ES2236743T3 - Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolitica de polipeptidos con actividad de proteasa hcv ns3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento. - Google Patents
Procedimiento de ensayo in vitro de la actividad proteolitica de polipeptidos con actividad de proteasa hcv ns3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento.Info
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Abstract
EL PROCESO DE CONFORMIDAD CON LA PRESENTE INVENCION PERMITE LA EXPRESION Y AISLAMIENTO DE POLIPEPTIDOS CON LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA PROTEASA NS3 DE HCV EN UNA FORMA PURA Y CATALITICAMENTE ACTIVA, Y EN CANTIDADES QUE SON SUFICIENTES PARA EL DESCUBRIMIENTO DE INHIBIDORES DE LA PROTEASA NS3 Y PARA LA DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA PROTEASA NS3. UN OBJETO ADICIONAL DE LA PRESENTE INVENCION ES UN PROCEDIMIENTO QUE DEFINE LAS CONDICIONES FISICAS Y QUIMICAS NECESARIAS PARA LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE DICHOS POLIPEPTIDOS. LA INVENCION SE REFIERE ADICIONALMENTE A NUEVAS COMPOSICIONES DE MATERIA (VECTORES DE EXPRESION) QUE CONTIENEN SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS CAPACES DE EXPRESAR LOS POLIPEPTIDOS MENCIONADOS EN CELULAS EN CULTIVO. FINALMENTE, SE DEFINEN NUEVAS COMPOSICIONES DE MATERIA, ADECUADAS PARA MEDIR LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA MENCIONADA, Y UTILES PARA DESARROLLAR INHIBIDORES DE LA PROTEASA NS3 Y EN CONSECUENCIA AGENTES TERAPEUTICOS PARA SU USO CONTRA HCV. LA FIGURA MUESTRA LOS PARAMETROS CINETICOS DE LA PROTEASA NS3 DE HCV EMPLEANDO EL SUSTRATO DEPSIPEPTIDOS S3 (SEQ ID NUM. 45).
Description
Procedimiento de ensayo in vitro de la
actividad proteolítica de polipéptidos con actividad de proteasa HCV
NS3 y peptidos sustratos a usar en dicho procedimiento.
La presente invención se refiere a la biología
molecular y a la virología del virus de la hepatitis C (VHC). Más
específicamente, la invención tiene como su sujeto un ensayo
enzimático capaz de seleccionar, para propósitos terapéuticos, los
compuestos que inhiben la actividad enzimática asociada a la
NS3.
Como se sabe, el virus de la hepatitis C (VHC) es
el principal agente etiológico de la hepatitis no-A,
no-B (NANB). Se estima que el VHC ocasiona al menos
el 90% de hepatitis vírica NANB post-transfusional y
el 50% de hepatitis vírica NANB esporádica. Aunque se ha hecho gran
progreso en la selección de donantes de sangre y la caracterización
inmunológica de sangre usada para transfusiones, todavía existe un
gran número de infecciones de VHC entre receptores de transfusiones
de sangre (un millón o más infecciones cada año en todo el mundo).
Aproximadamente el 50% de individuos infectados por VHC desarrolla
cirrosis hepática en un período que puede variar entre 5 y 40 años.
Además, estudios clínicos recientes sugieren que existe una
correlación entre infección por VHC crónica y el desarrollo de
carcinoma hepatocelular.
El VHC es un virus envuelto que contiene un
genoma positivo de ARN de aproximadamente 9,4 kb. Este virus es un
miembro de la familia Flaviviridae, los otros miembros de los cuales
son los flavivirus y pestivirus.
El genoma de ARN del VHC se ha mapeado
recientemente. La comparación de secuencias entre los genomas de VHC
aislados en diversas partes del mundo ha mostrado que estas
secuencias pueden ser extremadamente heterogéneas. La mayoría del
genoma del VHC está ocupado por una fase abierta de lectura (ORF)
que puede variar entre 9030 y 9099 nucleótidos. Esta ORF codifica
una proteína viral individual, la longitud de la cual puede variar
entre 3010 y 3033 aminoácidos. Durante el ciclo de infección viral,
la poliproteína se procesa proteolíticamente en los productos
génicos individuales necesarios para la replicación del virus.
Los genes que codifican las proteínas
estructurales del VHC se localizan en el extremo 5' de la ORF,
mientras que la región que codifica las proteínas no estructurales
ocupa es resto de la ORF.
Las proteínas estructurales constan de C (núcleo,
21 kDa), E1 (envuelta, gp37) y E2 (NS1, gp61). C es una proteína no
glicosilada de 21 kDa que probablemente forma el nucleocápsido
viral. La proteína E1 es una glicoproteína de aproximadamente 37
kDa, que se cree que es una proteína estructural para la otra
envuelta viral. E2, otra glicoproteína de membrana de 61 kDa, es
probablemente una segunda proteína estructural en la envuelta
externa del virus.
La región no estructural comienza con NS2 (p24),
una proteína hidrófoba de 24 kDa cuya función se desconoce.
La NS3, una proteína de 68 kDa que sigue a NS2 en
la poliproteína, se predice que tiene dos dominios funcionales: un
dominio serina proteasa dentro de los primeros 200 aminoácidos amino
terminal, y un dominio ATPasa dependiente de ARN en el extremo
carboxi.
La región génica NS4 codifica NS4A y NS4B (p26),
dos proteínas hidrófobas de 6 y 26 kDa, respectivamente, cuyas
funciones no se han clarificado todavía completamente.
La región génica de NS5 también codifica dos
proteínas, NS5A (p56) y NS5B), de 56 y 65 kDa, respectivamente. Las
secuencias de aminoácidos presentes en todas las ARN polimerasas
dependientes de ARN se pueden reconocer dentro de la región NS5.
Esto sugiere que la región NS5 contiene componentes de la maquinaria
de replicación viral.
Diversos estudios biológicos moleculares indican
que la peptidasa señal, una proteasa asociada con el retículo
endoplásmico de la célula hospedadora, es responsable del
procesamiento proteolítico en la región no estructural, que se dice
que está en los sitios C/E1, E1/E2, y E2/NS2.
La serina proteasa en NS3 es responsable de la
escisión en las conexiones entre NS3 y NS4A, entre NS4A y NS4B,
entre NS4B y NS5A y entre NS5A y NS5B. En particular se ha
encontrado que la escisión realizada por esta serina proteasa deja
una cisteína o un residuo treonina en el lado amino terminal
(posición P1) y un residuo alanina o serina en el lado
carboxi-terminal (Posición P'1) del sitio de
escisión. Se ha mostrado que la proteasa contenida en NS3 es una
proteína heterodimérica in vivo, que forma un complejo con la
proteína NS4A. La formación de este complejo incrementa la actividad
proteolítica en los sitios NS4A/NS4B y NS5A/NS5B, y es un requisito
necesario para el procesamiento proteolítico del sitio
NS4B/NS5A.
Una segunda actividad proteasa del VHC parece que
es responsable de la escisión entre NS2 y NS3. Esta actividad
proteasa está contenida en una región que comprende tanto la parte
de NS2 como la porción de NS3 que contiene el dominio serina
proteasa, pero no usa el mismo mecanismo catalítico que el
último.
Una sustancia capaz de interferir con la
actividad proteolítica asociada a la proteína NS3 podría constituir
un nuevo agente terapéutico. En efecto, la inhibición de esta
actividad proteasa implicaría la detención del procesamiento
proteolítico de la región no estructural y, por consiguiente,
evitaría la replicación viral de las células infectadas.
Esta secuencia de casos se ha verificado para el
flavivirus homólogo, que, a diferencia del VHC, infecta cultivos de
líneas celulares. En este caso, se ha mostrado que las
manipulaciones genéticas que implican la generación de una proteasa
no es más capaz de llevar a cabo su actividad catalítica, suprime
la capacidad del virus de repicarse (1).
Además, se ha mostrado de manera amplia, tanto
in vitro como en estudios clínicos, que los compuestos
capaces de interferir con la actividad proteasa del VIH son capaces
de inhibir la replicación de este virus (2).
Los procedimientos usados para generar moléculas
con potencial terapéutico los conocen los que operan en este campo.
Hablando en términos generales, las colecciones de compuestos que
contienen un gran número de entidades químicas individuales con una
alta diversidad molecular se hacen para someterse a un ensayo
automático con el fin de identificar agentes activos individuales,
que después se someten a posteriores modificaciones químicas con el
fin de mejorar su potencial terapéutico. Otros planteamientos pueden
incluir modificación racional de sustratos o ligandos de proteína
específica diana, con el propósito de desarrollar compuestos de alta
afinidad de unión capaces de alterar o suprimir la actividad
biológica de la proteína bajo examen. La determinación de la
estructura tridimensional de una proteína diana, por medio de
procedimientos conocidos en el sector como cristalografía de rayos X
o resonancia magnética nuclear (RMN) permite el diseño racional de
moléculas capaces de unirse específicamente a la proteína y que,
como resultado de esto, tienen la capacidad de interferir con las
propiedades biológicas de esa proteína.
La investigación sobre compuestos capaces de
interferir con la actividad biológica de la proteasa contenida en la
proteína NS3 del virus de la hepatitis C está dificultada por la
dificultad en la producción de cantidades suficientes de proteína
purificada con propiedades catalíticas no alteradas, y por la
necesidad de usar co-factores que potencian la
actividad de la enzima in vitro.
Por lo tanto existe una necesidad en el campo
específico de un procedimiento para producir NS3, o productos
similares, en grandes cantidades que ha sido posible en el pasado, y
con una actividad in vitro suficiente para seleccionar
inhibidores.
La presente memoria descriptiva describe
polipéptidos aislados y purificados, con la actividad proteolítica
de la proteína NS3 del VHC, caracterizada por el hecho de que tienen
una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias SEC ID.
Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº:
5.
También se describen los vectores de expresión
que producen los polipéptidos representados por las secuencias SEC
ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº:
5 que tienen la actividad proteolítica de la NS3 del VHC que
comprende:
- -
- un polinucleótido que codifica uno de dichos polipéptidos;
- -
- secuencias de regulación, transcripción y traducción funcional en dicha célula hospedadora, unida operativamente a dicho polinucleótido que codifica uno de dichos polipéptidos; y
- -
- opcionalmente un marcador seleccionable.
También se describe una célula hospedadora, bien
eucariótica o procariótica, transformada usando un vector de
expresión que contiende una secuencia de ADN que codifica las SEC
ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº:
5 de tal forma que permite que dicha célula hospedadora exprese el
polipéptido codificado específico en al secuencia elegida. También
se describe un procedimiento para la preparación de polipéptidos con
una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las SEC ID.
Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5,
caracterizadas por el hecho de que comprende, en combinación, las
siguientes operaciones:
- -
- transformación de una célula hospedadora, bien eucariótica o procariótica, usando uno de los vectores de expresión mencionados anteriormente; y
- -
- expresión de la secuencia de nucleótidos deseada para producir el polipéptido elegido; y
- -
- purificación del polipéptido así obtenido, evitando protocolos de resolubilización.
También se describe un procedimiento de
reproducción in vitro de la actividad proteolítica de la
proteasa NS3 del VHC, caracterizada por el hecho de que la actividad
de polipéptidos purificados, con secuencias elegidas entre el grupo
que comprende las SEC ID. Nº: 1, SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC
ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5, similar a NS3, se reproduce en una
solución que contiene Tris 30-70 mM pH
6,5-8,5, ditiotreitol 3-30 mM (DTT),
3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato
(CHAPS) al 0,5-3% y glicerol al
30-70% a temperaturas de entre 20 y 25ºC y por el
hecho de que en estas condiciones la actividad de los polipéptidos
anteriormente mencionados se pueden determinar y cuantificar
cinéticamente sobre sustratos peptídicos incluso en la ausencia de
co-factores.
La presente invención tiene como objeto un ensayo
de la actividad proteasa de los polipéptidos de las SEC ID. Nº: 1,
SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5. El
ensayo se puede realizar escindiendo un sustrato que proporciona
productos detectables. La escisión preferiblemente se detecta usando
procedimientos basados en señales radiactivas, colorimétricas o
frluorimétricas. Son también adecuados los procedimientos tales como
HPLC y similares. De acuerdo a la presente invención, los sustratos
usados son péptidos sintéticos correspondientes a la unión NS4A/4B
de la poliproteína de VHC. Si es necesario, los péptidos que
contienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID. Nº 6, o partes
de la misma, se pueden usar como co-factor de la
proteasa NS3.
Los péptidos adecuados para uso como sustratos
son los péptidos representados por la secuencia SEC ID. Nº 7 y los
derivados de la misma con supresiones N y/o
C-terminal (SEC ID números 8-12, 14,
18-20) y el péptido representado por la secuencia ID
Nº: 47. Particularmente adecuados son los decapéptidos representados
por las secuencias SEC ID números 18-20,
específicamente las SEC ID Nº: 18 y las secuencias derivadas de la
misma SEC ID Números 29-32, 35.
Estos péptidos se pueden usar para un ensayo de
alto rendimiento de la actividad de la proteasa NS3 a una
concentración de esta última de entre 100-200
nM.
De acuerdo a la invención los sustratos de
depsipéptidos (péptidos con al menos un enlace éster en las
secuencias) también se pueden usar de manera ventajosa durante un
ensayo de alto rendimiento de la actividad de la proteasa NS3. De
hecho, se sabe que es deseable llevar a cabo el ensayo a la
concentración de enzima más baja posible compatible con conversión
de sustrato suficiente. Esto maximiza la sensibilidad a la
inhibición y permite seleccionar los inhibidores que están presentes
a concentraciones muy bajas en mezclas de compuestos o genotecas
combinatorias. Los sustratos para la NS3 con una amida patrón en el
enlace escindible entre los residuos P1 y P1' tienen valores de
K_{cat}/K_{m} entre 30-100 M^{-1} s^{-1}.
Esto establece un intervalo práctico de concentración de enzima para
un ensayo de alto rendimiento de 100-200 nM. Para
reducir esta concentración es necesario usar sustratos con valores
de K_{cat}/K_{m} más altos. Los sustratos que contiene un enlace
éster entre P1 y P1' son idealmente adecuados para esto, ya que al
formación del intermedio acilo-enzima se lleva a
cabo mucho más fácilmente debido a la reacción de
transesterificación más termodinámicamente favorable (8). Los
sustratos de depsipéptido según la invención tienen valores muchos
más altos de K_{cat}/K_{m},y esto lleva el intervalo útil de
concentración de NS3 en el ensayo de alto rendimiento hasta
0,5-2 nM. Estos sustratos se pueden sintetizar con
alto rendimiento en fase sólida mediante metodología química
habitual.
habitual.
Son adecuados ensayos convencionales para rastreo
de alto rendimiento, pero requieren hidrólisis de al menos 10% del
sustrato antes de que el producto se pueda detectar de manera
conveniente. Esto impide la determinación de las verdaderas
velocidades iniciales, que son importantes para estudios cinéticos
exactos. Para superar estas dificultades, se ha desarrollado un
ensayo que permite el control continuo de la actividad proteasa. El
ensayo se basa en sustratos sintéticos especialmente confeccionados,
que son capaces de dirigir, la generación de señal continua que es
directamente proporcional al grado de hidrólisis de sustrato,
evitando así la necesidad de separación del sustrato del producto de
reacción. Los depsipéptidos usados (SEC ID números 45 y 46), las
fórmulas químicas de las cuales se proporcionan en la figura 12, son
sustratos fluorogénicos inactivados internamente basándose en
transferencia de energía de resonancia (RET). Contienen un dador
fluorescente, ácido
5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico
(EDANS), cerca de un extremo del péptido, y un grupo aceptor, ácido
4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico
(DABCYL) cerca del otro extremo. La fluorescencia de este tipo de
sustrato se inactiva inicialmente mediante RET intramolecular entre
el dador y aceptor, pero a medida de que la enzima escinde el
sustrato la fluorescencia aumenta. EDANS y DABCYL se seleccionaron
como un par dador/aceptor debido la superposición espectral
excelente entre la emisión fluorescente del anterior y la absorción
de este último (13-17). La eficacia de RET depende
de la distancia entre el dador y el aceptor, es decir, cuanto más
cerca de los dos, más alta es la inactivación. Para la pareja
EDANS/DABCYL, la distancia Förster para la transferencia de energía
al 50% (R_{0}) es de 33 \ring{A}. La distancia máxima entre
EDANS/DABCYL reseñada en un sustrato es 11 aminoácidos (19) que,
asumiendo una conformación extendida para el péptido, corresponde a
R = 39,8 \ring{A}, con una eficacia de RET calculada de 24,5%.
Esto corresponde a un incremento de 10 veces en fluorescencia tras
la escisión del sustrato.
Hasta este punto se ha proporcionado una
descripción general en la presente invención. Con la ayuda de los
siguientes ejemplos, una descripción más detallada de las
realizaciones específicas de las mismas se proporcionarán ahora, con
el fin de proporcionar un mejor entendimiento de los objetivos,
características, ventajas y procedimientos operativos de la
invención.
La figura 1 muestra el vector del plásmido usado
para transferencia y expresión del polipéptido representado por la
SEC ID Nº: 1 en células 9 del clon de Spodoptera
frugiperda.
Las figuras 2A y 2B muestran los vectores de
plásmido para transferencia y expresión en E. coli de los
polipéptidos representados por las secuencias SEC ID. Nº: 2, SEC ID.
Nº: 3, SEC ID. Nº: 4 y SEC ID. Nº: 5 respectivamente.
La figura 3 muestra la actividad de la NS3 en
función de la concentración de glicerol.
La figura 4 muestra la actividad de la NS3 en
función de la concentración de CHAPS,
3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato.
La figura 5 muestra la actividad de la NS3 en
función del pH.
La figura 6 muestra la actividad de la NS3 en
función de resistencia iónica.
La figura 7 muestra un diagrama de ensayo
enzimático para medir la actividad de la NS3 que usa como sustrato
un péptido Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala – Ser - His
- Leu - Pro Tyr - Lys - \epsilon - (3^{H}) - Ac (SEC ID Nº
47.
La figura 8 muestra el diagrama de reacción para
la síntesis del sustrato del depsipéptido S1 representado por la
secuencia SEC ID Nº: 42.
La figura 9 muestra el diagrama de reacción para
la síntesis del sustrato del depsipéptido S2 representado por la
secuencia SEC ID Nº: 43.
La figura 10 muestra el diagrama de reacción para
la síntesis del sustrato de depsipéptido radiactivo S1 representado
por la secuencia SEC ID Nº: 44.
La figura 11 muestra un ensayo de alto
rendimiento, basado en señales radiactivas, para determinar la
actividad de la proteasa NS3.
La figura 12 muestra la fórmula química de los
sustratos depsipeptídicos (SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 46) para un
ensayo continuo de la actividad de NS3 basada en la inactivación de
la fluorescencia intramolecular de RET.
La figura 13 muestra el diagrama de reacción para
la síntesis del sustrato depsipeptídico S3 (SEC ID Nº: 45).
Las figuras 14A y 14B muestran, respectivamente
los parámetros cinéticos para la proteasa NS3 con el sustrato S3
(SEC ID Nº: 45) y fluorescencia en función del tiempo en el ensayo
relevante.
Los sistemas para la expresión para genes
foráneos en células cultivadas de insecto, tales como células 9 del
clon de Spodoptera frugiperda infectadas con vectores de
baculovirus se muestran en la técnica (3). Genes heterólogos se
colocan usualmente bajo el control del promotor fuerte de
polihedrina del virus de polihedrosis nuclear de Autographa
californica o virus de polihedrosis nuclear de Bombix
mori. Los procedimientos para la introducción de ADN heterólogo
en el sitio deseado en los vectores baculovirales mediante
recombinación homóloga se conocen también en la técnica (4).
El vector del plásmido pBacNS3
(1039-1226) es un derivado de pBlueBacIII
(Invitrogen) y se construyó para la transferencia de un gen que
codifica un polipéptido con la actividad de NS3
(1039-1226). Para este propósito, la secuencia de
nucleótidos que codifica este polipéptido descrito en la SEC ID Nº:
1 se obtuvo mediante PCR usando oligonucleótidos que insertan un
codón ATG en 5' y un codón de parada TAG en 3' en la secuencia. El
fragmento obtenido de esta forma en el sitio BamH1 del vector
pBueBacIII, después del tratamiento con el fragmento de polimerasa
de ADN Klenow. El plásmido se ilustra en al figura 1.
Células 9 (Sf9) del clon de Spodoptera
frugiperda y kits de recombinación de baculovirus se compraron
en Invitrogen. Las células se desarrollaron en placas o en una
suspensión a 27ºC en medio de insecto completo de Grace (Gibco)
conteniendo suero bovino fetal al 10% (Gibco). La transfección,
recombinación, y selección de construcciones de baculovirus se
realizaron según recomendó el fabricante.
Para la expresión de proteínas, las células Sf9
se infectaron con el baculovirus recombinante a una densidad de 2 x
10^{6} células por ml en una relación de aproximadamente 5
partículas de virus por célula. Las células se cultivaron en
suspensión durante 72 horas a 23ºC. Reduciendo la temperatura desde
27ºC, que se corresponde normalmente a la temperatura de crecimiento
óptima, hasta 23ºC es crucial con el fin de obtener una proteína
activa y soluble.
Después de recoger las células mediante
centrifugación y lavándolas con PBS (fosfato sódico 20 mM pH 7,4,
NaCl 140 mM) el sedimento se resuspendió en fosfato sódico 25 mM pH
6,5, glicerol al 20%,
3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato
(CHAPS) al 0,5%, ditiotreitol 10 mM (DTT), ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. Las células se destruyeron a
4ºC mediante cuatro ciclos de sonicación a 10 W con una duración de
30 segundos cada uno, usando un instrumento Branson 250. El
homogenato obtenido de esta forma se centrifugó mediante
centrifugación a 120.000 x g durante una hora y el sobrenadante se
cargó en una columna de S-Sefarosa HR26/10
equilibrada con fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 10%, DTT 2
mN, EDTA 1 mM, CHAPS al 0,1% a un caudal de 2 ml/min. Después de
lavar con dos volúmenes de columna la proteasa se eluyó con un
gradiente de NaCl entre 0 y 1 M. Las fracciones que contenían la
proteasa se identificaron usando metodología de transferencia de
Western con anticuerpos policlonales específicos de NS3, se
concentraron hasta 3 ml usando una célula de ultrafiltración de
Amicon equipada con una membrana Ym10 y se cromatografió en una
columna Superdex 75 HR26/60 (Pharmacia) equilibrada con fosfato
sódico 50 mM pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 2 mM, CHAPS al, 0,1%, ESTA
1 mM y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones que contenían la
proteasa se reunieron y se sometieron adicionalmente a cromatografía
sobre una columna Mono-S HR5/5 (Pharmacia)
equilibrada con el mismo tampón usado en la columna anterior. La
proteasa se eluyó en forma pura de esta columna, aplicando un
gradiente de NaCl lineal entre 0 y 0,5 M. La proteasa se almacenó a
-80ºC en glicerol al 50%, CHAPS al 0,5%, DTT 10 mM y fosfato sódico
50 mM pH 7,5. El rendimiento del procedimiento es 0,5 mg/l de
células. La proteían purificada tiene una actividad catalítica
K_{cat}/K_{m} = 120-200 M^{-1} s^{-1} medida
en Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 2%, DTT 30 mM a 23ºC
usando el sustrato del péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp -
Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr -
Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7), derivada del sitio de escisión
de poliproteína entre NS4A y NS4B. Los productos de escisión que
derivan de esta reacción se separaron usando HPLC, se aislaron y se
identificaron mediante espectrometría de masa, confirmando que la
escisión proteolítica tuvo lugar entre cisteína y alanina. La
concentración de proteasa necesaria para determinar la actividad
estaba entre 100 nM y 1,6 \muM.
Los plásmidos pT7-7 (NS3
1039-1226), pT-7 (NS3
1039-1206), pT7-7 (NS3
1027-1206) y pT7-7 (NS3
1033-1206), descritos en las figuras 2A y 2B, se
construyeron con el fin de permitir la expresión en E. coli
de los polipéptidos indicados en las SEC ID. Nº: 2 y SEC ID. Nº: 3,
y SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº 5, respectivamente. Los fragmentos
proteicos contienen variantes del dominio de proteasa de la proteína
NS3 del VHC. Los fragmentos respectivos del ADNc del VHC se clonaron
cadena abajo del promotor \varnothing10 del bacteriófago T7 y en
un marco con el primer codón ATG de la proteína del gen 10 del fago
7, usando procedimientos que se conocen en la práctica. Los
plásmidos pT7-7 que contienen las secuencias de NS3
también contienen el gen para la enzima
\beta-lactamasa que se puede usar como marcador de
una selección de células de E. coli transformadas con estos
plásmidos.
Después los plásmidos se transformaron en la cepa
de E. coli BL21 (DE53), que se emplea normalmente para la
expresión a alto nivel de los genes clonados en vectores de
expresión que contienen el promotor de T7. En esta cepa de E.
coli, el gen de la polimerasa de T7 se lleva a cabo sobre el
bacteriófago \lambda DE53, que se integra en el cromosoma de las
células BL21 (5). La expresión a partir del gen de interés se induce
mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) al medio de
crecimiento según un procedimiento que se ha descrito previamente
(5). Sobre el 90% de las proteínas expresadas usando uno de los
plásmidos mencionados anteriormente se encuentra en una forma
insoluble en los cuerpos de inclusión, a partir de los cual es
posible obtener una proteína soluble y activa siguiendo los
procedimientos de replegamiento conocidos en el campo (véase por
ejemplo (6)). Los protocolos de replegamiento tienen a menudo
rendimientos variables de proteína catalíticamente activa, y
requieren condiciones extremadamente controladas, o producen
modificaciones irreversibles de la proteína (tal como carbamilación
en presencia de urea), o requieren procedimientos no prácticos,
tales como el uso de soluciones de proteínas extreamademnet
diluidas, o diálisis de volúmenes de muestras excesivamente
grandes.
Para evitar estos problemas, se ha desarrollado
un problema, que se describe más adelante, para la producción de la
proteasa del VHC en una forma soluble y activa, evitando así
protocolos de resolubilización: E. coli BL21 (DE53)
transformado usando uno de los plásmidos mencionados anteriormente
se desarrollaron a 37ºC hasta que alcanza una densidad celular que
produce absorción de 0,8 de DO (DO significa densidad óptica) a 600
nm. En este punto la temperatura se redujo hasta 30ºC en
15-20 minutos y se añadió IPTG 400 \muM para
inducir la expresión de al proteína. Después la temperatura se
redujo posteriormente hasta 22-24ºC entre un período
de 20-30 minutos. Las células se agitaron durante 4
horas adicionales a esta temperatura. En este punto las células se
recogieron mediante centrifugación y se lavaron usando PBS.
Los sedimentos resultantes a partir de las
operaciones descritas anteriormente se incubaron en hielo durante 5
minutos y se resuspendieron en fosfato sódico 25 mM pH 6,5, glicerol
al 50%, CHAPS al 0,5%, DTT 10 mM, EDTA 1 mM (tampón A) preenfriado
hasta 4ºC. Se usaron 10 ml de este tampón para cada litro de cultivo
bacteriano. Después de 5-10 minutos de incubación en
hielo la suspensión de células se homogeneizó usando una prensa
Francesa. El homogenato resultante se centrifugó a 120.000 x g. Los
sobrenadantes de esta centrifugación se preservaron en hielo,
mientras que los sedimentos se volvieron a suspender en tampón A (1
ml a cada litro de cultivo bacteriano). Después de la adición de
MgCl_{2} 1 mM y ADNasa I, la suspensión se incubó durante 10
minutos a 20ºC y se volvieron a centrifugar durante 1 hora a 120.000
x g. El sobrenadante se esta segunda centrifugación se reunió con el
primer sobrenadante y la solución de proteínas resultante se
adsorbió sobre resina S-Sefarosa (o
SP-Sefarosa) (Pharmacia) equilibrada con fosfato
sódico 25 mM pH 6,5, glicerol al 10%, CHAPS al 0,5%, DTT 3 mM, EDTA
1 mM (tampón B). 10 ml de resina suspendida en 5 ml de tampón B se
usaron para cada litro de cultivo bacteriano. La resina se agitó
durante 1 hora a 4ºC, se recogió mediante filtración, se lavó con
tampón B y se vertió en una columna de cromatografía apropiada. La
proteasa se eluyó con gradiente de NaCl entre 0 y 1 M. Las
fracciones que contenían la proteasa se identificaron usando
transferencia de Western, se reunieron y se concentraron usando
concentradores Centriprep 10 (Amicon) hasta que alcanzaron una
concentración de 6-10 mg/ml de proteína, se
determinaron usando el procedimiento BIORAD. Hasta 3 ml de esta
solución se cargó en una columna Superdex 75 HR 26/60 o hasta 20 ml
se cargaron en una Superdex 75 HR 26/600 (ambas de Pharmacia)
equilibradas con fosfato sódico 50 mM pH 7,5, glicerol al 10%, DTT 3
mM, CHAPS al 0,5% (tampón C) y se llevó a cabo una cromatografía a 1
ml/min (HR26/60) o 5 ml/min (HR60/600). Las fracciones que contenían
la proteasa se reunieron y se purificaron posteriormente mediante
cromatografía sobre HR 5/5 Mono S (Pharmacia) equilibrada con tampón
C. La proteasa se eluyó de esta columna con un gradiente de NaCl
entre 0 y 0,5 M. La purificación hasta homogeneidad también fue
posible con la siguiente modificación: después de cada elución de
S-Sefarosa las fracciones que contenían la proteasa
se diluyeron 1:4 en tampón C y se cargaron sobre
Heparina-Sefarosa. La elución de esta resina se
obtuvo con un gradiente de NaCl entre 0 y 0,5 M. Después la proteína
se cromatografió sobre hidroxiapatita o Superdex 75 como se ha
descrito anteriormente. La producción es 1-2 mg de
proteína purificada por litro de cultivo bacteriano.
La proteína purificada se caracterizó mediante
filtración de gel, HPLC de fase inversa, espectrometría de masas y
análisis de secuencia N-terminal.
Los experimentos de filtración sobre gel
analíticos mostraban que la proteína es monomérica. La proteína
expresada usando pT7-7 (NS3
1027-1206) muestra tres picos después de
cromatografía de HPLC de fase inversa. El análisis de espectrometría
de masas y determinación de la secuencia N - terminal mostró
heterogeneidad de la porción N-terminal de la
molécula. Se encontraron tres formas, que tienen las siguientes
secuencias N-terminal:
Para evitar este problema, se adoptaron dos
estrategias experimentales:
- 1.
- Homogeneización en presencia de 100 \mug/ml del inhibidor de la proteína quimoestatina. Este inhibidor no inhibe la actividad de la proteasa del VHC, pero inhibe las proteasas de tipo quimotripsina, específicas de residuos aromáticos similares a fenilalanina y tirosina. De esta forma era posible purificar una especie molecular individual con más de 95% de la forma 2.
- 2.
- Producción de una proteasa correspondiente a la forma 3 mediante el plásmido pT7-7 (NS3 1033-1206). De esta forma se purificó una proteína con más de 95% de la forma 3.
La capacidad de la proteasa purificada para
catalizar la escisión del péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp
- Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr -
Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7) se ha usado para definir las
condiciones óptimas para actividad. La escisión se detectó separando
el sustrato de los productos de hidrólisis mediante HPLC de fase
inversa. Para este propósito la mezcla que contenía el tampón y el
péptido incubado con la proteasa se inyectó en una columna
Lichospher RP-18 de fase inversa (Merck) y se eluyó
con un gradiente de acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético
al 0,1%. Los productos de escisión se identificaron mediante
co-inyección de patrones apropiados, y mediante
espectrometría de masas. Para estos experimentos, se usaron las
proteínas producidas por uno de los procedimientos descritos en los
ejemplos 1 y 2.
La dependencia de la actividad de la
concentración de glicerol se determinó en un tampón que contenía
Tris 50 mM pH 7,5, CHAPS al 2%, DTT 30 mM. Se añadieron
concentraciones crecientes de glicerol a este tampón, y se determinó
la actividad de la proteasa relativa. La figura 3 muestra los
resultados de este experimento, indicando que glicerol al 50% (v/v)
es el nivel óptimo. En un experimento posterior esta concentración
se mantuvo constante a 50% y se varió la concentración de CHAPS
(figura 4). De esta forma se encontró que un nivel de CHAPS al 2%
(v/p) era la concentración óptima. Es posible reemplazar CHAPS con
otros detergentes compatibles con la necesidad de mantener actividad
catalítica en los polipéptidos según la invención. Algunos de estos
detergentes son:
heptil-\beta-D-glucopiranósido,
decil-\beta-D-glucopiranósido,
decil-\beta-D-glucomaltósido,
nonil-\beta-D-glucopiranósido,
N-hexil-\beta-D-glucopiranósido,
octil-\beta-D-glucopiranósido,
octil-\beta-D-tioglucopiranósido,
Nonidet P-40, Tween-20.
A concentraciones de CHAPS y glicerol óptimas la
proteasa muestra actividad óptima a pH 8,5 (figura 5). A este pH la
estabilidad durante el tiempo es, sin embargo, menor que la
observada a pH 7,5. Para determinar el efecto de resistencia iónica
sobre la actividad, se realizó una valoración usando HCl. Este
experimento mostró que la actividad de la proteasa se inhibe a una
alta resistencia iónica (figura 9). El análisis cinético de los
datos mostró que los iones cloruro son inhibidores competitivos a
concentraciones de hasta 100 mM.
Así pues era posible definir las siguientes
condiciones óptimas para el ensayo in vitro o purificado de
la actividad de la proteasa del VHC: Tris 50 mM 7,5, DTT
3-30 mM, CHAPS al 2%, glicerol al 50%. La
dependencia de la actividad sobre la temperatura se analizó mediante
una representación gráfica Arrhenius en la que el logaritmo de la
constante cinética K_{cat} se proporciona como una función inversa
de temperatura. Este gráfico muestra discontinuidad a temperaturas
superiores a 25ºC, indicando cambios en conformación simultáneamente
con la disminución en actividad. Así pues se determinó la
temperatura óptima estaba entre aproximadamente
22-23ºC.
Como se ha mencionado anteriormente, la proteína
Ns4A es un cofactor de la proteasa del VHC. Los experimentos de
supresión N y C-terminal han definido el péptido
Pep4A con la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 6, como el dominio
mínimo capaz todavía de inducir activación óptima. En experimentos
de transfección o traducción in vitro la adición de
polipéptidos que contienen la secuencia mínima de NS4A es esencial
para proporcionar escisión eficaz. La adición de Pep4A es capaz de
inducir un incremento significativo en la actividad de proteasa
purificada en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. Las
características cinéticas de esta activación se describen más
adelante. Usando un experimento de valoración se determinó una
estequiometría de 1:1 para esta interacción a una concentración de
300 nM de proteasa, indicando una Kd < 300 nM.
Para definir el sustrato mínimo cuya escisión se
puede todavía detectar usando el procedimiento de HPLC descrito
anteriormente, se sintetizaron derivados del péptido Fmoc - Tyr -
Gln - Glu - Phe - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser -
His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu - Gln - Gly (SEC ID Nº: 7)
descrita anteriormente, con supresiones N - y C - terminal. Estos
péptidos se incubaron en las condiciones definidas en el capítulo
anterior en presencia de proteasa 100 nM - 1,6 \muM. La
nomenclatura para los residuos de aminoácidos de los péptidos usados
como sustratos que se adopta en lo siguiente es la establecida por
Schechter y Berger en (7). Los residuos se definen como Pn . . . .
P3, P2, P1, P1', P2', P3 . . . . Pn', donde el enlace hidrolizado es
P1-P1' (enlace entre Cys y Ala). La tabal 1 muestra
los datos cinéticos para este experimento, definiendo P6 y P3' o P4'
como los límites extremos de un sustrato que todavía se escinde
eficazmente. Las supresiones más allá de P6 o P3' producen un
descenso drástico en eficacia, medida como K_{cat}/K_{m}, con
las que el péptido respectivo puede todavía actuar como un sustrato.
La supresión de P4' produce un descenso menos marcado de
K_{cat}/K_{m}, sin embargo la separación de sustrato y producto
de escisión mediante HPLC es significativamente mejor para un
decapéptido P6-P4' que para un nonapéptido
P6-P3', de esta manera el decapéptido
P6-P4' se ha definido el sustrato óptimo.
Los parámetros cinéticos, K_{m}, k_{cat} y
k_{cat}/K_{m} se determinaron para los decapéptidos
P6-P4' correspondiente a los otros sitios de
escisión intermolecular NS4B/5A y NS5A/5B y estos datos se
compararon con los datos obtenidos usando el péptido
P6-P4' correspondiente al sitio NS4A/4B (tabla 2).
Estas cinéticas se obtuvieron tanto en ausencia como en presencia de
concentraciones estequiométricas de Pep4A. El análisis de los datos
cinéticos obtenidos de esta forma indica que el péptido Pep4A afecta
preferentemente a k_{cat}. Cuando los valores de k_{cat} para
los sustratos individuales se comparan se hace evidente que la
presencia de dos cargas negativas en P5 y en P6 determinaban la
unión eficaz de un sustrato peptídico. De hecho los decapéptidos
correspondientes a los sitios NS4A/4B y NS5A/5B con residuos Asp o
Glu en la posición P6 y P5 tiene valores de k_{m} similares y
significativamente menores que el péptido correspondiente al sitio
NS4B/5A con una carga individual en la posición P6.
Se llevó a cabo una investigación adicional sobre
la importancia relativa de residuos individuales en la secuencia
P6-P4', correspondiente al sitio de escisión
NS4A/4B, mediante mutación de cada aminoácido individualmente a
alanina y después determinando los parámetros cinéticos para los
péptidos mutantes obtenidos de esta forma. Los resultados se
describen en la tabla 3. Este experimento identifica la siguiente
escala de importancia de residuos individuales para la escisión
eficaz: P1 >> P3 = P5 = P6 > P2 = P4. La modificación de la
parte P' no tiene un efecto significativo sobre la velocidad de
escisión. Esta información se usó para desarrollar procedimientos de
ensayo de actividad de proteasa, útiles para la identificación de
inhibidores. Estos procedimientos se describirán más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para una determinación más detallada de la
importancia de los residuos en P6 y P1', se sintetizaron una serie
de péptidos P6-P4' en los que se introdujeron
modificaciones en estas posiciones. Los resultados de estos
experimentos se describen en la tabla 4. Los resultados de estos
experimentos subrayan la importancia de una carga negativa en
posición P6. De hecho, Asp o Glu en esta posición se aceptan con
K_{m} indistinguible. La neutralización de la carga mediante
introducción de Asn produce un incremento significativo en K_{m},
mientras la inversión de la carga mediante introducción de un
residuo Lys produce un incremento extremadamente marcado en
K_{m}.
La sustitución de Ala en la posición P1' con Ser
no tiene efecto significativo, mientras la sustitución con Phe
produce una reducción en el sitio de escisión del sustrato
resultante, medido como k_{cat}/K_{m}.
Se llevó a cabo un análisis sobre una serie de
mutaciones de la posición P1, descrito en la tabla 5. Se acepta la
sustitución de cisteína en esta posición con treonina, alilglicina,
ácido \alpha-aminobutírico, norvalina y valina,
incluso aunque los sustratos resultantes se escinden con una
eficacia, expresada como k_{cat}/K_{m}, que es
significativamente menor que la del sustrato no modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,4cm Alg, aliglicina; Abu, ácido
\alpha-aminobutírico; Nva, norvalina
La información relativa a la especificidad del
sustrato se puede usar tanto para el desarrollo de ensayos
enzimáticos como para la síntesis de inhibidores basándose en las
secuencias del sustrato modificado. Por ejemplo, los péptidos del
sustrato con residuos P1 modificados son inhibidores competitivos de
la proteasa con constantes de inhibición Ki de entre 350 y 90 \muM
(tabla 6). Estos péptidos se pueden además modificar para
incrementar su poder inhibidor mediante la introducción de grupos
aldehído, trifluorometilcetona, difluorometilencetona, dicetona,
cetoéster, cetoamida o \alpha-cetoheterocíclico,
ácido bórico y monoalometilcetona. La información sobre la
especificidad puede también permitir la síntesis de inhibidores que
no se basan en péptidos, tales como:
halo-enolactonas, isocumarinas,
\beta-lactamas, succinimidas, pironas,
bezoxiazinonas, bezoisotiazolinas o isocianatos latentes.
\hskip1,6cm Abu, ácido
\alpha-aminobutírico; Alg, alilglicina; Cha,
ciclohexilalanina.
El péptido Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Cys
- Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - \epsilon - (^{3}H) -
Ac (SEC ID Nº 47) derivada del sitio de escisión NS4A/NS4B, se
escinde mediante la proteasa NS3 con los siguientes parámetros
cinéticos: K_{m} = 79 \muM, k_{cat} = 0,49 min^{-1} y
k_{cat}/K_{m} = 103 M^{-1} s ^{-1}. 400.000 cpm del péptido
marcado con la actividad específica de 2 - 10 Ci/mmol se incubaron
durante 3 horas a 23ºC junto con 40 \muM (K_{m} /2) del péptido
no marcado en presencia de proteasa 200 nm y 1 \muM de Pep4A en
Tris 50 mM pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 3%, DTT 10 mM. Durante
este período se escindió el 20% del sustrato peptídico. El producto
de escisión se puede cuantificar siguiendo el procedimiento descrito
más adelante y resumido en la figura 7. Como se puede observar a
partir de la figura, la mezcla se pone en contacto con un
intercambiador iónico TSK-DEAE. La fracción que se
produce del intercambiador se filtra, se deja que sedimente o se
centrifuga. Se mide la radiactividad sobre la fracción transparente,
la cantidad de la cual está exclusivamente relacionada con el
fragmento derecho (terminal-C), dado que el sustrato
amida y el fragmento a la izquierda permanecen unidos al
intercambiador aniónico. La adición de inhibidores produce un
descenso en la velocidad relativa del fragmento escindido marcado.
Cuando más eficaz es el inhibidor, menor será la radiactividad
medida en la fracción que se produce del intercambiador
aniónico.
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu -\Psi
-[COO]- Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} -
Ac) - NH_{2} (SEC
ID Nº 42)
ID Nº 42)
La síntesis se realizó completamente en fase
sólida usando el procedimiento de flujo continuo
Fmoc-poliamida (9). La combinación de grupos
protectores era base-lábil
N\alpha-Fmoc para el grupo
\alpha-amidno y protección
ácido-lábil para las cadenas laterales: Asp
(Ot-Bu), Glu (Ot-Bu), Tyr
(T-Bu) e His (trt). El polímero usado era compuesto
Kieselguhr-poliamida (9) derivatizado con un engarce
amida Rink modificado (10), ácido
p-[(R,S)-a-[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]fenoxiacético
(11) (NovaSyn® KR 125, 0,1 mmoles/g). La resina, derivados de
aminoácidos, agentes de activación y todos los otros reactivos eran
de la calidad más alta disponible de fuentes comerciales. La
síntesis se llevó a cabo según los esquemas proporcionados en la
figura 8. Los acoplamientos se llevaron a cabo con un exceso 5 veces
de aminoácido activado sobre los grupos amino exentos de resina,
usando activación por
Fmoc-aminoácido/PyBOP/HOBt/DIEA (1:1:1:1:2) excepto
para ácido L-(+)-láctico cuando se usó la activación
por Fmoc-aminoácido/DIPC/HOBt (1:1:1:1). La
esterificación de Abu al grupo hidroxilo libre de ácido láctico se
realizó usando el anhídrido simétrico (Fmoc-Abu) 2O
en presencia de una cantidad catalítica (0,1 equiv.) de DMAP,
durante 30 minutos a temperatura ambiente (12): la reacción se
repartió dos veces para lograr un rendimiento de 90%; en la ausencia
de catalizador, los hidroxilos libre restantes son no reactivos en
las operaciones sintéticas posteriores. Al final del ensamblaje, la
resina se lavó con DMF metanol y CH_{2}Cl_{2}, después se secó a
vacío durante 16 horas. El péptido-resina seco se
trató con TFA/agua/triisopropilsilano (92,5:5:2,5) durante 1,5 horas
a temperatura ambiente; la resina se filtró y el péptido precipitó
con metil t-Bu éter frío; el precipitado se volvió a
disolver en agua al 50%/acetonitrilo conteniendo TFA al 0,1% y se
liofilizó.
La purificación hasta > 98% de homogeneidad se
logró a través de HPLC preparativa sobre una columna Nucleosyl
C-18 (250 x 21 mm, 7 \muM) usando como eluyentes
(A) agua y (B) acetonitrilo con TFA al 0,1%, y una etapa de
gradiente de 22% B durante 5 minutos, después 22-27%
B durante 25 minutos, caudal 12 ml/min. En estas condiciones el
péptido eluye a 21,9 minutos. Las fracciones que contienen el
material puro se reunieron y se liofilizaron: rendimiento 35%.
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Thr -
\Psi -[COO]- Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Lys -
(N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2} (SEC
ID Nº 43)
ID Nº 43)
La síntesis se realizó como se ha descrito en el
ejemplo anterior. La esterificación de Thr a ácido láctico requirió
tres repeticiones para obtener un rendimiento de 70%, que también se
acompañó por 3% de racemización del residuo Thr. El diastereoisómero
D-Thr sin embargo se resolvió bien
cromatográficamente a partir del isómero L, y se resolvió
fácilmente mediante HPLC preparativa. El gradiente usado era 21% B
durante 5 minutos, después 21-22% B durante 20
minutos, con el péptido deseado eluyendo a 19,7 minutos:
rendimiento: 24%.
Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu -
\Psi - [COO] - Ala - Ser - His - Leu -
Pro - Tyr - Lys - (N^{\epsilon} - [^{3}H]
- CH_{3}
CO) - NH_{2} (SEC ID Nº 44)
CO) - NH_{2} (SEC ID Nº 44)
Al péptido S1 marcado selectivamente sobre el
grupo N^{\epsilon} - amino de la lisina
C-terminal, el precursor protegido Ac - Asp (Ot -
Bu) - Glu (Ot - Bu) - Met - Glu (Ot - Bu) - Glu (Ot - Bu) - Abu -
\Psi - [COO] - Ala - Ser (t - Bu) - His (Trt) - Leu - Pro - Tyr
(t-Bu) - Lys CONH_{2} se ensambló sobre la resina
según el esquema de la figura 10. La única variación con respecto a
la síntesis de (N^{\epsilon} - Ac) - S1 era el uso de Fmoc - Lys
(Alloc) - OH en lugar de Fmoc - Lys (N^{\epsilon} - Ac) - OH. La
protección de Alloc es ortogonal con respecto a los grupos de
protección basados en Fmoc y t - Bu, que se retiran con un
tratamiento de dos horas con (0) PdP [(Ph_{3})_{4}] en
una solución de CHCl_{3} que contiene ácido acético al 5% y
N-metilmorfolina al 2,5%.
El péptido - resina seca (0,07 mmoles/g, 60 mg)
se hizo reaccionar con [^{3}H] anhídrido acético (25 mCi, 5,7
mCi/moles) durante 16 horas a temperatura ambiente. Después se usó
un exceso 10 veces de anhídrido acético no radiactivo para completar
la reacción. Después la resina se lavó con DMF y se trató como se ha
descrito previamente. Después de HPLC preparativa, se obtuvo >
98% de péptido puro Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu
-\Psi-[COO] - Ala - Ser - His – Leu - Pro - Tyr - Lys -
(N^{\epsilon} -[^{3}H] - CH_{3}CO) - NH_{2} con una
actividad específica de 0,68 mCi/mmol.
Usando el ensayo basado en HPLC, se obtuvieron
los siguientes parámetros cinéticos para el sustrato depsipéptidico
radiactivo S1 (SEC ID Nº: 44):
K_{cat} (min^{-1}) = 9
K_{m} (\muM) = 11
K_{cat}/K_{m} (M^{-1} s^{-1}) =
13,636
Usando el mismo ensayo, los parámetros cinéticos
para el sustrato radiactivo S2 son
K_{cat} (min^{-1}) = 16
K_{m} (\muM) = 96
K_{cat}/K_{m} (M^{-1} s^{-1}) = 2,780
La síntesis de los sustratos depsipeptídicos
radiactivos permite el establecimiento de un ensayo de alto
rendimiento para la determinación de la actividad de la proteasa NS3
como se ilustra esquemáticamente en la figura 11. El principio es el
siguiente: tanto el sustrato intacto como el fragmento
N-terminal que se origina a partir de la escisión
enzimática (Ac - Asp - Glu - Met - Glu - Glu - Abu - OH) son
extremadamente ácidas, mientras que el fragmento
C-terminal [HO - CH (CH_{3})CO - Ser - His
- Leu - Pro - Tyr - Lys (N^{\epsilon} -[^{3}H] - CH_{3}CO) -
NH_{2}] es, según el pH, neutro o básico. Por lo tanto es posible
capturar las dos especies ácidas obre una resina de intercambio
aniónica, dejando el fragmento C-terminal en
solución. Si el fragmento C-terminal contiene un
marcador radiactivo (en este caso el acetato tritiado unido
covalentemente al grupo \epsilon-amino de la
lisina C-terminal), la resina será capaz de
discriminar el sustrato procesado a partir de sustrato no procesado,
así haciendo posible cuantificar la actividad proteolítica midiendo
al cantidad de radiactividad restante en solución después de
incubación con la enzima y tratamiento con el intercambiados iónico.
El proceso completo es esencialmente el mismo usado en el ensayo de
alto rendimiento basándose en el sustrato de amida del ejemplo 4,
pero el pH usado en este caso es 7,0 en lugar de 7,5 para minimizar
la hidrólisis espontánea del enlace éster (0,6%/hora a 23ºC).
Ac - Asp - Glu - Asp - (EDANS) - Glu - Glu - Abu
-\Psi - [COO] - Ala - Ser – Lys - (DABCYL) NH_{2} (SEC ID Nº 45)
y Ac - Asp - Asp - (EDANS) - Met - Glu - Glu - Abu - \Psi - [COO]
- Ala - Ser - Lys - (DABCYL) NH_{2} (SEC ID Nº 46)
La fórmula química de los dos sustratos S3 y S4
se muestra en la figura 12.
La síntesis se realizó en fase sólida como se
detalla en el esquema de la figura 13 para S3 (SEC ID Nº: 45),
haciendo uso de dos derivados especiales, Fmoc - Asp (EDANS) - OH y
Fmoc - Lys (DABCYL) - OH, preparado según los procedimientos
conocidos (16-17). Todos los acoplamientos,
incluyendo Asp (EDANS) y Lys (DABCYL), se realizaron con 5 veces de
exceso de aminoácido activado sobre los grupos amino exentos de
resina, usando activación por
Fmoc-aminácido/PyBOP/HOBt/DIEA (1:1:1:2), con la
excepción del ácido L-(+)-láctico cuando se usó la
activación por Fmoc-aminoácido/DIPC/HOBt (1:1:1:1).
La esterificación de Abu al grupo hidroxilo libre de ácido láctico
se realizó usando el anhídrido simétrico
(Fmoc-Abu)_{2}O en presencia de una
cantidad catalítica (0,1 equiv.) de DMAP, durante 30 minutos a
temperatura ambiente (12): la reacción se repartió dos veces para
lograr un rendimiento de 92%. Al final del ensamblaje, el
péptido-resina se lavó y el péptido se escindió como
se ha descrito para el sustrato S1.
La purificación hasta > 98% de homogeneidad se
logró a través de HPLC preparativa sobre una columna Nucleosyl
C-18 (250 x 21 mm, 7 \muM) usando como eluyentes
(A) acetato amónico 50 mM, pH 6 y (B) acetonitrilo. El gradiente
usado para tanto S3 como S4 era 20% B durante 5 minutos, después
20-40% B durante 20 minutos, caudal 20 ml/min; las
fracciones que contenían el material puro se reunieron y se
liofilizaron: rendimiento 45% y 35% para S3 y S4, respectivamente.
Los parámetros cinéticos para este sustrato, se evaluaron a través
del ensayo basado en HPLC (véase la figura 14A), eran los
siguientes:
K_{cat} (min^{-1}) = 3,51
K_{m} (\muM) = 10,95
K_{cat}/K_{m} )M^{-1} s^{-1}) = 5342
El tampón usado para el ensayo es el siguiente:
DTT 33 mM, Tris 50 mM, pH 7, glicerol al 50%, CHAPS al 2%. La
incubación se lleva a cabo a pH 7,0 para minimizar la hidrólisis
espontánea del enlace éster. El ensayo se puede llevar a cabo en una
cubeta o en una placa de microtitulación (96 pocillos), controlando
la fluorescencia en función del tiempo (longitud de onda de
excitación 355 nM, longitud de onda de emisión 495 nM). El
incremento en fluorescencia tras la escisión del sustrato es 13
veces. La reacción es lineal como se muestra en la figura 14B
(concentración de sustrato fija = 2 \muM). El límite de detección
se estableció como 1 nM para el ensayo en microplacas de alto
rendimiento y 520 pM para el ensayo basado en HPLC. Si se realiza un
ensayo continuo (cubeta) para establecer las velocidades iniciales
para la reacción enzimática, el límite inferior para la
concentración enzimática es 80 nM, debido a que la inactivación de
fluorescencia del sustrato escindido a las concentraciones de
sustrato más altas que 10
\muM.
\muM.
Cepas de E. coli DH1 transformadas usando
los plásmidos pBac (1039-1226),
pT7-7 (1039-1226),
pT7-7 (1039-1206),
pT7-7 (1027-1206) y
pT7-7 (1033-1206), que codifican,
respectivamente, los polipéptidos con las secuencias SEC ID Nº: 1,
SEC ID. Nº: 2, SEC ID. Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº 5, se
depositaron el 14 de agosto de 1995 con The National Collections of
Industrial and Marine Bacterial Ltd (NCIMB), Aberdeen, Escocia,
Reino Unido, con números de acceso NCIMB 40761, NCIMB 40762, NCIMB
40763, NCIMB 40764 y NCIMB 40765.
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Abu = ácido 2-aminobutírico;
CHAPS
3-[(3-colamidapropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato;
DBCYL = ácido
4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico;
Depsipéptido = un péptido donde al menos un enlace peptídico se
reemplaza con el correspondiente enlace éster (el (las) localización
(es) del (de los) enlace (s) éster dentro de la molécula se indica
usualmente como \Psi[COO]- entre los residuos aminoácidos
implicados): DIEA = N,N-disoprpiletilamina; DIPC =
N, N'-diisopropilcarbodiimida; DMAP =
4-dimetilaminopiridina; DMF =
N,N-diemtilaminoformamida; DTT = ditiotreitol; EDANS
= ácido
5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico;
EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; HOBt =
N-hidroxibenzotriazol; HPLC = cromatografía líquida
de alto rendimiento; PyBOP = hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-oxi-tyris-pirrolidinofosfonio;
RET = transferencia de energía mediante resonancia;
T-Bu = terc-butilo; TFA = ácido
trifluoroacético; Trt (tritilo) = trifenilmetilo.
INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN DE BIOLOGÍA MOLECULAR. P. ANGELETTI S. p A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: METODOLOGÍA PARA PRODUCIR, PURIFICAR Y ANALIZAR POLIPÉPTIDOS CON LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA PROETASA NS3 de VHC
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 47
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Societa Italiana Brevetti
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Piazza di Pietra, 39
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Roma
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 1-00186
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete 3,5'' 1,44 MBYTES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 6.22
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Microsoft Word 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: DI CERBO, Mario (Dr).
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA: RM/X88568/PC-DC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 06/6785941
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 06/6794692
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 612287 ROPAT
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 191 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 195 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 181 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 174 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu
Ser Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Fmoc - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser His Leu Pro Tyr}
\sac{Ile Glu Gln Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser His Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser His Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser His}
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Tyr
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac-Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Met
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Glu Cys Ala Ser His Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Fmoc - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Ala
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Ala Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Ala Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Ala Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(28) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Ala Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(29) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ala His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(30) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser Ala
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(31) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(32) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Glu
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(33) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asn
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(34) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Lys
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(35) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ser Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(36) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Phe Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(37) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Alg (aliglicina)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(38) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido \alpha - aminobutírico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(39) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Thr Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(40) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Nva (norvalina)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(41) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Val Ala Ser His
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(42) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido 2 - aminobutírico) éster unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro
Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(43) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Thr unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro
Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(44) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Abu (ácido 2 - aminobutírico) éster unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - [^{3}H] - CH_{3}CO) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Xaa Xaa Ser His Leu Pro
Tyr Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(45) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp (EDANS)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Abu (ácido 2 - aminobutírico) unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (N^{\epsilon} - Ac) - NH_{2}
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Xaa Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(46) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp (EDANS)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Abu (ácido 2 - aminobutírico) unido al residuo siguiente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es éster de Ala unido al residuo precedente adyacente
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys (DABCYL)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Met Glu Glu Xaa Xaa Ser Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(47) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Ac - Asp
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: Xaa es Lys - \epsilon - (^{3}H) Ac
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro
Tyr Xaa}
Claims (14)
1. El péptido Fmoc - Tyr - Gln - Glu - Phe - Asp
- Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr -
Ile - Glu - Gln - Gly y sus derivados por supresión N - terminal y/o
supresión C-terminal y/o mutación, conteniendo un
sitio de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de
la hepatitis C (VHC) y comprendiendo los residuos de aminoácidos al
menos en las posiciones
-P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-,
en las que el enlace entre el residuo Cys en P1 y el residuo Ala en
P1' es el sitio de escisión de la proteasa en el que:
Asp en la posición P6 se puede reemplazar por
Asn, Glu o Ala;
Glu en la posición P5, Met en al posición P4, Glu
en la posición P3, Glu en la posición P2 se pueden reemplazar cada
uno de ellos por Ala;
Cys en al posición P1 se puede reemplazar por
Ths, ácido \alpha-aminobutírico, alilglicina, Val
o norvalina;
Ala en la posición P1' se puede remplazar por Ser
o Phe;
Ser en al posición P2' se puede reemplazar por
Ala;
His en al posición P3' se puede reemplazar por
Ala con tal que el derivado no sea la secuencia de aminoácidos Asp
-
Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu.
Glu - Met - Glu - Glu - Cys - Ala - Ser - His - Leu - Pro - Tyr - Ile - Glu.
2. El péptido según la reivindicación 1, que
tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC ID
Nº:
8-11, 14, 18-20, 23-27, 29-33, 35-41 y 47.
8-11, 14, 18-20, 23-27, 29-33, 35-41 y 47.
3. El péptido Ac - Asp - Cys - Ser - Thr - Pro -
Cys - Ser - Gly - Ser - Val (SEC ID Nº: 21) que tiene los residuos
dispuestos a lo largo de las posiciones
P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'
conteniendo un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa
NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) en la que el enlace entre el
residuo Cys en P1 y el residuo Ser en P1' es el sitio de escisión de
la proteasa.
4. El péptido Ac - Glu - Asp - Val - Val - Cys -
Cys - Ser - Met - Ser - Tyr (SEC ID Nº: 22) que tiene los residuos
dispuestos a lo largo de las posiciones
P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'
conteniendo un sitio de escisión reconocido por la serina proteasa
NS3 del virus de la hepatitis C (VHC) en la que el enlace entre el
residuo Cys en P1 y el residuo Ser en P1' es el sitio de escisión de
la proteasa.
5. El derivado del polipéptido según la
reivindicaciones 1 a 4 que es un depsipéptido que contiene un sitio
de escisión reconocido por la serina proteasa NS3 del virus de la
hepatitis C (VHC) y que comprende un enlace éster entre las
posiciones P1 y P1'.
6. Un depsipéptido según la reivindicación 5 que
tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID
números 42, 43, 44.
7. El péptido y derivado peptídico según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se proporcionaron
un marcador proporcionando una señal radiactiva, colorimétrica o
fluorométrica detectable.
8. El péptido y derivado peptídico según la
reivindicación 7 que es un depsipéptido, en el que la señal
fluorométrica se produce por inactivación fluorogénica interna
mediante transferencia de energía por resonancia entre un dador
fluorescente, ácido
5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico
(EDANS), cerca de un extremo del depsipéptido, y un grupo aceptor,
ácido 4-[(4'-(diemtilamino)fenil]azo]benzoico
(DABCYL) cerca del otro extremo del depsipéptido.
9. El depsipéptido de la reivindicación 8 que
tiene una secuencia seleccionada entre las SEC ID Nº: 45 y 46.
10. El procedimiento para ensayar in vitro
la actividad proteolítica de los polipéptidos que tienen actividad
de proteasa NS3 de VHC, que comprende poner en contacto el
polipéptido con un sustrato que proporciona productos de escisión
detectables en el que el sustrato es un péptido o derivado peptídico
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y controlando los
fragmentos escindidos.
11. El procedimiento de la reivindicación 10 en
el que el sustrato es un péptido o derivado peptídico según las
reivindicaciones 1 a 4, y el procedimiento es un ensayo de alto
rendimiento a concentraciones de proteasa NS3 de entre 100 y 200
nM.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 en
el que el sustrato es un depsipéptido o derivado peptídico según las
reivindicaciones 5 a 9 y el procedimiento es un ensayo de alto
rendimiento a concentraciones de proteasa NS3 de entre 0,5 y 2
nM.
13. El procedimiento se la reivindicación 11 ó 12
que comprende además el control continuo de la actividad
proteolítica de la proteasa NS3 del VHC con el depsipéptido de la
reivindicación 8.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 que comprende además poner en contacto la
proteasa NS3 del VHC con un cofactor que es el péptido que tiene la
secuencia Gly - Ser - Val - Val - Ile - Val -
Gly - Arg - Ile - Ile - Leu - Ser - Gly - Arg (SEC ID Nº: 6).
Gly - Arg - Ile - Ile - Leu - Ser - Gly - Arg (SEC ID Nº: 6).
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