ITRM950573A1 - Procedimento per produrre - in forma pura e in quantita' elevate - polipeptidi con l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 di hcv, e - Google Patents
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Abstract
Il procedimento secondo la presente invenzione permette l'espressione e l'isolamento di polipetidi con l'attività proteolitica della proteasi NS3 di HCV in forma pura, cataliticamente attiva ed in quantità sufficienti per la ricerca di inibitori nonché per la determinazione della struttura tridimensionale della proteasi NS3. E' anche oggetto della presente invenzione una metodologia che definisce le condizioni chimico-fisiche necessarie per l'espletamento dell'attività proteolitica dei suddetti polipeptidi. L'invenzione comprende anche nuove composizioni di materia (vettori di espressione) contenenti sequenze nucleotidiche capaci di esprimere i suddetti polipeptidi in cellule in coltura. Vengono infine definite nuove composizioni di materia adatte a misurare la suddetta attività proteolitica, e utili allo sviluppo di inibitori della proteasi NS3 e quindi di agenti terapeutici nei confronti di HCV.In figura 14A sono mostrati i parametri cinetici della proteasi NS3 di HCV con il substrato depsipeptidico S3 (SEQ ID NO:45).
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "PROCEDIMENTO PER PRODURRE - IN FORMA PURA E IN QUANTITÀ ELEVATE - POLIPEPTIDI CON L'ATTIVITÀ' PROTEOLITICA DELLA PROTEASI NS3 DI HCV, E METODOLOGIA PER RIPRODURRE E SAGGIARE EFFICACEMENTE IN VITRO L'ATTIVITÀ' PROTEOLITICA DEI SUDDETTI POLIPEPTIDI"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce alla biologia molecolare ed alla virologia del virus dell'epatite C (HCV). Più in particolare, l'invenzione ha per oggetto un procedimento per produrre - in forma pura e in quantità elevate -polipeptidi con l'attività proteolitica della proteasi NS3 di HCV, ed una metodologia per un efficace riproduzione in vitro dell'attività proteolitica dei suddetti polipeptidi per la messa a punto di un saggio enzimatico capace di selezionare, a fini terapeutici, composti inibitori dell'attività enzimatica associata ad NS3.
Come è noto, il virus dell'epatite C (HCV) e il principale agente eziologico dell'epatite non-A, non-B (NANB). Si stima che HCV causa almeno il 90% delle epatiti virali NANB post-trasfusionali ed il 50% delle epatiti NANB sporadiche. Sebbene ci siano stati notevoli progressi nella selezione di donatori di sangue e nella caratterizzazione immunologica del sangue per trasfusione, esiste tutt'orà una elevata incidenza di infezioni acute di HCV tra le persone che ricevono trasfusioni di sangue (un milione o più infezioni ogni anno in tutto il mondo). Circa 50% degli individui infettati con HCV sviluppano cirrosi epatica in un periodo che può variare tra 5 e 40 anni. Inoltre, recenti studi clinici hanno suggerito che esiste una correlazione tra l'infezione cronica di HCV e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare.
HCV è un virus con membrana che contiene un genoma a RNA positivo di circa 9,4 kb. Questo virus è un membro della famiglia dei Flaviviridae, di cui i pestivirus ed i flavivirus sono gli altri membri.
Il genoma a RNA di HCV è stato recentemente sequenziato. Paragonando sequenze del genoma di HCV isolate irt diversi punti del mondo, si è visto che queste sequenze possono essere estremamente eterogenee. La maggior parte del genoma di HCV è occupata da uno schema di lettura aperto (ORF) variabile tra 9030 e 9099 nucleotidi. Questo ORF codifica per una singola poliproteina virale, la cui lunghezza può ovviamente variare fra 3010 e 3033 amminoacidi. Durante il ciclo di infezione virale, la poliproteina è processata proteoliticamente nei prodotti genici individuali necessari per replicazione del virus.
I geni che codificano per le proteine strutturali di HCV sono localizzati all'estremità 5' dellORF, mentre la regione che codifica per le proteine non-strutturali occupa il resto dell'RF.
Le proteine strutturali consistono di C (core,21kDa), E1(envelope,gp37) ed E2(NS1,gp61). C è una proteina non glicosilata di 21 kDa che probabilmente costituisce il nucleocapside virale. La proteina El è una glicoproteina di circa 37 kDa e si ritiene che sia una proteina strutturale dell'involucro virale esterno. E2, un'altra glicoproteina di membrana di 61 kDa, costituisce probabilmente una seconda proteina strutturale dell'involucro esterno del virus.
La regione non-strutturale comincia con NS2 (p24), una proteina idrofobica di 24 kDa la cui funzione non è nota.
NS3, una proteina di 68 kDa che segue NS2 nella poliproteina, ha due domini funzionali: un dominio di serino-proteasi nei primi 200 amminoacidi ammino-terminali e un dominio di ATPasi RNA-dipendente al carbossi-terminale.
La regione genica corrispondente ad NS4 codifica per NS4A(p6) e NS4B (p26), due proteine idrofobiche di 6 e 26 kDa, rispettivamente, la cui funzione non è stata finora del tutto chiarita.
Il gene corrispondente a NS5 codifica anche per due proteine, NS5A (p56) e NS5B (p65), di 56 e 65 kDa rispettivamente. Sequenze amminoacidiche nell'ambito della regione di NS5 possono essere riconosciute in tutte le RNA polimerasi RNA dipendenti. Questo suggerisce che la regione NS5 contiene parti della replicasi virale.
Diversi studi di biologia molecolare hanno indicato che la peptidasi del segnale, una proteina associata al reticolo endoplasmico della cellula ospite, è responsabile del processamento proteolitico nella regione non strutturale, ovvero ai siti C/El, E1/E2 ed E2/NS2.
La serino-proteasi contenuta in NS3 è responsabile del taglio alle giunzioni tra NS3 ed NS4A, tra NS4A ed NS4B, tra NS4B ed NS5A e tra NS5A e NS5B. In particolare si è trovato che il taglio effettuato da questa serino-proteasi lascia un residuo di cisteina o di treonina al lato ammino-terminale (posizione PI) ed un residuo di alanina o di serina al lato carbossiterminale (posizione P1') del taglio stesso. E' stato dimostrato che la protessi contenuta in NS3 è una proteina eterodimerica in vivo, formando un complesso con la proteina NS4A. La formazione di questo complesso aumenta l'attività proteolitica sui siti NS4A/NS4B e NS5A/NS5B ed è un requisito necessario per il processamento proteolitico del sito NS4B/NS5A.
Una seconda attività proteasica di HCV sembra essere responsabile del taglio tra NS2 ed NS3. Questa attività proteasica è contenuta in una regione che comprende sia parte di NS2 che la parte di NS3 che contiene il dominio di serinoproteasi, ma non utilizza lo stesso meccanismo catalitico di quest'ultima.
Una sostanza in grado di interferire con l'attività proteolitica associata con la proteina NS3 potrebbe costituire un nuovo agente terapeutico. Infatti, l'inibizione di questa attività proteasica comporterebbe l'arresto del processamento proteolitico della regione non strutturale della poliproteina di HCV e, di conseguenza, impedirebbe la replicazione virale delle cellule infette.
Questa sequenza di eventi è stata verificata per l'omologo flavivirus, il quale, al contrario di HCV, infetta linee cellulari in coltura. In questo caso, si è potuto dimostrare che manipolazioni genetiche, che comportano la generazione di una proteasi non più in grado di espletare la sua attività catalitica, aboliscono la capacità del virus di replicarsi (1).
Inoltre è stato ampiamente dimostrato, sia in vitro che in studi clinici, che composti in grado di interferire con l'attività della proteasi di HIV sono in grado inibire la replicazione di questo virus (2).
Le metodiche per generare molecole con potenzialità terapeutiche sono note nel settore. In genere, collezioni di composti, contenenti un gran numero di singole entità chimiche ad alta diversità molecolare vengono sottoposte ad un esame automatizzato atto ad identificare singoli agenti attivi, che poi vengono sottoposti ad ulteriori modifiche chimiche con lo scopo di migliorarne le potenzialità terapeutiche. Altri approcci possono comprendere la modificazione razionale di substrati o ligandi di una determinata proteina bersaglio con il fine di sviluppare composti ad alta affinità di legame in grado di alterare o abolire l'attività biologica della proteina in esame. La determinazione della struttura tridimensionale di una proteina bersaglio, tramite tecniche note nel settore come la cristallografia a raggi X o la risonanza magnetica nucleare (NMR), permette la progettazione razionale di molecole capaci di legarsi specificamente alla proteina e che, di conseguenza, hanno la potenzialità di interferire con le proprietà biologiche della stessa.
La ricerca di composti in grado di interferire con l'attività biologica della protessi, contenuta nella proteina NS3 del virus dell'epatite C, è ostacolata dalla difficoltà di produrre quantitativi sufficienti di proteina purificata con inalterate proprietà catalitiche e dalla necessità di utilizzare cofattori per esaltare in vitro l'attività dell'enzima.
Esiste pertanto nello specifico settore l'esigenza di un procedimento per la produzione di NS3, oppure suoi analoghi, in quantitativi più elevati che nel passato e con attività in vitro sufficiente per la selezione di inibitori, preferibilmente in assenza di cofattori.
La presente invenzione consiste di polipeptidi isolati e purificati, con l'attività proteolitica della proteina NS3 di HCV, caratterizzati dal fatto di consistere in una sequenza amminoacidica scelta tra le sequenze SEQ
L'invenzione comprende anche vettori di espressione - per produrre i polipeptidi rappresentati dalle sequenze
con
l'attività proteolitica di NS3 di HCV comprendenti:
- un polinucleotide che codifica per uno di detti polipeptidi;
- sequenze di regolazione, di trascrizione e di traduzione, funzionali in detta cellula ospite, legati operativamente a detto polinucleotide che codifica per uno di detti polipeptidi; ed
- eventualmente, un marcatore selezionabile.
L'invenzione si estende anche ad una cellula ospite, eucariote o procariote, trasformata con un vettore d'espressione contenente una sequenza di DNA codificante per
in modo da
permettere a detta cellula ospite di esprimere lo specifico polipeptide codificato nella sequenza prescelta. L'invenzione comprende anche un procedimento per la preparazione di polipeptidi con sequenza scelta dal gruppo comprendente
caratterizzato dal fatto di comprendere
in combinazione le seguenti operazioni:
- trasformazione di una cellula ospite, eucariote o procariote, con uno dei vettori di espressione sopra menzionati; ed
espressione della sequenza nucleotidica desiderata per produrre il polipeptide prescelto,· e
- purificazione del polipeptide ottenuto, evitando protocolli di risolubilizzazione.
La presente invenzione ha anche per oggetto una metodologia per riprodurre in vitro l'attività proteolitica della proteasi NS3 di HCV, caratterizzata dal fatto che l'attività di polipeptidi purificati, con sequenze scelte dal gruppo comprendente
analoghi di
NS3 , viene riprodotta in soluzione contenente 30-70 mM Tris pH 6,5-8,5, 3-30 mM ditiotreitolo (DTT), 0,5-3% 3-[(3-colammido-propil)-dimetilammonio] -1-propansolfonato (CHAPS) e 30-70% glicerolo a temperature comprese fra 20 e 25°C e dal fatto che in queste condizioni l'attività dei suddetti polipeptidi può essere determinata e quantizzata cineticamente su substrati peptidici anche in assenza di cofattori.
L'attività di proteasi dei polipeptidi
può essere saggiata mediante taglio di un
substrato che fornisce prodotti di taglio rivelabili. Il taglio è preferibilmente rivelabile mediante metodologie basate su segnali radioattivi colorimetrici o fluorimetrici Sono anche adatti metodi come HPLC e simili. Secondo la presente invenzione, come substrati, vengono usati peptidi sintetici corrispondenti alla giunzione NS4A/4B della poliproteina di HCV. Eventualmente peptidi contenenti la sequenza amminoacidica SEQ ID NO:6, oppure parte di essa, possono essere usati come cofattore della proteasi'NS3.
Peptidi adatti come substrati sono il peptide rappresentato dalla sequenza SEQ ID NO:7 e i suoi derivati con delezioni N e/o C-terminali (SEQ ID NOS:8-12, 14, 18-20) e il peptide rappresentato dalla sequenza SEQ ID NO:47. Particolarmente adatti sono i decapeptidi rappresentati dalle sequenze SEQ ID NOS:18-20, in modo speciale SEQ ID NO:18 e le sequenze da esso derivate SEQ ID NOS:29-32, 35.
Questi peptidi possono essere usati per un saggio ad elevata prestazione dell'attività della proteasi NS3 ad una concentrazione di questa compresa nell'intervallo 100-200 nM.
Secondo l'invenzione possono anche essere usati vantaggiosamente per un saggio ad alta prestazione dell'attività di NS3 substrati depsipeptidici (peptidi con almeno un legame esterico nelle sequenze). Come è noto, infatti, è desiderabile eseguire il saggio alla concentrazione più bassa possibile di enzima ancora compatibile con una sufficiente conversione di substrato. Ciò esalta al massimo la sensibilità all'inibizione e permette di selezionare inibitori che sono presenti a concentrazioni·molto basse in miscugli di composti o in librerie combinatoriali. Substrati per la protessi NS3, o suoi analoghi, con una ammide standard al legame scissile tra i residuo PI e PI' hanno valori di Kcat/Km compresi nell'intervallo Questo determina un intervallo di concentrazione di enzima di 100-200 nM per un saggio ad alta prestazione. Per abbassare questa concentrazione è necessario usare substrati che esibiscono valori di Kcat/Km più alti. I substrati depsipeptidici secondo l'invenzione, rappresentati dalle sequenze SEQ ID NOS:42 fino a 46, con un legame esterico tra P1 e PI', sono particolarmente adatti a questo fine, dato che la formazione dell'intermedio acilenzima si ottiene molto più rapidamente grazie al fatto che reazione di transesterificazione è termodinamicamente più favorevole (8). I substrati depsipeptidici secondo l'invenzione hanno valori di Kcat/Km molto elevati e ciò porta l'intervallo utile di concentrazione di NS3, in un saggio ad elevata prestazione, a 0,5-2 nM. Questi substrati depsipeptidici possono essere sintetizzati con alta resa su fase solida mediante tecniche chimiche standard.
I saggi convenzionali sono adatti per un screening ad alta prestazione, ma richiedono l'idrolisi di almeno il 10% del substrato prima che il prodotto possa essere rivelato convenientemente. Ciò preclude la determinazione delle vere velocità iniziali che sono importanti per accurati studi cinetici. Per ovviare a queste difficoltà, è stato messo a punto, secondo l'invenzione, un saggio che permette la rivelazione continua dell'attività della protessi. Il saggio si basa su substrati sintetici depsipeptidici capaci di generare direttamente un segnale, continuo che è proporzionale all'entità dell'idrolisi del substrato, evitando così la necessità di separare il substrato dal prodotto della reazione. I depsipeptidi usati (SEQ ID NOS:45 e 46), le cui formule chimiche sono riportate in figura 12, sono substrati a "Quenching" di fluerescenza intramolecolare per l'effetto Resonance Energy Transfer (RET). Essi contengono un donatore fluorescente, l'acido 5-[(2'-amminoetil)ammino]-naftalensolfonico (EDANS), vicino ad una estremità del depsipeptide, ed un gruppo accettore, acido 4-[[4'-(dimetilammino)fenil]azo]benzoico (DABCYL) vicino all'altra estremità. La fluorescenza di questo tipo di substrato è normalmente estinta per RET intramomecolare tra il donatore e l'accettore, ma appena l'enzima comincia a tagliare il substrato la fluorescenza aumenta. EDANS e DABCYL sono stati scelti come coppia donatore/accettore grazie alla loro eccellente sovrapposizione spettrale tra l'emissione fluorescente del primo e l'assorbimento del secondo (13-17). L'efficienza RET dipende dalla distanza fra il donatore e l'accettore, cioè più vicino sono i due gruppi, più alta è l'estinzione. Per la coppia EDANS/DABCYL, la distanza Forster per il trasferimento del 50% di energia (R0) è 33À. La massima distanza tra EDANS e DABCYL riportata in un substrato è 11 amminoacidi (19) che, ipotizzando per il peptide una conformazione estesa, corrisponde ad R = 39,8 À; con una efficienza RET teorica di 24,5%. Questo corrisponde ad un incremento di fluorescenza di 10 volte al momento del taglio del substrato.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di sue specifiche forme di realizzazione, finalizzate a farne meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative.
Figura 1 rappresenta il vettore plasmidico utilizzato per il trasferimento e l'espressione del peptide rappresentanto da SEQ ID NO:1 in cellule del clone 9 di Spodoptera frugiperda.
Figura 2A e 2B rappresentano i vettori plasmidici per il trasferimento e l'espressione in E. coli rispettivamente dei peptidi rappresentati dalle sequenze SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO :4, e SEQ ID NO:5.
Figura 3 mostra l'attività di NS3 in funzione della concentrazione di glicerolo.
Figura 4 mostra l'attività di NS3 in funzione della concentrazione di CHAPS, 3-[(3-coìammidopropil)-dimetil-ammonio]-1-propansolfonato.
Figura 5 mostra l'attività di NS3 in funzione del pH.
Figura 6 mostra l'attività di NS3 in funzione della forza ionica.
Figura 7 mostra schematicamente il saggio enzimatico per misurare l'attività di NS3 usando come substrato un peptide
NO :47).
Figura 8 mostra lo schema di reazione per la sintesi del substrato depsipeptidico SI rappresentato dalla sequenza SEQ ID NO:42.
Figura 9 mostra lo schema di reazione per la sintesi del substrato depsipeptidico S2 rappresentato dalla sequenza SEQ ID NO:43.
Figura 10 mostra lo schema di reazione per la sintesi del substrato depsipeptidico SI radioattivo rappresentato dalla sequenza SEQ ID NO ;44.
Figura 11 mostra un saggio ad alta prestazione, basato su segnali,radioattivi, per la determinazione dell'attività della proteasi NS3 .
Figura 12 mostra la formula chimica dei substrati depsipeptidici (SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46)per un saggio continuo dell'attività di NS3 basato sul "quenching" di fluorescenza intramolecolare per RET.
Figura 13 mostra lo schema di reazione per la sintesi del substrato depsipeptidico S3 (SEQ ID NO:45) .
Figure 14A e 14B mostrano rispettivamente i parametri cinetici della proteasi NS3 con il substrato S3 (SEQ ID NO:45) e la fluorescenza in funzione del tempo nel saggio relativo.
ESEMPIO 1
Procedimento per esprimere la proteasi NS3 di HCV in cellule in coltura del clone 9 di Spodoptera frugiperda .
Sistemi di espressione di geni estranei in cellule di insetti in coltura, come le cellule del clone 9 di Spodoptera frugeperda (Sf9) infettati con vettori di Baculovirus sono noti nel settore in esame (3). I geni eterologhi vengono di solito posti sotto il controllo del promotore forte della poliedrina del virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica oppure del virus della poliedrosi nucleare di Bombix mori. Sono anche noti nel settore i metodi per l'introduzione di DNA eterologo nel sito desiderato dei vettori di Baculovirus per ricombinazione omologa (4).
Il vettore plasmidico pBacNS3(1039-1226) è stato derivato da pBlueBacIII (Invitrogen) ed è stato costruito per il trasferimento di un gene che codifica per un polipeptide che ha l'attività di NS3 (1039-1226). A questo scopo, la sequenza nucleotidica codificante per questo polipeptide descritto in SEQ ID NO:1 è stata ottenuta mediante PCR utilizzando degli oligonucleotidi che inseriscono un codone ATG al 5' ed un codone stop TAG al 3' della sequenza. Il frammento così ottenuto è stato inserito nel sito BamHl del vettore pBlueBacIII, previamente trattato con il frammento Klenow della DNA polimerasi . Il plasmide è illustrato in figura 1.
Cellule del clone 9 di Spodoptera frugiperda (Sf9) e i kit di ricombinazione di baculovirus sono stati forniti da Invitrogen. Le cellule sono state fatte crescere su piastra o in sospensione a 27°C, in mezzo completo per cellule d'insetto di Grace (Gibco) contenente il 10% di siero fetale bovino (Gibco). Trasfezione, ricombinazione e selezione dei costrutti di baculovirus sono stati eseguiti come raccomandato dal produttore.
Per l'espressione della proteina, le cellule Sf9 sono state infettate con baculovirus ricombinante alla densità di 2x10<6 >cellule per mi in un rapporto di circa 5 particelle virali per cellula. Le cellule sono state coltivate in sospensione per 72 ore a 23°C. L'abbassamento della temperatura da 27°C, che corrisponde alla temperatura di crescita ottimale, a 23°C. è cruciale per l'ottenimento di una proteina solubile ed attiva.
Dopo raccolta delle cellule per centrifugazione e lavaggio con PBS (20 mM sodio fosfato pH 7,4, 140 mM NaCl) il pellet è stato risospeso in 25 mM sodio fosfato pH 6,5, 20% glicerolo, 0,5% 3- [(3-colammidopropil)-dimetilammonio]-1-propansolfonato (CHAPS), 10 mM ditiotreitolo (DTT), 1mM acido etilendiamminotetracetico (EDTA). Le cellule sono state distrutte a 4°C mediante quattro cicli di sonicazione a 18 W della durata di 30 secondi ciascuno utilizzando uno strumento Branson 250. L'omogenato così ottenuto è stato centrifugato a 120.000x g per un'ora ed il supernatante è stato caricato su una colonna HR26/10 S-Sepharose (Pharmacia) equilibrata con 25 mM sodio fosfato pH 6,5, 10% glicerolo, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,1 % CHAPS ad un flusso di 2 ml/min. Dopo lavaggio con due volumi di colonna la proteasi è stata eluita con un gradiente di NaCl tra 0 e 1 M. Le frazioni contenenti la proteasi sono state identificate mediante Western blot utilizzando anticorpi policlonali specifici per NS3, concentrate a 3 ml utilizzando una cella di ultrafiltrazione Amicon dotata di una membrana YM10 e cromatografate su una colonna HR26/60 Superdex 75 (Pharmacia) equilibrata con 50 mM sodio fosfato pH 7,5, 10% glicerolo, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 mM EDTA ad un flusso di 1 ml/min. Le frazioni contenenti la proteasi sono state riunite e cromatografate ulteriormente su una colonna HR5/5 Mono-S (Pharmacia) equilibrata con lo stesso· tampone della colonna precedente. La proteasi è stata eluita in forma pura da questa colonna applicando un gradiente lineare di NaCl da 0 a 0,5 M. La proteasi è stata conservata a -80°C in 50% glicerolo, 0,5% CHAPS, 10 mM DTT e 50 mM sodio fosfato pH 7,5. La resa del procedimento è di 0,5 mg/1 di cellule. La proteina purificata ha una attività catalitica kcat/Km =120-200
misurata in 50 mM Tris pH 7,5, 50% glicerolo, 2% CHAPS, 30 mM DTT a 23°C utilizzando il substrato peptidico Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-GluGlu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly (SEQ ID NO:7), derivato dal sito di taglio della poliproteina tra NS4A e NS4B. I prodotti di taglio derivanti da questa reazione sono stati separati mediante HPLC, isolati e identificati tramite spettrometria di massa, confermando che il taglio proteolitico è avvenuto tra cisteina e alanina. Le concentrazioni di proteasi necessarie per una determinazione dell'attività sono comprese tra 100 nM e 1,6 μΜ.
ESEMPIO 2
Metodologia per esprimere la proteasi NS3 di HCV in E. coli
Espressione
I plasmidi pT7-7 (NS31039-1226), pT7-7 (NS3 1039-1206), pT7-7 (NS3 1027-1206) e pT7-7 (NS3 1033-1206), descritti in figura 2A e 2B sono stati costruiti per permettere l'espressione in E. coli dei polipeptidi indicati in SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 rispettivamente. I frammenti di proteina contengono varianti del dominio di proteasi della proteina NS3 di HCV. I rispettivi frammenti di HCV cDNA sono stati clonati a valle del promotore del batteriofago T7 Φ 10e in fase di lettura con il primo codone ATG della proteina del gene 10 del fago T7 utilizzando metodiche note nel settore. I plasmidi pT7-7 contenenti sequenze di NS3 contengono anche il gene per la β-lattamasi che può essere usato come marcatore di selezione di cellule E.coli trasformate con questi plasmidi.
I plasmidi vengono poi trasformati nel ceppo E. coli BL 21 (DE53), che è normalmente usato per elevati livelli di espressione di geni clonati in vettori di espressione che contengono il promotore T7. In questo ceppo di E. coli il gene della polimerasi T7 viene portato sul batteriofago λ DE53, che è integrato nel cromosoma di cellule BL21 (5). L'espressione del gene che interessa è indotta mediante l'aggiunta di isopropiltiogalattoside (IPTG) al mezzo di crescita seguendo procedure già descritte (5). Oltre il 90% delle proteine espresse utilizzando uno dei plasmidi sopra citati si trova in forma insolubile in corpi inclusi, dai quali può essere ricavata una proteina solubile ed attiva seguendo procedure note nel settore (vedi ad esempio (6)). Spesso i protocolli di risolubilizzazione hanno rese molto variabili di proteina cataliticamente attiva oppure necessitano di condizioni estremamente controllate, oppure causano alterazioni irreversibili della proteina {come la carbamilazione in presenza di urea), oppure richiedono procedure poco praticabili come l'utilizzo di soluzioni di proteina estremamente diluite, oppure dialisi di grandi volumi di campioni .
Per ovviare a questi inconvenienti, si è sviluppata la metodica descritta più avanti nelle condizioni di crescita descritte qui di seguito per produrre la proteasi di HCV in forma solubile evitando protocolli di risolubilizzazione: E. coli BL21 (DE53) trasformati con uno dei plasmidi sopra citati sono stati cresciuti a 37°C fino a raggiungere una densità cellulare che causa un assorbimento di 0,8 OD (OD sta per densità ottica) a 600 nm. A questo punto la temperatura è stata abbassata a 30°C in 15-20 minuti e 400 μΜ IPTG è stato aggiunto per indurre l'espressione della proteina. La temperatura è poi stata ulteriormente abbassata fino a raggiungere 22-24°C nel giro di 20-30 minuti. Le colture sono state agitate per altre 4 ore a questa temperatura. A questo punto le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavate con PBS.
Metodica di purificazione
I pellet risultanti dalle operazioni sopra descritte sono stati incubati su ghiaccio per 5 minuti e risospesi in 25 mM sodio fosfato pH 6,5, 50% glicerolo, 0,5% CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA (tampone A) preraffreddato a 4°C. 10 ml di questo tampone sono stati utilizzati per ogni litro di coltura batterica. Dopo altri 5-10 minuti di incubazione su ghiaccio la sospensione cellulare è stata omogeneizzata utilizzando una French press. L'omogenato risultante è stato centrifugato a 120.000 x g. I supernatanti di questa centrifugazione sono stati conservati su ghiaccio, mentre i pellet sono stati risospesi in tampone A (1 ml per ogni litro di coltura batterica). Dopo aggiunta di 1 mM MgCl2 e di DNasel la sospensione del pellet è stata incubata per 10 minuti a 20°C e ricentrifugata per 1 ora a 120.000xg. Il supernatante di questa seconda centrifugazione è stato aggiunto al primo supernatante e la soluzione proteica risultante è stata assorbita su resina S-Sepharose (o SP-Sepharose) (Pharmacia) equilibrata con 25 mM sodio fosfato pH 6,5, 10% glicerolo, 0,5% CHAPS, 3 mM DTT, 1 mM EDTA (tampone B). 10 ml di resina sospesa in 5 ml di tampone B sono stati utilizzati per ogni litro di coltura batterica. La resina è stata fatta agitare per 1 ora a 4°C, raccolta per filtrazione, lavata con tampone B e versata in una colonna cromatografica appropriata. La protessi è stata eluita con un gradiente di NaCl da 0 ad 1 M. Frazioni contenenti la proteasi sono state identificate mediante Western blot , riunite e concentrate utilizzando dei concentratori Centriprep 10 (Amicon) fino a raggiungere una concentrazione di 6-10 mg/ml in proteina, determinata con il metodo BIORAD. Fino a 3 mi di questa soluzione sono stati caricati su una HR 26/60 Superdex 75 oppure fino a 20 mi sono stati caricati su una HR 60/600 Superdex 75 (entrambe Pharmacia) equilibrate con 50 mM sodio fosfato pH 7,5, 10% glicerolo, 3 mM DTT, 0,5% CHAPS (tampone C) e cromatografate ad .1 ml/min (HR26/60) oppure 5 ml/min (HR60/600). Le frazioni contenenti la proteasi sono state riunite e purificate ulteriormente tramite cromatografia su HR 5/5 Mono S (Pharmacia) equilibrata con tampone C. La proteasi è stata eluita da questa colonna con un gradiente di NaCl da 0 a 0,5 M. La purificazione fino all'omogeneità è possibile anche con la seguente modificazione: dopo eluizione da S-Sepharose le frazioni contenenti la proteasi sono state diluite 1:4 con tampone C e caricate su Heparin-Sepharose. Eluizione da questa resina è stata ottenuta con un gradiente di NaCl da 0 a 0,5 M. La proteina è stata poi cromatografata su idrossiapatite oppure Superdex 75 come descritto sopra. La resa è di 1-2 mg di proteina purificata per litro di coltura batterica.
Caratterizzazione della proteina purificata
La proteina purificata è stata caratterizzata mediante gel filtrazione, HPLC a fase inversa, spettrometria di massa e analisi della sequenza N-terminale.
Esperimenti di gel filtrazione analitica hanno dimostrato che la proteina è monomerica. La proteina espressa utilizzando pT7-7 (NS3 1027-1206) mostra tre picchi dopo cromatografia su HPLC a fase inversa. Analisi mediante spettrometria di massa e determinazione della sequenza N-terminale hanno dimostrato una eterogeneità della parte N-terminale della molecola. Sono state trovate tre forme aventi le seguenti sequenze N-terminali:
(forma 3) Per ovviare a questo problema sono state adottate due strategie sperimentali:
1. Omogeneizzazione in presenza di 100 μg/ml dell'inibittore di protessi chimostatina. Questo inibitore non inibisce l'attività della protessi di HCV, ma inibisce le protessi del tipo chimotripsina con specificità per residui aromatici del tipo fenilalanina e tirosina. In questo modo è stata possibile la purificazione di una singola specie molecolare avente più del 95% di forma 2.
2. Produzione di una proteasi corrispondente alla forma 3 mediante il plasmide pT7-7 (NS3 1033-1206). In questo modo si è purificata una proteina avente più del 95% della forma 3.
ESEMPIO 3
Metodologia per riprodurre in vitro l'attività della proteasi NS3 di HCV
Definizione delle condizioni chimico-fisiche per la riproduzione dell'attività
La capacità della proteasi purificata di catalizzare il taglio del peptide Fmoc-Tyr-Gln-
è stata utilizzata per definire le condizioni ottimali dell'attività. Il taglio è stato rilevato separando il substrato dai prodotti di idrolisi mediante HPLC su fase inversa. A questo scopo la miscela contenente il tampone ed il peptide incubato con la protessi è stata iniettata su una colonna a fase inversa Lichrospher RP-18 (Merck) ed eluita con un gradiente di acetonitrile contenente lo 0,1% di acido trifluoroacetico. I prodotti di taglio sono stati identificati mediante coiniezione di standard appropriati nonché tramite spettrometria di massa. Per questi esperimenti sono state utilizzate proteine prodotte mediante una delle metodologie descritte negli esempi 1 e 2.
La dipendenza dell'attività dalla concentrazione di glicerolo è stata determinata in un tampone 50 mM Tris pH 7 , 5 , 2% CHAPS , 30 mM DTT . A questo tampone sono state aggiunte concentrazióni crescenti di glicerolo ed è stata determinata l'attività relativa della protessi. La figura 3 mostra i risultati di questo esperimento, dimostrando che il 50% (v/v) di glicerolo è la condizione ottimale. In un successivo esperimento questa concentrazione è stata mantenuta costante al 50% ed è stata variata la concentrazione di CHAPS (figura 4). Il 2% (w/v) di CHAPS è stato così determinato come valore di concentrazione ottimale. E' stato possibile sostituire il CHAPS con altri detergenti compatibili con il mantenimento dell'attività catalitica dei polipeptidi secondo l'invenzione. Alcuni di questi detergenti sono: eptil-β-D-glucopiranoside, decilβ-D-glucopiranoside , decil-β-D-gluco-maltoside, nonil-β-D-glucopiranoside, N-esil- -D-glucopiranoside, ottil-β-D-glucopiranoside, ottil- -D-tio-glucopiranoside, Nonidet P-40, TweeN-20.
Alle concentrazioni ottimali di CHAPS e glicerolo la proteasi mostra una attività ottimale a pH 8,5 (figura 5). A questo pH la stabilità nel tempo è però inferiore a quella osservata a pH 7,5. Per determinare l'effetto della forza ionica sull'attività è stata eseguita una titolazione con NaCl. Questo esperimento ha dimostrato che l'attività proteasica è inibita ad alta forza ionica (figura 6).L'analisi cinetica dei dati ha dimostrato che ioni cloruro sono degli inibitori competitivi fino alla concentrazione di 100 mM .
Abbiamo così potuto definire le seguenti condizioni come ottimali per riprodurre in vitro l'attività della proteasi di HCV purificata: 50 mM Tris pH 7,5, 3-30 mM DTT, 2% CHAPS, 50% glicerolo. La dipendenza dell'attività dalla temperatura è stata analizzata tramite un plot di Arhenius nel quale il logaritmo della costante cinetica kcat viene riportato in funzione dell'inverso della temperatura. Questo grafico mostra una discontinuità a temperatura superiore a 25°C, indicando cambiamenti conformazionali concomitanti con un decremento dell'attività. La temperatura ottimale è stata quindi determinata essere intorno a 22-23°C.
Come già menzionato, la proteina NS4A è un cofattore della proteasi di HCV. Esperimenti di delezioni N e C-terminali hanno definito il peptide Pep4A con la sequenza SEQ ID N0:6, come dominio minimo ancora in grado di indurre una attivazione ottimale. In esperimenti di trasfezione o di traduzione in vitro l'aggiunta di polipeptidi contenenti la sequenza minima di NS4A è spesso essenziale per l'osservazione di un taglio efficiente. Le condizioni di saggio sopra descritte permettono invece di determinare e quantizzare cineticamente l'attività della proteasi di HCV su substrati peptidici in assenza di peptidi contenenti sequenze di NS4A. Ciò nonostante l'aggiunta di Pep4A è in grado di indurre un aumento significativo dell'attività della protessi purificata anche nelle condizioni di saggio sopra descritte. Le caratteristiche cinetiche di questa attivazione sono descritte qui di seguito. Tramite un esperimento di titolazione abbiamo determinato una stechiometria di 1:1 per questa interazione a concentrazione 300 nM di proteasi indicando una Kd<300 nM.
Definizione del substrato ottimale per la riproduzione dell'attività
Per definire il substrato minimo il cui taglio possa ancora essere rivelato con la metodica HPLC sopra descritta si sono sintetizzati dei derivati del peptide
già descritto, con
delezioni N-e/ oppure C-terminali. Questi peptidi sono stati incubati nelle condizioni definite nel precedente capitolo in presenza di 100 nM-1,6 μΜ proteasi. La nomenclatura per i residui amminoacidici dei peptidici utilizzati come substrati adottati in seguito è quella definita da Schechter e Berger in (7). I residui vengono definiti come Pn....P3, P2, P1, P1', P2', P3'. ...Pn', dove il legame idrolizzato è P1-P1' {legame tra Cys ed Ala). La tabella 1 mostra i dati cinetici di questo esperimento definendo P6 e P3' o P4' come gli estremi di un substrato ancora tagliato efficientemente. Delezioni oltre P6 o P3' causano un drastico decremento dell'efficienza, misurata come kcat/Km, con la quale il rispettivo peptide può ancora fungere da substrato. Delezione di P4 ' causa un decremento di kcat/Km meno marcato, la risoluzione della separazione di substrato e prodotto di taglio in HPLC è però significativamente migliore per un decapeptide P6-P4' piuttosto che per un nonapeptide P6-P3', per cui il decapeptide P6-P4' è stato definito come substrato ottimale.
TABELLA 1: Caratterizzazione del substrato
Si sono determinati i parametri cinetici Km, kcat e kcat/Km per decapeptidi P6-P4' corrispondenti agli altri due siti di taglio intermolecolari NS4B/5A e NS5A/5B e si sono confrontati questi dati con i dati ottenuti con il peptide P6-P4' corrispondente al sito NS4A/4B (tabella 2). Queste cinetiche sono state ottenute sia in assenza che in presenza di concentrazioni stechiometriche di Pep4A. L'analisi dei dati cinetici così ricavati indica un effetto di Pep4A prevalentemente su kcat. Confrontando i valori di
Km dei singoli substrati appare evidente che la presenza di due cariche negative in P5 e in P6 determina l'efficienza di legame di un substrato peptidico. Infatti decapeptidi corrispondenti ai siti NS4A/4B e NS5A/5B che hanno dei residui Asp oppure Giu in posizione P6 e P5 possiedono dei valori di Km simili e significativamente minori del peptide corrispondente al sito NS4B/5A che possiede un'unica carica in posizione P6. TABELLA 2: Attività su peptidi corrispondenti ai siti di taglio in trans
Si è ulteriormente investigata l'importanza relativa dei singoli residui all'interno della sequenza P6-P4' corrispondente al sito di taglio NS4A/4B mutando singolarmente ogni amminoacido in
alanina e determinando poi i parametri cinetici dei peptidi mutati così ottenuti. I risultati sono descritti in tabella 3. Questo esperimento identifica la seguente scala di importanza dei singoli residui per un taglio efficiente: P1>>P3=P5=P6>P2=P4. Modificazioni della parte P' non hanno effetti significativi sull'efficienza di taglio. Queste informazioni sono state utilizzate per lo sviluppo di metodiche per saggiare l'attività della proteasi, utili per identificare inibitori. Queste metodiche verranno illustrate in seguito.
TABELLA 3: Sostituzioni con alanina dei residui P6-P4' del peptide substrato
Per determinare più dettagliatamente l'importanza dei residui in P6 ed in PI' sono
stati sintetizzati una serie di peptidi P6-P4' nei quali sono stati introdotte delle modificazioni in queste posizioni. I risultati di questi esperimenti sono descritti nella tabella 4. I risultati di questi esperimenti sottolineano l'importanza di una carica negativa in posizione P6. Infatti Asp o Giu in questa posizione vengono accettati con Km indistinguibili . La neutralizzazione della carica mediante introduzione di Asn causa un aumento significativo di Km, mentre l'inversione della carica mediante introduzione di un residuo Lys causa un aumento di Km molto marcato.
TABELLA 4: Sostituzioni dei residui P6 e P1' del peptide substrato
La sostituzione di Ala in posizione P1' con Ser non ha nessun effetto significativo, mentre la sostituzione con Phe causa un abbassamento
dell'efficienza di taglio del substrato risultante, misurato con kcat/Km.
E' stata analizzata una serie di mutazioni della posizione PI, descritte nella tabella 5. Sostituzioni della cisteina in questa posizione con treonina, allilglicina, acido aamminobutirrico, norvalina e vaiina vengono accettate, anche se i substrati risultanti vengono tagliati con una efficienza, espressa come kcat/Km, significativamente inferiore al substrato non modificato.
TABELLA 5: Sostituzioni del residuo PI del peptide
Alg, allilglicina; Abu, acido α-amminobutirrico; Nva, Norvalina
Le inforinazioni riguardanti la specificità di substrato possono essere utilizzate sia per lo sviluppo di saggi enzimatici che per la sintesi di inibitori basati su sequenze modificate del substrato. Ad esempio peptidi substrato con residui P1 modificati sono inibitori competitivi della proteasi con costanti di inibizione Ki tra 350 e 90 μΜ (tabella 6). Questi peptidi possono essere modificati ulteriormente aumentandone il potenziale inibitorio mediante l'introduzione di gruppi aldeidici, trifluorometilchetonici, difluorometilenchetonici , dichetonici, chetoesterici , chetoammidici oppure αchetoeterociclici , acidi boronici e monoalometilchetonici . Informazioni sulla specificità possono permettere anche la sintesi di inibitori non basati su peptidi quali: alo-enollattoni, isocumarine, β-lattami, succinimmidi, pironi, bezossazinoni , bezoiso-tiazoline oppure isocianati latenti.
TABELLA 6 : Azione inibitoria di decapeptidi P6-P4' modificati nella posizione PI
ESEMPIO 4
Metodologia per utilizzare l'attività in vitro. della proteasi per la ricerca di inibitori Saggio automatizzato utilizzando un substrato ammidico
Il peptide
derivato dal sito di taglio NS4A/NS4B, è tagliato dalla proteasi con i seguenti parametri cinetici:
400.000 cpm del peptide marcato con una
attività specifica di 2-10 Ci/millimole vengono incubati per 3 ore a 23°C insieme a 40 μΜ (Km/2) di peptide non marcato in presenza di 200 nM proteasi e 1 μΜ di Pep4A in 50 mM Tris pH 7,5, 50% glicerolo, 3% CHAPS, 10 mM DTT. Durante questo periodo il 20% del peptide substrato viene tagliato. Il prodotto di taglio può essere quantizzato seguendo la metodica descritta in seguito e riassunta in figura 7. Come si vede dalla figura, la miscela viene messa in contatto con uno scambiatore anionico TSK-DEAE. La frazione che esce dallo scambiatore viene filtrata, lasciata sedimentare o centrifugata. Sulla frazione limpida si misura la radioattività, la cui entità è legata esclusivamente al frammento di destra (C-terminale), dato che il substrato ammidico ed il frammento di sinistra vengono trattenuti dallo scambiatore anionico. L'aggiunta di inibitori provoca un abbassamento del rilascio del frammento di taglio marcato. Più è efficace un inibitore, minore sarà la radioattività misurata nella frazione limpida che esce dallo scambiatore anionico.
ESEMPIO 5
Sintesi chimica del substrato depsipeptidico SI:
La sintesi è stata eseguita interamente su fase solida usando il metodo Fmoc-poliammide a flusso continuo (9). La combinazione di gruppi protettivi è stata: protezione base-labile N<a->Fmoc per il gruppo α-ammino e protezione acido-labile per le catene laterali: Asp(Ot-Bu), Glu(Ot-Bu), Ser(t-Bu), Tyr(t-Bu) e His(Trt). Il polimero usato è stato Kieselguhr-poliammide(9) derivatizzato con un linker di Rink modificato (10), acido p-[(R,S)-α-[1-(9H-fluoren-9-il)-metossi-formammido]-2,4-di-metossibenzil]-fenossiacetico (11) (NovaSyn KR 125, 0,1 mmol/g) . La resina, i derivati amminoacidici, gli agenti di attivazione e tutti gli altri reagenti sono del più elevato grado di purezza disponibile in commercio. La sintesi è stata fatta secondo lo schema di figura 8. Gli accoppiamenti sono stati fatti con amminoacido attivato cinque volte in eccesso rispetto ai gruppi amminici liberi della resina, usando attivazione Fmoc-amminoacido/PyBOP/HOBT-DIEA (1:1:1:2), tranne che per l'acido L-(+)-lattico nel qual caso si è usata attivazione Fmocamminoacido/DIPC/HOBt (1:1:1:1). L'esterificazione di Abu all'idrossile libero dell'acido lattico è stata eseguita usando l'anidride simmetrica (Fmoc-Abu)20 in presenza di una quantità catalitica (0,1 equivalenti) di DMAP, per 30 minuti a temperatura ambiente (12): la reazione è stata ripetuta due volte per ottenere una resa del 70%; in assenza di catalizzatore, gli idrossili liberi rimanenti non sono reattivi nelle operazioni di sintesi successive. Alla fine dell'assemblaggio, la resina è stata lavata con DMF, metanolo e CH2C12, quindi è stata seccata sotto vuoto per 16 ore. La resinapeptide secca è stata trattata con TFA-acqua/triisopropilsilano (92,5:5:2,5) per 1,5 ore a temperatura ambiente; la resina è stata filtrata ed il peptide precipitato con etere metil-tbutilico freddo; il precipitato è stato ridisciolto in acqua-acetonitrile 1:1 (contenente 0,1% TFA) e liofilizzato.
La purificazione ad omogeneità superiore al 98% è stata ottenuta mediante HPLC preparativa su una colonna Nucleosyl C-18 (250x21 mm, 7 μΜ) usando come eluenti (A) acqua e (B) acetonitrile con 0,1% TFA, e un gradiente a gradino 22% B per 5 minuti, poi 22-27%B per 25 minuti, velocità di flusso 12 ml/min . In queste condizioni il peptide eluisce a 21,9 minuti. Le frazioni contenenti il materiale puro sono state raccolte e liofilizzate: resa 35%.
ESEMPIO 6
Sintesi chimica del substrato depsipeptidico S2:
La sintesi è stata eseguita come descritto nell'esempio precedente. L'esterificazione di Thr ad acido lattico ha richiesto tre ripetizioni per ottenere una resa del 70%, che è stata anche accompagnata dal 3% di racemizzazione del residuo Thr. Il diastereoisomero contenente D-Thr risulta tuttavia ben risolto cromatograficamente dall'isomero contenente L-Thr, ed è stato facilmente separato mediante HPLC preparativa. Il gradiente usato è stato 21% B per 5 minuti, poi 21-22% B per 20 minuti, con eluizione del peptide desiderato a 19,7 minuti: resa 24%.
ESEMPIO 7
Sintesi del substrato depsipeptidico S1 radioattivo:
Per marcare selettivamente il peptide S1 sul gruppo amminico della lisina C-terminale, il precursore protetto
è stato
assemblato sulla resina secondo lo schema di figura 10. La sola variazione rispetto alla sintesi di è stato l'uso di Fmoc-Lys (Alloc)-OH invece di La protezione Alloc è ortogonale rispetto ai gruppi di protezione basati su Fmoc e t-Bu, ed è rimossa con un trattamento di due ore con
in una soluzione di CHC13 contenente 5% di acido acetico e 2,5% di N-metilmorfolina.
La resina-peptidi secca (0,07 mmole/g, 60 mg) viene fatta reagire con anidride acetica [<3>H) (25 mCi, 5,7 mCi/mmole) per 16 ore a temperatura ambiente. Per completare la reazione viene poi usato un eccesso di 10 volte di anidride acetica non radioattiva. La resina viene poi lavata con DMF e trattata come descritto in precedenza. Dopo HPLC preparativa, viene ottenuto il peptide del titolo con una purezza superiore al 98% e con una attività specifica di 0,68 mCi/mmole.
Usando il saggio basato su HPLC, si ottengono i seguenti parametri cinetici per il substrato depsipeptidico SI radioattivo (SEQ ID NO.44):
Usando lo stesso saggio, i parametri cinetici relativi al substrato S2 radioattivo sono
La sintesi dei substrati depsipeptidici radioattivi permette la messa a punto di un saggio ad alta prestazione per la determinazione dell'attività della protessi NS3 come è schematizzato in figura 11. Il principio è il seguente: sia il substrato intatto che il frammento N/terminale che prende origine dal taglio enzimatico
sono molto acidi, mentre il frammento C-terminale
è, a seconda del pH, neutro o basico.
E' pertanto possibile catturare le due specie acide su una resina scambiatrice di anioni, lasciando il frammento C-terminale in soluzione. Se nel frammento C-terminale è contenuto un marcatore radioattivo (in questo caso l'unità di acetato triziato covalentemente attaccata al gruppo ε-amminico della lisina C-terminale), la resina potrà effettivamente discriminare il substrato non-processato da quello processato, rendendo così possibile la quantizzazione dell'attività proteolitica mediante misura della quantità di radioattività che rimane in soluzione dopo incubazione con l'enzima e trattamento con lo sacambiatore di ione. L'intero processo è essenzialmente lo stesso usato nel saggio ad alta prestazione basato sul substrato ammidico dell'esempio 4, ma il pH usato in questo caso è 7,0 invece di 7,5 per minimizzare l'idrolisi spontanea del legame estereo (0,6%/ora a 23°C). ESEMPIO .8
Sintesi dei substrati depsiptidici S3 ed S4:
La formula chimica dei due substrati S3 e S4 è mostrata in figura 11.
La sintesi è stata eseguita su fase solida come è mostrato nello schema di figura 13 per S3 (SEQ ID NO:45), facendo uso di due speciali derivati,
OH, preparati secondo metodi noti (16-17). Tutti gli accoppiamenti, inclusi Asp(EDANS) e Lys (DABCYL), sono stati eseguiti con amminoacido attivato cinque volte in eccesso rispetto ai gruppi amminici liberi della resina, usando attivazione
(1:1:1:2), con l'eccezione dell'acido L- (+)-lattico nel qual .caso è stata usata una attivazione
L'esterificazione di Abu all'idrossile libero dell'acido lattico è stata eseguita usando l'anidride simmetrica (Fmoc-Abu)20 in presenza di una quantità catalitica (0,1 equivalenti) di DMAP, per 30 minuti a temperatura ambiente (12).· la reazione è stata ripetuta due volte per ottenere una resa del 92%. Alla fine dell'assemblaggio, la resina peptidica è stata lavata ed il peptide sbloccato come descritto per il substrato SI.
Purificazione ad omogeneità superiore a 98% è stata ottenuta mediante HPLC preparativa su una colonna Nucleosyl C-18 (250 x 21 mm, 7 μm) usando come eluenti (A) 50 mM acetato d'ammonio, pH 6 e (B) acetonitrile. Il gradiente usato è stato 20% B per 5 minuti, poi 20-40%B per 20 minuti, velocità di flusso 25 ml/min; le frazioni contenenti il materiale puro sono state raccolte e liofilizzate: resa 45%. I parametri cinetici per questo substrato, calcolati mediante saggio basato su HPLC (vedere figura 14A) sono i seguenti:
Il tampone usato per il saggio è il seguente: 33 mM DTT, 50 mM Tris, pH 7, 50% glicerolo, 2% CHAPS . L'incubazione è stata eseguita a pH 7,0 per minimizzare l'idrolisi spontanea del legame esterico. Il saggio può essere condotto in una cuvetta oppure in una piastra per microtitolazione (a 96 pozzetti), monitorando la fluorescenza in funzione del tempo (lunghezza d'onda di eccitazione 355 nm, lunghezza d'onda di emissione 495 nm). L'incremento in fluorescenza dopo taglio del substrato è di 13 volte. La reazione è lineare come mostrato in figura 14B (concentrazione del substrato fissa = 2μΜ). Il limite di rivelazione è stato stabilito in 1 nM per il saggio ad alta prestazione su micropiastra e in 520 pM per il saggio basato su HPLC. Se viene eseguito un saggio continuo (cuvetta) per stabilire le velocità iniziali per la reazione enzimatica, il limite inferiore per la concentrazione di enzima è 80 nM, a causa dell'estinzione di fluorescenza del substrato tagliato a concentrazioni di substrato più alte di 10 μΜ.
DEPOSITI
Ceppi di E. coli DH1 - trasformati con i plasmidi pBac (1039-1226), pT7-7 (1039-1226), pT7-7 (1039-1206), pT7-7 (1027-1206) e pT7-7 1033-1206) che codificano rispettivamente per i polipeptidi con sequenza amminoacidica SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 - sono stati depositati il 14 agosto 1995 presso The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NICIMB), Aberdeen, Scotland, U.K., con i numeri di accesso NCIMB 40761, NCIMB 40762, NCIMB 40763, NCIMB 40764 e NCIMB 40765.
LISTA DI SEQUENZE
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Polipetidi isolati, caratterizzati dal fatto di consistere in una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, e dal fatto di possedere l'attività proteolitica della proteina NS3 del virus HCV.
- 2. Vettori d'espressione, per la produzione di uno dei polipeptidi di rivendicazione 1 in un organismo ospite, comprendenti: - un polinucleotide che codifica per uno dei detti polipeptidi; - sequenze di regolazione, di trascrizione e di traduzione, funzionali in detto organismo ospite, legate operativamente a detto polinucleotide; ed - eventualmente, un marcatore di selezione.
- 3. Cellula ospite, eucariote o procariote, trasformata con uno dei vettori di espressione di rivendicazione 2, capace di esprimere lo specifico polipeptide codificato nella sequenza polinucleotidica prescelta.
- 4 . Preocedimento per la preparazione di uno dei polipeptidi di rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere in combinazione le seguenti operazioni: - trasformazione di una cellula ospite eucariote o procariote con un vettore di espressione contenente una sequenza di DNA codificante per un polipeptide scelto dal gruppo di sequenze rappresentate da SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5; - espressione della sequenza di DNA desiderata per produrre il polipeptide prescelto; e - purificazione del polipeptide ottenuto, evitando protocolli di risolubilizzazione.
- 5. Peptidi, caratterizzati dal fatto di consistere in una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo delle sequenza rappresentate da SEQ ID NOS:7-12, 14, 18-20, 29-32, 35 e 47, e dal fatto di essere utilizzabili come substrati in un saggio ad alta prestazione dell'attività in vitro di polipeptidi con l'attività proteolitica di NS3 di HCV.
- 6. Depsipeptidi, caratterizzati dal fatto di consistere in una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente le sequenze rappresentate da SEQ ID NOS:42-46, e dal fatto di essere utilizzabili come substrati un un saggio ad alta utilizzano come substrati i depsipeptidi di rivendicazione 6 in saggio ad elevata prestazione a concentrazione dei polipeptidi di rivendicazione 1 comprese nell'intervallo 0,5-2 nM. 10. Metodologia per riprodurre e saggiare efficacemente in vitro l'attività proteolitica di NS3 di HCV come da rivendicazione 9 , in cui si realizza un monitoraggio continuo dell'attività proteolitica dei polipeptidi di rivendicazione 1 mediante uso, come substrati di depsipeptidi scelti dal gruppo delle sequenze rappresentate da SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46, internamente estinti sotto il profilo fluorogenico per "Resonance Energy Transfer" tra un donatore fluorescente, acido 5- [(2 ' -amminoetil)ammino]naftalensolfonico (EDANS), vicino ad una estremità del depsipeptide, ed un gruppo accettore, acido 4-[[4'-(dimetilammino)fenil]azo]benzoico (DABCYL) vicino all'altra estremità del depsipeptide. prestazione dell'attività in vitro di polipeptidi con l'attività proteolitica di NS3 di HCV.
- 7. Metodologia per riprodurre e saggiare efficacemente in vitro l'attività proteolitica della proteina NS3 di HCV, caratterizzata dal fatto che l'attività dei polipeptidi come da rivendicazione 1 viene riprodotta e saggiata in soluzione contenente 30-70 mM Tris pH 6,5-8,5 3-30mM ditiotreitolo, 0,5-3% 3-[(3-colammidopropil)-dimetil-ammonio] -1-propansolfonato e 30-70% glicerolo a temperature comprese fra 20 e 25°C, in un saggio ad elevata prestazione, utilizzando come substrati i peptidi di rivendicazione 5 o i depsipeptidi di rivendicazione 6.
- 8. Metodologia per riprodurre e saggiare efficacemente in vitro l'attività proteolitica di NS3 di HCV come da rivendicazione 7, in cui si utilizzano come substrati i peptidi di rivendicazione 5 in un saggio ad elevata prestazione a concentrazioni dei polipeptidi di rivendicazione 1 comprese nell'intervallo 100-200 nM.
- 9 . Metodologia per riprodurre e saggiare efficacemente in vitro l'attività proteolitica di NS3 di HCV come da rivendicazione 7, in cui si
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