MXPA98009330A - - Google Patents

Description

INHIBIDORES SINTÉTICOS DE LA PROTEASA NS3 DEL VIRUS DE HEPATITIS C ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de hepatitis C (VHC) es considerado el agente etiológico más importante de hepatitis no A no B (NANB) , enfermedad hepática crónica y carcinoma hepatocelular (CHC) en todo el mundo. La infección viral representa más de 90% de la hepatitis asociada con transfusión en los Estados Unidos y es la forma predominante de hepatitis en adultos de más de 40 años de edad. Casi todas las infecciones dan como resultado hepatitis crónica y casi 20% desarrollan cirrosis hepática. La partícula del virus no ha sido identificada debido a la falta de un sistema de replicación in vitro eficiente y la cantidad extremadamente baja de las particulas de VHC en tejidos hepáticos o sangre infectados. Sin embargo, se ha logrado la clonación molecular del genoma viral aislando el ARN mensajero (AR?m) del suero de chimpancés infectados después clonados utilizando las metodologías recombinantes [Gra oui A. et al. J. Virol. 67: 1385-1395 (1993]. Ahora se sabe que el VCH contiene un genoma de AR? de hebra positiva que consiste en aproximadamente 9400 nucleótidos, cuya organización es semejante a la de los flavivirus y pestivirus. El genoma del VCH, al igual que los flavivi- y pestivirus codifica una sola poliproteina de aproximadamente 3000 aminoácidos que es sometida a proteólisis para formar proteínas virales maduras en células infectadas. La traducción sin células de la poliproteina viral y estudios de expresión en cultivo celular han establecido que la poliproteina del VCH es procesada por proteasas celulares y virales para producir proteínas estructurales putativas y no estructurales (NE) , cuando menos nueve proteínas virales maduras se producen a partir de la poliproteina por proteól sis especifica. El orden y nomenclatura de los productos de disociación o desdoblamiento son como sigue: NH2-C-El-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Las tres proteínas estructurales putativas aminoterminales, C (cápside), El y E2 (dos glucoproteinas de envoltura), son consideradas que pueden ser disociadas o desdobladas por peptidasas de señal de hospedero del retículo endoplásmico (RE) . La enzima hospedera también es responsable de la generación del aminoterminal del NS2. El procesamiento proteolitico de las proteínas no estructurales se lleva a cabo por proteasas virales: NS2-3 y NS3, contenidas dentro de la poliproteina viral. La proteasa NS2-3 cataliza el desdoblamiento entre NS2 y NS3. Esta es una metaloproteasa y requiere tanto de la NS3, como del dominio de la proteasa de la NS3. La proteasa NS3 cataliza el resto de los desdoblcimientos de los sustratos en la parte no estructural de la poliproteina. La proteina NS3 contiene 631 residuos aminoácido y se compone de dos dominios enzimáticos: el dominio proteasa contenido dentro de los residuos aminoácido 1-181 y un dominio ATPasa helicasa contenido dentro del resto de la proteina. No se sabe si la proteina NS3 de 70kD se desdobla además en células infectadas para separar el dominio proteasa del dominio helicasa, no obstante, ningún desdoblamiento se ha observado en estudios de expresión en cultivos celulares. La proteasa NS3 es un miembro de la clase de enzimas serina proteinasa. Ésta contiene His, Asp y Ser como la triada catalítica. La mutación de los residuos de la triada catalítica anula los desdoblamientos en sustratos NS3/4A, NS4A/4B, NS4B/5A y NS5A/5B. El desdoblamiento entre NS3 y NS4A es mediado por una reacción enzimática intramolecular, mientras que los desdoblamientos en los sitios NS4A/4B, 4B/5A, 5A/5B ocurren en una reacción enzimática trans. Los experimentos que utilizan expresión transitoria de diferentes formas de poliproteinas NS del VCH en células de mamífero han establecido que la serina proteasa NS3 es necesaria pero no suficiente para el procesamiento eficiente de todos estos desdoblamientos. Al igual que los flavivirus, la proteasa NS3 del VCH también requiere un cofactor para catalizar algunas de estas reacciones de desdoblamiento. Además de la serina proteasa NS3, la proteina NS4A es absolutamente necesaria para el desdoblamiento del sustrato en los sitios NS3/4A y 4B/5A e incrementa la eficiencia del desdoblamiento del sustrato entre 5A/5B y posiblemente 4A/4B. Ya que la proteasa NS3 del VHC desdobla las proteínas no estructurales del VHC que son necesarias para la replicación del VHC, la proteasa NS3 puede ser un blanco para el desarrollo de los agentes terapéuticos contra el virus VHC. De esta manera, existe una necesidad para el desarrollo de inhibidores de la proteasa del VHC.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención cumple con esta necesidad proporcionando un inhibidor bivalente de una proteasa NS3 de hepatitis C compuesta de un primer péptido enlazado a un segundo péptido, siendo el primer péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa mutada de un sustrato de la proteasa NS3 de hepatitis C y siendo el segundo péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa mutada de un polipéptido NS4A de hepatitis C. La presente solicitud además proporciona un inhibidor de una proteasa de VCH que consta de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un sustrato de la proteasa. NS3 del VHC. La presente solicitud además proporciona un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC que consta de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa mutada de un polipéptido NS4A del VCH. La presente invención además consiste en un método para el tratamiento a un individuo infectado con el virus VHC que consiste en administrar un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC al individuo, estando el inhibidor compuesto de un primer' péptido unido a un segundo péptido, siendo el primer péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un sustrato de la proteasa NS3 de hepatitis C y siendo el segundo péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un polipéptido NS4A de hepatitis C. La presente invención además consiste en un método de tratamiento a un individuo infectado con el virus VCH que comprende la administración de un inhibidor de una proteasa NS3 del VCH al individuo, siendo el inhibidor compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un sustrato de la proteasa NS3 del VCH. La presente invención además consiste en un método de tratamiento a un individuo infectado con virus VHC que consiste en: administrar un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC al individuo, siendo el inhibidor compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecue-ncia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un polipéptido NS4A del VHC. La presente invención además consiste en una composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC, siendo el inhibidor compuesto de un primer péptido unido a un segundo péptido, siendo el primer péptido, una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un sustrato de la proteasa NS3 de la hepatitis C y siendo el segundo péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un polipéptido NS4A de hepatitis C, y un portador farmacéutico.

La presente invención además proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica compuesta de un inhibidor de una proteasa NS3 del VCH y un portador farmacéutico, siendo el inhibidor una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud complete-, mutada de un sustrato de la proteasa NS3 del VCH, La presente invención además proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica compuesta de un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC y un portador farmacéutico, en donde el inhibidor consta de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una subsecuencia de longitud completa, mutada de un polipéptido NS4A del VCH.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 representa a manera de esquema una modalidad de un inhibidor bivalente de la presente invención. La figura 2 representa la sintesis recombinante del plásmido pBJ1015. La figura 3 representa la sintesis recombinante del plásmido pTS56-9. La figura 4 representa la sintesis recombinante del plásmido pJB1006. La figura 5 representa la sintesis recombinante del plásmido pBJ1022. La figura 6 representa la sintesis recombinante del plásmido pNB (-V) 182?4AHT. La figura 7 representa la sintesis recombinante del plásmido pT5His/HIV/183.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las enseñanzas de todas las referencias mencionadas se incorporan en la presente en sus enterezas como referencia. La presente invención son inhibidores de la proteasa NS3 del VHC. La presente invención se refiere a los inhibidores de la proteasa NS3 del VHC que inhibe la interacción de un sustrato o cofactor NS4A con la proteasa NS3 o un inhibidor bivalente que inhibe la interacción de la proteasa NS3 con el cofactor NS4A y un sustrato de la proteasa NS3. En comparación con los inhibidores que se dirigen solo a un único sitio de unión, los inhibidores de enzimas bivalentes pueden proporcionar ventajas adicionales en términos de una afinidad de unión superior (potencia) asi como mejor especificidad contra enzimas hospederas celulares semejantes para reducir los efectos de toxicidad.

Estrategia de diseño de los inhibidores bivalentes de la proteasa NS3 del VHC. La estrategia fundamental para el diseño de los inhibidores bivalentes de la proteasa NS3 del VHC incluye la consideración de una estructura molecular que consiste en tres componentes individuales: 1. una región adecuada para la unión a un sitio de unión del sustrato; 2. una región adecuada para la unión al sitio de unión a NS4A; 3. una región del enlazador flexible que conecta las regiones (1) y (2) que permitan que las dos regiones extremas se unan a los sitios de unión respectivos. En forma de esquema esto se representa en la figura 1, en la cual la secuencia del sustrato es representada como bloque 10, estando unido al enlazador 12, y el enlazador 12 estando unido al polipéptido NS4A designado 14. Dado que la proteasa NS3 desdobla la poliproteina del VCH en las uniones NS3/4A, 4A/4B, 4B/5A y 5A/5B, entonces las sübsecuencias de o las subsecuencias mutadas de estos sitios pueden ser utilizadas como inhibidores del sustrato. Un inhibidor de sustrato que es una subsecuencia del inhibidor debe ser una subsecuencia que se encuentre antes o después del sitio de desdoblamiento pero, de preferencia, que no contenga el sitio de desdoblamiento. Una subsecuencia mutada o una subsecuencia de longitud completa mutada del sustrato puede utilizarse si el sitio de desdoblamiento es mutado de manera que no ocurra el desdoblamiento del sustrato, el desdoblamiento de origen a inactivación de la proteasa. con base en el mecanismo [sic] . Por ejemplo, el sitio de desdoblamiento NS3/4A contiene la siguiente secuencia: Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val 5 10 Leu Val Gly Gly Val Leu (SEQ ID NO: 26) 15 20 El sitio de desdoblamiento es entre la treonina en la posición 10 y la serina en la posición 11. Cualquier inhibidor subsecuente de preferencia estarla antes de la serina o después del residuo treonina. De otra manera, una subsecuencia o secuencia mutada puede producirse cambiando el sitio de desdoblamiento treonina/serina en la posición 10-11 para eliminar el sitio de desdoblamiento. NS4A/4B contiene la siguiente secuencia. Tyr Gln Glu Phe Asp Gly Met Glu Glu Cys Ser Gln His Leu 5 10 Pro Tyr He Glu Gln Gly (SEQ ID NO: 27) 15 20 El sitio de desdoblamiento es entre el residuo cisteina en la posición 10 y la serina en la posición 11. Cualquier subsecuencia de preferencia estarla antes de la serina o después de la cisteina, pero de preferencia no contendría ni cisteina ni serina. De otra manera, una subsecuencia o secuencia mutada puede ser producida cambiando el sitio de desdoblamiento cisteina/serina en la posición 10-11 para eliminar el sitio de desdoblamiento. NS4B/5A contiene la siguiente secuencia.

Trp He Ser Ser Glu Cys Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp 5 10 Leu Arg Asp He Trp Asp (SEQ ID NO: 28) 15 20 El sitio de desdoblamiento es entre la cisteina en la posición 10 y serina en la posición 11. Cualquier subsecuencia de preferencia terminarla antes de la serina o iniciarla después de la cisteina pero de preferencia no contendría ni la serina ni la cisteina. De otra manera, una subsecuencia o secuencia mutada puede ser producida cambiando el sitio de desdoblamiento cisteina/serina en la posición 10-11 para eliminar el sitio de desdoblamiento. NS5A/5B contiene la siguiente secuencia. Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Trp Thr 5 10 15 Gly (SEQ ID NO: 25) El sitio de desdoblamiento es entre la cisteina en la posición 8 y la serina en la posición 9. Cualquier subsecuencia de preferencia terminarla en la cisteina o iniciaría en la serina, pero de preferencia no contendría cisteina ni serina. De otra manera, una secuencia o subsecuencia mutada puede ser producida cambiando el sitio de desdoblamiento cisteína/serina en la posición 8-9 para eliminar el sitio de desdoblamiento. El enlazador 12 puede ser cualquier entidad química que pueda formar una unión con polipéptidos 10 y 14. De preferencia, el enlazador seria equivalente en longitud a una cadena de carbonos que tenga aproximadamente 7-14 residuos de carbono. Los ejemplos de los enlazadores adecuados son dos residuos ácido 6-aminocapróico (Acp) o un Acp y Lys en donde uno de los polipéptidos 10 o 14 forma un enlace peptidico con la e-amina de la lisina. Los ejemplos de los inhibidores bivalentes de la presente invención son los siguientes: Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Acp-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys (SEQ ID N0:1) Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2) Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys (SEQ ID NO: 3) En donde Xaa es un residuo lisina que tiene un enlace peptidico entre su e-amino y el grupo carboxilo de la siguiente lisina que forma un enlace peptidico con la glicina en la posición 10. Además, el residuo ácido glutámico en la posición 1 puede o no ser acetilado. Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys (SEQ ID NO: 4) en donde Xaa es lisina que tiene un enlace peptídico entre su e-amino y el grupo carboxilo de la siguiente lisina que forma un enlace peptidico con la Gly; además, el grupo carboxilo de la Xaa forma un enlace peptídico con el grupo a-amino de otra lisina (no se muestra) ; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys (SEQ ID NO: 5) en donde los aminoácidos en las posiciones 9-11 de preferencia son D-aminoácidos; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys (SEQ ID NO: 6) en donde el residuo lisina en la posición 8 tiene un enlace peptídico entre el carboxilo del Acp y el grupo a-a ino de la lisina, y el grupo e-amino de la lisina en la posición 8 forma un enlace peptídico con el grupo carboxilo del residuo cisteina en la posición 9 y los residuos aminoácidos en las posiciones 9-21 de preferencia son residuos D-aminoácidos; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Lys (SEQ ID NO: 7) en donde los residuos aminoácidos en las posiciones 8-20 de preferencia son residuos D-aminoácidos; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys (SEQ ID NO: 8) en donde Xaa es una Lys que forma un enlace peptidico entre su e aminoácido y el grupo carboxilo del residuo Cys en la posición 8 y el grupo carboxilo del residuo Lys forma un enlace peptidico con un grupo a amino de otro residuo Lys (no se muestra) de preferencia los residuos aminoácido en las posiciones 8-20 son D-aminoácidos. Los ejemplos de los inhibidores monovalentes adecuados de la presente invención son los siguientes: Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Lys (SEQ ID NO: 9) en donde los residuos aminoácido en las posiciones 1-13 de preferencia son residuos D-aminoácido; Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Lys (SEQ ID NO.: 10) en donde los residuos aminoácido en las posiciones 1-11 de preferencia son residuos D-aminoácido; Cys-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys (SEQ ID NO: 11) en donde los residuos aminoácido de preferencia son residuos D-aminoácido; Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val (SEQ ID NO: 12) en donde los residuos aminoácidos de preferencia son residuos D-aminoácido, el residuo serina en la posición 1 de preferencia ácido acetilado; Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys (SEQ I ID NO: 13) en donde los residuos aminoácido de preferencia son residuos D-aminoácido, el residuo lisina en la posición 1 de preferencia es acetilado; Xaa-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-He Val-Val-Cys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) en donde Xaa es biotina y los residuos aminoácido en las posiciones 2-14 de preferencia son residuos D-aminoácido; Lys-Gly-Ser-Leu-Val-Ile-Arg-Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 15) Xaa es un residuo de lisina en el cual el grupo e de la lisina forma un enlace peptidico con una biotina y los residuos aminoácido en las posiciones 1-13 de preferencia son residuos D-aminoácido. Los inhibidores de la presente invención pueden ser sintetizados mediante un método adecuado como puede ser por sintesis exclusiva en fase sólida, métodos en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o la sintesis en solución tradicional. Los polipéptidos de preferencia se preparan por la síntesis peptídica en fase sólida como se describe por Merrifield, J. Chem. Soc. 85:2149 (1963). La sintesis se lleva a cabo con aminoácidos que son protegidos en el al fa-aminoterminal . Los aminoácidos trifuncionales con cadenas laterales lábiles también son protegidos con grupos adecuados para evitar que ocurran reacciones químicas no deseadas durante el ensamblado de los polipéptidos. El grupo protector del alfa-amino se elimina selectivamente para permitir que se lleve a cabo la reacción posterior en el amino terminal. Las condiciones para la eliminación del grupo protector del alfa amino no eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales. Los grupos protectores del alfa-amino son aquellos conocidos por ser útiles en la técnica de la síntesis de los polipéptidos paso a paso. Se incluyen aquellos grupos protectores del tipo acilo (por ejemplo formilo, trifluoroacetilo, acetilo) , grupos protectores del tipo arilo (por ejemplo biotinilo) , grupos protectores del tipo uretano aromático [por ejemplo benciloxicarbonilo (Cbz) , benciloxicarbonilo sustituido y 9-fluorenilmetiloxi carbonilo (Fmoc)], grupos protectores de uretano alifático [por ejemplo t-butiloxicarbonilo (tBoc) , isopropiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo] y grupos protectores del tipo alquilo (por ejemplo bencilo, trifenilmetilo) . Los grupos protectores preferidos son tBoc y Fmoc, de esta manera se dice que los polipéptidos son sintetizados por la química del tBoc y Fmoc, respectivamente. Los grupos protectores de la cadena lateral que se seleccionen deben permanecer intactos durante la copulación y no ser eliminados durante la desprotección de los grupos portectores amino terminales o durante las condiciones de copulación. Los grupos protectores de la cadena lateral también deben ser eliminables al término de la síntesis, utilizando las condiciones de reacción que no modifiquen el polipéptido terminado. En la química tBoc, los grupos protectores de la cadena lateral para aminoácidos trifuncionales son principalmente a base de bencilo. En la química del Fmoc, estos son principalmente a base de ter-butilo o tritilo. En la química del tBoc, los grupos protectores de cadenas laterales preferidos son tosilo para Arg, ciciohexilo para Asp, 4-metilbencilo (y acetamidometilo) para Cys, bencilo para Gly, Ser y Thr, benciloximetilo (y dinitrofenilo) para His, 2-Cl-benciloxicarbonilo para Lys, formilo para Trp y 2-bromobencilo para Tyr. En la química del Fmoc, los grupos protectores de cadenas laterales preferidos son 2, 2, 5, 1 , 8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) o 2, 2, 4, 6, 7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf) para Arg, tritilo para Asn, Cys, Gln y His, terbutilo para Asp, Gly, Ser, Thr y Tyr, tBoc para Lys y Trp. La sintesis en fase sólida por lo común se lleva a cabo a partir de los carboxilo terminales mediante la copulación del aminoácido protegido en el alfa-amino (protegido en la cadena lateral) a un soporte sólido adecuado. Un enlace éster se forma cuando la unión se hace a una resina clorometilo, clorotritilo o hidroximetilo, y el polipéptido resultante tendrá un grupo carboxilo libre en el C terminal. De otra manera, cuando se utiliza una resina amida, como puede ser la resina benzhidrilamina o p-metilbenzhidrilamina (para la química tBoc) y Rink amida o resina PAL (para la química Fmoc) , se forma un enlace amida y el polipéptido resultante tendrá un grupo carboxamida en el C-terminal. Estas resinas, ya sea a base de poliestireno o poliamida o injertadas con polietilenglicol, con o sin una manija o enlazador, con o sin el primer aminoácido unido, están a la disposición en el comercio y sus preparaciones han sido descritas por Stewart et al (1984)., "Solid Phase Peptide synthesis" (2a edición), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, y Bayer & Rapp (1986) Chem. Pept. Prot. 3,3; y Athérton, et al. (1989) Solif Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. El aminoácido C-terminal protegido en la cadena lateral, si es necesario, y en el grupo alfa-amino, se une a una resina hidroximetilo utilizando diversos agentes activadores que incluyen diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) y carbonildiimidazol (CDI) . Esta puede estar unida a la resina clorometilo o clorotritilo directamente en su forma de sal tetrametilamonio de cesio o en presencia de trietilamina (TEA) o diisopropiletilamina (DIEA) . La unión del primer aminoácido a una resina amida es igual como la formación del enlace amida durante las reacciones de copulación. Después de la unión al soporte de resina, el grupo protector alfa-amino se elimina utilizando diversos reactivos, dependiendo de la química de protección (por ejemplo, tBoc, Fmoc) . El grado de eliminación del Fmoc puede ser monitoreado a 300-320 nm o por una celda de conductividad. Después de la eliminación del grupo protector del alfa amino, los aminoácidos protegidos remanentes son copulados paso a paso en el orden requerido para obtener la secuencia deseada. Diferentes agentes activadores pueden utilizarse para las reacciones de copulación incluido: DCC, DIPCDI, hexafluorofosfato de 2-cloro-l, 3-dimetilimidio (CIP), hexaflúorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris- (dimeti Lamina) -fosfonio (BOP) y su análogo pirrolidina (PyBOP) , hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBroP), hexafluorofosfato N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il) - (dimetilamino) metileno] -N-metilmetana inio (HBTU) y su análogo tetrafluoroborato (TBTU) o su análogo pirrolidina (HBPyU) , (HATU) y su análogo tetrafluoroborato (TATÚ) o análogo pirrolidina (HAPyU) . Los aditivos catalíticos más comunes que se utilizan en las reacciones de copulación incluye 4-dimetilaminopiridina (DMAP) , 3-hidroxi-3, 4-dihidro-4-oxo-l, 2, 3-benzotriazina (HODhbt) , N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) . Los fluoruros o cloruros de aminoácidos pueden utilizarse para copulaciones difíciles. Cada aminoácido protegido se utiliza en exceso (>2.0 equivalentes) , y las copulaciones por lo común se llevan a cabo en N-metilpirrolidona (NMP) o en DMF, CH2CI2 o mezclas de los mismos. El grado de terminación de la reacción de copulación puede ser monitoreada en cada etapa, por ejemplo por la reacción de la ninhidrina como se describe por Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595 (1970). En casos donde se encuentre copulación incompleta, la reacción de copulación se amplia y repite y pueden adicionarse sales caotrópicas. Las reacciones copulantes pueden realizarse automáticamente con instrumentos disponibles en el comercio como pueden ser los sintetizadores de péptidos ABI modelo 430A, 431A y 433A.

Después del ensamblado completo del péptido deseado, la resina-péptido se desdobla con un reactivo con depuradores adecuados. Los péptidos del Fmoc por lo común se desdoblan y desprotegen por TFA con depuradores (por ejemplo, H20, etanoditiol, fenol y tioanisol) . Los péptidos de tBoc por lo común se desdoblan y desprotegen con HF liquido durante 1-2 horas de -5 a 0°C, el cual desdobla el polipéptido de la resina y elimina la mayor parte de los grupos protectores de cadenas laterales. Los depuradores como anisol, sulfuro de dimetilo y p-tiocresol por lo común se utilizan con el HF líquido para evitar que los cationes formados durante el desdoblamiento alquilen y acilen los residuos aminoácido presentes en el polipéptido. El grupo formilo del Trp y el grupo dinitrofenilo de His necesitan ser eliminados, respectivamente, por piperidina y tiofenol en DMF antes del desdoblamiento con HF. El grupo acetamidometilo de la Cys puede ser eliminado por acetato de mercurio (II) y alternativamente por yodo, trifluoroacetato de talio(III) o tetrafluoroborato de plata que simultáneamente oxidan cisteína a cistina. Otros ácidos fuertes que se utilizan para desdoblar péptidos de tBoc y la desprotección incluyen ácido trifluorometansulfónico (TFMSA) y trifluoroacetato de trimetilsililo (TMSOTf) . En particular, los péptidos de la presente invención fueron- ensamblados a partir de Fmoc-resina amida o Fmoc-L-Lys- (tBoc) -resina Wang sobre un sintetizador ABI modelo 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA) por el método de síntesis de péptidos en fases sólida, como se describe originalmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963) pero con la química de Fmoc. Las cadenas laterales de los - aminoácidos trifuncionales fueron protegidas por terbutilo para Glu, Asp y Ser, tritilo para Cys, ter-butiloxicarbonilo (tBoc) para Lys y 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) o 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf) para Arg. Los aminoácidos protegidos con N-a-Fmoc fueron preactivados con HATU y l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) antes del acoplamiento a la resina. El dimetilsulfóxido (20%) fue adicionado durante la copulación extendida condicional y las reacciones de desprotección de Fmoc. La sintesis de los inhibidores SEQ ID NOs.: 1,2,5,7 y 9-15 se llevaron a cabo por ensamble en secuencia y lineal de los D- y L aminoácidos adecuados y aminoácidos aquirales. (Gly y Ahx) . La sintesis de los inhibidores SEQ ID NOs: 3,4,6 y 8 requirieron ensamble de cadena ortogonal anclada a un residuo de Lys cuyo grupo amino de cadena lateral fue protegido por l-(4,4-dimetil-2, 6-dioxociclohex-l-iliden) etilo (Dde) . Por ejemplo, para la preparación el inhibidor de SEQ ID NO: 3, primero se ensambló Ac-Gly-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys- (resina amida) (SEQ ID NO: 29) . Después que el grupo protector Dde en el residuo Lys fue removido por hidrazina al 2% en dimetilformamida (Bycroft, B.W. et al. J. Chem. Soc. Chem.

Commun. 1993, 778) . Por último, el segundo brazo Cys-Val-Val-He-Val-Gly-Arg-He-Val-Leu-Ser-Gly-Lys (SEQ ID NO: 30) fue secuencialmente ensamblado a partir del grupo amino de la cadena lateral. El péptido ensamblado fue disociado de la resina con desprotección simultánea de los grupos protectores de cadenas laterales durante tres horas por ácido trifluoroacético (TFA) con depuradores adecuados (80% TFA: 4% fenol: 4% H20, 4% tioanisol: 4% etanoditiol: 4% triisopropilsilano) , el péptido desdoblado fue separado de la resina por filtración y precipitado y lavado repetidas veces en etil éter anhidro. El péptido precipitado fue liofilizado en H20 durante la noche. El péptido impuro iofilizado fue purificado por CLAR en fase inversa. El péptido purificado además fue analizado por CIAR, espectroscopia de masa y análisis de aminoácidos. Es posible determinar si un compuesto potencial es efectivo como inhibidor de la proteasa NS3 del VHC utilizando un ensayo de alto rendimiento con la proteasa NS3, el cofactor NS4 y los sustratos péptidos, 4B/5A o 5A/5B. Estos pueden ser utilizados para explorar compuestos que inhiban la actividad proteolítica de la proteasa. Esto se hace desarrollando técnicas para determinar si un compuesto inhibirá o no la proteasa NS3 del desdoblamiento de los sustratos virales. Si los sustratos no son desdoblados, el virus no puede replicarse. Un ejemplo de este ensayo de alto rendimiento es el ensayo de proximidad por centelleo (EPS) . La tecnología EPC incluye el uso de perlas cubiertas con centelleante. Unidas a las perlas se encuentran las moléculas aceptoras como anticuerpos, receptores o sustratos enzimáticos que interactúan con dos ligandos o enzimas en una forma reversible. Para un ensayo de proteasa a base de EPC común, el péptido sustrato se hace reaccionar con biotina en un extremo y el otro extremo es radio marcado con emisores de poca energía como 1 5I o 3H. El sustrato marcado entonces se incuba con la enzima. Después se adicionan\ las perlas para el EPC recubiertas con avidina las cuales se unen a la biotina. Cuando el péptido sustrato es desdoblado por la proteasa, el emisor radioactivo ya no esta en proximidad con la perla centelleante y no se lleva a cabo la emisión de luz. Los inhibidores de la proteasa dejarán el sustrato intacto y pueden ser identificados por la emisión de luz resultante que se lleva a cabo en su presencia. Otro ejemplo de una técnica de ensayo adecuada es un ensayo por CLAR en el cual la mezcla de reacción resultante que contiene la proteasa NS3, los productos sustrato y el inhibidor potencial se resuelven sobre una columna de CLAR para determinar el grado de desdoblamiento del sustrato. Si el sustrato no ha sido desdoblado o el desdoblamiento ha sido inhibido, entonces solo el sustrato intacto estará presente o solo se mostrará una cantidad reducida del producto desdoblado. Si este es el caso, entonces el compuesto es un inhibidor efectivo de la proteasa NS3.

Composiciones farmacéuticas El nivel de dosificación de los inhibidores, necesaria para la terapia efectiva para inhibir la proteasa NS3 del VHC depe-nderá de múltiples factores diferentes que incluye: el medio de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente y otros métodos administrados. De esta manera, las dosificaciones para el tratamiento serán tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. Por lo común, las dosificaciones que se utilizan in vitro pueden proporcionar una guía útil acerca de las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. Las pruebas de las dosis efectivas en animales para el tratamiento de los trastornos particulares proporcionará además indicios predictivos de la dosificación humana. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo en Gilman, et al., (eds.) (1990) Goodman y Gil an's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a edición., Pergamon Press, y Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17a edición (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos de administración se describen en la presente y a continuación, por ejemplo para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdémica y otras. Véase también Langer (1990) Science 249:1527-1533. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, salina, soluciones amortiguadoras y otros compuestos que se describen, por ejemplo en Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. 1 µg por kilogramo de peso del paciente hasta 500 mg por kilogramo de peso del paciente, con un portador adecuado en un rango desde el cual pueda ser elegida la dosificación. Las formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta con frecuencia se podrá utilizar para la administración continua. Los inibidores de la proteasa NS3 del VHC de la presente invención pueden ser administrados directamente al hospedero que va a ser tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos con proteínas portadoras como albúmina o albúmina de suero antes de s administración. Las formulaciones terapéuticas pueden ser administradas en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones por lo común contienen cuando menos un ingrediente activo, como ya se definió, junto con uno o más portadores aceptables de las mismas. Cada portador debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con otros ingredientes y no lesionar al paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) . Las formulaciones pueden estar presentes, por conveniencia en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo Gilman, et al., (eds.) (1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapetucis, 8a edición, Pergamon Press, Parrytown, NY, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17a edición, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn; Avis, et al., (eds) (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications 2a edición, Dekker, NY; Lieberman et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 2a edición, Dekker, NY, y Lieberman, et al., (eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de esta invención puede ser combinada con o utilizada en asociación con otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos. Se incluyen los siguientes ejemplos para ilustrar pero no para limitar la presente invención.

Ejemplo 1 Inhibidores bivalentes de la proteasa NS3 del VHC Loe inhibidores bivalentes definidos por SEQ ID NO: 1-10 fueron producidos de manera sintética como se describe antes y probados para su capacidad para inhibir la proteasa NS3 del VHC como sigue. En una solución acuosa que contiene 25 mM TRIS, 50 mM NaCl, 0.5mM de EDTA, 10% de glicerol y 0.1% de NP40 se colocó el inhibidor potencial, la proteasa NS3 del VHC en una concentración de 0.05 µM - 0.1 mM, el cofactor NS4A del VCH en una concentración de 0.05 µM - 0.1 µM y el sustrato 5A/5B en una concentración de 50 µM. Esta solución fue entonces incubada durante aproximadamente 2 horas a 30°C después de lo cual la solución fue aplicada a una columna de CLAR para determinar si el 5A/5B permaneció intacto y de esta manera el compuesto se determina como inhibidor. Sin embargo, si la CLAR muestra que 5A/5B estuvieron presentes sin 5A/5B, entonces el compuesto no es un inhibidor. Los inhibidores potenciales fueron ensayados a diferentes concentraciones para determinar la concentración que produjo 50% de inhibición de la proteasa NS3 del VHC. Los resultados se muestran a continuación.

Inhibidor IC5o(µM) SEQ ID NO:l 0.6 50571-120 SEQ ID NO: 2 3.0 50962-13 SEQ ID NO: 3 3.0 50828-001 SEQ ID NO: 4 3-30 50962-22 SEQ ID NO: 5 0.2 50571-144 SEQ ID NO: 6 2.0 50571-150 SEQ ID NO: 7 0.2 50828-131 SEQ ID NO: 8 0.2 50962-24 Ej emplo 2 Inhibidores monovalentes de la proteasa NS3 del VHC Los ejemplos de los inhibidores monovalentes de la proteasa NS3 del VHC son como sigue.

Inhibidor IC5o(µM) SEQ ID NO: 9 0.2 50828-129 SEQ ID NO: 10 5 50962-004 SEQ ID NO: 11 0.2 50828-70 SEQ ID NO: 12 0.6 50828-116 SEQ ID NO: 13 2.0 50571-147 SEQ ID NO: 14 0.4 50962-047 SEQ ID NO: 15 0.4 50962-050 Ejemplo 3 Producción de proteasa NS3 del VHC A. Construcciones de los plásmidos Diversos plásmidos fueron diseñados y construidos utilizando técnicas del ADN recombinante normales (Sambrook, Fritsck & Maniatis) para expresar proteasa del VHC en E. coli (fig. 2-7) . Todas las secuencias específicas del VHC se originaron a partir del plásmido de procedencia pBRTM/VHC 1- 3011 (Grakoui et al. 1993). Para expresar las versiones de 183 aminoácidos N-terminales de la proteasa, un codón sin sentido fue insertado en el genoma del VHC utilizando oligonucléotidos sintéticos (Fig. 3) los plásmidos designados para expresar los 246 residuos aminoácidos N-terminales fueron generados por el sitio de restricción Ncol natural en el C terminal. i) Construcción del plásmido pBJ1015 (figura 2) . El plásmido pBRTM/VHC 1-3011 que contenia el genoma completo del VHC (Grakoui et al., J. Virol . 67: 1385-1395) fue digerido con* las enzimas de restricción Sea I y Hpa I, y el fragmento del ADN con 7138 pb (pares de bases) fue asilado y clonado en el sitio Sma I de pSP72 (Promega) para producir el plásmido pRJ201. El plásmido pRJ 201 fue digerido con Msc I y el fragmento del Msc I con 2106 pb fue aislado y clonado en el sito Sma I del plásmido pBD7. El plásmido resultante pMBM48 fue digerido con Kas I y Neo I, y el fragmento de ADN con 734 pb después de terminarlo en redondo o despuntarlo con Klenow polimerasa fue asilado y clonado en el sitio Neo I en el plásmido de expresión pTrc HIS B seq tratado con Klenow polimerasa, digerido (Invitrogen) . La ligación regeneró un sitio Neo I en el extremo 5' y un sitio Nsi I en el extremo 3' de la secuencia del VHC. El plásmido pTHB HVC NS3 fue entonces digerido con Neo I y Nsi I, y tratado con Klenow polimerasa y T4 ADN polimerasa para producir un fragmento de ADN con 738 pb, con extremos despuntados, que fue asilado y clonado en el corte Asp I, el plásmido de expresión pQE30 (HIV) tratado con Klenow polimerasa. El plásmido pBJ 1015 resultante expresa la proteasa NS3 del VHC (246 aminoácidos) . ii) Construcción del plásmido pTS 56-9 con un codón sin sentido después de 183 aminoácidos (figura 3) . El plásmido pTHB VHC NS3 fue digerido con Neo I, tratado con Klenow polimerasa, luego digerido con. Bst Y I; y el fragmento de ADN que contenía la secuencia del VHC fue aislado y clonado en Sma I y el pSP72 digerido con Bgl II. El plásmido pTS49-27 resultante fue entonces digerido con Bgl II y Hpa I y ligado con un oligonucleótido de doble hebra: GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA (SEQ ID NO: 18) para producir pTS56-9.

De esta manera, un codón sin sentido fue colocado directamente en el extremo del ADN que codifica el dominio catalítico de la proteasa de la proteína NS3. Esto permite que la proteasa del VHC sea expresada independientemente del dominio helicasa de la proteina NS3. iii) Construcción del plásmido pJB 1006 fusionado con un péptido de aminoácidos positivamente cargados en el carboxi terminal del NS3 183 (figura 4) El plásmido pTS 56-9 fue digerido con Sph I y Bgl II y el fragmento de ADN que contenia la secuencia del VHC fue aislado y clonado en un corte de Sph I, Bgl II de pSP72. El plásmido pJB1002 resultante fue digerido con Age I y Hpa I y ligado a un nucleótido de doble hebra, CCG GTC CGG AAG AAA AAG AGA CGC TAG C AG GCC TTC TTT TTC TCT GCG ATC G (SEQ ID NO: 19), para construir pJB1006. Esto fusionó el motivo solubilizante, hidrofilico en la proteasa NS3. iv) construcción del plásmido pBJ1022 que expresa His-NS3 (183) -HT en E. Coli (figura 5). El plásmido pJB1006 fue digerido con NgoM I y Nhe I y el fragmento de ADN de 216 pb fue asilado y clonado en el corte Ngo M I, Nhe I de pBJ1015 para construir el plásmido pBJ 1019. El plásmido pBJ 1019 fue digerido con Nar I y Pvu II, y tratado con klenow polimerasa para llenar los extremos 5' de fragmentos Nar I. El plásmido de expresión pQE31 (Invitrogen) fue digerido con BamH I, despuntado en los extremos con Klenow polimerasa. El fragmento de ADN Nar I-Pvu II con 717 pb fue aislado y ligado al fragmento Msc I (Bal I), digerido con BamH I y tratado con klenow, de 2787 pb, del plásmido de expresión pQE31 (Invitrogen) . El plásmido recombinante pBJ 1022, obtenido después de la transformación en E. coli expresa His NS3 (2-183) -HT que no contiene ninguna secuencia del sitio de desdoblamiento de la proteasa del VIH. El plásmido también contiene una gran supresión en el gen CAT (cloranfenicol acetil transferasa) . v) Construcción del plásmido pNB (-V) 182-?4A HT (figura 6) El plásmido pMBM 48 fue digerido con Eag I y Xho I tratado con klenow polimerasa, y el fragmento de ADN con 320 pb fue aislado y clonado en el corte BamH I, el pSP72 despuntado en sus extremos, para construir el plásmido pJB 1004. El fragmento con 320 pb codifica el aminoácido 7 a partir del carboxi terminal de NS3(631), todo el NS4A, y el aminoácido 46 aminoterminal de NS4B. El plásmido recombinante pJB 1004 fue digerido con Eag I y Cel 2, despuntado en los extremos con klenow polimerasa. El fragmento de ADN con 220 pb fue aislado y clonado en el plásmido de expresión pQE30, el cual fue digerido con BamH I y despuntado en sus extremos con klenow polimerasa antes de la ligación. El plásmido pJB 1011 resultante fue digerido con NgoM I y Hind III y ligado a un oligonucleótido de doble hebra, CCG GCA ATT ATA CCT GAC AGG GAG GTT CTC TAC CAG GAA TTC GT TAA TAT GGA CTG TCC CTC CAA GAG ATG GTC CTT AAG GAT GAG ATG GAA GAG TGC CGG AAG AAA AAG AGA CGC A CTA CTC TAC CTT CTC ACG GCC TTC TTT TTC TCT GCG TTC GA (SEQ ID NO; 20) para construir el plásmido pNB 4A HT. El plásmido pNB 4AHT fue digerido con Msll y Xba I. El fragmento de ADN con 1218 pb fue aislado y clonado en el corte Age I, tratado con klenow polimerasa, el ADN vector del corte Xba I de pJB 1019. La ligación da como resultado una sustitución de valina residuo aminoácido en la posición 183 por un residuo de glicina en NS3, y una supresión de 3 residuos aminoácido aminotei-minales de NS4A en la unión. El plásmido reco bir-ante pNB182?4A HT que contiene NS3 (182aa) -G-NS4A(4-54 aminoácidos) no contiene la secuencia del sitio de desdoblcimiento NS3/NS4A en la unión y no es desdoblado por la actividad autocatalitica de la NS3. Por último, el plásmido pNB182?4A HT (SEQ ID NO: 8) fue digerido con Stu I y Nhe :-, el fragmento de ADN con 803 pb fue aislado y clonado en el corte Stu I y Nhe I del plásmido pBJ 1022. El plásmido pNB (-V) 182-?4A HT resultante contiene una supresión de la secuencia del VIH a partir del extremo amino terminal de la secuencia NS3 y en el gen CAT (SEQ ID NO: 23) . vi) Construcción del plásmido pT5 His VIH-NS3 (figura 7) El plásmido pTS56-9 fue digerido con Bgl II, y tratado con klenow polimerasa para llenar los extremos 5' . El plásmido fue entonces digerido con NgoM I y el fragmento Bgl II/Ngo MI con extremos despuntados que contenia la secuencia NS3 fue aislado y ligado a Sgl I, el corte NgmMI, tratado con Klenow y Sal I tratado con Klenow del pásmido pBJ 1015. El plásmido resultante se denomina pT5His VIH 183.

Ejemplo 4 Purificación de proteasa NS3 del VHC con un motivo solubilizante Purificación de Hisl82HT (SEQ ID NO: 4) y His (-V) 182?4AHT (SEQ ID NO:8) Los plásmidos recombinantes pBJ1022 y pNB(-V) 182?4A fueron utilizados para transformar cultivos separados de la cepa de E. coli M15 [pREP4] la cual sobreexpresa el represor lac, de acuerdo con los métodos recomendados por el fabricante. Bacterias M15 [pREP4] que sirven de puerto a los plásmidos recombinantes fueron desarrolladas durante la noche en un caldo que contenia 20 g/1 de bactotripton, 10 g/1 de extracto de bacto-levadura, 5g/l de NaCl (caldo 20-10-5) y complementado con 100 µg/ml de ampicilina y 25 µg/ml de kanamicina. Los cultivos fueron diluidos para un D O. A 600 de 0.1, después desarrolladas a 30°C para una D. 0. a 600 de 0.6 a 0.8, después de lo cual se adicionó IPTG para una concentración final de lmM. A una inducción posterior de 2 a 3 horas, las células fueron cosechadas por empaquetamiento, y los paquetes celulares fueron lavados con tris 100 mM, pH 7.5. los lisados celulares fueron preparados como sigue: a cada ml equivalente de caldo de fermentación empaquetado se adicionaron 50 µl de solución amortiguadora para sonorización (fosfato de sodio 50 mM, pH 7.8, NaCl 0.3 M) con 1 mg/ml de lisozima; la suspensión celular se colocó en hielo durante 30 minutos. Después, la suspensión fue llevada a una concentración final de 0.2% de Tween 20, ditiotreitol (DTT) 10 mM, y fue sometida a sonorización hasta que el rompimiento de las células fue completo. El material insoluble fue empacado a 12000 x g en una microcentrífuga durante 15 minutos, la porción soluble fue removida a un tubo separado y el lisado soluble fue entonces llevado a una concentración final de 10% de glicerol. Los lisados solubles de las células que expresan los plásmidos producen bandas fuertemente inmunoreactivas de peso molecular predecible. Los lisados solubles preparados para purificación en columna Ni2+ fueron preparados con ß-mercaptoetanol lOmM (BME) en lugar de DTT. Los lisados fueron almacenados a -80°C.

Purificación utilizando ácido Ni2+-nitrosilacético (NTA) agarosa (QIAGEN) Las proteínas fueron entonces purificadas colocando el lisado extraido sobre una columna de NTA agarosa. La cromatografia en columna de NTA agarosa fue utilizada porque la etiqueta de histidina que fue fusionada al N terminal de las proteasas se unen fácilmente a la columna de níquel. Esto produce una técnica cromatográfica de afinidad poderosa para purificar rápidamente la proteasa soluble. La cromatografia en columna se realizó en un modo de lote. La resina Mi2+NTA (3 ml) fue lavada dos veces con 50 ml de buffer A(fosfato de sodio 50 mM, pH7.8, con un contenido de 10% de glicerol, 0.2% de Tween 20, BME 10 mM) . El lisado obtenido de una fermentación de 250 ml (12.5 ml) fue incubado con la resina durante 1 hora a 4°C. El flujo fue colectado por centrifugación. La resina fue empacada en una columna de 1.0 x 4cm y lavada con solución amortiguadora A hasta que se llego a la línea base. La proteína unida fue entonces eluída con un gradiente de 20 ml de imidazol (0-0.5 M) en buffer A. las fracciones eluidas fueron evaluadas por SDS-PAGE y el análisis western blot utilizando anticuerpos policlonales de conejo para His-VIH 183.

Purificación utilizando columna de afinidad metal-quelato POROS En un método alternativo para purificar las proteínas el lisado que contenía las proteínas fue aplicado a una columna de afinidad metal-quelato POROS. La cromatografía de perfusión se realizó en una columna metal quelato POROS MC (4.6 x 50 mm, 1.7 ml) precargada con Ni2+. La muestra fue aplicada a 10 ml/min y la columna fue lavada con buffer A. la columna fue eluida en forma gradual con 10 volúmenes de columna de buffer A con un contenido de imidazol 25 mM. La columna fue además eluida con un gradiente 25 del volumen de columna de imidazol 25-250 mM en buffer A. Todas las fracciones eluídas fueron evaluadas por SDAS-PAGE y el análisis Western blot utilizando anticuerpos policlonales de conejo.

Ejemplo 5 Síntesis peptídica de los sustratos 5A/5B y 4B/5A Los sustratos 5A/5B y 4B/5A péptidos (SEQ ID NO: 16, 18, 19, 20 y 21 fueron sintetizados utilizando la química de Fmoc sobre un sintetizador de péptidos ABI modelo 431A. el fabricante recomendó la estrategia de activación FastMoc ® (HBTU/HOBt) que fue utilizada para la síntesis del péptido activador 4A. Un activador más potente, HATU con o sin el aditivo HOAt fueron empleados para ensamblar los péptidos del sustrato 5A/5B sobre una resina Wang precargada. Los péptidos fueron desdoblados de la resina y desprotegidos por el protocolo de desdoblamiento TFA estándar. Los péptidos fueron purificados sobre CLAR en fase inversa y confirmados por análisis espectrométrico de masas.

Ejemplo 6 Ensayo por CLAR utilizando un sustrato peptídico 5A/5B sintético Para probar la actividad proteolitica de la proteasa NS3 del VHC, la DTEDWCC SMSYTWTGK (SEQ ID NO: 16) y NS3 del VHC soluble (SEQ ID NO: 27) fueron colocadas juntas en una solución amortiguadora de ensayo. La solución amortiguadora de ensayo fue fosfato de sodio 50 mM pH 7.8, por un contenido de' 15% de glicerol, DTT 10 mM, 0.2% Tween 20 y NaCl 200 mM) . La actividad de la proteasa de SEQ ID NO: 27 desdobló el sustrato en dos subproductos peptídicos, a saber, 5A y 5B. El sustrato y los dos subproductos peptídicos fueron separados sobre una columna CIAR en fase inversa. (Dynamax, 4.6 x 250 mm) con un tamaño de por de 300 Á y un tamaño de partícula de 5 µm. La columna fue equilibrada con 0.1% de TFA (solvente A) a una velocidad de flujo de 1 ml por minuto. El sustrato y los estándares peptidicos del producto fueron aplicados a la columna equilibrada en A. la elución se realizó con un gradiente de acetonitrilo (solvente B = 100% acetonitrilo en A) . Para la elución se utilizaron dos gradientes (5% a 70% B en 50 minutos seguido por 70% a 100% B en 10 minutos) .

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Schering Corp. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidores sintéticos de proteasa NS3 del virus de hepatitis C (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 30 (iv) DOMICILIO POSTAL: (A) DESTINATARIO: Schering Corp (B) CALLE: 2000 Galloping Hill Road (C) CIUDAD: Kenilworth (D) ESTADO: New Jersey (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07033-0530 (v): FORMA DE CÓMPUTO LEGIBLE: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.1 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/644,544 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de mayo de 1996 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO-ABOGADO: (A) NOMBRE: Dulak, Norman C. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 31608 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: JB0595 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 908-298-5061 (B) TELEFAX: 908-298-5388 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Glu Asp Val Val Cys Cys Acp Acp Cys Val Val He Val Gly Arg 5 10 15 He Val Leu Ser Gly Lys 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Cys-Val-Val-He-Val-Gly-Arg- 5 10 Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys-Lys (SEQ ID NO: 2) 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-He- 5 10 -Arg-Gly-Val-He-Val-Val-Cys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: Xaa es lisina que tiene un enlace peptídico entre su grupo epsilon amino y el grupo carboxiLo de lisina en la posición 8. El grupo carboxilo de Xaa forma un enlace peptidico con el grupo alfa amino de otra lisina (no se muestra) ; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Lys-GLy-Ser-Leu-Val-He-Arg- 5 10 Gly-Val-He-Val-Val-Cys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (il) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos aminoácido en las posiciones 9-21 de preferencia son residuos D-aminoácido; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-He- 5 10 Arg-Gly-Val-He-Val-Val-Cys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (i:L) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: el residuo lisina en la posición 8 tiene un enlace peptídico entre el grupo carboxilo de Acp y el grupo alfa amino de la lisina, y el grupo epsilon amino de la lisina en la posición 8 forma un enlace peptídico con el grupo carboxilo del residuo cisteína en la posición 9 y los residuos aminoácido en las posiciones 9-21 de preferencia son residuos D-aminoácido; Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Cys-Val-Val-He-Val-Gly- 5 10 Arg-He-Val-Leu-Ser-Gly-Lys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: los aminoácidos en la posición 8-20 de preferencia son D-aminoácidos. Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys-Gly-Ser-Leu-Val-He-Arg- 5 10 Gly-Val-Ile-Val-Val-Cys-Lys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) OTRA INFORMACIÓN: Xaa es una lisina en donde el grupo epsilon amino del cual forma un enlace peptidico con el grupo carboxilo del residuo cisteína en la posición 8 y el grupo carboxilo del residuo lisina forma un enlace peptidico con un grupo alfa amino de otro residuo lisina (no se muestra) , de preferencia los residuos aminoácidos en la posición 8-20 de preferencia son residuos D-aminoácidos. Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Xaa-Cys-Val-Val-He-Val-Gly-Arg- 5 10 Ile-Val-Leu-Ser-Gly-Lys 15 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos aminoácidos en las posiciones 1-13 de preferencia son residuos D-aminoácidos y lisina en la posición 14 de preferencia es un residuo L-aminoácido; Lys Gly Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val Val Cys Lys 5 10 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10: (i] CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos aminoácidos en las posiciones 1-11 de preferencia son D-aminoácidos. Lys Gly Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val Lys 5 10 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN : los residuos aminoácidos de preferencia son residuos D-aminoácidos. Cys Val Val He Val Gly Arg He Val Leu Ser Gly 5 10 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos aminoácidos de preferencia son D-aminoácidos y el residuo serina en la posición 1 de preferencia es acetilada; Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val 5 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE : (B) OTRA INFORMACIÓN: los residuos aminoácidos de preferencia son D-aminoácidos y el residuo lisina en la posición 1 de preferencia es acetilado. Lys Gly Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val Val Cys 5 10 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii.) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: Xaa es biotina y los residuos aminoácidos en las posiciones 2-14 de preferencia son D-aminoácidos; Xaa Lys Gly Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val Val Cys 5 10 Lys Lys (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: (B) OTRA INFORMACIÓN: Xaa es un residuo lisina en el cual el grupo epsilon amino de la lisina forma un enlace peptidico con una biotina y los residuos aminoácido en las posiciones 1-13 de preferencia son residuos D-aminoácidos; Lys Gly Ser Leu Val He Arg Gly Val He Val Val Cys 5 10 Xaa Lys 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 549 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (íx) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE : proteasa NS3 del VHC GCG CCC ATC ACG GCG TAC GCC CAG CAG ACG AGA GGC CTC CTA GGG 45 Ala Pro lie Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly 1 5 10 15 TGT ATA ATC ACC AGC CTG ACT GGC CGG GAC AAA AAC CAA CTG GAG 90 Cys lie He Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu 20 25 30 GGT GAG GTC CAG ATC GTG TCA ACT GCT ACC CAA ACC TTC CTG GCA 135 Gly Glu Val Gln He Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala 35 40 45 ACG TGC ATC AAT GGG GTA TGC TGG ACT CTC TAC CAC GGG GCC GGA 180 Thr Cys lie Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly 50 55 60 ACG TGC ATC AAT GGG GTA TGC TGG ACT GTC TAC CAC GGG GCC GGA i80 Thr Cys X- Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly 50 55 60 ACG AGG ACC ATC GCA TCA CCC AAG GGT CCT GTC ATC CAG ATG TAT 225 Thr Arg Thr lie Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val lie Gln Met Tyr 65 70 75 ACC AAT GTG GAC CAA GAC CTT GTG GGC TGG CCC GCT CCT CAA GGT 270 Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly 80 85 90 TCC CGC TCA TTG ACÁ CCC TGC ACC TGC GGC TCC TCG GAC CTT TAC 315 Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr CTG GTT ACG AGG CAC GCC GAC GTC ATT CCC GTG CGC CGG CGA GGT 360 Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val He Pro Val Arg Arg Arg Gly 110 115 120 GAT AGC AGG GGT AGC CTG CTT TCG CCC CGG CCC ATT TCC TAC CTA 405 Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro He Ser Tyr Leu 125 130 135 AAA GGC TCC TCG GGG GGT CCG CTG TTG TGC CCC GCG GGA CAC GCC 450 Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala 140 145 150 GTG GGC CTA TTC AGG GCC GCG GTG TGC ACC CGT GGA GTG ACC AAG 495 Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Thr Lys 155 160 165 GCG GTG GAC TTT ATC CCT GTG GAG AAC CTA GAG ACÁ ACC ATG AGA 5 0 Ala Val Asp Phe He Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg 170 175 180 TCC CCG GTG Ser Pro Val (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 162 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ( i ;L ) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ( ix) PECULIARIDAD : (A) NOMBRE/CLAVE : NS4A AGC ACC TGG GTG CTC GTT GGC GGC GTC CTG GCT GCT CTG GCC GCG 45 Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala ?la 1 5 10 15 TAT TGC CTG TCA ACÁ GGC TGC GTG GTC ATA GTG GGC AGG ATT GTC 90 Tyi- Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val He Val Gly Arg He Val 20 25 30 TTG TCC GGG AAG CCG GCA ATT ATA CCT GAC AGG GAG GTT CTC TAC 135 Leu Ser Gly Lys Pro Ala He He Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr 35 40 45 CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC 162 Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 50 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: doble (il) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE CCG GTC CGG AAG AAA AAG AGA CGC TAG C AG GCC TTC TTT TTC TCT GCG ATC G (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 79 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE CCG GCA ATT ATA CCT GAC AGG GAG GTT CTC TAC CAG GAA TTC GT TAA TAT GGA CTG TCC CTC CAA GAG ATG GTC CTT AAG GAT GAG ATG GAA GAG TGC CGG AAG AAA AAG AGA CGC A CTA CTC TAC CTT CTC ACG GCC TTC TTT TTC TCT GCG TTC GA (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: mutante activo NS4A Cys Val Val He Val Gly Arg He Val Leu Ser Gly Lys 5 10 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: sustrato 5A/5B soluble Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 5 10 15 Gly Lys (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NOr 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 810 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: pNB182?4AHT ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ACG GAT CCG CCC ATC 45 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro Pro He 1 5 10 15 ACG sca TAC GCC CAG CAG ACG AGA GGC CTC CTA GGG TGT ATA ATC 90 Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys He He 20 25 30 ACC AGC CTG ACT GGC CGG GAC AAA AAC CAA GTG GAG GGT GAG GTC 135 Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val 35 40 45 CAG ATC GTG TCA ACT GCT ACC CAA ACC TTC CTG GCA ACG TGC ATC 180 Gln He Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys llß 50 55 60 AAT GGG GTA TGC TGG ACT GTC TAC CAC GGG GCC GGA ACG AGG ACC 225 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 65 70 75 ATC GCA TCA CCC AAG GGT CCT GTC ATC CAG ATG TAT ACC AAT GTG 270 He Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val He Gln Met Tyr Thr Asn Val 80 85 90 GAC CAA GAC CTT GTG GGC TGG CCC GCT CCT CAA GGT TCC CGC TCA 315 Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser 95 100 105 TTG ACÁ CCC TGC ACC TGC GGC TCC TCG GAC CTT TAC CTG GTT ACG 360 Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr 110 115 120 AGG CAC GCC GAC GTC ATT CCC GTG CGC CGG CGA GGT GAT AGC AGG 05 Arg His Ala Asp Val He Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg 125 130 135 GGT AGC CTG CTT TCG CCC CGG CCC ATT TCC TAC CTA AAA GGC TCC 450 Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro He Ser Tyr Leu Lys Gly Ser 140 145 150 TCG GGG GGT CCG CTG TTG TGC CCC GCG GGA CAC GCC GTG GGC CTA 95 Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Leu 155 160 165 TTC AGG GCC GCG GTG TGC ACC CGT GGA GTG ACC AAG GCG GTG GAC 5 0 Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Thr Lys Ala Val Asp 170 175 180 TTT ATC CCT GTO GAG AAC CTA GAG ACÁ ACC ATO AGA TCC CCG GGG 585 Phe He Pro Val Glu ?sn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Gly 185 190 195 GTG CTC GTT GGC GGC GTC CTG GCT GCT CTG GCC GCG TAT TGC CTG 630 Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu 200 205 210 TCA AC? GGC TGC GTG GTC ATA GTG GGC AGG ATT GTC TTG TCC GGG 720 Ser Thr Gly Cys Val Val He Val Gly Arg He Val Leu Ser Gly 215 220 225 AAG CCG GCA ATT ATA CCT GAC AGG GAG GTT CTC TAC CAG GAG TTC 765 Lys Pro ?la He He Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr G n Glu Phß 230 235 240 GAT GAG ATG GA? G?G TGC CGG ??G ??? ??G ?G? CGC ??G CTT ??T 810 ?sp Glu Met Glu Glu Cys ?rg Lys Lys Lys ?rg ?rg Lys Leu ?sn 245 250 255 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO : 24 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 162 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla ( D) TOPOLOGÍA: lineal ( i L ) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ( ix) PECULIARIDAD : (A) NOMBRE/CLAVE : NS4A nativo TCA ACÁ TGG GTG CTC GTT GGC GGC GTC CTG GCT GCT CTG GCC GCG 45 Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala ?la 1 5 10 15 TAT TGC CTG TC? AC? GGC TGC GTG GTC ATA GTG GGC AGG ATT GTC 90 Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val He Val Gly Arg He Val 20 25 30 TTG TCC GGG AAG CCG GCA ATT ?T? CCT G?C AGG GAG GTT CTC TAC 135 Leu Ser Gly Lys Pro Ala He He Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr 35 40 45 CAG G?G TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 50 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: sustrato 5A/5B nativo Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 5 10 15 Gly (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio de desdoblamiento NS3/NS4A Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu 5 10 15 Val Gly Gly Val Leu 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio de desdoblamiento NS4A/4B Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Cys Ser Gln His Leu Pro 5 10 15 Try He Glu Gln Gly 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: 4B/5A Trp He Ser Ser Glü Cys Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu 5 10 15 Arg Asp He Trp Asp 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Acp-Lys 5 (2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido (ix) PECULIARIDAD: (A) NOMBRE/CLAVE: Cys Val Val He Val Gly Arg He Val Leu Ser Gly Lys 5 10

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor bivalente de una proteasa NS3 de hepatitis C que se compone de un primer péptido enlazado a un segundo péptido, siendo el primer péptido una subsecuencia, subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un sustrato de la proteasa NS3 de hepatitis C, y siendo el segundo péptido una subsecuencia de un polipéptido NS4A de hepatitis C.

2. El inhibidor bivalente de la reivindicación 1 se selecciona del grupo 1 que consiste en: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

3. Un inhibidor de una proteasa de VHC que esta compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa mutada de un sustrato de la proteasa NS3 del VHC.

4. El inhibidor de la reivindicación 3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID N0:15.

5. Un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC compuesto de un péptido, siendo el péptido una secuencia, una subsescuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un polipéptido NS4A del VCH.

6. El uso de un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hepatitis C, en donde el inhibidor esta compuesto de un primer péptido enlazado a un segundo péptido, siendo el primer péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada, una secuencia de longitud completa, mutada, de un sustrato de la proteasa NS3 de hepatitis C y siendo el segundo péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un polipéptido NS4A de hepatitis C.

7. El uso de la reivindicación 6, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:

8. 8. El uso de un inhibidor de proteasa NS3 del VHC para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hepatitis C, en donde el inhibidor esta compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un sustrato de la proteasa NS3 del VHC.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

10. El uso de un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hepatitis C, en donde eí inhibidor esta compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una subsecuencia de longitud completa, mutada, de un polipéptido NS4A del VHC.

11. Una composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con el virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC, estando el inhibidor compuesto de un primer péptido enlazado a un segundo péptido, siendo el primer péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un sustrato de la proteasa NS3 de hepatitis C y siendo el segundo péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada, de un polipéptido NS4A de la hepatitis C, y un portador farmacéutico.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:l, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

13. Une- composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica compuesta de un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC y un portador farmacéutico, siendo el inhibidor una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una secuencia de longitud completa, mutada de un sustrato de proteasa NS3 del VHC.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO:

15. 15. Una composición farmacéutica para el tratamiento a un individuo infectado con virus de hepatitis C, siendo la composición farmacéutica compuesta de un inhibidor de una proteasa NS3 del VHC y un portador farmacéutico, en donde el inhibidor esta compuesto de un péptido, siendo el péptido una subsecuencia, una subsecuencia mutada o una subsecuencia de longitud completa, mutada, de un polipéptido NS4A del VHC.