MXPA03004835A - Proteasa ns2/3 activa, purificada de virus de hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un metodo para producir una forma inactiva, replegada de NS2/3-proteasa recombinantemente producida que comprende los pasos de: a) purificar la proteasa de cuerpos de inclusion en la presencia de un agente caotropico; y b) replegar la proteasa purificada al poner en contacto con un agente reductor y oxido de laurildietilamina (LDAO) en la presencia de concentracion reducida de agente caotropico o aditivo polar. La invencion comprende ademas un metodo para activar esta NS2/3-proteasa inactiva, replegada al adicionar un detergente de activacion. Este metodo produce grandes cantidades de NS2/3-proteasa y activa para permitir que las moleculas pequenas y los ligandos se detecten como inhibidores potenciales de la NS2/3-proteasa, que pueden ser util como agentes terapeuticos contra HCV.

Description

PROTEASA NS2/3 ACTIVA, PURIFICADA, DE VIRUS DE HEPATITIS C Campo de la Invención La invención se refiere en general a métodos de purificación y activación para la proteasa NS2/3 del virus de hepatitis C (HCV) particularmente un método para producir una proteasa NS2/3 inactiva, replegada o truncamientos de la misma que se pueden activar posteriormente para la auto-escisión. De manera más particular, el método proporciona proteasa NS2/3 activa, purificada, truncada de HCV y ensayos para identificar inhibidores de la misma.

Antecedentes de la Invención El virus de hepatitis C (HCV) es una importante causa de enfermedad hepática crónica que conduce a cirrosis y enfermedad hepática de etapa, terminal en humanos. Más de 150 millones de personas a nivel mundial están infectadas persistentemente con HCV y el número de muertes atribuibles a la infección crónica probablemente va aumentar dramáticamente más en los próximos 10-20 años. Las terapias actualmente disponibles son de eficiencia limitada y son insatisfactor! as . Estas terapias han comprendido el uso de interferón -al f , ya sea sólo o en combinación con otros agentes ancivirales tal como ríbavirina. Dada esa baja proporción de respuesta, además de que se observa una alta recaída de los pacientes y efectos laterales, se requieren nuevas terapias que puedan ofrecer beneficios de tratamiento a largo plazo . Las secuencias parciales y completas, clonadas y caracterizadas del genoma del HCV se han analizado para proporcionar objetivos apropiados para la terapia antiviral potencial.- El HCV es un virus de ARN, de hebra positiva envuelta, en la familia Flaviviridae . El genoma de ARN, del HCV, de hebra individual es de aproximadamente 9600 nucleótidos de longitud y tiene un cuadro de lectura abierto (ORF) individual que codifica para una poliproteína grande, individual de aproximadamente 3010 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína se escinde en múltiples sitios por proteasa celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS) . En el caso del HCV, la generación de proteínas maduras no estructurales (NS2, NS3, NS4A, ??4?, NS5A y NS5B) se efectúa por dos proteasas virales. En la primera, puesto que aún esta pobremente caracterizada escinde en la unión NS2/3 y de ahí se refiere como proteasa NS2/3. La segunda es una serina-proteasa contenida dentro de la región N-terminal de NS3 , de ahí se refiere como proteasa NS3 , y medía todas las escisiones subsiguientes en la dirección 3' de NS3 , tanto en cis, en el sitio de escisión NS3/4A, y en trans , para los restantes sitios NS4A/4B, NS4B/5A, NS5A/5B. La proteína MS4A parece servir para múltiples funciones, actuando como un co-factor para la proteasa NS3 y ayudando posiblemente en la localización en membrana de NS3 y otros componentes de replicasa viral. La formación compleja de la proteína NS3 con N34A parece ser necesaria a los casos de procesamiento, mejorando la exigencia proteolítica en todos estos sitios. La proteína NS3 también exhibe actividades de nucleósido-trifosfatasa y ARN-helicasa . La NS5B es una ARN-pol imerasa dependiente del ARN que está comprendida en la replicacion del HCV. La mayoría de las enzimas codificadas por HCV se han evaluado como objetivos para el desarrollo de nuevas terapias anti -virales , específicamente la proteasa ??3, helícasa y actividades de ATPasa, así como la actividad de ARN-pol imerasa dependiente de ARN, NS5B (Dymock, B.W. et al. (2000) Antiviral Chemistry & Chemotherapy. ll(2) :79-96 y alker, M.A. (1999) Drug Discovery Today 4(11) : 518-529) . La única enzima viral que aún no se ha caracterizado de manera extensiva es la proteasa NS2/3 probablemente debido que actúa de manera co -transduccional .

La proteasa NS2/3 es responsable ae la auto-escisión en la unión NS2 y S3 entre los aminoácidos Leul026 y Alal027 (Hirowatarí, Y., et al (1993) Arch. Virol. 133:349-356 y Reed, K.E., et al. (1995) J. Viral. 69 (7) 4127-4136) . Esta escisión parece ser esencial para la replicación productiva in vivo como se muestra por la ausencia de la infección de HCV en un chimpancé después de la inoculación con un clon desprovisto de actividad de proteasa NS2/3 ( Kolykhalov , A. A., et al (2000) J. Virol. 74 (4) 2046-2051) . También parece que la generación de una NS2 funcional y una secuencia N-terminal auténtica de la proteasa NS3 , se enlaza algo a la fosforilación de NS5A (L.iu, Q . , et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Co ir n. 254, 572-577 y Neddermann P., et al. (1999) J. Vircl. 73 (12) : 9984-9991) . la región mínima del cuadro de lectura abierta del HCV requerida para la actividad de auto- esc i s ion se ha informado que está localizada en alguna parte entre los aminoácidos 898 y 907 para el límite N-terminal y el aminoácido 1206 para el límite C-terminal (Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 ( 8 ) : 4665 -4675. ; Grakoui, A., et ai. (1993) Proc- Nati. Acad. Sci. USA 90:10583-10587; Santolini. E . , et al (1995) J. Virol. 69 (12) : 7461-7471; y Liu, Q . , et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 572 -577; Pallaoro et al., (2001) J. Virol.. 75(20) ; 9939-46) . De manera interesante, la actividad d proteasa ??2/3 es independiente de la actividad de proteasa NS3 (Grakoui, A., et al. (1993) Proc . Nati. Acad. Sel. USA 90:10583-10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol 67(8) : 4565-4675) pero el dominio de la proteasa NS3 no se puede sustituir por otra proteína no estructural (Santolini, E., et al (1995) J. Virol. 69 (12) : 7461-7471) . Los estudios de mutagénesis han mostrado que les residuos His9S2 y Cys993 son esenciales para la actividad de cis-escisión (Grakoui, A., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:10583 -10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 (8) :4665-4675) . Gorbalenya, A.E, et al. (1956) Perspect. Drug Discovery Design. 6:64-86)) han sugerido que la proteasa NS2/3 puede ser una cisteína -proteas . Sin embargo, la observación que la actividad se estimula por iones metálicos y se inhibe por EDTA condujo a la sugerencia que la proteasa NS2/3 es una metaloproteasa (Grakoui, A., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:10583 -10587 ; Hijikata, . et al (1993) J. Virol. 67 (3) :4665-4675) ) . Los estudios con inhibidores clásicos de proteasas en un ensayo de trascripción y traducción m vi tro (Pieroni, L. et al (1997) J. Virol. 71 (9) : 6373-6380) aún no han permitido una clasificación definitiva. Se ha informado el procesamiento en la unión NS2/3 (Darke, P.L. et al (1999) J". Biol . Che . 274 (49) 34511-34514 y WO 01/16379; Grakoui , A., et al (1993) . Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:10583-10587; Hijikata, M . , et al. (1993) J. Virol. 67 ( 8 ) : 4665 - 675 ; Píercni, L., et al (1997) J. Virol. 71 (9) : 6373-6380 y Santolina., E. et al (1995) J. Virol. 69 (12) : 7461-7471) después de la expresión de la región NS2/3 en sistemas de traducción libres de célula, en E. coli, en células de insecto infectadas con recombinantes de baculovirus y/o en células de mamífero ( transíección momentánea o sistema híbrido de virus T7 de vaccinia. Sin embargo, no se ha informado el procesamiento en una enzima recombinante aislada hasta muy recientemente (Pallaoro et a., (2001) J. Virol. 75(20) ; 9939-46; Thibeault et al., u. Biol . Chem. 276 (49) : 46678-46684) . Grakoui et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci .

USA, 90:10583-10587 y Komoda et al. (1994) Gene, 145:221-226 han descrito ambos la expresión del polipéptido de HCV, impidiendo la proteasa NS2/3, ?? E. coli. Después de la expresión, se valoró el procesamiento de SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia de lisados celulares. Kodoma usando poliproteínas de HCV fusionadas a proteína de unión a maltosa (MBP) en su N-termino y díhidrofolato-reductasa (DHFR) en su C-termino, también informado en la purificación parcial de productos fusionados a DHFR de lisados celulares por cromatografí definida para el propósito únicamente de secuenciación N-terminal . De esta manera, la caracterización bioquímica de la proteasa ??2/3 así como estudios mecanísticos y estructurales se han obstaculizado debido a la no disponibilidad de una forma recombinante , pura de la enzima. Antes de que se pueda identificar cualquier inhibidor potencial de la proteasa NS2/3 en un formato de detección de alto rendimiento, debe haber una fuente confiable de proteasa NS2/3 activa, purificada. La WO 01/68818 publicada el 20 de Septiembre de 2001 {así como Pallaoro et al., .(2001) J. Virol . 75(20); 9939-46} ha descrito un proceso para la purificación de la proteasa NS2/3 activa, recombinante. Sin embargo, su método de replegado necesita ser llevado a cabo a 4°C para evitar la auto-catálisis. El método de la presente invención, también descrito en Thibeault et al., Biol . Chem. 276(49); 46678-46684, describe un método de purificación que prosigue en dos pasos, se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y conduce en el primer caso a una proteasa NS2/3 inactiva, soluble (estable a temperatura ambiente) que se puede llevar a escala y almacenar de manera segura sin auto -escisión . Por lo tanto, es una ventaja de esta invención proporcionar un método para la purificación de proteasa NS2/3 inactiva, replegada. Es una ventaja adicional de esta invención que la proteasa inactiva, soluble se pueda activar adicionalmente para producir proteasa NS2/3 activa, soluble para esfuerzos de detección a gran escala. También es una ventaja adicional de esta invención proporcionar una proteasa NS2/3 activa, recombinante , purificada y truncamientos de la misma en una escala tal que se puedan detectar moléculas pequeñas y ligandos como inhibidores potenciales. La presente descripción se refiere a varios documentos, el contenido de los cuales se incorpora en la presente corno referencia.

Breve Descripción de 1a Invención La presente invención reduce las dificultades y desventaja de la técnica anterior al proporcionar nuevo método para purificar y activar proteasa NS2/3 de HCV. De manera- ventajosa, este método tanto solubiliza la proteasa como la repliega bajo condiciones que no promoverán la auto-escisión de la proteasa. Además, el método tiene una ventaja adicional ya que se produce una forma truncada N-terminal de proteasa NS2/3 a altos niveles en cuerpos de inclusión usando métodos recombinantes después de su expresión en R. coli. Esta producción a alto nivel permite que se aislen y purifiquen grandes cantidades de la proteasa. Este es el primer informe de una proteasa ??2/3 inactiva, aislada que es estable a temperatura ambiente sin proceder de una auto-catálisis. También es el primer informe de una proteasa NS2/3 activa, recombinante , purificada obtenida del método de la invención. La disponibilidad de la proteasa NS2/3 recombinante, purificada permitirá una caracterización bioquímica detallada de la enzima y el desarrollo de ensayos in vi tro para detectar nuevos inhibidores. De acuerdo a una primera modalidad, la invención proporciona un método para producir una proteasa NS2/3 inactiva, replegada de HCV, que comprende los pasos de : a) aislar la proteasa en la presencia de un agente caotrópico, b) replegar la proteasa aislada al ponerla en contacto con un agente reductor y óxido de laurildietilamina (LDAO) en la presencia de concentración reducida de agente caotrópico o aditivo polar. De acuerdo con una segunda modalidad de esta invención, se proporciona un método para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende: c) adicionar un agente de activación a un medio que contiene proteasa NS2/3 inactiva, soluble obtenida en el paso b) , formando de este modo un amortiguador de escisión/activación para inducir la auto-escisión de la proteasa NS2 /3. En una tercera modalidad, la invención proporciona un método para valorar la actividad de la proteasa NS2/3, que comprende: d) incubar la proteasa ??2/3 en el amortiguador de escisión/activación del paso c) durante un tiempo suficiente de modo que se auto-escinda la proteasa NS2/3; e) medir la presencia o ausencia de los productos de escisión, o fragmentos de los mismos, como una indicación de la auto-escisión. De acuerdo con una cuarta modalidad de la invención, se proporciona un ensayo para detectar un fármaco o ligando candidato que inhiba la actividad de proteasa de un proteasa NS2/3, que comprende: d) incubar una muestra de la proteasa NS2/3 en el amortiguador de escisión/activación del paso c) durante el tiempo suficiente en la presencia de, o la ausencia del fármaco o ligando candidato; e) medir la cantidad de productos de escisión o fragmentos de los mismos; y f) comparar la cantidad de los productos de escisión o los fragmentos de los mismos, en la presencia de, o ausencia del fármaco o ligando candidato. De acuerdo con una quinta modalidad de la invención, se proporciona una proteasa NS2/3 inactiva, replegada, un truncamiento o una variante funcionalmente equivalente de la misma, que tiene la secuencia mínima de aminoácidos desde los residuos 90S a 1206 de la proteasa NS2/3 de longitud completa como se numera de acuerdo a la numeración usada en la Figura IB. De acuerdo con una sexta modalidad de la invención, se proporciona una composición que comprende una proteasa en NS2/3 aislada seleccionada de la proteasa NS2/3 de longitud completa, un truncamiento de la misma o una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15, en donde la proteasa está en ¦ una solución que comprende una-- concentración suficiente de LDAO para impedir la auto-escisión de la proteasa.

Breve Descripción de los Dibujos Habiendo descrito de manera general la invención, ahora se hará referencia a los dibujos anexóos, que muestran a modo de ilustración una modalidad preferida de la misma, y en los cuales: La Figura 1A muestra una secuencia de nucleótidos de la NS2/3 de longitud completa (810-1206)st (SEQ ID NO. 1) del genotipo Ib de HCV.

La Figura IB muestra una secuencia de aminoácidos de la NS2/3 de longitud completa (810 - 1206 ) st. (SEQ ID NC . 2) codificada por la secuencia de nucleótidos de la Figura 1A. La Figura 2 muestra un estudio de truncamiento N-terminal en el cual se clonaron los mutantes de supresión de longitud completa y N-terminales de la proteasa NS2/3 de HCV, que abarca los aminoácidos desde 815-915 a 1206 en el vector de expresión pETlld. Las construcciones de la proteasa NS2/3 se tradujeron ín vi tro como un lisado de reticulocitos de conejo. Los productos marcados con [35S] traducidos, se separaron por SDS-PAGE (15 %) y se visualizaron con un Phosphorimager (A) .La expresión en E. coli de las construcciones de proteasa NS2/3 sin inducción (sendas-) o después de una inducción de 2h-a 37°C con IPTG 1 mM (sendas +) se evaluaron por SDS-PAGE (15 %) (B) y análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal anti-NS3 (C) . Se numeraron las sendas de acuerdo al primer aminoácido de la proteasa NS2/3 expresada en cada trascrito. Las posiciones de las normas de masa molecular se indican así como la proteasa NS2/3. La Figura 3 muestra un diagrama que representa una construcción de proteasa NS2/3 de HCV que abarca los residuos de aminoácido 904-1206 junto con los residuos de lisina-N y C- erminales , una marca de hexahist idina N-terminal y una marca de estreptavidina C- erminal ("st") . La Figura 4 muestra un cromatograma obtenido de la 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st -4K de replegado (SEQ ID NO. 4) en una columna de filtración en gel Superóse 12. Después de la adición de TCEP 5 mM y ZnCl2 a los cuerpos de inclusión purificados, la enzima se replegó y se eluyó en Tris 50 mM, pH 8.0, argimna 0.5 M-HCl , LDAO al 1 %, TCEP 5 mM. La línea continua ( ) representa absorbancia a 280 nm y la línea punteada ( ? ) indica actividad del dominio de proteasa NS2/3 monitoreada en las fracciones seleccionadas usando el sustrato fluorogénico , antranilil-DDIVPAbu [C (O) -o] AMY (3-N02) TW-OH. La Figura 5 muestra la producción y purificación de 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st - 4K de cuerpos de inclusión, monitoreada por SDS-PAGE al (15 %), teñida con azul de Coomassie (A) análisis de inmunotransferencia usando antisueros de conejo anti-NS3, (B) y análisis de inmunotransferencia usando un antisuero de conejo anti-His6 (C) . Senda 1: extracto crudo de células de E. col i; sendas 2-5: lavados de cuerpos de inclusión (IB); sendas 6-10: purificación de cuerpos de inclusión en columna de quelante de Ni2+; senda 11: cuerpos de inclusión puri icados; senda 12: carga de columna de filtración en gel Superóse 12; senda 13: enzima replegada (ver Ejemplos para detalles) . La enzima no procesada y los productos de escisión 4K-6H-NS2 (904-1206) y NS3 ( 1027 - 1206 ) St - 4K se indican . La Figura 6 muestra el efecto de glicerol y CHAPS en la actividad de autoprocesamiento de la 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st - 4K monitoreada por inmunotransferencia usando antisueros de conejo anti-NS3. La reacción de auto -escisión se inicio por dilución de la enzima replegada en Tris 50 mM pH 8.0, TCEP 1 mM que contiene varias cantidades de glicerol y CHAPS seguido por una incubación 18h a 23°C. Senda 1: 30 % de glicerol, no CHAPS; sendas 2-5; no glicerol y 0.1, 0.25, 0.5 o 1.0 % de CHAPS, respectivamente; sendas 6-9: 30 % de glicerol y 0.1, 0.25, 0.5 y 1.0 % de CHAPS, respectivamente. La enzima no procesada y el producto ??3 ( 1027 - 1206 ) s -4 se indican. La Figura 7 muestra un transcurso en el tiempo de la cis-escisión de 4K-6H-NS2/3 (904-1206) st-4K monitoreada por inmunotransferencia usando antisueros de conejo anti-NS2/3 (A) y antisuero de conejo anti-His6 (B) . La reacción de auto-escisión se inicio al diluir la enzima replegada en Hepes 50 mM, pH 7.0, 50 % de glicerol (p/v) , 1 % de ?-ß-D-dodecil-maltósido, TCEP 1 mM se incubaron durante 0, 1, 2, 4, 6 y 24 horas a 23°C. La enzima no procesada y los productos 4 -6?-??2 (904-1206) y NS3 (1027-1206) st-4k se indican. La Figura 8 muestra una comparación de la actividad de proteasa NS2-NS3 del mutante purificado His952Ala ( UH952A" ) (SEQ ID NO 16) de 4K-6H-NS2/3 (904 -1206)st-4K y el WT purificado por análisis de inmunotransíerencia usando antisueros anti-NS3 (A) o antisueros anti-Hiss (B) . La reacción de auto-escisión se realizó en Hepes 50 mM, pH 7.0, 50 % de glicerol (p/v) , 1 % de ?-ß-D-dodecil-maltósido, TCEP 1 mM durante 0, 2, y 24 horas a 23°C. También se realizó una incubación de 24 horas en la ausencia de detergente (senda 24*) . La enzima no procesada y los productos de auto-escisión 4K-6H-NS2 (904-1206) y NS3 ( 1027 - 1206 ) s - 4k se indican. La Figura 9A muestra una secuencia de nucleótidos de 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) s -4k (SEQ ID NO. 3) La Figura 9B muestra una secuencia de aminoácidos de 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1 06 ) st- 4k (SEQ ID NO. 4) codificada por la secuencia de nucleótidos de la Figura 9A. La Figura 10 es un diagrama que ilustra el formato de un ensayo de Fluorescencia Resuelto en Tiempo, Heterogéneo (TRF) . La Figura 11 es un diagrama que ilustra el formato de un ensayo de Fluorescencia Resuelto en Tiempo (TRF) Homogéneo.

La Figura 12 es un diagrama que ilustra el formato de un Ensayo de Polarización de Fluorescencia. La Figura 13 es un diagrama que ilustra el formato de un Ensayo Radiométrico . La Figura 14 es una representación esquemática de un formato alternativo del ensayo de TRF usando la proteasa NS2/3 purificada de la invención.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como aquellos comúnmente entendidos por un experto en la técnica al cual corresponde la invención. En general, los procedimientos para el cultivo de células, infección, métodos de biología molecular y similares son métodos comunes usados en la técnica. Estas técnicas se pueden encontrar en manuales de referencia tal como por ejemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories) y Ausubel et al. (1994, Current Protocols en Molecular Biology, Wiley, New York) . La secuencia de nucleótidos se presentan en la presente por hebra individual, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, usando los símbolos de nucleótidos de una letra como se usa comúnmente en la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemistry , 1972 , 11 : 1726-1732) . Como se usa en la presente, los términos "proteasa NS2/3" "proteasa" y "enzima" se usan de manera indistinta a todos lo largo de esta especificación y se refieren a un proteasa NS2/3, codificada de HCV. Como se usa en la presente, el término "proteasa NS2/3 activa" se propone para describir la proteasa NS2/3 que retiene un nivel detectable de actividad de escisión entre los residuos 1026-1027. La actividad de proteasa se mide al monitorear los niveles de la proteasa NS2/3 no escindida, restante, los productos de escisión tal como ya sea la proteína NS2 o la proteasa NS3 , o un fragmento de los mismos, por ejemplo, en ensayos enzimáticos, ELISA o por análisis de transferencia Western. Como se usa en la presente, el término "aislado" cuando se refiere a la proteasa MS2/3 se propone que signifique que la proteasa NS2/3 que sea enriquecida con respecto a los componentes celulares. De manera particular, este término significa que la proteasa NS2/3 está enriquecida al 50 % más en comparación a los componentes celulares contaminantes .

Como se usa en la presente, el término "purificación" o "purificado", cuando se refiere a la proteasa NS2/3, se propone que signifique que la proteasa ??2/3 está sustancialmente libre de componentes celulares contaminantes. De manera preferente, la proteasa NS2/3 se purifica a una pureza de aproximadamente 90%. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 se purifica a aproximadamente 95 %. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 se purifica a una pureza de aproximadamente 98 %. Como usa en la presente, el termino "proteasa NS2/3 inactiva" se propone para describir proteasa NS2/3 que tiene una actividad de escisión, significativamente reducida, o esencialmente eliminada, entre los residuos Leul026-Alal027< como se determina por SDS-PAGE. Como se usa la presente, el termino "molécula de ácido nucleico" se propone que incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómmo) y moléculas e ARN (por ejemplo ARN) . La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra individual o de doble hebra, pero de manera preferente es ADN de doble hebra. Como se usa la presente, el término "vector" se refiere una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a una asa de ADN de doble hebra, circular a la cual se pueden ligar los fragmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos adicionales de ADN se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una celda hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos) . Se integran otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales y mamífero) en el genoma de una célula hospedadora en la introducción en la célula hospedadora, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos otros vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan de manera operativa. Estos vectores se refieren en la presente, "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos. En la presente especificación "plásmido" "vector" se puede usar de manera indistinta, puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de un vector. Sin embargo, la invención se propone que incluya estas otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales, que sirven para funciones equivalentes. Como se usa en la presente, el término "célula hospedadora" se propone para referirse a una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico de la invención, tal como un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan de manera indistinta en la presente . Se debe entender que estos términos no sólo se refieren a la presente célula particular sino a la progenie o progenie potencial de esta célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones subsecuentes debido ya sea a mutación o influencias ambientales, esta progenie puede ser en realidad, no idéntica a la célula de origen, pero aún se incluye dentro del alcance de los términos como se usa en la presente. Como se usa en la presente, el término "recombinante" o "recombinantemente producido" se propone que indique que una célula replica o expresa una molécula de ácido nucleico, o expresa un péptido o proteína codificada por una molécula de ácido nucleico cuyo origen es exógeno a la célula. En particular, la célula recombinante puede expresar genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Como se usa en la presente, una "variante uncionalmente equivalente" , cuando se usa para describir la proteasa NS2/3, se propone para referirse a una secuencia de proteína donde se reemplazan uno o más aminoácidos por otro(s) aminoácido ( s ) o aminoácido ( s) no natural (es) que no afecta de manera sustancial la actividad de la proteasa NS2/3. Estos reemplazos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos o sustituciones degenerativas de ácido nucleico. Cuando se refiere a una secuencia de proteína, el aminoácido de sustitución tiene propiedades químico- físicas que usualmente, pero no necesariamente, son similares a aquellas del aminoácido sustituido. Las propiedades químico- físicas similares incluyen, similitudes en carga, volumen, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares. Algunas de las más comúnmente conocidas sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen de manera enunciativa y sin limitación: Leu o Val o lie; Gly o Ala; Asp o Glu; Asp o Asn o His; Glu o Gln; Lys o Arg; Phe o Trp o Tyr; Val o Ala; Cys o Ser; Thr o Ser; y Met o Leu. Como se usa en la presente, una el término "inhibir" , cuando se usa con referencia a la proteasa NS2/3, se propone que signifique que se disminuye la capacidad de la proteasa para la auto-escisión. Los fármacos o ligandos que pueden inhibir la proteasa NS2/3 (referidos posteriormente como "inhibidores potenciales") pueden ser útiles para modular la infección por HCV en un población de células y por lo tanto pueden ser útiles como medicamentos para tratar una patología caracterizada por la presencia de HCV en las células. Como se usa en la presente, una el término "replegada" , cuando se usa con referencia a la proteasa NS2/3, se propone que se refiera al proceso por el cual la proteasa NS2/3 no plegada, o inapropiadamente plegada se somete a cambios conformacionales (parciales o completos) para lograr una conformación que es soluble y estable sin actividad detectable de auto-escisión a temperatura ambiente. La proteasa replegada requiere la adición de un detergente de activación para llegar a ser activada. Como se usa en la presente, el término "auto-escisión" o "auto-escindido" cuando se usa para describir la proteasa NS2/3, se propone que signifique que la escisión en la unión NS2/3 (Leul026 -Alal027) se presenta de manera intramolecular sin un sustrato exógeno . El término "marca de afinidad" o "marbete de afinidad" como se usa en la presente se refiere a una marca que se atrapa de manera específica por un ligando complementario. Los ejemplos de pares de marcador de afinidad/ligando de afinidad incluyen de manera enunciativa y sin limitación: Proteína de Unión a Maltosa ( BP) /maltosa ; Glutationa-S-Transfersa (GST) /glutationa ; histidina (HIS) /metal; marca de estreptavidina/estreptavidina o neutravidina . El metal usado como el ligando de afinidad se puede seleccionar del grupo que consiste de: cobalto, zinc, cobre, hierro y níquel (Wong et al. (1991) Separation and Purification Methods, 20(1), 49-106). La marca de afinidad se puede colocar en el extremo N- o C-terminal de la proteína, pero de manera preferente en el N- término de la proteína. De manera preferente, el metal seleccionado es níquel. El ligando de afinidad se puede establecer en columnas para facilitar la separación por cromatogra ía de afinidad.

Modalidades Preferidas I . Métodos de Replegado y Purificación De acuerdo a un primer aspecto de la primera modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producir una proteasa ??2/3 inactiva, replegada de HCV, que comprende los pasos de: a) aislar la proteasa de cuerpos de inclusión en la presencia de una alta concentración de un agente caotrópico; b) replegar la proteasa aislada al poner en contacto la proteasa con un agence reductor y LDAO en la presencia de una baja concentración de agente caotrópico o aditivo polar. En un aspecto preferido de la primera modalidad, la proteasa NS2/3 activa se produce usando técnicas de ADN recom inante . Los vectores de expresión de la invención (ver Ejemplos) comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de la proteína en una célula hospedadora, que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que se enlazan operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operablemente enlazado" se propone que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) de una manera que permita la expresión de la secuencia correspondiente de aminoácidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora) . El término "secuencia reguladora" se propone para incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de pol iadenilación) . Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo en Goeddel ; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) . Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula hospedadora y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido) . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseadas, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente (por ejemplo, proteasa NS2/3, truncamientos o formas frutantes de proteasa NS2/3. Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteasa NS2/3 en células procarióticas o eucarióticas . Por ejemplo, se puede expresar la proteasa NS2/3 en células bacterianas tal como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus) , células de levadura o células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se analizan adicionalmente en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) . La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo más frecuentemente en E . col i con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de ya sea proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión y varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, usualmente al término amino de la proteína recombinante . Estos vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en la purificación por afinidad (por ejemplo, marca de afinidad tal como una marca de hexahistidina) . Una estrategia es aumentar al máximo la expresión de la proteína recombinante en E. coli que va a expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad dañada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128) . Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean aquellos pre erencialmente utilizados en E. col i (Wada et al., (1992) Nuc . Acida Res. 20:2111-2118) . Esta alteración de las secuencias de ácido nucleico de la invención se pueden llevar a cabo por técnicas normales de síntesis de ADN. Se puede introducir ADN de vector en células procariót icas o eucarióticas vía técnicas convencionales de transformación o transfección . Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se proponen para referirse a una variedad de técnicas reconocidas comúnmente para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo ADN) en una célula hospedadora, incluyendo método de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, por transfección mediada por DEAE-dextrano , lipofección o electroporación . Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden encontrar en Sambrook et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio. Frecuentemente, durante la expresión de la proteína, se forman los llamados cuerpos de inclusión. La proteasa NS2/3 se puede aislar de la célula hospedadora, por ejemplo, al lisar la célula hospedadora y al recuperar la proteasa en NS2/3 reco binante de los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión son agregados de proteínas intactas o polipéptidos en conformaciones tipo no nativa (ver Current Protocols in Protein Science (1997) John Wiley & Sons Inc.) . Existen muchos ejemplos de como extraer la proteína de los cuerpos de inclusión y se analizan en Current Protocols in Protein Science. La célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariótica o eucariótica, en cultivo, se puede usar para producir proteasa NS2/3 de la presente invención. Por consiguiente, la invención incluye adicionalmente cultivar una célula hospedadora en un medio de cultivo. La célula hospedadora contiene un vector de expresión que tiene una región de codificación de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteasa NS2/3, dando por resultado la producción de proteasa NS2/3 recombinante , inactiva, no plegada o inapropiadamente plegada. Las células hospedadoras se lisan con un amortiguador de lisis para producir los lisados de la célula hospedadora. Los cuerpos de inclusión en los Usados de la célula hospedadora se recuperan de los mismos por centrifugación a baja velocidad. De manera preferente, el amortiguador de lisis contiene aproximadamente 0.1 % de Tritón X-100. Los cuerpos de inclusión entonces se extraen de manera selectiva usando un amortiguador de extracción que contiene de manera preferente cerca de 2 % de Tritón X-100 y urea 2M. De manera preferente, tanto el amortiguador de lisis como el amortiguador de extracción contienen un agente reductor seleccionado del grupo que consiste de DTT y TCEP. En otro aspecto de la primera modalidad, los cuerpos de inclusión, que contienen proteasa ??2/3 inactiva, entonces se aislan por centrifugación a baja velocidad después de la extracción selectiva de granulos obtenidos de centrifugación a baj velocidad de los Usados de la célula hospedadora, descritos anteriormente. Los cuerpos de inclusión, aislados, se tratan con un agente caotrópico a una concentración suficiente para producir proteasa NS2/3 inactiva, soluble. De manera preferente, el reactivo caotrópico se selecciona del grupo que consiste de guanidina, guanidina-HCl y urea. De manera más preferente, el, agente caotrópico es guanidina-HCl. De manera preferente, la concentración suficiente está entre 4M y 9M. De manera más preferente, la guanidina o guanidina-HCl está a una concentración entre 4 y 8 ; de manera más preferente a 6M . De manera preferente, urea está a una concentración entre 6 y 9M; de manera más preferente 8M. De manera alternativa, también se puede preparar proteasa NS2/3 recombinante como una proteína extracelular al enlazar operativamente una secuencia de señal heteróloga al término amino de la proteasa tal que se segregue de una célula eucariótica. En este caso, la proteasa NS2/3 recombinante se puede recuperar del medio de cultivo en el cual se cultivan las células. En otro aspecto de la primera modalidad, la proteasa NS2/3 se construye para contener una marca de afinidad que se puede usar tal que la proteasa NS2/3 inactiva, soluble se pueda aislar de los cuerpos de inclusión usando cromatografía de afinidad. Esta marca de afinidad y el ligando correspondiente son bien conocidos en la técnica. En un aspecto preferido de la primera modalidad, se usa LDAO a o por arriba de su concentración crítica de micelas. De manera más preferente, LDAO está a una concentración entre 0.003 % y 1 %. En un aspecto más preferido, se usa LDAO a una concentración entre 0.03 % y 1 %. Sin proponer que se limite por teoría, los inventores creen que LDAO presente en el amortiguador de replegado (filtración en gel) se requiere para replegar pero no es suficiente para la cis-escisión de la enzima. En una aspecto preferido del paso b) de la primer modalidad, el agente caotrópico o aditivo polar se selecciona del grupo que consiste de: guanidina, clorhidrato de guanidina, urea y arginina-clorhidrato . De manera máa preferente, se usa clorhidrato de guanidina o arginina-HCl . De manera más preferente, se usa arginina-HC1. En un aspecto preferido del paso b) de la primera modalidad, de manera preferente el agente caotrópico o adhesivo polar se usa a una concentración entre 0.25M y 2M. En un aspecto muy preferido, se usa a una concentración entre 0.5M y 1M, de manera más preferente, a una concentración final de 0.5M. En otro aspecto preferido, el agente reductor se selecciona del grupo que consiste de TCEP y DTT. De manera preferente, el agente reductor está presente a una concentración final entre 0 y 100 mM, de manera más preferente entre 1 mM y 10 mM. De manera más preferente, el agente reductor está presente a una concentración final de 5 mM. En un aspecto preferido de esta primera modalidad, el . método de replegado descrito anteriormente se lleva a cabo por diálisis o por filtración en gel para producir una proteasa NS2/3 purificada. En un aspecto importante, la proteasa NS2/3 inactiva, soluble se repliega usando filtración en gel. El amortiguador de elusión usado contiene LDAO, arginina-HCl y el agente reducto y la NS2/3 inactiva, soluble se mantiene en el amortiguador de elusión durante tiempo suficiente para replegar la proteasa NS2/3. La recolección de las fracciones principales permite la recuperación de una enzima altamente purificada.

II Método de activación De acuerdo con una segunda modalidad de esta invención, se prpporciona un método para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende: c) adicionar la proteasa ??2/3 inactiva, soluble obtenida en el paso b) , a un medio que contiene un agente de activación para inducir la auto-escisión de la proteasa NS2/3. En un aspecto preferido de la segunda modalidad, el agente de activación se selecciona del grupo que consiste de: glicerol, o un detergente tal como CHAPS, Tritón X-100, NP-40 y n-doceci 1 - ß -D-mal tosido . Como una alternativa a esta segunda modalidad de la invención, se proporciona un método para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende: c) diluir la proteasa NS2/3 inactiva, replegada obtenida en el paso b) , en un medio que contiene un detergente de activación para inducir la auto-escisión de la proteasa NS2/3. De manera preferente, el LDAO que permanece en la proteasa NS2/3 después de la dilución está a una concentración final por abajo de 0.25 %. De manera más preferente, el LDAO se diluye a una concentración final igual a o por abajo de 0.1 %. De manera más preferente, el LDAO se diluye a una concentración final por abajo de 0.05 %. De manera preferente, el detergente de activación se puede seleccionar de: CHAPS, Tritón X-100, NP-40 y n-docecil -ß-D-maltósido . De mera más preferente, el detergente de activación es CHAPS, o n-docecil -ß-D-maltosido . De manera preferente, el detergente de activación está a una concentración final de 0.1 % a aproximadamente 3 %. De manera más preferente, el detergente de activación está a una concentración final de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 %. De manera más preferente, el detergente de activación está a una concentración final de 0.5 %. Además del detergente de activación, se puede adicionar también glicerol para ayudar en la activación de la proteasa NS2/3 inactiva, replegada. De manera preferente, el glicerol puede estar presente a una concentración final entre 0 % y 60 % . De manera más preferente, el glicerol puede estar presente a una concentración final entre 10 ¾ y 50 ¾, De manera más preferente, el glicerol está presente a una concentración final de 30 %. De manera importante, en un aspecto preferido, el agente reductor aún está presente en el amortiguador o el medio de activación/escisión usado para la activación, si bien a una concentración menor que sea necesaria para el paso de replegado. El agente reductor se puede seleccionar del grupo que consiste de TCEP y DTT. De manera más preferente, el agente reductor es TCEP. De manera preferente, el agente reductor está a una concentración final de entre lmM y lOOmM. De manera más preferente, el agente reductor está a una concentración final de entre lmM y lOmM. De manera preferente, el agente reductor está a una concentración final de lmM.

III, Método para medir la actividad de la proteasa NS2/3 De acuerdo con un aspecto preferido de la tercera modalidad de la invención, se proporciona un método para medir la actividad de auto-escisión de la proteasa NS2/3 purificada, que comprende: c) incubar la proteasa NS2/3 inactiva, replegada obtenida en el paso b) en un amortiguador que contiene un detergente de activación, durante el tiempo suficiente de modo que se auto-escinda la proteasa NS2/3 Y d) medir la presencia o ausencia de la proteasa NS2/3 no escindida, restante, loa productos de escisión, o fragmentos de los mismos, como una indicación de la auto-escisión. De manera preferente, la proteasa ??2/3 inactiva, replegada se repliega y purifica usando filtración en gel antes de llevar a cabo el ensayo mencionado anteriormente. De manera preferente, el detergente de activación es: CHAPS, n-dodecil -ß-D-maltósido , NP-40 y Tritón X-100. De manera más preferente, el detergente de activación es n-dodecil -ß-D-maltósido (DM) a.. una concentración de entre 0.1 % a 3 %. De manera más preferente, el detergente de activación es n-dodecil -ß-D-maltósido, a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 %. De manera aún más preferente, DM está a una concentración final de 0.5 %. También se puede adicionar un agente de activación adicional tal como glicerol para ayudar en la activación de la proteasa NS2/3 inactiva, replegada. De manera preferente, el glicerol puede estar presente a una concentración final entre 0 % y 60 %. De manera más preferente, el glicerol puede estar presente a una concentración final entre 10% y 50 %. De manera más preferente, el glicerol está a una concentración final de 30 % . De manera preferente, la proteasa NS2/3 se incuba en el amortiguador de escisión durante al menos 1 hora desde 15°C a 30°C. De manera más preferente, la proteasa de ??2/3 se incuba en el amortiguador de escisión durante al menos 1 hora de 15°C a 25°C. De manera más preferente, la proteasa de NS2/3 se incuba en el amortiguador de escisión durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En otro aspecto de la segunda modalidad, la reacción de escisión se detiene al desnaturalizar la proteasa NS2/3. De manera m s preferente, la proteasa NS2/3 se desnaturaliza por calor. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 se desnaturaliza con SDS , para detener la auto-escisión. Los productos de escisión son de manera preferente proteína NS2 o proteasa NS3. La cantidad de la proteína NS2 o proteasa NS3, o fragmentos de las mismas, se puede medir usando cualquiera de muchas técnicas conocidas por un experto en la técnica. Los ejemplos de estas técnicas son actividad enzimática, tinción por inmunotransferencia , quimioluminiscencia , fluorescencia, o tinción con azul de Coomassie. Como una alternativa, también se puede medir la cantidad de la proteasa NS2/3 no escindida, restante como un indicador de la escisión.

IV. Métodos para detectar inhibidores En una cuarta modalidad, la invención proporciona un ensayo para detectar inhibidores potenciales de la actividad de auto-escisión de la proteasa NS2/3 activa, que comprende: c) incubar una muestra de la proteasa NS2/3 inactiva, replegada obtenida en el paso b) en un amortiguador que contiene un detergente de activación, durante tiempo suficiente en la presencia de o en la ausencia de, el inhibidor potencial; d) medir la cantidad de los productos de escisión o fragmentos de los mismos, y e) comparar la cantidad de los productos de escisión o fragmentos de los mismos, en la presencia de, o ausencia de, el inhibidor potencial. La muestra de la proteasa NS2/3 activa se incuba de manera preferente durante aproximadamente 1 hora en el medio adecuado con el fármaco o ligando candidato . En un aspecto preferido, los productos de escisión son ya sea la proteína NS2 o la proteasa MS . De manera preferente, la presencia o ausencia de ya sea la proteína NS2 o la proteasa NS3, o fragmentos de las mismas, se analiza usando actividad enzimática, análisis por inmunotransferencia , que comprende usar un anticuerpo anti-proteasa ??3 o un anticuerpo anti-marca de histidina. Como una alternativa, la cantidad de la proteasa NS2/3 no escindida, restante también se puede medir como un indicador de la escisión.

V. Proteasa NS2/3, polipéptidos y truncamientos/moléculas de ácido nucleico De manera preferente, la proteasa NS2/3 es la proteasa NS2/3, 810-1206 de longitud completa o un truncamiento de la misma. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 está N- terminalmente truncada teniendo su primer aminoácido que corresponde al aminoácido 815 al aminoácido 906. De manera aún más preferente, la proteína truncada N-terminal que tiene su primer aminoácido que corresponde al aminoácido 866 a 906. De manera aún más preferente, la proteína truncada, N-terminal que tiene su primer aminoácido que corresponde al aminoácido 890 a 904. De manera más preferente, se proporciona una proteína truncada NS2/3 que tiene la secuencia mínima de aminoácidos desde los residuos ¿04 a 1206 de la proteasa NS2/3 de longitud completa. De manera aún más preferente, la proteína NS2/3 truncada consiste de los aminoácidos 904-1206 como se enumera de acuerdo a SEQ ID NO. 10.

En una quinta modalidad de la invención, ae proporciona un polipéptido NS2/3 activo que consiste de una proteasa NS2/3 truncada seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. De manera preferente, la proteasa ??2/3 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID NOs . 4, 10, 11, 12 y 15. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO. 4 o 10 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. De manera más preferente, la proteasa NS2/3 tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO. 4 o 10. De acuerdo a otro aspecto de la quinta modalidad de esta invención, se proporciona una proteasa NS2/3 inactiva, replegada seleccionada del grupo que consiste de: proteasa NS2/3 de longitud completa, una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID NO . 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. De manera más preferente, se proporciona una proteasa NS2/3 inactiva, replegada como se define de acuerdo a SEQ ID NO. 4 o 10. De acuerdo a un aspecto adicional de la quinta modalidad, se proporciona un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene 90 % de identidad con respecto a su longitud en comparación al polipéptido como se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. De manera más preferente, se proporciona un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene 90 % de identidad con respecto a su longitud en comparación al polipéptido como se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 4 o 10. En otro aspecto de la quinta modalidad, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15, respectivamente. Los fragmentos de ácido nucleico que codifican para variantes funcionalmente equivalentes de la proteasa NS2/3 se pueden preparar al aislar una porción de los residuos de SEQ ID NO. 1, que expresan la porción codificada 890-1206 de la proteasa NS2/3, por ejemplo, por expresión recombinante en una célula hospedadora, como se describe anteriormente, y valorando la capacidad de la porción para la auto-escisión después de la purificación y re-plegado. Se pueden aislar moléculas de ácido nucleico de la presente invención usando técnicas normales de biología molecular y la información de la secuencia proporcionada en la presente. Una molécula de ácido nucleico que abarca todos o una porción de los residuos que codifican para el aminoácido 890-1206 se puede aislar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores apropiados de ol igonucleótidos . Por ejemplo, se puede aislar ARNm de las células (por ejemplo, por el procedimiento de extracción con guanidinio- tíocianato de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y el ADNc se puede preparar usando transcriptasa invertida (por ejemplo, transcriptasa invertida de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, Md. ; o transcriptasa invertida de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St . Peterburg, Fia.) . Se pueden diseñar cebadores sintéticos de ol igonucleótidos para la amplificación por PCR en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 1. Se puede amplificar un ácido nucleico de la invención usando ADNc o de manera alternativa, ADN genómico, como una plantilla y los cebadores apropiados de ol igonucleótidos de acuerdo a las técnicas normales de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de este modo se puede.,, clonar en un vector apropiado y se caracteriza · por análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente , los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de la proteasa NS2/3 se pueden preparar por técnicas normales de síntesis, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de ADN. Además de las variantes que se presentan de forma natural de la secuencia de proteasa NS2/3 que pueden existir en una población viral, un experto en la técnica apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios por mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica para los aminoácidos 890 hasta 1206, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, que pueden alterar o no, la actividad funcional de la proteasa NS2/3. Por ejemplo, l-as sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de nucleótidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" se pueden hacer en la secuencia de SEQ ID NO. 1. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de longitud completa de la proteasa NS2/3, (por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO. 2) sin alterar la actividad funcional de la proteasa NS2/3, en tanto que se requiere un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad funcional. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteasa NS2/3 que contiene cambios en los residuos de aminoácidos que son esenciales para la actividad de la proteasa NS2/3. Estas mutantes de la proteasa NS2/3 difieren en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 10 y han perdido su actividad de proteasa. Los ejemplos de estas proteasa NS2/3 mutantes que se pueden usar en la presente invención son la proteasa NS2/3 [904-1206] H952A (SEQ ID NO. 16), en la cual His-952 se reemplaza por Ala, proteasa NS2/3 [904-1206] AL1026A1027 ( SEQ ID NO. 17), que corresponde a una supresión en los residuos del sitio de escisión entre las proteínas NS2 y NS3 y la proteasa NS2/3 [ 904 - 1206 ] C993A en la cual el Cys993 se reemplaza por Ala (SEQ ID NO. 18) .

Ej emplos La presente invención se ilustra en detalle adicional por los siguientes ejemplos no limitantes.

Materiales y Métodos Abreviaciones : AAllaa:: alanina °C: celsius CHAPS sulfonato de 3 - [ ( 3 - colamidopropil ) dimetil -amonio] -1-pronano CMC: concentración micelar crítica DHFR: dihidrofolato-reductasa DNasa : desoxiribonucleasa DTPA : N,N-bis[2-(bís [carboximeti i ] amino) etil] -glicina DTT: ditiotreitol EDTA: ácido etilendiaminatetraacético g : gramo g: fuerza centrífuga relativa h : hora HCV: virus de hepatitis C Hepes: ácido 4 - (2 -hidroxietil ) - 1 -pirerazina - etanosul fónico His : histidina His6 : marca de hexahistidina HMK cinasa de músculo cardiaco IPTG : isopropil- -D- iogalactopiranosido kDa: kilodalton LDAO : óxido de laurildietilamina Leu: leucina : molar BP: proteína de unión a maltosa min: minuto ¦ mL : mililitro m : milimolar Oct il - POE : n-octilpen aoxietileno PCR : reacción en cadena de la polimerasa SDS-PAGE: electroforesís en gel de dodecilsulfato de sodio-pol iacrilamida st : marca de estreptavidina como se describe en Schmidt & Skerra, Pro . Engineeríng (1993) 6; 109-122 TCEP : clorhidrato de tris (2 -carboxietil ) fosfina Tris: tri [hidroximet i 1 ] aminometano 9 = microgr mo µp?: mieras WT: tipo silvestre w/v : peso por volumen Materiales Los detergentes CHAPS y Tritón X-100 se obtuvieron de Sigma, el LDAO de Calbiochem, el n-dodecil-ß-D-maltósido de Anatrace Inc., NP-40 de Roche y octil-POE de Bachem. Los agentes reductores DTT y TCEP se obtuvieron de Pharmacia Biotech y Pierce respec ivamente. El clorhidrato de arginina, glicerol, Hepes, imidazol y cloruro de magnesio se obtuvieron todos de Sigma. El clorhidrato de guanidina y Tris se obtuvieron de Gibco B L, en tanto que IPTG y urea fue de Roche. Se obtuvieron cloruro de sodio y cloruro de zinc de Fisher y Aldrich, respectivamente, el EDTA se obtuvo de Ambion y DNasa de Pharmacia Biotech. Las enzimas de restricción se obtuvieron de Pharmacia Biotech. Se obtuvieron células XL-l Blue de E. coli a partir de Stratagene y las células BL21 (DE3 ) LysS de Novagen . FLAGMR se obtiene de Eastman Koday Company y corresponde a una secuencia peptídica que se reconoce por el anticuerpo anti-FLAG. ? ?^^ es un péptido de cinco residuos (RRASV) que es una secuencia de reconocimiento para la proteína cinasa específica HMK (Cinasa de Músculo Cardiaco) , que introduce por lo tanto un sitio de fosforilación (Blanar, M. y Rutter, W. (1992) Science 256:1014-1018) .

EJEMPLO 1 Construcción de longitud completa de NS2/3 La secuencia NS2/3 de longitud completa (810-1206) se amplificó por PCR a partir de la secuencia lb-40 de HCV (WO 99/07733 por Boehringer- Imgelheim (Canadá) , Ltd.), usando dos cebadores de oligonucleótidos , 5 ' CCATGGACCGGGAGATGGCT- 3 ' (SEO ID NO. 5) para el N-término y 5 GGATCCTTAACCACCGAACTGCGGGTGACGCCAAGCGCTACTAGTCCGCATGGTA GTTTCCAT- 3 ' (SEQ ID NO. 6) para el C-término. Este procedimiento introduce un sitio Ncol en el extremo 5' y una marca de estreptavidina "st" (Schmidt & Skerra, Pro . Engineering (1993) 6; 109-122) seguida por un sitio BamHl en el extremo 3' que da una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO. 1 (Figura 1) . El producto de PCR se insertó en el vector pCRMR 3 usando el equipo de clonación TA cloningR de Invitrogen. El inserto entonces se transfirió a un vector de expresión bacteriano pET-lld (Novagen) al cortar con EcoRI seguido por tratamiento Klenow para crear extremos romos seguido por una digestión parcial con Ncol. Esta construcción se designó pET-lld-NS2/3st .

El ADN se transformó en células XL-1 Blue de E- coli, se aisló y se secuenció. El ADN entonces se transfirió a BL2l(DE3) pLysS de E. coli para la producción de proteína .

EJEMPLO 2 Mutantes de supresión N-terminales NS2/3 Las mutantes de expresión N-terminales 815*-1206, 827-1206, 855-1206, 866-1206, 904-1206 y 915-1206 se derivaron de la plantilla pET-lld/NS2/3 que se designó con un sitio Ncol en el extremo 5' y dentro del dominio NS3 en el aminoácido 1083. Después de la digestión con plantilla con Ncol, el fragmento del extremo 3' y el vector se purificaron en gel . Loa mutantes se obtuvieron por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos sintéticos apropiados que contienen la secuencia NS2/3 de los nucleótidos que codifican para el residuo N-terminal deseado hasta el aminoácido 1083. Los cebadores también introdujeron un sitio Ncol en el extremo 5', tal que los insertos resultantes se pueden ligar al fragmento purificado en gel. El ADN entonces se transformó en células XL-Blue de E. coli, se aisló y se secuenció. Finalmente, el ADN se transfirió en BL21 (DE3 ) pLysS de E . coli para la producción de la proteína. Se verificó la expresión por SDS-PAGE (Figura 2A, 2B, 2C) .

* La numeración de este fragmento es errónea puesto que la primera metionina es parte de la secuencia original y por lo tanto se debe numerar "814" . Por lo tanto, toda la referencia al truncamiento que inicia con 815 se debe leer como "814" como se representa correctamente en SEQ ID NO. 11.

EJEMPLO 3 Mutante 4K-6H ( 904 - 1206 ) st -4K (SEQ ID NO. 4) de truncamiento N-terminal de NS2/3: En esta construcción, se adicionaron cuatro lisinas en los N- y C-términos así como una marca de hexahistidína en el N-término. Esta construcción se obtuvo usando PCR y la plantilla pET-lld/NS2/3st con dos cebadores que contienen la secuencia para las marcas así como la secuencia NS2/3 de los nucleótidos que codifican para los residuos 904-1206 de aminoácido. Los cebadores también introdujeron un sitio Ndel y BamHI en el extremo 5' y 3', respectivamente. El inserto se clonó en pET-lld y se designó pET-lld 4?-6?-??2/3 ( 904 - 1206 ) - s -4 (SEQ ID NO. 3). El ADN se transformó en células XL-1 Blue de E. coli, se aisló y se secuenció. El ADN entonces se transfirió en BL21 (DE3 ) pLysS de E. coli para la producción de la proteína. Para la construcción truncada 904-1206, se usaron 4 cebadores y 2 reacciones sucesivas de PCR. Los cebadores usados en la primera reacción de PCR fueron GCTCGAGCATCACCATCACCATCACACTAGTGCAGGCATAACCAAA (SEQ ID NO.7) para el N-término y AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO.8 para el C-término. Para la segunda reacción de PCR, los cebadores usados fueron ACCTGCCATATGAAAAAGAAAAAGCTCGAGCATCACCATCACCAT (SEQ ID NO.9) para el N-término y AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO.7 para el C-término.

EJEMPLO 4 Expresión y producción de la Enzima El genotipo Ib [904-1206] de la proteasa NS2/3 de HC (Figura 3) que tiene una marca de hexahistidina N-terminal se clonó en el vector de expresión pET-lld. También se adicionaron cuatro residuos de lisina a ambos extremos N- y C-terminales para mejorar la solubilidad de la proteína, junto con una marca de estreptavidina en el extremo C-terminal que da la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO.3. La proteasa se expresó en BL21 (DE3 ) pLysS de E. coli después de la inducción con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37°C. Una fermentación típica de 4L produjo aproximadamente 20 g de pasta húmeda de células. La pasta celular se puede almacenar a -80°C.

EJEMPLO 5 Extracción de Cuerpos de Inclusión Después del descongelamiento a 23 °C, las células se homogeneizaron en amortiguador de lisis (5 mL/g) que consiste de Tris 100 mM, pH 8.0, Tritón X-100 al 0.1 %, EDTA 5 mM, MgCl2 20 mM, DTT 5 mM, seguido por un tratamiento con DNasa (20 g/ml) durante 15 minutos a 4°C y una centrifugación a 22,000xg durante 1 hora a 4°C. El sedimento celular entonces se lavó dos veces por homogenización (5 mL/g) en Tris 100 mM, pH 8.0, Tritón X-100 al 2 %, EDTA 5 mM, urea 2 M, DTT 5 mM, y se centrifugó a 22,000xg durante 30 minutos a 4°C. Finalmente, se lavaron las células en Tris 100 mM, pH 8.0, EDTA 5 mM, DTT 5 mM . Los cuerpos de inclusión se recuperaron en el sedimento por centrifugación a 22,000xg durante 30 minutos a 4°C.

EJEMPLO 6 a) Extracción de Cuerpos de Inclusión Para solubilizar los cuerpos de inclusión, el sedimento celular se dispersó en el amortiguador de extracción (4 mL/g) que consiste de Tris 100 mM, pH 8.0, guanidina 6 M-HC1, NaCl 0.5 M y se mantuvo en ese amortiguador durante 1 hora a 23 °C. La suspensión entonces se centrifugó a 125,000xgr durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro de 0.22 El extracto clarificado de cuerpos de inclusión se puede almacenar a -80°C hasta que se requiera b) aislamiento de 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st-4K (SEQ ID M0.4) , de los cuerpos de inclusión. Para aislar la 4K-6H-NS2/3 (904 -1206) st-4K (SEQ ID NO .4 ) , el extracto de los cuerpos de inclusión se diluyó dos veces (a aproximadamente 1 mg/mL) en Tris 100 mM, pH 8.0, guanidina 6 M-HCl, NaCl 0.5 M y se aplicó a una columna quelante Ni2+ Hi-Trap de Pharmacia. La proteína aislada se eluyó típicamente con imidazol 250 mM de un gradiente lineal de imidazol de 50 a 500 mM. Se mezclaron las fracciones que corresponden al pico principal .

EJEMPLO 7 Replegado y purificación en columna de filtración en gel A la preparación de los cuerpos de inclusión aislados se adicionó TCEP 5 mM y ZnCl2 5 mM. Después de una incubación de 15 minutos a 23°C, La muestra se cargó en una columna de filtración en gel Superóse 12 de Pharmacia. La 4K-6H-NS2/3 (904-1206) st-4K entonces se eluyó en Tris 50 mM, pH 8.0, arginina 0.5 M-HC1, LDAO al 1 %, TCEP 5 mM que producen proteasa NS2/3 replegada. Sólo se recolectan y mezclan aquellas fracciones que corresponden al pico principal (Figura 4) . La auto-escisión no fue detectable bajo estas condiciones. La Enzima inactiva, replegada, purificada se almacenó a -80°C en el amortiguador de elusión. Típicamente, se obtuvieron cerca de 7 mg de la proteasa NS2/3 replegada por litros de cultivo de E. coli. Para superar el problema de la auto-escisión de la proteasa NS2/3, las condiciones de re-plegado se determinaron inicialmente usando ya sea el mutante His952Ala (SEQ ID NO.16) o el mutante ALeul026-Alal027 (SEQ ID NO.17) de la 4 -6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st - 4K. Ambos mutantes están desprovistos de actividad auto-catalítica. El re-plegado se valoró indirectamente en base a la actividad de la proteasa NS3 (Figura 4) al incubar diluciones en serie de la enzima replegada con 5 µ? del sustrato fluorogénico internamente enfriado antranílil-DDIVPAbu [C (0) -0] AMY (3 -N02) TW-OH (SEQ ID NO.19) en Tris 50 mM-HCl, pH 7.5, 30 % de glicerol, 1 mg/mL de BSA y TCEP 1 mM durante 30 ó 60 minutos a 23 °C (específicamente descrito en O 99/07733 incorporado en la presente como referencia) . La actividad proteolítica se monitoreó por el cambio de fluorescencia asociado con la escisión del sustrato y la aparición del producto fluorescente antranilil-DDIVPAbu-COOH (SEQ ID NO.20) en un lector de placas de 96 cavidades BMG Galaxy (filtro de excitación: 355 nm,- filtro de emisión: 485 nm) . Entonces se produjo 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st - 4K, se purificó y replegó de acuerdo al mismo protocolo, dando por resultado una enzima >95% pura. El replegado apropiado se confirmó por la actividad de proteasa NS3 (Figura 4, línea punteada) .

EJEMPLO 8 Validación de la Actividad después del Replegado Ensayo de Cis-Escisión La reacción de auto-escisión de la 4K-6H-NS2/3 (904-1206) st-4K se inició al adicionar a la enzima el amortiguador de escisión que consiste de Hepes 50 mM, pH 7.0, 50 % (p/v) de glicerol, 0.1 % de CHAPS (Figura 6) o 1 % de n-dodecil-3-D-maltósido (Figuras 7, 8) (NP-40 y Tritón X-100 también se pueden usar) y TCEP 1 mM. Esta mezcla de ensayo entonces se incubó durante 3 horas a 23 °C. La reacción se detuvo por desnaturalización con calor de la enzima en la presencia de SDS . La escisión en la unión NS2/3 se monitoreó por SDS-PAGE (15 %) y análisis de inmunotransferencia usando ya sea un anticuerpo policlonal de proteasa NS3 producido en casa o un anticuerpo monoclonal con marca de hexahist idína comercialmente disponible (Santa Cruz Biotechnology , Inc . ) (Figura 5 ) .

EJEMPLO 9 Ensayo de Fluorescencia Resuelto en Tiempo, Heterogéneo La proteasa NS2/3 se inmovilizó primero en una placa de quelación de níquel (Figura 10) . Entonces se adicionó el anticuerpo anti-NS2 o anti-FLAGn,arca, marcado con europio. Un experto en la técnica reconocerá que están disponibles muchas marcas para marcar proteínas. En este ejemplo, se utilizan FLAGMR y HMK. Después de la unión del anticuerpo, se realiza un paso de lavado para remover el exceso de anticuerpo. Entonces, la reacción de auto-escisión se inicia por la adición del amortiguador de escisión. Después del tiempo apropiado de incubación, la mezcla de ensayo se transfiere a una segunda placa y la escisión se monitorea mediante la medición de la fluorescencia resuelta en tiempo asociada con el producto marcado con europio. La escisión de la proteasa NS2/3 también se puede monitorear mediante la disminución de la señal de luorescencia de europio resuelta en tiempo que resulta de la enzima no procesa unidad a la placa de quelación de níquel . Como una alternativa, se incuba proteasa NS2/3 que contiene Strep-tag en el amor iguador de activación y la reacción de auto-escisión se deja proseguir (Figura 14) . El fragmento de Strep-tag NS3 resultante y la proteasa NS2/3 de Strep-tag no escindida entonces se inmoviliza en una placa revestida con estreptavidina . Entonces se adiciona un anticuerpo anti-NS2 marcado con europio y se mide la fluorescencia resulta en tiempo asociada con el anticuerpo unido marcado con europio.

Protocolo de Ensayo 1. - Reacción de auto-escisión En una placa de polipropileno de 96 cavidades, • se adicionaron secuencialmente : i) 20 µ?? del amortiguador de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7.5, glicerol al 30 , TCEP 1 mM) con o sin la presencia de un compuesto de prueba (inhibidor potencial) y, ii) 10 µ?^ de la proteasa NS2/3 (a una concentración final de 200 nM) como se purifica de acuerdo al Ejemplo 7. La reacción de auto-escisión se inicia por la adición de 20 µ? del amortiguador de activación (Hepes 50 mM, pH 7.5, 30 % de glicerol, 0.5 % de n-dodecil-P-D-maltósido, TCEP 1 mM) y se deja proseguir durante 1.5 horas a 30°C. 2. - Unión a la placa de Estreptavidma En una placa revestida con estreptavidina, blanca, de 96 cavidades (Pierce) , la mezcla de reacción de auto-escisión se diluye 5 veces en el amortiguador de ensayo (Hepes 50 mM, pH 7.5, 30 % de glicerol, TCEP 1 mM) . Después de una incubación de 1 hora a 23 °C, la placa se lava con PBS , 0.05 % de Tween-20, guanidina 2M-HC1. 3.- Unión de anti-NS2 marcado con Eu43 A la placa1 revestida con estreptavidina , blanca, de 96 cavidades, entonces se adiciona el anti-NS2 marcado con Eu+3 a una concentración final de 35 nM en PBS , 0.05 % de Tween-20, 0.3 % de BSA, biotina 1 µ?, DTPA 100 µ?. Después de una incubación de 1 hora a 23°C, la placa se lava con el amortiguador de lavado DELFIA (Perkin Elmer allac) . Finalmente, la solución de Enhancement (Perkin Elmer Wallac) se adiciona y la fluorescencia resuelta en tiempo se mide en un contador de varias marcas Wallac 1420 VICTOR2. xNOTA: También se pueden usar placas de Neutravidina EJEMPLO 10 Ensayo Homogénea de Fluorescencia Resulta en Tiempo La proteasa ??2/3 se marca con un quelato de europio fluorescente en un extremo y con un enfriador de la fluorescencia de europio en el otro extremo (Figura 11) . Por ejemplo, se usa el anticuerpo anti-NS2 o anti-FLAGmarca marcado con europio como la porción fluorescente, en tanto que el enfriador de la fluorescencia de europio se une ya sea de manera covalente a la enzima o se une a un potente inhibidor de proteasa NS3. La reacción enzimática se inicia por la adición del amortiguador de escisión. En la auto-escisión, el quelato de europio y el enfriador se separan dando por resultado un incremento en la señal de fluorescencia de europio resuelta en tiempo durante el tiempo.

EJEMPLO 11 Ensayo de Polarización de Fluorescencia Una sonda fluorescente, tal como un potente inhibidor de proteasa NS3 marcado con una porción fluorescente, se adiciona a la solución que contiene proteasa NS2/3 (Figura 12). La reacción de autoescisión se inicia por la adición del amortiguador de escisión. En cambio en la polarización de la fluorescencia de la sonda en la autoescisión se monitorea durante el tiempo. De manera alternativa, también se puede usar una proteasa NS2/3 inmovilizada en una placa de quelación de níquel. Después de la incubación de la enzima con la sonda fluorescente, la reacción de autoescisión se inicia por la adición del amortiguador de escisión. Después del tiempo apropiado de incubación, la escisión se monitorea al medir el cambio en la polarización de fluorescencia de la sonda.

EJEMPLO 12 Ensayo Radiométrico La proteasa NS2/3 se inmoviliza primero en una placa de quelación de níquel (Figura 13) . El HMKmarca entonces se fosforila usando la proteína cinasa A y un sustrato radiomarcado. Después del término de la reacción de fosforilación, la placa se lava y la reacción de auto-escisión se inicia al adicionar el amortiguador de escisión. Después del tiempo apropiado de incubación, la reacción se cuantífica ya sea al medir la cantidad del producto radiomarcado liberado en la solución de ensayo o la cantidad de la proteasa NS2/3 no procesada, radíomarcada . De manera alternativa, la reacción de fosforilación se puede realizar seguida primero por inmovilización en la placa de quelación de níquel.

EJEMPLO 13 Inhibición de proteasa NS2/3 Se evaluaron los péptidos derivados del sitio de escisión de proteasa NS2/3 como sustratos potencíalmente competentes (Tabla I) . Los péptidos derivados del sitio de escisión de proteasa NS2/3 y los péptidos derivados de NS4A se sintetizaron en casa usando la metodología normal de fase sólida o elaboraron por Múltiple Peptide Systems (San Diego, Ca) . Se pre-incubaron varias concentraciones de péptidos con proteasa NS2/3 0.54 µ? durante 30 minutos a 23°C en Hepes 50 mM, pH 7.0, y glicerol al 50 % (p/v) . La reacción de autoescisión se inició por la adición de n-dodecil-P-D-maltósido a una concentración final de 0.5 %. El contenido final de DMSO nunca excedió 5% (v/v) . La mezcla resultante entonces se incubó durante 3 horas a 23°C. La reacción se detuvo y se cuantificó. Ninguno de los péptidos derivados del sitio de escisión de la proteasa NS2/3 se escindieron en trans (datos no mostrados) . El péptido que abarca los residuos P10-P10' de la unión NS2/3 (péptido 1) inhibieron la auto-escisión con una IC50 de 270 µ?, en tanto que el sustrato peptídico que abarca los residuos P6-P6' (péptido 4) es menos potente con una IC50 de 630 µ?. Entre los productos correspondientes de sitios de escisión, el más activo fue el péptido SFEGQGWRLL ( IC50=90 Mm, SEQ IN NO. 21), el producto N-terminal del péptido 1.

Tabla I Inhibición de la Autoescisión de S2/3 por PéptiáosJ Péptido # Secuencia ic¾0 (µ?) Péptidosc derivados del sitio de escisión de proteasa NS2/3 1 SFEGQGWRLL -APITAYSQQT 270 2 SFEGQGWRLL (SEQ ID No 90 3 21) >1000 4 KGWRLL APITAYSQQT 630 5 -APITAY 1000 A ITAY a Los péptidos se prepararon como solución concentrada 20 mM en DMSO . El contenido final de DMSO nunca accedió 5 % (v/v) . b Se realizó el ensayo en la presencia de proteasa NS2/3 0.54 µ?. c El guión indica el sitio de escisión entre los residuos Pl y Pl' .

Análisis A la fecha, se ha obstaculizado la producción de NS2 nativa sola o enlazada ¦ a NS3 por su naturaleza hidrófoba, sólo que se logró una expresión a bajo nivel. Un estudio de truncamiento N-terminal ha permitido la identificación en la proteasa en NS2/3 [904-1206] (Figura 3) . Este truncamiento se expresó a altos niveles en E. coli en la inducción de IPTG (Figura 2B y 2C, senda 904) y fue activa como se muestra por la presencia del producto de escisión de proteasa NS3 (Figura 2A y 2C, senda 904) . Sin embargo, la proteasa NS2/3 [904-1206] se recuperó sólo en la fracción insoluble como cuerpos de inclusión. El uso de compañeros solubles de fusión, tal como proteína de unión a maltosa y tioredoxina, fue no exitoso en el incremento de la solubilidad de la proteasa en la expresión (datos no mostrados) . El mantenimiento de una baja concentración de agente caotrópico o aditivo polar tal como arginina 0.5 M-HC1 fue importante para mantener la 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k (Figura 9B, SEQ ID NO. 4) en solución durante el proceso de re-plegado. La arginina-HCl es un aditivo polar que desestabiliza ligeramente las proteínas de una manera comparable a una baja concentración de caotrofos . Se tiene como hipótesis que la arginina-HCl puede incrementar la solubil ización de los compuestos intermedios de re-plegado (Lin, T.-Y. et al. (1996) Protein Sci. 5:372-381. También se requirió un detergente para el replegado para reducir y/o suprimir la agregación al sustituir el amortiguador de desnaturalización por el amortiguador de re-plegado. Los detergentes LDAO, n-dodecil- ß-D-maltóido y octil-POE se evaluaron para su capacidad para promover el re-plegado de 4K-6H-NS2/3 (904-1206) st-4k a concentraciones en o mayores que su respectivo valor de CMC de 0.03 %, 0.01 % y 0.25 % (en agua) . No fue detectable el re-plegado en la presencia de octil-POE. El LDAO y n-dodecil - ß -D-maltósido que se encontró que repliegan de manera eficiente la enzima. Sin embargo, adem s de su capacidad de re-plegado, el n-dodec l - ß -D-maltósido se encontró que induce la activación de 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206 ) st - 4K . Se seleccionó LDAO puesto que, de manera inesperada, permitió el replegado y la reconstitución de la actividad de la proteasa NS3 sin promover la auto-escisión. Finalmente, los inventores han encontrado que la presencia de un agente reductor, ya sea DTT o TCEP, fue necesaria para re-plegar la enzima. Se evaluaron varios detergentes de escisión/activación para su capacidad para promover la auto-escisión de la 4K-6H-NS2/3 ( 904 - 1206) s -4k . Se observó el auto-procesamiento en la adición de CHAPS en el amortiguador de ensayo del ejemplo 7 (Figura 6, sendas 2-5) . También se observó un autoprocesamiento similar con n-dodecil-p-D-maltósido, NP-40 y Tritón X-100, aunque pareció ser superior 0.5 % y 1 % de n-dodecil - ß -D-maltósido. El procesamiento pobre se observó, sin embargo, en la presencia de octil-POE en tanto que no se observó nada con LDAO (datos no mostrados) . Además de los detergentes de escisión/activación, se encontró que el glicerol promueve la auto-escisión (Figura 6, senda 1) . De manera interesante, se observaron bajo niveles de escisión con 0 % de glicerol, en tanto que se observó una escisión sustancialmente mejorada cuando se adicionaron tanto glicerol como el detergente de escisión/activación al amortiguador de ensayo (Figura 6, senda 6) . El LDAO, que se usó durante el re-plegado, inhibió el auto-procesamiento, tal que la reacción de auto-escisión sólo se puede iniciar por dilución de la enzima en el amortiguador apropiado de escisión/activación y dilución de la LDAO a una concentración por debajo de aproximadamente 0.25 %. La actividad de la proteasa NS2/3 se confirmó por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia (Figura 7) y por la ausencia de los productos de escisión para el mutante His952Ala correspondiente (Figura 8). Además, no se observó cambio en la actividad en la presencia de potentes inhibidores de proteasa ??3 (datos no mostrados) . Finalmente, la secuenciación N-terminal de ambos productos de cis-escisión confirmó que la escisión se presentó entre los residuos Leul026 y Alal027. Los sustratos P10-P10' y P6-P6' peptídicos derivados del sitio de escisión se evaluaron como sustratos potencialmente competentes. En un sistema de ensayo bien definido que usa NS2/3 purificado (904-1206) y un amortiguador de escisión optimizado (que contiene 50 de glicerol y 0.5 % de n-dodecil - ß -D-maltosido) los péptidos P10-P10' y P6-P6' inhibieron del procesamiento de NS2/3 con IC50 de 270 y 360 µ?, respectivamente; aún bajo condiciones idénticas de ensayo, no se observó una trans-escisión de los péptidos (datos no mostrados) . Los datos sugieren unión no productiva del sustrato peptídico en el sitio activo. De forma notable, el péptido del producto de escisión N-terminal P10-P1 más corto fue el mejor inhibidor con una IC50 de 90 µ?, en tanto que el producto C-terminal correspondiente estaba desprovisto de actividad inhibitoria.

LISTADO DE SECUENCIAS ¿110;. Eoehringer Ingelheim (Caxiada) Ltd. <I20i Protcasa NS2/3 Activa, Purificad» de Virus de Hepatitis C 30 13/082pcc <150 60/255 , 031 <151> 2000-12-1S <160¾ 21 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 1230 212> ADN <213> HCV <220> <22 > CDS <222> (1) .. . (1230) 400> 1 atg gac cgg gag atg gct gca tcg tgc gga ggc gcg gtc ttc ata ggt 8 Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe lia Gly 1 5 10 15 tt gca etc ttg acc ttg tea cea tac tat a.aa gtg tc etc gct agg 96 Leu Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Ty-r Lys Val Leu Leu Ala Arg 20 2? 30 etc ata tgg tgg tta cag tat tta ate acc: aga gtc gag gcg cae tr.g 144 Leu lie Trp Trp Lau Gln Tyr Leu lie Thr Arg al Glu Ala H13 Lau 35 40 45 ca gcg tgg ate cea ect etc aat gct cgg gga ggc cgc gat gee ate 192 Gln Val Trp lia Pro 2ro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ha SO SS 60 ate etc etc acg tgc gca gtc cae cea gag cta ate ttt gac ate acc 240 lie Leu Leu Thr Cys Ala val His ero Glu Leu lie Phe Aap lia Thr 65 70 75 SO aaa etc ctg etc gee ata ttc ggt ceg etc atg gtg etc cag gca ggc 239 Lya Leu Leu Leu ALa lie Phe Gly Pro Leu Met Val Leu Glh Ala Gly 35 90 95 ata acc aaa gtg ceg tac ttc gtg cgc gcg cag ggg etc att cgt gcg 336 lie Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu lie Arg Ala 100 IOS 110 cgt atg ttg gtg cgg aag gct gcg 339 gg cat tat gtc caá atg gee 384 cys Met Leu Val Arg Lya Ala Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Mee Ala 115 120 125 ctc atg aag cta gcc gcg ctg acá ggt acg tac gtt tat gac cat ctc 432 Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Aap Hia Leu 130 135 140 act cea ttg cag gat tgg gcc ca gcg ggc cta ga gac tt gca gtg 480 Thr Pro Leu Gln Aap Trp Ala Hia Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val 145 150 155 160 gcg gta gag cc gtc ate ttc tet gac atg gag gtc aag acc ate acc 523 Ala Val Glu Pro Val lie Phe Ser Aap Met Glu Val Lys lia lie Thr 16S 170 175 tgg ggg gcg gac acc gcg g a tgc ggg gac ate att tea ggt ctg ccc 576 Trp Gly Ala ASp Thr Ala Ala Cys Gly Aap lie lie Ser Gly Leu Pro 180 18S 190 gtc tcc g=t cga agg gg-a agj gag «.ta ctc ctg gga ceg gcc gat aat 624 Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu Gly Pro Ala Asp sn 195 200 205 ttt gaa ggg cag ggg tgg cgn ctc tt gcg ccc ate acg gcc tac tcc 672 Phe Glu Gly Qln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lie Thr Ala Tyr Ser 210 215 220 caá cag acá cgg ggc cta ctt ggt tgc ate ate acc age ctc acá ggc T2C Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys lia He Thr Ser Leu Thr Gly 225 230 235 240 cgg gac aag aac cag gtc gag ggg gag gtt caá gtg gtc tcc acc gct 768 Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu val Gln al Val Ser Thr Ala 245 250 255 ac caá tet ttc ctg gcg acc tgc gtc aac ggc gtg tgt tgg act gtc S16 Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cya Val Asn Gly Val Cya Trp Thr Val 260 ' 265 270 ttc cat ggc gcc ggc tea aag acc ttg gcc ggc ccc aaa ggc cea ate 854 Phe Hia Gly Ala Gly Ser Lya Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro He 275 ¦ 280 285 acc cag atg tac act aat gtg gac cag gac ctc gtc ggc tgg cag gcg 912 Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala 290 ' 295 300 ccc ect ggg gcg cgc tcc atg acá c a tgc acc tgc ggc age teg gac 3S0 í>ro Pro Gly Ala Arg fiar Met Thr Pro cys Thr Cya Gly Sar Ser Aap 30.5 310 315 320 ctc tat ttg gtc acg aga cat gcc gac gtc att ceg gtg cgc cgg cgg 1008 Leu Tyr Leu Val Thr Arg Hia Ala Asp Val He ?¡ro Val Arg Arg Arg 325 33C 335 ggc gac agt agg ggg age ctg ctc tcc ccc agg ect gtc tcc tac ttg 1056 Gly Aap Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu 340 345 350. aag ggc tct Lcg ggt ggc cea ctg ctc tgc cct tcg ggg cac gct gtg 1104 Lys Gly Ser Ser Qly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly Hia Ala v«l 355 360 355 ggc ate ctc cgg gct gct gtg tgc ice cgg ggg gct gca aea gcg gtg 12.52 Gly Ha Phe Arg Ala Al» al Cyo Thr Arg Gly al Ala Lys Ala Val 370 375 330 gac ttc ata cct gtt gag tct atg gaa. act acc atg cgg act age age 1200 Asp Phe lie Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Thr Sor Ser 385 390 195 100 gct tgg cgt cac ceg cag ttc ggt ggt taa 1230 Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly * 405 <210> 2 <211> 409 <2 2> PRT <213> HCV <400> 2 Met Asp Arg Qlu Met Ala Ala ser Cys Gly Gly Ala. Val Phe He Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Val Leu Leu Ala Arg 20 25 30 Lí He Trp Trp Lau Gln Tyr Leu He Thr Arg Val Glu Ala His Leu 35 40 45 Gln Val Trp He Pro Pro Leu A3n Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ha 50 55 SO He Leu Leu Thr Cys Ala Val Hia Pro Glu Leu lia Phe A3 lie Thr 6S 70 75 T0 Lys Leu Leu Leu Ala He Phe Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly es 90 95 He Thr Lya Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ha Arg Ala 100 105 110 Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala 115 120 125 Phe Met Lys Leu Al Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu 130 135 140 Thr Pro Leu Gln Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Aap Leu Ala Val 145 1-50 155 160 Ala Val Glu Pro Val He Phe Ser Asp Met Glu Val Lys He He Thr 165 170 175 Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ha He Ser Gly Leu Pro 180 185 190 Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu Gly Pro Ala Asp Asn 195 200 205 Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ha Thr Ala Tyr Ser 210 215 220 Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly cys lie He Thr Ser Leu Thr Gly 225 230 235 240 Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln. Val Val 3er Thr Ala 245 250 255 Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cy3 Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val 260 265 270 Phe Kis Cly Ala Gly Ser Lys thr L¾u Ala Gly Pro Lys Gly Pro 11e 275 280 285 Thr Gln Mee Tyr Thr Aan Val Asp Gln Aap Leu Val Gly Trp Gln Ala 290 295 300 Pro Pro Gly Ala Arg Ser Mee Thr Pro Cys Thr Cys Gly Sar Ser Asp 335 310 315 320 Leu Tyr Leu al Thr Arg HÍ8 Ala Asp Val He Pro al Arg Arg Arg 325 330 335 Gly Asp Ser Arg Gly Sar Leu Leu Ser Pro Arg Pro val Ser Tyr Leii 340 345 350 L/3 Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu La Cys Pro Sar Gly His Ala Val 355 360 355 Gly lie Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val 370 375 390 Asp Phe He Pro Val Glu ser Met Glu Thr Thr Met Arg Thr Ser 3er 335 390 395 400 Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 405 <210> 3 <211> 1011 <212i ADN <213> HCV < 22 Q > 221 > C S < 222 > (1) . , . (1005) <40C> 3 atg aaa aag aaa aag etc gag cat cae cat cae cat cae acc agt gca 48 Met Lys Ly» Lya Lys Lau Glu His Hia His His Hia His Thr Ser Ala 1 5 10 15 ggc ata acc aaa gtg ceg tac ttc gtg cgt gcg cag ggg etc att cgt 9fi Gly lie Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu lie Arg 20 25 30 gcg tgt atg ttg gtg cgg aag gct gcg ggg ggt cat tat gtc caá atg 144 Ala Cys Met Lau Val Arg Lys Ala Ala Gly Gly Hia Tyr Val Gln Met 35 40 45 g c ttc atg aag ct«. get gcg ceg aca ggt a g tac gtt tat gac cat 132 Ala Phe Met Lya Lau Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp Hís 50 SS so etc act cea ttg cag gac tgg gcc cae gcg ggc cea cga gac ctt gca 240 Leu Thr Pro Leu Gln Aep Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala 6? 70 75 ao gtg gcg gta gag ecc gtc ate ttc tet gac atg gag gtc aag ate ate 29a Val Ala Val Glu Pro Val lie Phe Ser Asp Met Glu Val Lys lia lie 85 90 95 acc tgg ggg gcg gac acc gcg gca tgc ggg gac ate ate tea ggt ctg 336 Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Aap lie l e Ser Gly Leu 100 105 110 ccc gtc tcc gct cga agg gga agg gag ata ctc ccg gga ccg gcc gat 384 Pro Val Ser Ala Aig Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu 31y Pro Ala Asp 115 120 125 aac ttt gaa ggg cag ggg Cgg cga ctc ctt gcg ccc ate acg gcc tac 432 Asn Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lia Thr Ala Tyr 130 135 140 tcc caá cag acá cgg ggc ct» ctc ggt tgc ate ate acc age ctc acá 4B0 Ser Gln Qln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cye lie lie Thr Ser Leu Thr 145 150 1S5 160 ggc cgg g«.c aag a*c cag gtc gag ggg gag gtt caá gtg gtc tcc acc 52 S Gly Arg Asp Lys Asn Qln Val Glu Gly Olu V«l Gln Val Val Ser Thr 1S5 170 175 gct acá caá tct ttc ctg gcg acc tgc gtc aac ggc ytg tgc tgg act 575 Ala Thr GLn Ser Phe Leu Ala Thr Cye Val Asn Gly Val Cys Trp Thr 180 1B5 190 gtc ttc cat ggc gcc ggc tea aag «ce ttg gcc ggc ccc aaa ggc cea 521 Val Phe Hii Gly Ala Gly Sar Lya Thr Leu Ala Oly Pro Lya Gly Pro 195 200 20S ate acc eag acg tac act aat gtg gac cag gac ctc gtc ggc tgg cag 672 lis Thr Qln Met Tyr Thr Asn Val Asp aln. Asp Leu val Gly Trp Gln 210 21S 220 gcg ccc ccc ggg gcg cgc tcc atg acá cea tgc acc tgc ggc age teg 720 Ala ro Pro Gly Ala Arg Ser- Met Thr Pro Cys Thr Cys gly Ser ser 225 230 235 · 240 g*c ctc tat ttg gtc a g aga cat gcc gac gtc att ccg gtg cgc cgg 768 Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg Hia Ala Asp Val lie Pro Val Arg Arg 245 250 255 cgg ggc gac agt agg ggg age ctg ctc tcc ccc agg cct gtc tcc tac 81S Arg Gly Asp Ser Arg Gly Sar Leu Leu' ser ?ro Arg Pro Val ser Tyr 260 265 270 ttg aag ggc tct teg ggt ggc cea ctg ctc tgc cct teg ggg cae gct 364 Leu Lys Gly Sar Ser Gly Gly Pro '.su Leu Cys Pro Sar Oly Hia Ala 275 2BQ 235 gtg ggc ate ttc cgg gct gct gtg cgc acc cgg ggg gct gca aaa gcg 912 Val Gly lie Pha Arg Ala Ala Val Cya T r Arg Gly Val Ala Lys Ala 290 295 300 gtg gac ttc ata cct gtt gag tct acg ^ a act acc atg cgg act agt 960.

Val A3p Phe lia Pro Val Glu Ser Me Glu Thr Thr Met Axg Thr Ser 305 310 315 320 age gct tgg cgt cae ccg cag ctc ggc ggt aaa aag aaa aag taa 1005 Ser Ala Trp Arg Hia Pro Gln Phe Gly Gly Lys Lys Lys Ir/a * 325 330 ggaece 1011 <210 4 ¦¿211.-. 32-1 <212> PRT ¦c213> HCV <400> 4 Lya Lys Lya Lys Leu Glu His His His HiS Hia His Thr Ser Ala 1 3 10 15' Gly lie Thr Lys Val Pro Tyr Phe val Arg Ala Gln Gly Leu lie Arg 20 25 30 Ala Cys Mee Leu val Arg Lya Ala Ala Gly Gly Hia Tyr Val Gln Me- 35 40 45 Ala Phe Met Ly» Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr AS His 50 55 60 Leu Thr íro Leu Gln A3P Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Aap Leu Ala 65 70 75 80 Val Ala Val Glu pro val lie Phe ser Asp Met Glu Val Lys Ha lia es 90 55 Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cyg Gly ASp lie lie Sar Qly Lau 100 105 110 Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu Gly Pro Ala A3p 115 120 125 Aan Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lia Thr Ala Tyr 130 115 140 Sar Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly cys lie He Thr Ser Lau Thr 145 150 155 160 Gly Arg Aap Lys Aan Gln Val Glu Gly Glu Val Gln al Val Ser Thr 165 170 175 Ala Thr Gln Ser Phe Leu .11 Thr cys val Asn Gly V l Cys Trp Thr 1T0 185 190 V l Phe EÍ3 Gly Ala Gly Ser Lya Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro 195 200 205 lia Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val As Gln As Leu Val Gly Trp Gln 210 215 220 Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Mee Thr Pro Cys Thr Cy3 Gly 3er ser 225 230 235 240 Aap Leu Tyr Leu Val Thr Arg Hia Ala As Val lie Pro Val Arg Arg 245 250 255 Arg Gly ASp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr 260 2E5 270 Leu Lya Gly Sar Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala 27S 280 285 Val Gly lia Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala 290 295 300 Val Asp Phe He Pro Val Glu Ser Ket Glu Thr Thr Mat Arg Thr Ser 305 310 315 320 Ser Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly Lys LV3 Lys Lya 325 3 3 0 <210> 5 <211> 20 ¦ 212> ADN <213 HCV <400> ? ccatggaccg ggagatggct 2io> e <211 63 <212> ADM --213> HCV c400> e ggatccttaa ccaccgaact gcgggtgacg ccaagcgcta. ctagtccgca tggtagtttc 60 cat 63 <211? 46 <212¾ ADN <213> HCV <400> 7 gctcgagcat caccatcacc atcacactag tgcaggcata jccata 4S <21Q> 8 ¿211 4S <212 ADN <213> HCV -,·400 T aaciiatggat ccttactttt tctttthscc aocgsactgc gg<jtg <15 <210> 9 <211> 45 <212> ADN <213> HCV <400> 9 acctgccata tcjaaaaagaa aaagctcgag catcaccatc accac 45 <2ia> lo <2X1 303 <212> i"RT <213> HCV <400> 10 Ala Gly He Thr Lys Val pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu He 1 5 10 15 Arg Ala Cya Mat Leu Val Arg Lys Ala Ala Gly Gly Kia Tyr V l Gln 20 25 30 Met Ala Phe Ket Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp 35 40 ?5 HlS Leu Ttir- Pro Leu Gln Asp T p Ala His Ala Gly Leu. Arg ASp Leu 50 55 SO Ala val Ala Val Glu ro val He Phe Ser Asp Met Glu val Lys He 65 70 75 80 lia Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp He He ser Gly 35 90 9S LeU Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu Ha Leu Leu Gly Pro Ala 100 105 110 Asp Aan Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Lau Al Pro He Thr Ala 115 120 125 Tyr Ser Gln 31n Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys He He Thr Ser Leu 130 135 140 Thr Gly Arg A3p Lya Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser 145 150 155 ISO Thr Ala Thr Gln Ser phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cya Trp 165 L70 175 Thr Val Ph¾ His Oly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly 130 1T5 190 Pro lie Thr aln Met Tyr Thr Asn Val Aap Gln A9p Leu Val Gly Trp 195 200 205 aln Ala Pro Pro Qly Ala Arg Ser Met Thr Pro Cya Thr Cy3 eiy 3er 210 215 220 Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Aap Val lie Pro Val Arg 225 230 235 240 Arg Arg Gly Aap Ser Arg Gly Ser Leu Leu. Ser Pro Arg Pro Val Ser 245 250 255 Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cya Pro Ser Gly His 250 265 270 Ala Val ?ly lie Pha Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lya 275 280 2 B5 Ala Val Aap Phe lie Pro Val Glu Ser Me Glu Thr Thr Mat Arg 290 29S 300 210=· 11 212> PS.T 213> HCV 400> 11 Met Ala Ala Ser Cya Gly Gly Ala Val Phe lia Gly Leu Al Leu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Pro Tyr- Tyt- Val Leu Le Ala Arg Leu lie Trp Trp 20 25 30 Leu Gln Tyr Leu lia T r Arg Val Glu Ala Hia Leu Gln Val Trp 11* 35 40 45 P o pro Leu Asn val Arg Gly Gly Arg Asp Ala lie lie Leu Leu Thr 50 55 SO Cys Ala Val HÍ3 Pro Glu Leu lia Phe Asp lie Thr Lys Leu Leu Leu 65 70 75 ao Ala lie Phe Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly lie Thr Lys Val as 90 95 Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu lie Arg Al Cys Met Leu Val 100 IOS 110 Arg Lye Al Ala Gly Gly Hia Tyr Val Gln Me Ala Phe Me Lye Leu 115 120 125 Al» A a Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr His Leu Thr Pro Leu Gln 130 13? 140 Asp Trp Ala Hia Ala Gly Leu Arg Aap Leu Ala Val Ala Val Glu Pro 145 150 1SS 160 Val lia Pha Ser Asp Met Glu Val Lys lie lie Thr Trp Gly Ala Asp 165 L7Q 175 Thr Ala Ala Cya Gly Asp lie lia Ser Gly Le Pro val Ser Ala Arg 130 195 190 Arg Gly Arg Glu lia Leu Leu Gl Pro Ala Asp Asn pha Glu Gly Gln 155 200 205 Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lie Thr Ala Tyr Ser 31n Gln Thr Arg 210 215 220 Gly Leu Le Gly Cys lie lie Thr Ser Leu Thr Gly Arg A3P Lya Asn 225 230 235 240 Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val ser Thr Ala Thr Gln 3er Phe 215 250 255 Leu Ala Tlir Cys al Asn Gly Val Cya Trp Thr al Phe Hi-i Gly Ala 350 265 27Q Gly Sar Lyo Thr Leu Ala Gly Pro Lya Gly Pro lie Thr Gln Met Tyr 275 230 28S Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu al Gly Trp Gln Ala Pro pro Gly Ala 290 295 300 Azrg 3er Met Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu al 305 310 315 320 Thr Arg Hi3 Ala Asp Val lie Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg 325 330 335 Gly Ser Leu Leu s«r Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lya Gly Ser Ser 340 345 350 Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly Illa Ala Val Gly .lie Phe Arg 3 SS 360 365 Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Aap Phe lie Pro 370 375 380 Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Mat Arg 385 390 ¦=210» 12 <211> 380 <212> P T <;213> HCV Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Val Leu Leu Ala Arg Leu 1 5 10 15 lie Trp Trp Leu Gln Tyr Leu lie Thr Arg Val Glu Ala His Leu Gln 20 25 30 Val Trp lie Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Aap Ala lie lia 35 40 45 Leu Leu Thr Cys Ala Val His Pro Qlu Leu lie Phe Asp lie Thr Lys 50 55 eo Lau Leu Leu Ala lie Phe Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly lie 65 70 75 60 Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Lau Ile^Arg Ala Cys 85 90 95 Met Leu Val Arg Lya Ala Ala Gly Gly Hia Tyr Val Gln Met Ala Phe 100 105 110 Met Lya Leu Ala Ala Leu Thr Oly Thr Tyr al Tyr Aap Hia Leu Thr 115 120 125 Pro Leu Gln Asp Trp Ala His Ala Gly Le Arg Aap Leu Ala Val Ala 130 13S 140 Va.1 Glu Pro Val lie Phe Ser Aap Met Glu Val Lys lie He Thr Trp 145 150 1?? 160 Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Aap lie lie Ser Gly Leu Pro Val 165 170 175 Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu Gly Pro Ala A=p Asn Phe 130 135 190 Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lia Thr Ala Tyr Ser Gln 195 200 205 Gln Thr Arg Gly Lau Leu Gly Cys lie He Thr Ser Leu Thr Gly Arg 210 215 220 Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr 225 230 235 240 Gln Ser Phe Lau Ala Thr Cys Val Asn Gl Val Cys Trp Thr Val Phe 245 250 255 His OIy Ala Gly Ser L Thr Leu Ala Gl Pro Lys Gly Pro lie Thr 260 2S5 270 Gln Met Tyr Thr Así- Val Aap Gln. Aap Leu Val Gly Trp Gln Al Pro 275 230 235 P o Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro Cys Thr Cys Gly Sar Sar Asp Leu 290 295 300 Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val lie P o Val Arg Arg Arg Gly 305 310 315 320 ASp Ser Axg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys 325 330 335 Gly Ser Ser Gly Gly Pro Lnu Lau Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly 340 345 350 He Phe Arg Ala Ala Val Cye Thr Arg Gly val Ala Lys Ala Val Asp 355 360 365 Phe lie Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Mee Arg 370 375 380 <210> 13 <213> HCV <400s 13 Ala His Leu Gln Val Trp lie Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg 1 5 10 15 Asp Ala lie lio Leu Leu Thr Cys Ala Val Hia Pro Glu Leu lie Phe 20 25 30 Aap Il« Thr Lya Leu Lau Lau Ala lia Phe Gly Pro Leu Met Val Le 35 40 Gln Ala Gly lie Thr Lys Val pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu 50 5S £0 Ha Arg Ala Cye Met Leu val Arg Lyo Ala Ala Gly Gly His Tyr val 65 70 7S 80 Gln Met Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr val Tyr B5 90 95 Aap His Leu Thr Pro Lau Gln Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp 100 105 110 Leu Ala al Ala Val Glu Pro Val lie Phe Ser Asp Met Glu Val Lys US 120 12S lie He Thr Trp Gly Ala Aap Thr Ala Ala Cys Gly Asp lie lie Ser 130 135 140 Gly Leu Pro val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu lie Leu Leu Gly Pro 145 150 155 1S0 Ala Asp A3n Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro lie Thr 165 170 175 Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cya lie lie Thr Ser 180 1T5 190 Leu Thr Gly Arg ASp Lya Asn Gln Val Glu Gly Glu Val (Sin Val val 135 200 205 Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr ys al Asn Gly Val Cys 210 21S 220 Trp Thr al Phe Hig Gly Ala Gly Ser Lys Thr Le Ala Gly P o Lya 225 230 235 240 Gly Pro lie Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly 24S 250 255 Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro Cyg Thr Cys Gly 260 2S5 270 Ser Ser Asp Leu Tyr Leu val Thr Arg Hia Ala Asp Val lie Pro Val 275 280 285 A g rg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Lye Gly 3er Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly 305 310 315 320 His Ala Val Gly lie Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala 325 330 335 Lys Ala Val Aap Phe lie Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Mee Arg 340 345' 350 210> 14 211> 341 212> PRT 213> HCV <400: L4 Val Ajg Gly Gly Arg Aa Ala lie lie Leu Leu Thr Cys Ala Val His 1 5 10 15 Pro Glu Leu ríe Phe Aap lia Thr Lys Leu Lau Leu Ala lia Phe Gly 20 25 30 Pro Leu Met Val Leu Gla Ala Gly lia Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val 35 40 45 Arg Ala Gln Gly Leu lie Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Ala 50 55 SO Gly Gly His Tyr Val Gln Mat Ala Phe Met Lya Leu Ala Ala Leu Thr 65 70 75 80 Gly Thr Tyr al Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu Gln Aap Trp Ala His 85 90 .95 Ala Gly Leu Arg ASP Leu Ala Val Ala al Glu Pro Val Il« Pha Ser 100 105 110 Asp Mat Glu Val Lya lie lie Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala cys 115 120 125 Gly Asp lia lia Ser Gly Leu Pro val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu 130 135 140 lie Leu Leu Gly Pro Ala Aa Aa. Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu 145 150 155 1S0 Lau Ala Pro lie Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly .165 170 175 Cya lia lie Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lym Asn Gln Val Glu Gly iao 185 190 Glu val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Lau Ala Thr Cys 195 200 20S Val Aan Gly Val cys Trp Thr Val Phe His Gly Ala Gly Sar Lya Thr 210 215 220 Leu Ala Gly P o L s Gly Pro He Thr Gln Mat Tyr Thr Aan Val Asp 22? 230 235 240 Gln Asp Leu val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met rhr 245 2S0 255 Pro cya Thr Cys Gly ser Ser Asp Leu Tyr L«u val. Thr Arg His Ala 260 253 270 Asp Val lia Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu 275 280 235 Ser Pro Arg Pro Val Sar Tyr Leu Lyo Gly Sür Ser Gly Gly pro Leu 290 295 300 Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly lie Phe Axg Ala Ala Val Cys 305 310 315 320 Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Aap Phe lie Pro al Glu Ser Mee 325 330 335 Glu Thr- Thr Met 340 c21Q> 15 <212> PRT <;213> HCV 400> 15 Ala Gln. Gly Leu lie Arg Ala Cys Met Leu Val Axg Lys Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Hla Tyr val Gln Met Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly 20 25 30 Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu Gln. Asp Trp Ala His Ala 35 40 45 Gly Leu Arg Asp Leu Ala val Ala Val Glu Pro Val Tic Phe Ser Asp 50 5S 60 Met Glu Val Lys lie lie Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly 63 70 75 80 Asp lie lie Ser Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Axg Glu lie T5 90 95 Leu. Leu Gly Pro Ala Asp Asn Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu 100 105 110 Ala Pro 1.1a Thr Ala Tyr Sar Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 115 120 125 lia lie Thr SerLeu Thr Gly Arg Asp Lya Asn Gln Val Glu Gly Glu 130 135 140 val Gln Val val Ser Thr Ala Thr Gln Ser ?he Leu Ala Thr Cya Val 145 ISO 155 1S0 Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Phe Hís Gly Ala Gly ser Lys Thr Leu 1S5 170 175 Ala Gly Pro Lys Gly Pro lie Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Aap Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro 195 200 205 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg HÍ3 Ala Asp 210 215 220 Val lia Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser 22S 230 235 240 Pro Arg- Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Sar Ser Gly Gly Pro Leu Leu 245 250 2?5 Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly lie Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr 260 265 270 Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe lie Pro Val Glu Ser Met Glu 275 280 Thr Thr Mee Arg 290 210:- 16 <211> 303 212> ??? <213 HCV <400 16 Ala Gly He Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu lie 1 S 10 15 Arg Ala Cys Met Leu l Arg Lys Ala Al» Gly Gly His Tyr Val Gln 20 25 30 Met Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr val Tyr Aap 35 40 45 Al Leu Thr Pro Leu Gln. Asp Trp A a Eia Al Gly Leu Arg Aap Leu 50 55 GO Ala Val Ala Val Glu Pro Val lia Phe Ser Aap Mee Gl Val Lys lie 65 70 75 80 lie Thr Trp ?ly Al A3p Thr Ala Ala Cys Gly Asp He He ser Gly 85 90 95 Leu. Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu ríe Leu Leu Gly Pro Al 100 105 110 Asp Asn Phe GlU Gly Gln Gl Trp Arg leu Leu Ala Pro lie Thr Ala 115 120 125 Tyr Ser Qln Gln Thr Arg 31y Leu Leu Gl Cy» lie lie Thr Ser Leu 130 135 140 Thr Gly Arg Asp Lys ASZl Gln val Glu Gly Glu Val Gln val val Ser 145 150 155 160 Thr Ala Thr Gln 3er Phe Leu Ala Thr Cya Val Aan Gly V l Cys Trp 165 170 175 Thr Val Phe Hís Gly Ala Gly 3er Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly 1T0 ias 190 Pro lie Thr Qln Me Tyr Thr Aan Val Aap Gln Asp Leu Val Gly Trp 195 200 20S Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro Cye Thr Cys Gly ser 210 215 220 Ser Aap Leu Tyr Leu V l T r Arg HÍ3 Ala As Val lie Pro Val Arg 225 230 235 240 Arg Arg Oly £ ser Arg Gly Ser Leu Leu Sar Pro Arg Pro Val Ser 245 250 255 Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly Hie 260 265 270 Ala Val Gly lie Phe Arg Ala Al Val Cyg Thr Arg Gly Val Ala Lys 275 2B0 2T5 Ala Val Ásp Phe He Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Mee Arg 290 235 300 :210> ? 213> HCV c400> 17 Ala Gly He Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Axg Ala Gln Gly Leu lie 1 5 10 15 Axg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Ala Gly Gly Hla Tyr Val Qln 20 25 30 Met Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp 35 40 4? Kis Leu Thr Pro Leu Gln Aap Trp Ala H 3 Ala Gly Leu Arg Aap Leu SO 55 SO Ala al Ala Val Glu Pro Val 11- Phe Ser Asp Met Glu val Lys lie 65 70 75 80 lia Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ha Ha Ser Gly 85 90 95 Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu Ha Le L* Gly Pro Ala 100 105 110 Asp Asn Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Pro lie Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Gln Gln Thr A g Gly Leu Leu. Gly Cys He He Thr ser Leu Thr Gly 130 135 140 Arg Aap Lys Aan Gln Val Glu Gly Glu val Gln val Val Ser Thr Ala 145 150 155 iso Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cya Val Asn Gly val Cys Trp ¦ Thr Val 1S5 170 175 Phe His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu A a Gly Pro Lys Gly Pro He 180 1B5 190 Thr Gln Met Tyr Thr Aan val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala 195 200 20? Pro Pro Qly Ala Arg Ser Met Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp 210 215 220 Leu Tyr Leu Val Th Arg Hifi Ala Asp Val He Pro Val A g Arg Arg 225 230 235 240 Gly Aap Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val ser Ty Leu 245 250 255 Lys Gly Ser Sar Gly Gly P o Leu Leu Cya Pro Ser Gly Ala Val 250 2G5 27C Gly lia Phe Arg Ala Al Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lya Ala Val 275 230 285 Asp Phe lio o Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg 290 235 300 <210 IB <211> 303 <2l2> PRT <2l3> HCV Ala Gly ?ß Thr Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu lie 1 5 10 15 Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Ala Gly Gly His Tyr Val Gln 20 25 30 Met Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp 35 40 45 His Leu Thr Pro Leu Gln Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu 50 55 60 Ala Val Ala Val Glu Pro Val lie Phe Ser As Met Glu Val Lya lia 65 70 75 80 lia Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Al Al* Gly Aap lie He Ser Gly 85 90 95 Leu pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu He Leu Leu Gly Pro Ala 100 IOS 110 Asp Aan Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro He Thr Ala 115 120 125 Tyr Ser Gln Gln Thr Arg aly Leu Leu Gly Cys lie lie Thr Ser Leu 130 135 140 Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 'Gln Val Gln Val Val Ser 145 150 155 160 Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cya Val Aan Gly Val Cya Trp 1S5 170 175 Thr Val Phe His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly 180 185 190 Pro lie Thr Gln Mee Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu al Gly Trp 195 200 205 Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Mat Thr Pro Cya Thr Cys Gly Ser 210 215 220 Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp al lie Pro val Arg 225 230 235 240 Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser 245 230 255 Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His 2S0 2S5 270 Ala Val Gly lie Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lya 275 280 285 Ala Val Asp Phe lie Pro Val Glu Ser Met Glu Thr Thr Met Arg 290 295 300 <210> 19 <211> 11 < 2 12 > PRT <213> HCV <220> 22 1 > VARIANTE <222¾ (1) ... (1) <223 > Asp marcado con antranil ilo < 22 > VARIANTE <2 22 > (S) ... (6) <223> Xaa en posición 6 es Abu -..221? VARIANTE <222 > (ó) ... (7) < 223 Abu-A entre 6 y 7 es C(0)-0 <221> VARIANTE <222> f 9) ... (9) <223 > Tyr en posición 9 se denvatiza con )2 <400> 19 Aap Asp lie val Pro Xaa Ala Mee Tyr 1 5 21Q> 20 <2 11 > 5 c212> PRT <213 HCV <220> <221> VARIANTE <222> (1) ... (1) «223? Asp marcado con antranililo

Claims (44)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una proteasa ??2/3 inactiva, re-plegada del virus de hepatitis C (HCV(, que comprende loa pasos de: a) aislar la proteasa en la presencia de un agente caotrópico; b) replegar la proteasa aislada al ponerla en contacto con un agente reductor, y óxido de laurildietilamina (LDAO) en la presencia de concentración reducida de agente caotrópico o aditivo polar.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el LDAO está a una concentración final a o por arriba de la concentración micelar crítica.
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde el LDAO está a una concentración final entre 0.003 % y 1 %.
4. 4. El método según la reivindicación 1, en donde el LDAO está a una concentración final entre 0.03 % y 1% .
5. 5. El método según la reivindicación 1, en donde el LDAO está a una concentración final de 1 % .
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde en el paso a) del agente caotrópico se selecciona del grupo que consiste de: guanidina-HCl , guanidina o urea .
7. 7. El método según la reivindicación 6, en donde el agente caotrópico está a una alta concentración entre 5 M y 8 M.
8. 8. El método según la reivindicación 7, en donde el agente caotrópico es guanidina o guanidina-HCl , cada uno a una concentración final de 6 M o urea o una concentración final de 8 M .
9. 9. El método según la reivindicación 8, en donde el agente caotrópico en guanidina 6 M-HCl .
10. 10. El método según la reivindicación 1, en donde en el paso b) , el agente caotrópico o aditivo polar se selecciona del grupo que consiste de: guanidina, guanidina-HCl urea y arginina-HCl .
11. 11. El método según la reivindicación 10, en donde se usa guanidina-HCl o arginina HC1.
12. 12. El método según la reivindicación 11, en donde se usa arginina-HCl.
13. 13. El método según la reivindicación 12, en donde la arginina-HCl está a una concentración final entre 0.25 M y 2 M .
14. 14. El método según la reivindicación 13, en donde la arginina-CHl está a una concentración final entre 0.5 M y 1 M .
15. 15. El método según la reivindicación 14, en donde la arginina-HCl está a una concentración final de 0.5 M .
16. 16. El método según la reivindicación 1, en donde el agente reductor se selecciona del grupo que consiste de TDEP y DTT .
17. 17. El método según la reivindicación 16, en donde el agente reductor es TCEP a una concentración final de 5 mM.
18. 18. El método según la reivindicación 1, en donde la proteasa se aisla de cuerpos de inclusión celulares .
19. 19. El método según la reivindicación 1, en donde el replagado se lleva a cabo por diálisis o por filtración en gel para producir un proteasa NS2/3 purificad .
20. 20. El método según la reivindicación 19, en donde el replegado se lleva a cabo por filtración en gel.
21. 21. El método según la reivindicación 1, en donde la proteasa NS2/3 es la proteasa NS2/3 de longitud completa o un truncamiento de la misma que tiene como su residuo N-tertninal cualquier aminoácido desde el aminoácido 810 al aminoácido 906.
22. 22. El método según la reivindicación 21, en donde la proteasa NS2/3 tiene la secuencia de aminoácidos mínima desde los residuos 904 a 1206 de la proteasa NS2/3 de longitud completa lb-40 de HCV.
23. 23. El método según la reivindicación 22, en donde la proteasa NS2/3 consiste de uno proteasa NS2/3 truncada como se define de acuerdo a la SEQ ID NO. 10.
24. 24. Un método para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende: c) diluir la proteasa NS2/3 inactiva, replegada como se define en la reivindicación 1, en un medio que contiene un detergente de activación para inducir la auto-escisión de la proteasa NS2/3.
25. 25. El método según la reivindicación 24, en donde el LDAO de diluye una concentración final igual o por debajo de 0.1 %.
26. 26. El método según la reivindicación 24, en donde en el paso c) glicerol se adiciona adicionalmente .
27. 27. El método según la reivindicación 26, en donde el glicerol está una concentración final de entre 10 % y 50 %.
28. 28. El método según la reivindicación 24, en donde el detergente de activación se selecciona del grupo que consiste de: CHAPS, Tritón X-100, NP-40 y n-dodecil-ß -D-maltósido .
29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde el detergente de activación está a una concentración final entre 0.1 % y 1 %.
30. 30. El método según la reivindicación 29, en donde el detergente de activación es CHAPS.
31. 31. El método según la reivindicación 29, en donde el detergente de activación es n-dodecil - ß -D-maltós ido .
32. 32. Un método para medir la actividad de auto-escisión de una proteasa NS2/3, que comprende: d) incubar la proteasa NS2/3 activa producida por el método de la reivindicación 24 durante el tiempo suficiente para inhibir la auto-escisión de la proteasa NS2/3 y producir productos de escisión o fragmentos de los mismos y e) medir la presencia o ausencia de la proteasa NS2/3 no escindida, productos de escisión o fragmentos de los mismos .
33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde el paso c) se lleva a cabo a una temperatura entre 15°C y 30°C.
34. 34. El método según la reivindicación 33, en donde el paso c) se lleva a cabo a una temperatura entre 15°C y 25°C.
35. 35. El método según la reivindicación 34, en donde el paso c) se lleva a cabo a temperatura ambiente.
36. 36. Un ensayo para detectar un inhibidor potencial de la actividad de auto-escisión de una proteasa NS2/3 activa, que comprende: a) llevar a cabo el método de acuerdo a la reivindicación 32 en la presencia de, o ausencia del inhibidor potencial; b) comparar la cantidad de la proteasa NS2/3 no escindida, producto de escisión o fragmentos de los mismos, en la presencia de, o ausencia del inhibidor potencial.
37. 37. Un polipéptido aislado que consiste de una proteasa NS2/3 de longitud completa o un truncamiento de la misma que tiene como su residuo N-terminal cualquier aminoácido desde el aminoácido 810 al aminoácido 906.
38. 38. Un polipéptido aislado que consiste de un truncamiento de una proteasa NS2/3 de HCV, en donde la proteasa NS2/3 truncada tiene la secuencia mínima de aminoácidos desde los residuos 904 a 1206 de la proteasa NS2/3 de longitud completa lb-40 de HCV.
39. 39. Un polipéptido aislado que consiste de una proteasa NS2/3 truncada como se define de acuerdo a SEQ ID NO . 4 o 10.
40. 40. Un polipéptido aislado que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad con respecto a su longitud en comparación al polipéptido de acuerdo a la reivindicación 39.
41. 41. Un polipéptido aislado que consiste de una proteasa NS2/3 truncada seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14 y 15.
42. 42. Una composición que comprende una proteasa NS2/3 de HCV, aislada, seleccionada de proteasa NS2/3 de longitud completa, un tratamiento de la misma o una secuencia como se define de acuerdo a SEQ ID NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13, 14 y 15 en donde la proteasa está en una solución que comprende una concentración suficiente de LDAO para prevenir la auto-escisión en la proteasa.
43. 43. Un péptido que tiene la secuencia SFEGQG RLL (SEQ ID NO. 21) .
44. 44. Un péptido según la reivindicación 43, en donde el péptido es un inhibidor de proteasa NS2/3.