE5
3）にトランスフォームされる．この大腸菌株中では,T7
遺伝子ポリメラーゼはバクテリオファージλDE53に運ば
せて，これをBL21の染色体に挿入する．関心遺伝子から
の発現は，既述の操作［Studier ＆ Moffatt,Use of ba
cteriophage T7 RNA polymerase to direct selective
high−level expression of cloned genes（1986）,J.M
ol.Biol,189,113−130］に従い，増殖培地にイソプロピ
ルチオガラクトシド（IPTG）を添加して誘発する． セリンプロテアーゼドメインを含有する組換えNS3フ
ラグメントは，プラスミドpT7−７ NS3（1027−1206）
によってトランスフォームされた，大腸菌BL21（DE53）
から，以下に要約する操作によって精製することができ
た． 略述すれば,pT7−７ NS3（1027−1206）プラスミド
を繋留する大腸菌株BL21（DE53）細胞を37℃で,600nmに
おいて約0.8吸収単位の至適密度まで増殖させた．その
後，培地を22℃に冷却し，最終濃度が0.4mMになるよう
にIPTGを添加して所望の蛋白質の産生を誘発させた.IPT
Gの存在下22℃に４〜６時間置いたのち，細胞を収穫し
て,20mMリン酸ナトリウム,pH6.5,0.5％（w/v）の３−
［（３−クロラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］
１−プロパンスルホネート（CHAPS）,50％（v/v）グリ
セロール,10mMジチオスレイトールおよび1mMEDTAを含有
する緩衝液（溶解緩衝液）中でフレンチプレスを用いて
細胞を溶解させる．細胞残屑を遠心分離（120000×g,1
時間）によって除去し，得られたペレットを溶解緩衝液
中に再懸濁し,DNAアーゼＩで消化し，上述のように再均
質化および再遠心分離を行った．溶解緩衝液中で予め平
衡化したＳ−Sepharose Fast Flowイオン交換樹脂（Pha
rmacia）を，プールした上清に添加し（30％v/v），つ
いで，スラリーを４℃で１時間撹拌した．樹脂を沈降さ
せて溶解緩衝液によって完全に洗浄し，クロマトグラフ
ィーカラムに注入した.0〜1M NaCl勾配を適用すると樹
脂からNS3プロテアーゼが溶出した．プロテアーゼ含有
分画を50mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.5,10％（v/v）
グリセロール,0.5％（w/v）CHAPSおよび2mMジチオスレ
イトールで平衡化した．この工程後の蛋白質は純度は90
〜95％であった．＞98％への精製は続いて,50mMトリスp
H7.5,10％（v/v）グリセロール,0.5％（w/v）CHAPSおよ
び2mMジチオスレイトールで平衡化したHeparin Sepharo
se上クロマトグラフィーを行うことによって達成され
た，このカラムからのNS3プロテアーゼの溶出を線状０
〜1M NaCl勾配の適用によって達成された． 精製された蛋白質の濃度はBio−Rad蛋白アッセイ（Bi
o−Rad cat 500−0006）によって測定した． 上述の操作により，大腸菌内で産生された組換えNS3
セリンプロテアーゼは検出可能な切断産物を提供する基
質を切断することにより活性を検出できた．シグナルは
比色法または蛍光法によって検出可能であることが好ま
しい.HPLC等のような方法もまた適当である． たとえば，本願発明者らは基質として,HCVポリプロテ
インのNS4A/4B接合部に相当する合成ペプチドを用い
た． 活性の検出は,5〜1000μＭの基質および0.05〜１μＭ
のプロテアーゼを,25mMトリス塩酸塩pH7.5,3mMジチオス
レイトール,0.5％（w/v）CHAPSおよび10％（v/v）グリ
セロールを含有する緩衝液中,22℃で１〜３時間インキ
ュベートすることによって行われる．トリフルオロ酢酸
を最終濃度0.1％（w/v）になるように添加して反応を停
止させる． 反応生成物をついでC18逆相カラム上HPLCによって分
離し，それらの遠紫外部吸収によって定量する． 上述のように活性の検定を行った場合，大腸菌から精
製された組換えNS3セリンプロテアーゼの示す蛋白分解
活性はきわめて低い．しかしながら，本発明者らは配列
番号:3に記載の合成ペプチドの量を増大させていくと，
組換えNS3セリンプロテアーゼの蛋白分解活性は20倍ま
で刺激されることを見出したのである．組換えNS3セリ
ンプロテアーゼと合成ペプチドが等モル量で存在する場
合に最大の活性を到達する． 上述のアッセイはプロテアーゼ阻害剤の探索に使用す
ることができる．このようなアッセイにおけるNS3プロ
テアーゼの活性は,NS3セリンプロテアーゼドメインのNS
4A由来アミノ酸配列との相互作用に依存するので，上述
のアッセイを用いることにより，最終的にはNS3に従う
蛋白分解活性を阻害するNS3とNS4Aの間の相互作用のア
ンタゴニストの探索も可能である． 例５ 図中のプラスミドの構築の詳細 pCite（NS3）はヌクレオチド3351〜5175（ポリプロテ
インのアミノ酸1007〜1615）からなるHCV−BKゲノムの
一部分を含有する．このプラスミドの構築は,L.Tomei
ら,NS3 is a serine protease required for procesing
of hepatitis C virus polyprotein,J.Virol（1993）6
7,1017−1026に記載されている． pCite（NS4B/5A）は,Tomeiらによって記載されている
プラスミドpCite（NS4−５）から誘導されるSca I−Bam
H Iフラグメントを，予めMsc IおよびBamH Iで消化した
pCite（NS3）中にクローンニングすることによって得ら
れた.pCite（NS4B/5A）は，ヌクレオチド5652〜7467
（ポリプロテインのアミノ酸1774〜2380）からなるHCV
ゲノムの部分を含有する． pCite（NS5AB）はHCV−BKポリプロテインのアミノ酸1
965〜アミノ酸3010の配列からなる蛋白質をコードす
る．このプラスミドを構築するためには,Tomeiら（199
3,前出）に記載されたプラスミドpCite（SX）を最初にA
se Iで消化し,DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント
で処置した．クレノウ酵素の不活性化後に，プラスミド
をXba Iで消化した．ヌクレオチド6224〜9400の領域を
含む，得られたcDNAフラグメントを精製し,Bst XIによ
って生じた末端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化し
たのちベクターpCite−１（登録商標）のBst XIおよびX
ba I部位に挿入した． pCite（NS3/4A）は以下のようにして得られた.HCV−B
Kゲノムのヌクレオチド3711〜5465の領域に相当するcDN
Aフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により，
プライマーとして配列特異的オリゴヌクレオチドを用い
て合成した.UAG停止コドンはアンチセンスオリゴヌクレ
オチド中に適当に挿入された.PCR増幅後，得られたcDNA
を5'末端でSal Iによって切断し,750塩基対の生成物はD
NAポリメラーゼクレノウフラグメントによりNhe I末端
を平滑末端化したのち，プラスミドpCite（SX）のSal I
およびNhe I部位に方向性にクローン化した．得られた
プラスミドは，アミノ酸991〜1711からなるHCV/BKポリ
プロテインの部分をコードする． pCite（NS4A）の構築のためには,HCV−BKゲノムのヌ
クレオチド5281と5465の間の領域（アミノ酸1649〜171
1）に相当するcDNAフラグメントを，プライマーとして
配列特異的なオリゴヌクレオチドを用い，ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）増幅により得た.PCR増幅から得られたc
DNAを続いて,Bst XI消化末端をバクテリオファージT4の
DNAポリメラーゼで平滑化したのち，プラスミドpCite−
１（登録商標）のBst XIおよびStu I部位でクローン化
した． pCite（NS3Δint1237−1635）は，ヌクレオチド4043
とヌクレオチド5235の間からなる配列すべてが削除され
たpCite（NS3/4A）の誘導体である．これは,pCite（NS3
/4A）をBste IIおよび部分的にSca Iで消化することに
よって得られた．興味ある削除を含むフラグメントを，
ついでT4 DNAライガーゼを用いて環化した．このプラ
スミドはpCite（NS3/4A）によってコードされるのと同
一のアミノおよびカルボキシ末端を有する蛋白質をコー
ドするが，セリンプロテアーゼNS3活性に必ずしも必須
ではないことが実験により見出されたアミノ酸1237とア
ミノ酸1635の間に含まれるアミノ酸残基がすべて削除さ
れている． pT7−７［NS3（1027−1206）］はアミノ酸1027〜アミ
ノ酸1206からなるHCV NS3フラグメントをコードするHC
V配列ヌクレオチド3411〜ヌクレオチド3951を含有す
る．このプラスミドを得るためには，ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）によってHCV cDNAを増幅させることによ
り,DNAフラグメントを生成させた.PCRによって得られた
cDNAフラグメントをリン酸化して,Nde Iで消化し，つい
で，予めNde IおよびSma Iで消化したベクターpT7−７
中のバクテリオファージT7プロモーターの下流,T7遺伝
子10蛋白質の最初のATGコドンの直後に，クローン化し
た［Studier ＆ Moffatt,Use of bacteriophage T7RNA
polymerase to direct selective high−level express
ion of cloned genes（1986）,J.Mol.Biol.189,113−13
0］.HCV−由来の配列の直後にアンバーコドンが挿入さ
れたことに注意すべきである．
【配列表】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＳ (72)発明者 ファイラ，クリスチーナ イタリア国 アイ − 00199 ローマ, ビアレ リビア 121 (72)発明者 トメイ，リシア イタリア国 アイ − 80123 ナポリ, ビアレ アウグスト 122 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，（1993）Ｖｏｌ．67，Ｎｏ．７, ｐ．3835−3844 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）NS3プロテアーゼ
    におけるHCV NS4A蛋白質のフラグメントからなる候補
    化合物の補因子活性を決定するための方法であって、 （ａ）NS3プロテアーゼ及びNS3プロテアーゼ基質からな
    る反応混合物を用意し； （ｂ）候補化合物を反応混合物に導入し；及び （ｃ）プロテアーゼ活性での増加が起こったかどうかを
    決定するために、NS3プロテアーゼ活性を測定する工程
    からなる上記方法。
  2. 【請求項２】NS3プロテアーゼは組換え蛋白質である請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】候補化合物のHCV NS3プロテアーゼ阻害活
    性を決定するための方法であって、 （ａ）HCV NS3プロテアーゼ,HCV NS4A補因子及びNS3
    プロテアーゼ基質からなる反応混合物を用意し； （ｂ）候補化合物を反応混合物に導入し；及び （ｃ）プロテアーゼ活性の阻害が起こったかどうかを決
    定するために、NS3プロテアーゼ活性を測定する工程か
    らなる上記方法。
  4. 【請求項４】NS3プロテアーゼ及びNS4A補因子が組換え
    蛋白質である請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】NS3プロテアーゼ及びNS4A補因子が単一の
    組換え蛋白質として一緒に融合されている請求項３記載
    の方法。
  6. 【請求項６】NS3プロテアーゼとNS4A補因子との間の蛋
    白分解での切断部位がNS3とNS4Aとの間の蛋白分解的切
    断に抵抗性になるように変異されている請求項５記載の
    方法。
  7. 【請求項７】NS4A補因子は合成ペプチドである請求項３
    記載の方法。
  8. 【請求項８】NS4A補因子及びNS3プロテアーゼは1:1の比
    で存在する請求項３記載の方法。
  9. 【請求項９】NS3プロテアーゼは配列番号:1の配列を有
    し、NS4A補因子は配列番号:2の配列を有する請求項３記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】HCV NS3プロテアーゼ/NS4A補因子相互
    作用における候補化合物の阻害活性を決定する方法であ
    って、 （ａ）HCV NS3プロテアーゼ,HCV NS4A補因子及びNS3
    プロテアーゼ基質からなる反応混合物を用意し； （ｂ）候補化合物を反応混合物に導入し；及び （ｃ）NS3プロテアーゼ/NS4A補因子相互作用の阻害が起
    こったかどうかを決定するために、NS3プロテアーゼ活
    性を測定する工程からなる上記方法。
  11. 【請求項１１】NS3プロテアーゼ及びNS4A補因子が組換
    え蛋白質である請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】NS3プロテアーゼ及びNS4A補因子が単一
    の組換え蛋白質として一緒に融合されている請求項10記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】NS3プロテアーゼとNS4A補因子との間の
    蛋白分解での切断部位が蛋白分解的切断に抵抗性になる
    ように変異されている請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】NS4A補因子は合成ペプチドである請求項
    10記載の方法。
  15. 【請求項１５】さらにNS3プロテアーゼ/NS4A補因子相互
    作用の阻害の補因子濃度依存性を決定する工程からなる
    請求項10記載の方法。
  16. 【請求項１６】NS3プロテアーゼは配列番号:1の配列を
    有し、NS4A補因子は配列番号:2の配列を有する請求項10
    記載の方法。
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