JP3310298B2 - Ｈｃｖ ｎｓ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリぺプチドを製造し、精製し、分析する方法 - Google Patents

Ｈｃｖ ｎｓ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリぺプチドを製造し、精製し、分析する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分子生物学と、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ウ
イルス学とに関する。さらに詳しくは、本発明はその課
題として、HCV NS3プロテアーゼのタンパク質分解活性
を有するポリペプチドを純粋な形でかつ多量に製造する
方法と、NS3に付随する酵素活性を阻害する化合物を治
療目的のために選択することができる酵素分析法を定義
するために、これらのペプチドのタンパク質分解活性を
in vitroで有効に再現する方法とを有する。
知られているように、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は非
Ａ非Ｂ型肝炎（NANB）の主要な病原体である。HCVが輸
血後NANBウイルス性肝炎の少なくとも90％と、散発性NA
NB肝炎の50％との病因であると推定される。血液ドナー
の選択と、輸血に用いられる血液の免疫学的特徴付けと
には大きな進歩がなされているが、輸血のレシピエント
にはまだ非常に多くのHCV感染が生じている（世界中で
毎年100万件以上の感染）。HCV感染者の約50％が５〜40
年間の範囲でありうる期間内に肝硬変を発症する。さら
に、最近の臨床研究は、慢性的HCV感染症と肝細胞癌の
発症との間に相互関係があることを示唆する。
HCVは約9.4kbのRNAポジティブゲノムを含有する被覆
ウイルス（enveloped virus）である。このウイルスは
フラビウイルス科のメンバーであり、この科の他のメン
バーはフラビウイルスとペスチウイルスである。
HCVのRNAゲノムは最近マッピングされている。世界の
様々な領域において単離されたHCVゲノムからの配列の
比較は、これらの配列が極めてヘテロでありうることを
実証している。HCVゲノムの大部分は9030〜9099ヌクレ
オチドの間で変化しうるオープン・リーディング・フレ
ーム（ORF）によって占められている。このORFは、その
長さが3010〜3033アミノ酸の範囲で変化しうる単ウイル
スポリプロテインをコードする。ウイルス感染サイクル
中に、ポリプロテインはタンパク質分解的にプロセシン
グされて、ウイルスの複製に必要な個々の遺伝子産物に
なる。
HCV構造タンパク質をコードする遺伝子はORFの5'末端
に配置され、非構造タンパク質をコードする領域がORF
の残部を占める。
構造タンパク質はＣ（コア、21kDa）と、E1（エンベ
ロープ、gp37）と、E2（NS1、gp61）とから成る。Ｃは2
1kDaの非グリコシル化タンパク質であり、ウイルス・ヌ
クレオキャプシドをおそらく形成すると思われる。タン
パク質E1は約37kDaの糖タンパク質であり、外部ウイル
スエンベロープの構造タンパク質であると考えられる。
61kDaの別の膜糖タンパク質であるE2は、おそらくウイ
ルスの外部エンベロープ中の第２構造タンパク質である
と思われる。
非構造領域は、その機能が未知である24kDaの疎水性
タンパク質である、NS2（p24）から開始する。
ポリプロテイン中でNS2の次にくる68kDaのタンパク質
であるNS3は、２つの機能的ドメイン、最初の200アミノ
末端アミノ酸内のセリンプロテアーゼ・ドメインと、カ
ルボキシ末端におけるRNA依存性ATPアーゼ・ドメインと
を有すると予想される。
NS4遺伝子領域は、それぞれ、6kDa及び26kDaの疎水性
タンパク質である、NS4（p6）及びNS4B（p26）をコード
する、これらのタンパク質の機能はまだ完全には解明さ
れていない。
NS5遺伝子領域も、それぞれ、56kDa及び65kDaのNS5A
（p56）とNS5B（p65）の２種類のタンパク質をコードす
る。全てのRNA依存性RNAポリメラーゼ中に存在するアミ
ノ酸配列をNS5領域内に認めることができる。このこと
は、NS5領域がウイルス複製機構の成分を含有すること
を示唆する。
様々な分子生物学研究は、シグナルペプチダーゼ、宿
主細胞の小胞体に付随するプロテアーゼが非構造領域、
即ち、部位C/E1、E1/E2及びE2/NS2におけるタンパク質
分解プロセシングの要因であることを示している。
NS3におけるセリンプロテアーゼは、NS3とNS4Aとの
間、NS4AとNS4Bとの間、NS4BとNS5Aとの間及びNS5AとNS
5Bとの間の結合における切断の要因である。特に、この
セリンプロテアーゼによってなされた切断が、切断部位
のアミノ末端側（位置P1）にシステイン残基又はトレオ
ニン残基を残し、カルボキシ末端側（位置P1'）にアラ
ニン残基又はセリン残基を残すことが判明している。NS
3中に含有されるプロテアーゼがタンパク質NS4Aと複合
体を形成する、in vivoのヘテロダイマータンパク質で
あることが実証されている。この複合体の形成は部位NS
4A/NS4B及びNS5A/NS5Bにおけるタンパク質分解活性を高
め、部位NS4B/NS5Aのタンパク質分解プロセシングのた
めの必要な要件である。
HCVの第２プロテアーゼ活性はNS2とNS3との間の切断
の要因であると思われる。このプロテアーゼ活性はNS2
の部分と、セリンプロテアーゼ・ドメインを含有するNS
3の部分との両方を含む領域に含有されるが、後者と同
じ接触機構を用いない。
タンパク質NS3に関連したタンパク質分解活性を妨害
することができる物質は新規な治療剤を構成することが
できると考えられる。実際に、このプロテアーゼ活性の
阻害はHCVポリプロテインの非構造領域のタンパク質分
解プロセシングの中断を含み、その結果として、感染し
た細胞のウイルス複製を防止すると考えられる。
この一連のイベントが、HCVとは異なり、細胞系培養
物を感染させる相同性（homologous）フラビウイルスに
関して実証されている。この場合に、その触媒活性をも
はや行使することができないプロテアーゼの作製を含む
遺伝子操作はウイルスが複製する能力を完全に破壊する
ことが判明している（１）。
さらに、HIVプロテアーゼ活性を妨害することができ
る化合物がこのウイルスの複製を阻害することができる
ことが、in vitroと臨床研究の両方で広範囲に示されて
いる（２）。
治療能力を有する分子の作製に用いられる方法は、こ
の分野で活動する人々に知られている。一般的にいえ
ば、分子的多様性（high molecular diversity）を有す
る多数の単独化学的エンティティ（single chemical en
tity）を含有する化合物群を作成し、次に、単独の活性
剤を同定するために自動化分析を受けさせ、次に、これ
らの活性剤の治療能力を改良するためにさらに化学的修
飾を受けさせる。他のアプローチは、審査中のタンパク
質の生物学的活性を変化させるか又は破壊することがで
きる高結合アフィニティ化合物を開発する目的で、特定
のターゲットタンパク質の基質又はリガンドを合理的に
修飾することを包含しうる。Ｘ線結晶学又は核磁気共鳴
（NMR）として当該分野で公知の方法によって、ターゲ
ットタンパク質の三次元構造を測定することは、タンパ
ク質に特異的に結合し、この結果として、同タンパク質
の生物学的活性を妨害する能力を有する分子の合理的な
設計を可能にする。
Ｃ型肝炎ウイルスNS3タンパク質に含有されるプロテ
アーゼの生物学的活性に干渉することができる化合物に
関する研究は、不変の触媒性を有する精製タンパク質を
充分な量で製造することの困難さと、in vitroにおける
酵素活性を強化するために補因子を用いる必要性とによ
って妨げられる。
それ故、特定の分野では、NS3又は同様な製品を今ま
でに可能であったよりも多量に、かつ阻害剤を選択する
ために充分なin vitro活性を有するように製造する方法
が必要とされている。
本発明は、HCVタンパク質NS3のタンパク質分解活性を
有する、単離精製されたポリペプチドであって、配列番
号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4及び配列番
号:5の配列から選択されるアミノ酸配列を有することを
特徴とするポリペプチドから成る。
本発明はまた、HCV NS3のタンパク質分解活性を有
し、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4
及び配列番号:5の配列によって表されるポリペプチドを
製造するための発現ベクターであって、 前記ポリペプチドの１つをコードするポリヌクレオチ
ドと、 前記ポリペプチドの１つをコードする前記ポリヌクレ
オチドに機能的に結合した、前記宿主細胞中の機能的調
節配列、転写配列及び翻訳配列と、 任意の選択可能なマーカーと を含む発現ベクターをも含む。
本発明はまた、宿主細胞に特定のコードされたポリペ
プチドを選択された配列に発現させるような方法で、配
列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4及び配
列番号:5をコードするDNA配列を含有する発現ベクター
を用いて形質転換させた、真核細胞又は原核細胞に拘わ
らず、宿主細胞にも及ぶ。本発明はさらに、配列番号:
1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4及び配列番号:
5を含む群から選択された配列を有するポリペプチドの
製造方法であって、下記操作： 上記発現ベクターの１つを用いて、真核細胞又は原核
細胞のいずれかの宿主細胞を形質転換させる工程； 選択されたポリペプチドを製造するために望ましいヌ
クレオチド配列を発現させる工程；及び 再可溶化プロトコールを避けて、このようにして得ら
れたポリペプチドを精製する工程 を組合せて含むことを特徴とする方法を含む。
本発明はまた、その目的として、HCV NS3プロテアー
ゼのタンパク質分解活性をin vitroで再現する方法であ
って、NS3に類似した、配列番号:1、配列番号:2、配列
番号:3、配列番号:4及び配列番号:5から成る群から選択
された配列を有する精製ポリペプチドの活性を30〜70mM
Tris pH6.5〜8.5と、３〜30mM ジチオトレイトール
（DTT）と、0.5〜３％ ３−［（３−コラミド−プロピ
ル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホ
ネート（CHAPS）と、30〜70％ グリセロールとを含有
する溶液中で20〜25℃の温度において再現することと、
これらの条件下で、上記ポリペプチドの活性を補因子の
不存在下でもペプチド基質上で動力学的に測定し、定量
することができることを特徴とする方法を有する。
ポリペプチド、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:
3、配列番号:4及び配列番号:5のプロテアーゼ活性の分
析は、検出可能な生成物を生じる基質を切断することに
よって行うことができる。この切断は好ましくは放射能
シグナル、比色シグナル又は蛍光測定シグナルに基づく
方法を用いて検出する。例えばHPLC等のような方法も適
する。本発明によると、用いる基質はHCVポリプロテイ
ンNS4A/NS4B結合に相当する合成ペプチドである。必要
な場合には、配列番号:6のアミノ酸配列又はその一部を
含有するペプチドを、NS3プロテアーゼの補因子として
用いることもできる。
基質として用いるために適したペプチドは、配列番
号:7の配列と、Ｎ及び／又はＣ末端欠失を有するその誘
導体（配列番号:8〜12、14、18〜20）によって表される
ペプチドと、配列番号:47の配列によって表されるペプ
チドである。配列番号:18〜20、特に配列番号:18の配列
によって表されるデカペプチドと、それらから誘導され
る配列番号:29〜32、35の配列とが特に適する。
これらのペプチドは100〜200nMの後者の濃度における
NS3プロテアーゼ活性の高スループット分析に用いるこ
とができる。
本発明によると、デカペプチド基質（配列中に少なく
とも１つのエステル結合を有するペプチド）も、NS3プ
ロテアーゼ活性の高スループット分析に有利に用いるこ
とができる。充分な基質転化に適合する最低に可能な酵
素濃度において分析を行うことが望ましいということが
実際に知られている。このことは阻害に対する感度を最
大にし、化合物混合物又は組合せライブラリー中に非常
に低い濃度で存在する阻害剤のスクリーニングを可能に
する。残基P1とP1'間の切断しやすい結合に標準アミド
を有するNS3プロテアーゼの基質は、30〜100M-1s-1のK
cat/Km値を有する。これは100〜200nMの高スループット
分析の酵素濃度の実際の範囲を設定する。この濃度を減
ずるためには、さらに高いKcat/Km値を有する基質を用
いることが必要である。P1とP1'間のエステル結合を含
有する基質がこのために理想的に適する、というのは、
アシル−酵素中間体の形成が熱力学的に一層有利なエス
テル交換反応のために非常に容易に達成されるからであ
る（８）。本発明によるデプシペプチド基質は非常に高
いKcat/Km値を有し、これは高スループット分析におけ
るNS3濃度の有効範囲を0.5〜2nMにする。これらの基質
は標準の化学的方法によって固相で高収率において合成
することができる。
慣用的な分析法は高スループット・スクリーニングに
適するが、これらの分析法は、生成物を便利に検出する
ことができるまでに、基質の少なくとも10％を加水分解
することを必要とする。このことは、正確な動力学的研
究のために重要な真の初期速度の決定を妨げる。これら
の困難さを克服するために、プロテアーゼ活性の連続的
モニターリングを可能にする分析法が開発されている。
この分析法は、基質の加水分解の程度に正比例する直接
の連続的なシグナル発生を可能にし、それ故に反応生成
物から基質を分離する必要性を回避することのできる、
特別仕立ての合成基質に依存する。用いるデプシペプチ
ド（配列番号:45と46）（これらの化学式は図12に記載
する）は、共鳴エネルギー転移（RET）に基づく内部的
に消光される蛍光発生基質（internally quenched fluo
rogenic substrate）である。これらはペプチドの一方
の末端近くの蛍光ドナー、５−［（2'−アミノエチル）
アミノ］ナフタレンスルホン酸（EDANS）と、他方の末
端近くのアクセプター基、４−［［4'−（ジメチルアミ
ノ）フェニル］アゾ］安息香酸（DABCYL）とを含有す
る。この種の基質の蛍光はドナーとアクセプターとの間
の分子内RETによって最初に消光されるが、酵素が基質
を切断すると、蛍光が増大する。EDANSとDABCYLとは、
前者の蛍光発光と後者の吸光との間の良好なスペクトル
・オーバーラップのために、ドナー／アクセプター対と
して選択された（13〜17）。RET効率はドナーとアクセ
プターとの間の距離に依存する、即ち、両者が接近すれ
ばするほど、消光は高度になる。EDANS/DABCYL組合せに
関して、50％エネルギー転移のためのFoerster距離
（R0）は33Åである。基質中の報告されたEDANS/DABCYL
間の最大距離は11アミノ酸であり（19）、これはペプチ
ドの伸長された構造を推定すると、Ｒ＝39.8Åに相当
し、算出RET効率は24.5％である。これは基質切断時の
蛍光の10倍増大に相当する。
これまでは、本発明を一般的に説明した。次には、本
発明の目的、特徴、利点及び操作方法をさらに良好に理
解するために、下記実施例によって、本発明の特定の実
施態様をさらに詳細に説明する。
図１は、Spodoptera frugiperdaクローン９細胞に配
列番号:1によって表されるポリペプチドの転移と発現の
ために用いられるプラスミドベクターを示す。
図2Aと2Bは、それぞれ、配列番号:1、配列番号:2、配
列番号:3、配列番号:4及び配列番号:5の配列によって表
されるポリペプチドのE.coliにおける転移と発現のため
のプラスミド・ベクターを示す。
図３は、グリセロールの濃度の関数としてのNS3活性
を示す。
図４は、CHAPS、３−「（３−コラミド−プロピル）
−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホネー
トの濃度の関数としてのNS3活性を示す。
図５は、pHの関数としてのNS3活性を示す。
図６は、イオン強度の関数としてのNS3活性を示す。
図７は、基質としてペプチド Ac−Asp−Glu−Met−G
lu−Glu−Cys−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Lys−
ε−（3H）−Ac（配列番号:47）を用いるNS3活性を測定
するための酵素分析のダイヤグラムを示す。
図８は、配列番号:42の配列によって表されるデプシ
ペプチド基質S1を合成するための反応ダイヤグラムを示
す。
図９は、配列番号:43の配列によって表されるデプシ
ペプチド基質S2を合成するための反応ダイヤグラムを示
す。
図10は、配列番号:44の配列によって表される放射性
デプシペプチド基質S1を合成するための反応ダイヤグラ
ムを示す。
図11は、NS3プロテアーゼ活性を測定するための、放
射能シグナルに基づいた高スループット分析法を示す。
図12は、RET分子内蛍光消光に基づいてNS3活性を連続
的に分析するためのデプシペプチド基質（配列番号:45
と配列番号:46）の化学式を示す。
図13は、デプシペプチド基質S3（配列番号:45）を合
成するための反応ダイヤグラムを示す。
図14Aと図14Bは、それぞれ、関連分析法における基質
S3（配列番号:45）によるNS3プロテアーゼの動力学パラ
メーターと、時間の関数としての蛍光とを示す。
実施例１ Spodoptera frugiperdaクローン９培養細胞におけるHCV
NS3プロテアーゼの発現方法 バキュロウイルスベクターに感染した、例えばSpodop
tera frugiperdaクローン９（Sf9）細胞のような昆虫
培養細胞中の外来遺伝子の発現系は、技術上公知である
（３）。異種遺伝子は通常、Autographa california核
多角体病ウイルス又はBombix mori核多角体病ウイルス
の強度なポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ
る。相同的組換えによるバキュロウイルスベクターの所
望の部位への異種DNAの導入方法も技術上周知である
（４）。
プラスミドベクターpBacNS3（1039〜1226）はpBlueBa
c III（Invitrogen）の誘導体であり、NS3の活性を有す
るポリペプチド（1039〜1226）をコードする遺伝子を転
移させるために構築した。この目的のために、配列番
号:1に表されたこのポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列は、配列の5'にATGコドンを、3'にTAG停止コド
ンを挿入するオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって
得られた。この方法によって得られたフラグメントを、
Klenow DNAポリメラーゼフラグメントによる処理に続
いて、ベクターpBlueBac IIIのBamH1部位に挿入した。
このプラスミドは図１に示す。
Spodoptera frugiperdaクローン９（Sf9）細胞とバ
キュロウイルス組換えキットとは、Invitrogenから購入
した。細胞は10％ウシ胎児血清（Gibco）を含有する完
全Grace昆虫培地（Gibco）に含めて27℃においてディッ
シュ上で又は懸濁液中で増殖させた。バキュロウイルス
構築体のトランスフェクション、組換え及び選択を製造
者の指示に従って行った。
タンパク質発現のために、約５ウイルス粒子／細胞の
比で2x106細胞/mlの密度において、Sf9細胞を組換えバ
キュロウイルスによって感染させた。細胞を懸濁液中で
23℃において72時間培養した。通常の最適増殖温度に相
当する27℃から23℃に温度を低下させることが、可溶性
で活性なタンパク質を得るために重要である。
遠心分離によって細胞を回収し、それらをPBS（20mM
リン酸ナトリウムpH7.4、140mM NaCl）によって洗浄
した後に、ペレットを25mM リン酸ナトリウムpH6.5、2
0％グリセロール、0.5％３−［（３−コラミド−プロピ
ル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホ
ネート（CHAPS）、10mMジチオトレイトール（DTT）、1m
Mエチレンジアミノ四酢酸（EDTA）中に再懸濁させた。B
ranson 250機器を用いた、それぞれ30秒間の持続期間に
よる４サイクルの10Wにおける超音波処理によって、細
胞を４℃において破壊した。この方法で得られたホモジ
ネートを120,000xgにおける遠心分離によって１時間ペ
レット化し、上清を2ml/分の流速で、25mMリン酸ナトリ
ウムpH6.5、10％グリセロール、2mM DTT、1mM EDTA、
0.1％CHAPSと平衡させたHR26/10S−Sepharoseカラム（P
harmacia）にかけた。カラムの２倍量によって洗浄した
後に、０〜1MのNaCl勾配によって溶出させた。プロテア
ーゼを含有する画分をウェスターンブロッティング法を
用いてNS3特異性ポリクローナル抗体によって同定し、Y
m10膜を装備したAmicon限外濾過セルを用いて3mlに濃縮
してから、50mMリン酸ナトリウムpH7.5、10％グリセロ
ール、2mM DTT、0.1％CHAPS、1mM EDTAと平衡させたS
uperdex 75 HR26/60カラム（Pharmacia）上で、1ml/分
の流速度でクロマトグラフィーした。プロテアーゼを含
有する画分をプールし、前記カラムに用いた同じ緩衝剤
と平衡させたMono−Ｓ HR5/5カラム（Pharmacia）上で
さらにクロマトグラフィーを受けさせた。このカラムか
ら、０〜0.5Mの線状NaCl勾配を適用して、プロテアーゼ
を溶出した。プロテアーゼを−80℃において50％グリセ
ロール、0.5％CHAPS、10mM DTT及び50mMリン酸ナトリ
ウムpH7.5中に保存した。このプロセスの収率は0.5mg/l
細胞である。精製タンパク質は、50mM Tris（pH7.
5）、50％グリセロール、２％CHAPS、30mM DTT中で23
℃において、NS4AとNS4Bとの間のポリプロテイン切断部
位から誘導されたペプチド基質 Fmoc−Tyr−Gln−Glu
−Phe−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−Cys−Ala−Ser−His
−Leu−Pro−Tyr−Ile−Glu−Gln−Gly（配列番号:7）
を用いて測定して、触媒活性Kcat/Km＝20〜200 M-1s-1
を有する。この反応から生ずる切断生成物をHPLCを用い
て分離し、単離し、質量分光測定によって同定し、シス
テインとアラニンとの間でタンパク質分解切断が行われ
たことを確認した。活性を測定するために必要なプロテ
アーゼ濃度は100nM〜1.6μＭの範囲であった。
実施例２ E.coliにおけるHCV NS3プロテアーゼの発現方法 それぞれ、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配
列番号:4及び配列番号:5に表示されるポリペプチドのE.
coliにおける発現を可能にするために、図2Aと2Bに示す
プラスミドpT7−７（NS3 1039〜1226）、pT7−７（NS3
1039〜1206）、pT7−７（NS3 1027〜1206）及びpT7
−７（NS3 1033〜1206）を構築した。これらのタンパ
ク質フラグメントはHCV NS3タンパク質のプロテアーゼ
ドメインの変異体（variant）を含有する。HCV cDNAの
各フラグメントをバクテリオファージT7φ10プロモータ
ーの下流、ファージT7遺伝子10タンパク質の第1ATGコド
ンによるフレーム内に、実際に知られた方法を用いてク
ローン化した。NS3配列を含有するpT7−７プラスミド
は、これらのプラスミドによって形質転換したE.coli細
胞を選択するマーカーとして用いることができるβ−ラ
クタマーゼ酵素の遺伝子をも含有する。
これらのプラスミドを次にE.coli菌株BL21（DE53）に
形質転換する、これは通常T7プロモーターを含有する発
現ベクターにクローン化した遺伝子の高レベル発現のた
めに用いられる。E.coliのこの菌株では、T7ポリメラー
ゼ遺伝子は、BL21細胞の染色体中に取り込まれるバクテ
リオファージλDE53上で運ばれる（５）。問題の遺伝子
からの発現は、今までに開示された方法に従って増殖培
地にイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）を添加する
ことによって誘導される（５）。上記プラスミドの１つ
を用いて発現されるタンパク質の90％以上が封入体中に
不溶性形で見い出され、これらから当該分野に公知のリ
フォールディング方法に従って可溶性で活性なタンパク
質を得ることが可能である（例えば（６）を参照のこ
と）。リフォールディング・プロトコールはしばしば、
触媒活性タンパク質の可変な収率を有し、これらのプロ
トコールは極めて制御された条件を必要とし、さもなく
ば、タンパク質の不可逆的な修飾（例えば、尿素の存在
下でのカルバミル化）を生じるか、又は例えば非常に希
釈されたタンパク質溶液の使用若しくは非常に多量のサ
ンプルの透析のような、実際的でない操作を必要とす
る。
これらの問題を避けるために、可溶な活性形でHCVプ
ロテアーゼを製造して、再可溶化プロトコールを回避す
るために、以下で述べる方法が開発されている：即ち、
上記プラスミドの１つを用いて形質転換したE.coli BL
21（DE53）を600nmにおいて0.8OD（ODは光学密度を意味
する）の吸光度を生じる細胞密度に達するまで37℃にお
いて増殖させた。この時点において、温度を15〜20分間
内に30℃に下げて、400μM IPTGを加えて、タンパク質
の発現を誘導した。次に、温度をさらに20〜30分間に22
〜24℃に下げた。培養物をこの温度においてさらに４時
間撹拌した。この時点において、細胞を遠心分離によっ
て回収して、PBSを用いて洗浄した。
精製方法 上記操作から得られたペレットを氷上で５分間インキ
ュベートしてから、４℃に予め冷却した25mMリン酸ナト
リウムpH6.5、50％グリセロール、0.5％CHAPS、10mM D
TT、1mM EDTA（緩衝剤Ａ）中に再懸濁した。この緩衝
剤の10mlを細菌培養物の１リットルに対して用いた。さ
らに５〜10分間氷上でインキュベートした後に、細胞懸
濁液をFrenchプレスを用いてホモジナイズした。得られ
たホモジネートを120,000xgにおいて遠心分離した。こ
の遠心分離からの上清を氷上に保存し、ペレットを緩衝
剤Ａ（細胞培養物の１リットルにつき1ml）に再懸濁し
た。1mM MgCl2とDNアーゼＩとを加えた後に、懸濁液を
20℃において10分間インキュベートし、120,000xgにお
いて１時間、再遠心分離した。この第２遠心分離からの
上清を第１上清と共にプールし、得られたタンパク質溶
液を、25mMリン酸ナトリウムpH6.5、10％グリセロー
ル、0.5％CHAPS、3mM DTT、1mM EDTA（緩衝剤Ｂ）と
平衡させたＳ−セファロース（Sepharose）（又はSP−S
epharose）樹脂（Pharmacia）に吸着させた。5mlの緩衝
剤Ｂ中に懸濁させた10mlの樹脂を細胞培養物の１リット
ルにつき用いた。樹脂を４℃において１時間撹拌し、濾
過によって回収し、緩衝剤Ｂによって洗浄し、適当なク
ロマトグラフィーカラムに注入した。０〜1MのNaCl勾配
によってプロテアーゼを溶出した。プロテアーゼを含有
する画分をウェスターン・ブロッティングを用いて同定
し、プールし、Centriprep 10濃縮機（Amicon）を用い
て、BIORAD法によって測定してタンパク質中で６〜10mg
/mlの濃度に達するまで濃縮した。3mlまでのこの溶液を
HR26/60 Superdex 75に負荷した、又は20mlまでをHR60/
600 Superdex 75（両方ともPharmacia）に負荷した、樹
脂は50mMリン酸ナトリウムpH7.5、10％グリセロール、3
mM DTT、0.5％CHAPS（緩衝剤Ｃ）と平衡させたもので
ある、クロマトグラフィーは1ml/分（HR26/60）又は5ml
/分（HR60/600）で行った。プロテアーゼ含有画分をプ
ールし、緩衝剤Ｃと平衡させたHR5/5 Mono S（Pharmaci
a）上でのクロマトグラフィーによってさらに精製し
た。プロテアーゼをこのカラムから０〜0.5MのNaCl勾配
によって溶出した。次の改良によって均質になるまでの
精製も可能であった：即ち、Ｓ−Sepharoseからの溶出
後に、プロテアーゼ含有画分を緩衝剤Ｃ中で1:4に希釈
し、ヘパリン−セファロース（Heparin−Sepharose）上
に負荷した。この樹脂からの溶出は０〜0.5MのNaCl勾配
によって行った。次に、タンパク質をヒドロキシアパタ
イト又はSuperdex 75上で上述したようにクロマトグラ
フィーした。収量は細菌培養物１リットルにつき精製タ
ンパク質１〜2mgである。
精製タンパク質の特徴付け 精製タンパク質をゲル濾過、逆相HPLC、質量分光測定
及びＮ−末端配列分析によって特徴付けた。
ゲル濾過分析実験は、このタンパク質がモノマーであ
ることを示した。pT7−７（NS3 1027〜1206）を用いて
発現させたタンパク質は逆相HPLCクロマトグラフィーに
よると３ピークを示す。質量分光測定分析とＮ−末端配
列の測定とは、分子のＮ−末端部分の不均一性を示し
た。下記Ｎ−末端配列を有する３形態が発見された： この問題を回避するために、２つの実験方法を採用し
た： 1.100μg/mlのキモスタチン プロテアーゼ阻害剤の
存在下でのホモジナイゼーション。この阻害剤はHCVプ
ロテアーゼ活性を阻害しないが、フェニルアラニン及び
チロシンのような芳香族残基に特異的な、キモトリプシ
ン型プロテアーゼを阻害する。この方法で、95％を越え
る形態２を含む単分子種を精製することが可能であっ
た。
2.プラスミドpT7−７（NS3 1033〜1206）による形態
３に相当するプロテアーゼの産生。この方法では、95％
を越える形態３を含むタンパク質が精製された。
実施例３ HCV NS3プロテアーゼの活性をin vitroで再現する方法 活性の再現のための化学的及び物理的条件の定義 ペプチド Fmoc−Tyr−Gln−Glu−Phe−Asp−Glu−Me
t−Glu−Glu−Cys−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Il
e−Glu−Gln−Gly（配列番号:7）の切断を触媒する精製
プロテアーゼの能力を用いて、活性のための最適条件を
定義した。切断は加水分解生成物から基質を逆相HPLCに
よって分離することによって検出した。この目的のため
に、緩衝剤と、プロテアーゼと共にインキュベートした
ペプチドとを含有する混合物を逆相Lichrospher RP−1
8カラム（Merck）に注入して、0.1％トリフルオロ酢酸
を含有するアセトニトリル勾配によって溶出した。切断
生成物は適当な標準の同時注入と、質量分光測定とによ
って同定した。これらの実験のために、実施例１と２に
述べた方法の１つによって得られたタンパク質を用い
た。
グリセロール濃度への活性の依存性を50mM Tris（pH
7.5）、２％CHAPS、30mM DTTを含有する緩衝剤中で評
価した。濃度を高めながら、グリセロールをこの緩衝剤
に加えて、相対的プロテアーゼ活性を測定した。図３は
この実験の結果を示し、50％（v/v）グリセロールが最
適レベルであることを実証する。次の実験では、この濃
度を50％に一定に維持して、CHAPSの濃度を変化させた
（図４）。この方法では、２％CHAPS（w/v）のレベルが
最適濃度であることが判明した。CHAPSの代わりに、本
発明によるポリペプチドに触媒活性を維持することの必
要性に適合した、他の界面活性剤を用いることも可能で
あった。これらの界面活性剤の一部は、ヘプチル−β−
Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド、デシル−β−Ｄ−グルコマルトシド、ノニル−β
−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グル
コピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、
オクチル−β−Ｄ−チオ−グルコピラノシド、Nonidet
P−40、Tween−20である。
最適のCHAPS及びグリセロール濃度では、プロテアー
ゼはpH8.5において最適活性を示す（図５）。しかし、
このpHにおいては、経時的安定性がpH7.5において観察
される安定性よりも低い。活性に対するイオン強度の影
響を測定するために、NaClを用いて滴定を行った。この
実験は、高いイオン強度ではプロテアーゼ活性が阻害さ
れることを示した（図９）。データの動力学的分析は、
100mMまでの濃度において塩化物イオンが競合阻害剤で
あることを示した。
したがって、精製HCVプロテアーゼ活性のin vitro分
析のための最適条件:50mM Tris（pH7.5）、３〜30mM
DTT、２％CHAPS、50％グリセロールを定義することも可
能であった。温度への活性の依存性を、動力学的定数K
catの対数が温度の逆関数として与えられるアレニウス
プロットを用いて分析した。このグラフは25℃を超える
温度における不連続性を示し、このことは活性の低下と
同時に形態の変化が生ずることを実証する。したがっ
て、最適温度は約22〜23℃であると判定された。
上述したように、タンパク質NS4AはHCVプロテアーゼ
の補因子である。Ｎ及びＣの末端欠失実験は配列番号:6
に表示した配列を有するペプチドPep4Aを、最適活性化
をまだ誘導することができる最小ドメインとして定義し
ている。トランスフェクション又はin vitro翻訳実験で
は、最小NS4A配列を含有するポリペプチドの添加が有効
に切断するために重要である。Pep4Aの添加は、上述し
た分析条件において精製プロテアーゼの活性を顕著に増
大させることができる。この活性化の動力学的特徴は以
下で述べる。滴定実験を用いて、プロテアーゼの300nM
の濃度におけるこの相互作用に関して1:1の化学量論が
判明し、kd＜300nMが示された。
活性分析のための最適基質の定義 上述したHPLC法を用いてその切断がまだ検出されるこ
とができる最小基質を定義するために、上述したペプチ
ド Fmoc−Tyr−Gln−Glu−Phe−Asp−Glu−Met−Glu−
Glu−Cys−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Ile−Glu−
Gln−Gly（配列番号:7）の誘導体を、Ｎ−及び／又はＣ
−末端欠失によって合成した。これらのペプチドを上記
章で定義した条件下、100nM〜1.6μＭのプロテアーゼの
存在下でインキュベートした。基質として用いたペプチ
ドのアミノ酸残基の、以下で採用する命名法は、Schech
terとBergerが（７）において指定したものである。残
基はPn・・・・P3、P2、P1、P1'、P2',P3'・・・・・P
n'として定義され、加水分解された結合はP1−P1'（Cys
とAlaとの間の結合）である。表１はこの実験の動力学
的データを示し、P6とP3'又はP4'をまだ有効に切断され
る基質の極限として定義する。P6又はP3'を越えた欠失
は、それによって各ペプチドがまだ基質として作用しう
るkcat/Kmとして測定される効力を顕著に低下させる。P
4'の欠失はkcat/Kmをあまり顕著でなく低下させるが、P
HLCによる基質と切断点との分離はナノペプチドP6−P3'
に関するよりもデカペプチドP6−P4'に関する方が良好
であるので、デカペプチドP6−P4'が最適基質として定
義されている。
動力学パラメーターKm、kcat、kcat/kmは、他の２つ
の分子間切断部位NS4B/5AとNS5A/5Bに相当するデカペプ
チドP6−P4'に関して測定したものであり、このデータ
を部位NS4A/4Bに相当するペプチドP6−P4'を用いて得ら
れたデータと比較した（表２）。これらの動力学は化学
量論濃度のPep4Aの不存在下と存在下の両方で得た。こ
の方法で得られた動力学的データの分析は、Pep4Aが主
としてkcatに影響を与えることを実証する。単一基質の
Km値を比較すると、P5とP6における２つの負の電荷の存
在がペプチド基質の結合力（bonding effectiveness）
を決定するということが明らかになる。実際に、位置P6
とP5にAsp又はGlu残基を有する、部位NS4A/4BとNS5A/5B
に相当するデカペプチドは、位置P6に単一電荷を有する
部位NS4B/5Aに相当するペプチドに比べて同様の、有意
に低いKmを有する。
切断部位NS4A/4Bに相当する配列P6−P4'内の単一残基
の相対的重要性に関して、各アミノ酸を単独にアラニン
に突然変異させ、次にこのようにして得られた突然変異
体ペプチドの動力学パラメーターを測定することによっ
て、さらに研究を行った。結果は表３に示す。この実験
は、有効な切断に関する単一残基の重要性の下記スケー
ル:P1＞＞3P＝P5＝P6＞P2＝P4を同定する。P'部分の修
飾は切断速度に有意な影響を及ぼさない。この情報を用
いて、阻害剤の同定のために有用なプロテアーゼ活性分
析法を開発した。これらの方法は以下に述べる。
P6とP1'における残基の重要性のさらに詳細な評価に
関しては、一連のペプチドP6−P4'を合成し、これらの
ペプチドに修飾を導入した。これらの実験の結果は表４
に示す。これらの実験の結果は位置P6における負の電荷
の重要性を強調する。実際に、この位置におけるAsp又
はGluは、区別がつかないKmによって受容される。Asnの
導入による電荷の中和はKmを有意に増加させるが、Lys
残基の導入による電荷の逆転はKmを極めて顕著に増加さ
せる。
Serによる位置P1'のAlaの置換は有意な影響を与えな
いが、Pheによる置換はkcat/Kmとして測定される、生成
基質の切断速度を低下させる。表５に記載する位置P1の
一連の突然変異に関して分析をおこなった。スレオニ
ン、アリルグリシン、α−アミノ酪酸、ノルバリン及び
バリンによる、この位置のシステインの置換は、生成基
質が非修飾基質に比べて有意に低い、kcat/Kmとして表
現される効率によって切断されるとしても、受容され
る。
基質特異性に関する情報は、酵素分析法の開発と、修
飾基質配列に基づく阻害剤の合成との両方のために用い
ることができる。例えば、修飾されたP1残基を有する基
質ペプチドは350〜90μＭの阻害定数を有するプロテア
ーゼの競合阻害剤である（表６）。アルデヒド、トリフ
ルオロメチルケトン、ジフルオロメチルケトン、ジケト
ン、ケトエステル、ケトアミド又はα−ケト複素環、ボ
ロン酸（boronic acid）及びモノアロメチルケトン基を
導入することによって、これらのペプチドをさらに修飾
して、それらの阻害力を高めることができる。特異性に
関する情報は、例えばハロ−エノールアセトン類、イソ
クマリン類、β−ラクタム類、スクシンイミド類、ピロ
ン類、ベゾキシアジノン類（bezoxyazynones）、ベゾイ
ソ−チアゾリン類（bezoiso−thiazolines）又は潜在
（latent）イソシアネート類のような、ペプチドに基づ
かない阻害剤の合成をも可能にすることができる。
実施例４ 阻害剤探索のためのin vitroプロテアーゼ活性の利用方
法 アミド基質を用いた自動分析法 切断部位NS4A/NS4Bから誘導されたペプチド Ac−Asp
−Glu−Met−Glu−Glu−Cys−Ala−Ser−His−Leu−Pro
−Tyr−Lys−ε−（3H）Ac（配列番号:47）を下記動力
学パラメーター:Km＝79μＭ、kcat＝0.79分-1及びkcat/
Km＝103M-1s-1を有するNS3プロテアーゼによって切断す
る。２〜10Ci/mmolの比活性を有する標識ペプチド400,0
00cpmを40μＭ（Km/2）の非標識ペプチドと共に、50mM
Tris（pH7.5）、50％グリセロール、３％CHAPS、10mM
DTT中で、200nMプロテアーゼと１μＭ Pep4Aの存在下
で23℃において３時間インキュベートした。この期間中
に、ペプチド基質の20％が切断された。切断生成物は以
下に述べ、図７に要約する方法に従って定量することが
できる。この図から知ることができるように、混合物を
TSK−DEAEアニオン交換体と接触させて配置する。この
交換体から流出する画分を濾過し、沈降させ、遠心分離
する。透明な画分に関して放射能を測定する、アミド基
質と左側フラグメントとがアニオン交換体に結合した状
態で留まると仮定して、この放射能量は排他的に右側フ
ラグメント（Ｃ−末端）に関するものである。阻害剤の
添加は標識された切断フラグメントの脱離速度（releas
e rate）を低下させる。阻害剤が有効であればあるほ
ど、アニオン交換体から流出する画分に測定される放射
能は減少する。
実施例５ デプシペプチド基質S1:Ac−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−
Abu−Ψ［COO］−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Lys
（Ｎε−Ac）−NH2（配列番号:8）の合成 この合成は連続フローFmoc−ポリアミド方法（９）を
用いて完全に固相でおこなった。保護基組合せは、α−
アミノ基のための塩基−不安定性Ｎα−Fmocと、側鎖の
ための酸−不安定性保護:Asp（Ot−Bu）、Glu（Ot−B
u）、Tyr（ｔ−Bu）及びHis（trt）とであった。用いた
ポリマーは修飾Rinkアミドリンカー（10）によって誘導
体化された複合ケイソウ土−ポリアミド（９）、ｐ−
［（R,S）−ａ−［１−（9H−フルオレン−９−イル）
−メトキシホルムアミド］−2,4−ジメトキシベンジ
ル］−フェノキシ酢酸（11）（NovaSyn（登録商標）KR1
25,0.1mmol/g）であった。樹脂、アミノ酸誘導体、活性
剤及び他の全ての試薬は商業的ソースからの入手可能な
最高等級であった。この合成は図８に示したスキームに
従って行った。カップリングは、Fmoc−アミノ酸/DIPC/
HOBt（1:1:1:1）活性化を用いたＬ−（＋）−乳酸以外
は、Fmoc−アミノ酸/PyBOP/HOBt/DIEA（1:1:1:2）活性
化を用いて、樹脂遊離アミノ基に比べて５倍過剰な活性
化アミノ酸によっておこなった。乳酸の遊離ヒドロキシ
ルに対するAbuのエステル化を、触媒量（0.1当量）のDM
APの存在下で対称的無水物（Fmoc−Abu）20を用いて、
室温において30分間行った（12）：この反応を２回繰り
返して、90％収率を得た；触媒の不存在下では、残留す
る遊離ヒドロキシルはその後の合成操作において不反応
性である。アセンブリの終了時に、樹脂をDMF、メタノ
ール及びCH2Cl2によって洗浄して、16時間真空乾燥させ
た。乾燥ペプチド−樹脂をTFA/水／トリイソプロピルシ
ラン（92.5:5:2.5）によって室温において1.5時間処理
した；樹脂を濾別し、ペプチドを冷メチルｔ−Buエーテ
ルによって沈殿させ；沈殿を0.1％TFA含有50％水／アセ
トニトリル中に再溶解して、凍結乾燥した。
溶離剤として（Ａ）水と（Ｂ）0.1％TFA含有アセトニ
トリルとを、５分間にわたって22％Ｂ、次に25分間にわ
たって22〜27％Ｂのステップ勾配で、流速度12ml/分に
おいて用いた、Nucleosy l Ｃ−18カラム（250x21mm、
７μＭ）上での分取HPLCによって、＞98均質性までの精
製が達成された。これらの条件下で、ペプチドは21.9分
間目に溶出する。純粋な物質を含有する画分をプール
し、凍結乾燥した：収率35％。
実施例６ デプシペプチド基質S2:Ac−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−
Thr−Ψ−［COO］−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Ly
s（Ｎε−Ac）−NH2（配列番号:43）の合成 この合成は上記実施例に述べたように行った。乳酸へ
のThrのエステル化は70％収率を得るために３回の反復
を必要とし、Thr残基の３％ラセミ化をも付随した。し
かし、Ｄ−Thrジアステレオマーはクロマトグラフィー
によってＬ−異性体から良好に分割され、分取HPLCによ
って容易に分割された。用いた勾配は５分間にわたって
21％Ｂ、次に20分間にわたって21〜22％Ｂであり、所望
のペプチドは19.7分間目に溶出した：収率24％。
実施例７ デプシペプチド基質S1:Ac−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−
Abu−Ψ−［COO］−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Ly
s（Ｎε−［3H］−CH3CO）−NH2（配列番号:44）の合成 ペプチドS1をＣ−末端リシンのＮε−アミノ基におい
て選択的に標識するために、保護された先駆体 Ac−As
p（Ot−Bu）−Glu（Ot−Bu）−Met−Glu（Ot−Bu）−Gl
u（Ot−Bu）−Abu−Ψ−［COO］−Ala−Ser（ｔ−Bu）
−His（Trt）−Leu−Pro−Tyr（ｔ−Bu）−Lys−CONH2
を図10のスキームに従って樹脂上にアセンブルした。
（Ｎε−Ac）−S1の合成に比べた唯一の変化はFmoc−Ly
s（Ｎε−Ac）−OHの代わりにFmoc−Lys（Alloc）−OH
を用いたことであった。Alloc保護はFmocとｔ−Buに基
づく保護基に対して直角（orthogonal）であり、５％酢
酸と2.5％Ｎ−メチルモルホリンとを含有するCH3Cl溶液
中での（０）PdP［（Ph3）］による２時間処理によって
脱離される。
乾燥ペプチド−樹脂（0.07mmol/g、60mg）を［3H］無
水酢酸（25mCi、5.7mCi/mmol）と、室温において16時間
反応させた。次に、10倍過剰な非放射性無水酢酸を用い
て、反応を完成させた。次に、樹脂をDMFによって洗浄
し、上述したように処理した。分取HPLC後に、＞98％純
粋なペプチド Ac−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−Abu−Ψ
−［COO］−Ala−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Lys（Ｎε
−［3H］−CH3CO）−NH2が0.98mCi/mmolの比活性を有し
て得られた。
HPLCに基づく分析法を用いて、放射性デプシペプチド
基質S1（配列番号:44）に関して下記動力学パラメータ
ーが得られた： Kcat（min-1）＝９ Km（μＭ）＝11 Kcat/Km（M-1s-1）＝13.636 同じ分析法を用いて、放射性基質S2に関して下記動力
学パラメーターが得られる： Kcat（min-1）＝16 Km（μＭ）＝96 Kcat/Km（M-1s-1）＝2.780. 放射性デプシペプチド基質の合成は、図11に概略的に
説明したNS3プロテアーゼ活性の測定のための高スルー
プット分析の設定を可能にする。原理は次の通りであ
る：完全な基質と、酵素切断に由来するＮ−末端フラグ
メント（Ac−Asp−Glu−Met−Glu−Glu−Abu−OH）とは
極度に酸性であるが、Ｃ−末端フラグメント［HO−CH
（CH3）CO−Ser−His−Leu−Pro−Tyr−Lys（Ｎε−［3
H］−CH3CO）−NH2］は、pHによると、中性又は塩基性
である。それ故、アニオン交換樹脂上で２つの酸性種を
捕捉し、Ｃ−末端フラグメントを溶液中に残すことが可
能である。Ｃ−末端フラグメントが放射性マーカー（こ
の場合には、Ｃ−末端リシンのε−アミノ基に共有結合
したトリチウム化アセテート）を含有する場合には、樹
脂は処理基質を非処理基質から識別することができるの
で、酵素と共にインキュベーションし、イオン交換体に
よって処理した後に溶液中に残留する放射能量を測定す
ることによってタンパク質分解活性を定量することを可
能にすると考えられる。全体のプロセスは実施例４のア
ミド基質に基づく高スループット分析に用いたプロセス
と本質的に同じであるが、この場合に用いるpHは7.5で
はなく7.0であり、エステル結合の自然加水分解を最小
にする（23℃において0.6％／時）。
実施例８ デプシペプチド基質S3とS4: Ac−Asp−Glu−Asp−（EDANS）−Glu−Glu−Abu−Ψ［C
OO］−Ala−Ser−Lys−（DABCYL）NH2（配列番号:45）a
nd Ac−Asp−Asp−（EDANS）−Met−Glu−Glu−Abu−
Ψ［COO］−Ala−Ser−Lys（DABCYL）NH2（配列番号:4
6） の合成 ２つの基質S3とS4の化学式を図11に示す。
合成は、公知方法（16〜17）に従って製造した２種類
の特定の誘導体:Fmoc−Asp（EDANS）−OHとFmoc−Lys
（DABCYL）−OHを用いて、S3（配列番号:45）に関して
図13のスキームに詳述した通りに固相で行った。Asp（E
DANS）とLys（DABCYL）とを含めて、カップリングの全
ては、Fmoc−アミノ酸/DIPS/HOBt（1:1:1:1）活性化を
用いたＬ−（＋）−乳酸を例外として、Fmoc−アミノ酸
/PyBOP/HOBt/DIEA（1:1:1:2）活性化を用いて、樹脂遊
離アミノ基に比べて５倍過剰な活性化アミノ酸によって
行った。乳酸の遊離ヒドロキシルに対するAbuのエステ
ル化を、触媒量（0.1当量）のDMAPの存在下で対称的無
水物（Fmoc−Abu）20を用いて、室温において30分間行
った（12）：この反応を２回繰り返して、92％収率を得
た。アセンブリの終了時に、ペプチド−樹脂を洗浄し
て、基質S1に関して述べた通りにペプチドを切断した。
溶離剤として（Ａ）50mM 酢酸アンモニウム（pH6）
と（Ｂ）アセトニトリルとを用いて、Nucleosy l Ｃ−
18カラム（250x21mm、７μｍ）上での分取HPLCによっ
て、＞98均質性までの精製が達成された。S3とS4の両方
に対して用いた勾配は、５分間にわたって20％Ｂ、次に
20分間にわたって20〜40％Ｂ、流速度20ml/分であっ
た；純粋な物質を含有する画分をプールし、凍結乾燥し
た:S3とS4に関してそれぞれ収率45％と35％。HPLCに基
づく分析（図14A参照）によって評価した、この基質の
動力学パラメーターは次の通りであった： Kcat（min-1）＝3.51 Km（μＭ）＝10.95 Kcat/Km（M-1s-1）＝5342. この分析に用いた緩衝剤は次の通りである:33mM DT
T、50mM Tris（pH7）、50％グリセロール、２％CHAP
S。エステル結合の自然加水分解を最小にするために、
インキュベーションはpH7.0において実施する。この分
析はキュベット又は（96ウェル）マイクロタイタープレ
ートにおいて蛍光を時間の関数としてモニターしながら
行うことができる（励起波長355nM、発光波長495nM）。
基質切断時の蛍光増加は13倍である。反応は図14Bに示
すように直線的である（固定基質濃度＝２μＭ）。検出
限界は高スループットマイクロタイタープレート分析に
関して1nM、HPLCに基づく分析に関しては520pMと判定さ
れた。酵素反応の初期速度を確認するために連続（キュ
ベット）分析をおこなう場合には、酵素濃度の下限は、
10μＭよりも高い基質濃度では切断基質の蛍光が消光す
るために、80nMである。
寄託 配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4及
び配列番号:5のアミノ酸配列をを有するポリペプチドを
それぞれコードするプラスミド pBac（1039〜1226）、
pT7−７（1039〜1226）、pT7−７（1039〜1206）、pT7
−７（1027〜1206）及びpT7−７（1033〜1206）を用い
て形質転換したE.coli DHIの菌株は1995年８月14日
に、National Collections of Industrial and Marine
Bacteria Ltd.（NCIMB）、英国、スコットランド、アバ
ーディーンによって、受託番号:NCIMB40761、NCIMB4076
2、NCIMB40763、NCIMB40764及びNCIMB40765で寄託され
た。
参考文献 1.Chamber,T.J.等,1990,「黄熱病ウイルスからの非構造
タンパク質NS3のＮ−末端ドメインがウイルス・ポリプ
ロテインにおける部位特異性切断の要因のセリンプロテ
アーゼであるという証拠」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
7,8898−8902. 2.Lam.P.Y.S.等,1994,「HIVプロテアーゼ阻害剤として
の強力な、生体適合性の非ペプチドサイクリック尿素の
合理的な設計」,Science,263,380〜384. 3.Luckow,V.A.「ヒト遺伝子産物の発現のためのバキュ
ロウイルス系」，（1993）Current Opinion in Biotech
nology,4,564〜572. 4.O'Reilly,D.R.,Miller,L.K.,Luckow,V.A.（1992），
「バキュロウイルス発現ベクター−実験室マニュア
ル」,W.H.Freeman and Company（ニューヨーク）． 5.StudierとMoffatt,「クローン化遺伝子の選択的な高
レベル発現を導くためのバクテリオファージT7 RNAポ
リメラーゼの使用」，（1986）,J.Mol.Biol.189,113〜1
30. 6.ThatcherとHitchcock,「バイオテクノロジーにおける
タンパク質フォールディング」,Mechanism of Protein
Folding（R.H.Painによって編集）,226〜263.IRL Pres
s Oxford,New York,Tokyo（1994）． 7.SchechterとBerger,1968,「プロテアーゼＩ パパイ
ンにおける活性部位のサイズに関して」,Biochem.Bioph
ys.Res.Communs.27,127〜162. 8.Fersht,A.（1985），「酵素構造と機構」,W.H.Freema
n,New York. 9.Atherton,E.,Brown,E.,Sheppard,R.C.及びRosevear,
A.（1981）,J.Chem.Soc.Chem.Commun,.1151. 10.Rink,H.（1987）,Tetrahedron Lett.28,3782. 11.Bernatowicz,M.S.,Daniels,S.B.及びKoster,H.（198
9）,Tetrahedron Lett.30,4645. 12.Atherton,E.及びSheppard,R.C.（1989），「固相ペ
プチド合成，実用的なアプローチ」,IRL Press,Oxfor
d. 13.Matayoshi,E.D.,Wang,G.T.,Krafft,G.A.及びErickso
n,J.（1990）Science,247,954. 14.Maggiora,L.L.,Smith,C.W.及びZhang,Z.Y.（1992）
J.Med.Chem.35,3727. 15.Wang,G.T.,Chung,G.C.,Holzman,T.F.及びKraft,G.A.
（1993）,Anal.Biochem.210,351〜359. 16.Andreae,F.,Sommergruber,W.,Gauss−Muller,V.,Sch
ultheis,T.及びAhorn,H.（1994），「固相合成における
新機軸と見通し」,R.Epton編集,Mayflower Worldwise L
td.,Birmingham UK,433〜436頁． 17.Kraft,G.A.とWang,G.T.（1994）,Methods Enzymol.2
41,70. 18.Pennington,M.W.とThornberry,N.A.（1994）,Peptid
e Res.7,72. 19.Holskin,B.P.,Bukhtiyarova,M.,Dunn,B.M.,Baur,P.,
J.de Chastonay及びPennington,M.W.（1995）,Anal.Bi
ochem.226,148. 明細書に用いた略号と記号 Abu＝２−アミノ酪酸;CHAPS＝３−［（３−コラミド
−プロピル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパ
ンスルホネート;DABCYL＝４−［［4'−（ジメチルアミ
ノフェニル］アゾ］安息香酸；デプシペプチド＝少なく
とも１つのペプチド結合が対応エステル結合によって置
換されたペプチド（分子内のエステル結合（単数又は複
数）の位置（単数又は複数）は関与するアミノ酸残基間
のΨ［COO］−として通常表示される）;DIEA＝N,N−ジ
イソプロピルエチルアミン;DIPC＝N,N'−ジイソプロピ
ルカルボジイミド;DMAP＝４−ジメチルアミノピリジン;
DMF＝N,N−ジメチルホルムアミド;DTT＝ジチオトレイト
ール;EDANS＝５−［（2'−アミノエチル）アミノ］ナフ
タレンスルホン酸;EDTA＝エチレンジアミノ四酢酸;HOBt
＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール;HPLC＝高速液体
クロマトグラフィー;PyBOP＝ベンゾトリアゾル−１−イ
ル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキ
サフルオロホスフェート;RET＝共鳴エネルギー転移;t−
Bu＝tert−ブチル;TFA＝トリフルオロ酢酸;Trt（トリチ
ル）＝トリフェニルメチル。
配列表 一般的情報 （ｉ）出願人:Istituto Di Ricerche Di Biologia Mole
colare P.Angeletti S.p.A. （ii）発明の名称:HCV NS3プロテアーゼのタンパク質
分解活性を有するポリペプチドを製造し、精製し、分析
する方法。
（iii）配列数:47 （iv）通信先住所： （Ａ）受信人:Societa Italiana Brevetti （Ｂ）街:Plazza di Pietra,39 （Ｃ）市：ローマ （Ｄ）国：イタリー （Ｅ）郵便番号:1−00186 （ｖ）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク 3.5" 1.44MBYT
ES （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパーティブル （Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
Rev.6.22 （Ｄ）ソフトウェア:Microsoft Word 6.0 （viii）代理人情報 （Ａ）名称DI CERBO,Mario（Dr.） （Ｃ）リファレンス:RM/X88568/PC−DC （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話:06/6785941 （Ｂ）テレファックス:06/6794692 （Ｃ）テレックス:612287ROPAT （１）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:191アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子種類:cDNA （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:195アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:2: （３）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:174アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:3: （４）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:181アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:4: （５）配列番号:5に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:174アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:5: （６）配列番号:6に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:14アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:6: （７）配列番号:7に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:20アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:7: （８）配列番号:8に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:16アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （xi）配列：配列番号:8: （９）配列番号:9に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:15アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 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（ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Alaである （xi）配列：配列番号:23: （24）配列番号:24に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:24: （25）配列番号:25に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:25: （26）配列番号:26に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:26: （27）配列番号:27に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:27: （28）配列番号:28に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:28: （29）配列番号:29に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:29: （30）配列番号:30に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:30: （31）配列番号:31に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:31: （32）配列番号:32に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Gluである （xi）配列：配列番号:32: （33）配列番号:33に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Asnである （xi）配列：配列番号:33: （34）配列番号:34に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Lysである （xi）配列：配列番号:34: （35）配列番号:35に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:35: （36）配列番号:36に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:36: （27）配列番号:37に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:XaaはAlg（アリルグリシン）である （xi）配列：配列番号:37: （38）配列番号:38に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:XaaはAbu（α−アミノ酪酸）である （xi）配列：配列番号:38: （39）配列番号:39に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:39: （40）配列番号:40に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:XaaはNva（ノルバリン）である （xi）配列：配列番号:40: （41）配列番号:41に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:10アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （xi）配列：配列番号:41: （42）配列番号:42に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:13アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:Xaaは次の残基にエステル結合したAb
u（２−アミノ酪酸）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報:Xaaは隣接先行残基にエステル結合し
たAlaである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:13 （Ｄ）他の情報:XaaはLys（Ｎε−Ac）−NH2である （xi）配列：配列番号:42: （43）配列番号:43に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:13アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:Xaaは次の隣接残基にエステル結合し
たThrである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報:Xaaは隣接先行残基にエステル結合し
たAlaである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:13 （Ｄ）他の情報:XaaはLys（Ｎε−Ac）−NH2である （xi）配列：配列番号:43: （44）配列番号:44に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:13アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:Xaaは次の隣接残基にエステル結合し
たAbu（２−アミノ酪酸）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報:Xaaは隣接先行残基にエステル結合し
たAlaである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:13 （Ｄ）他の情報:XaaはLys（Ｎε−［３］−CH3CO）−
NH2である （xi）配列：配列番号:44: （45）配列番号:45に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:3 （Ｄ）他の情報:XaaはAsp（EDANS）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:Xaaは次の残基にエステル結合したAb
u（２−アミノ酪酸）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報:Xaaは隣接先行残基にエステル結合し
たAlaである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報:XaaはLys（DABCYL）である （xi）配列：配列番号:45: （46）配列番号:46に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:9アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:2 （Ｄ）他の情報:XaaはAsp（EDANS）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報:Xaaは次の残基にエステル結合したAb
u（２−アミノ酪酸）である （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報:Xaaは隣接先行残基にエステル結合し
たAlaである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報:XaaはLys（DABCYL）である （xi）配列：配列番号:46: （47）配列番号:47に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ:13アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報:XaaはAc−Aspである （ix）特徴： （Ａ）名称：ペプチド （Ｂ）位置:13 （Ｄ）他の情報:XaaはLys−ε−（3H）Acである （xi）配列：配列番号:47:
フロントページの続き (72)発明者 ビアンチ，エリザベッタ イタリア国 アイ − 00195 ローマ, ビア サボッティノ，31 (72)発明者 タリアニ，マリナ イタリア国 アイ − 00174 ローマ, ビア クルジオ ルフォ，15 (72)発明者 トメイ，リシア イタリア国 アイ − 00143 ローマ, ビア ガッダ，173 (72)発明者 ウルバニ，アンドレア イタリア国 アイ − 00187 ローマ, ビア ピアベ，41 (72)発明者 デ フランセスコ，ラファエル イタリア国 アイ − 00040 マリノ アールエム，ビア アピア ヌオバ ケイエム．21 エヌ．133 (72)発明者 ナルイェス，フランク イタリア国 アイ − 00040 アリシ ア，ビア ラモ ドロ，53 (56)参考文献 特開 平８−205893（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ｏｆ Ｂｉｒｏｌｏｇｙ，1993 年，Ｖｏｌ．67，Ｎｏ．７，ｐ．4017− 4026 Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，1992年，Ｖｏ ｌ．23，Ｐ．39−53 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号:8〜11、14、18〜20、22、29〜3
    2、35及び47に表示された配列から成る群から選択され
    たアミノ酸配列から成ることと、HCV NS3タンパク質分
    解活性を有するポリペプチドのin vitro活性の高スルー
    プット分析に基質として用いることができることを特徴
    とするペプチド。
  2. 【請求項２】タンパク質分解酵素により切断され易い結
    合であるアミド結合が、エステル結合により置換されて
    いることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
  3. 【請求項３】配列番号:42〜46に表示された配列から成
    る群から選択されたアミノ酸配列から成ることと、HCV
    NS3タンパク質分解活性を有するポリペプチドのin vi
    tro活性の高スループット分析に基質として用いること
    ができることを特徴とするデプシペプチド。
  4. 【請求項４】HCV NS3タンパク質のタンパク質分解活性
    をin vitroで再現し、効果的に分析する方法であって、
    30〜70mM Tris pH6.5〜8.5と、３〜30mMジチオトレイ
    トールと、0.5〜３％ ３−［（３−コラミド−プロピ
    ル）−ジメチル−アンモニウム］−１−プロパンスルホ
    ネートと、30〜70％ グリセロールとを含有する溶液中
    で、20〜25℃の温度において、高スループット分析で請
    求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド又はデプシ
    ペプチドを基質として用いて、該タンパク質分解活性が
    再生されることを特徴とする、上記方法。
  5. 【請求項５】請求項１記載のペプチドを100〜200nMの酵
    素濃度において高スループット分析に用いる、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】請求項２又は３に記載のデプシペプチドを
    0.5〜2nMの酵素濃度において高スループット分析に用い
    る、請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】タンパク質分解活性の連続モニターリング
    を、基質として配列番号:45と配列番号:46によって表示
    される配列から成る群から選択されたデプシペプチドを
    用いて、デプシペプチドの一方の末端に接近した蛍光ド
    ナー、５−［（2'−アミノエチル）アミノ］ナフタレン
    スルホン酸（EDANS）と、デプシペプチドの他方の末端
    に接近したアクセプター基、４−［［4'−（ジメチルア
    ミノフェニル）アゾ］安息香酸（DABCYL）との間の“共
    鳴エネルギー転移”による蛍光発光の内部消光によって
    行う、請求項６に記載の方法。
JP51008297A 1995-08-22 1996-08-20 Ｈｃｖ ｎｓ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリぺプチドを製造し、精製し、分析する方法 Expired - Fee Related JP3310298B2 (ja)

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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1285158B1 (it) * 1996-09-17 1998-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Polipeptidi solubili con l'attivita' di serino-proteasi di ns3 del virus dell'epatite c, e procedimento per la loro preparazione e il
GB9623908D0 (en) * 1996-11-18 1997-01-08 Hoffmann La Roche Amino acid derivatives
GB9707659D0 (en) * 1997-04-16 1997-06-04 Peptide Therapeutics Ltd Hepatitis C NS3 Protease inhibitors
ES2143918B1 (es) * 1997-05-23 2001-01-01 Inst Cientifico Tecnol Navarra Peptidos inhibidores de la proteasa c y su utilizacion en la preparacion de composiciones utiles en las infecciones causadas por el virus de la hepatitis c.
WO1999028482A2 (en) * 1997-11-28 1999-06-10 Schering Corporation Single-chain recombinant complexes of hepatitis c virus ns3 protease and ns4a cofactor peptide
IT1299134B1 (it) * 1998-02-02 2000-02-29 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per la produzione di peptidi con proprieta' inibitrici della proteasi ns3 del virus hcv, peptidi cosi' ottenibili e peptidi
WO2000001718A2 (en) * 1998-07-02 2000-01-13 University Of Florida Ns4a-ns3 catalytic domain of hepatitis c
US6323180B1 (en) * 1998-08-10 2001-11-27 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd Hepatitis C inhibitor tri-peptides
CA2359971A1 (en) 1999-01-08 2000-07-13 Bristol-Myers Squibb Company Modified forms of hepatitis c virus ns3 protease
MXPA01011045A (es) * 1999-05-04 2002-07-22 Boehringer Ingelheim Ltd Sistema sustituto basado en celulas y metodo para evaluar la actividad de la proteasa ns3 de virus de la hepatitis c.
WO2001016379A1 (en) * 1999-08-30 2001-03-08 Merck & Co., Inc. Hepatitis c virus replication inhibitors
GB0006537D0 (en) 2000-03-17 2000-05-10 Angeletti P Ist Richerche Bio Assays and screening methods
ES2282320T3 (es) 2000-12-15 2007-10-16 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Proteasa hcv ns2/3 activa, purificada.
ATE385253T1 (de) * 2002-10-29 2008-02-15 Boehringer Ingelheim Int Nhibitor-resistente hcv ns3 protease
US7834145B2 (en) 2005-03-22 2010-11-16 Merck Sharp & Dohme Corp. HCV protease substrates
JP2009513113A (ja) * 2005-10-28 2009-04-02 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ２／３活性のアッセイ法
CN103012565B (zh) * 2013-01-15 2014-07-16 成都天台山制药有限公司 一种曲普瑞林及其固相合成制备方法
JP6564539B1 (ja) * 2018-09-14 2019-08-21 長瀬産業株式会社 スルホン酸化合物によるペプチド精製方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2079105C (en) * 1990-04-04 2000-06-13 Michael Houghton Hepatitis c virus protease
EP0729973A4 (en) * 1993-10-29 1998-12-30 Srl Inc AN ANTIQUE PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOASSAY PROCEDURE
JPH08205893A (ja) * 1994-12-08 1996-08-13 Sumitomo Metal Ind Ltd Ｈｃｖプロテアーゼ活性測定法
US5767233A (en) * 1995-05-12 1998-06-16 Schering Corporation Soluble cleavable substrates of the hepatitis C virus protease

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．ｏｆ Ｂｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３年，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．７，ｐ．４０１７−４０２６
Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１９９２年，Ｖｏｌ．２３，Ｐ．３９−５３

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