JP2003526361A

JP2003526361A - Ｈｃｖｎｓ２／３フラグメント及びその使用

Info

Publication number: JP2003526361A
Application number: JP2001567302A
Authority: JP
Inventors: シユタインクーラー，クリスチヤン; パツラオーロ，ミケーレ; ラーム，アルミン
Original assignee: イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2003-09-09
Also published as: US20040054134A1; ES2254380T3; CA2403405A1; US7078215B2; DE60116474T2; EP1278867B1; EP1278867A2; WO2001068818A3; DE60116474D1; WO2001068818A2; GB0006537D0; AU4269401A; ATE315093T1

Abstract

(57)【要約】欠損ＨＣＶＮＳ２／３を組換え的に産生し、活性モジュレーター及びＨＣＶ機能のモジュレーターのアッセイに有用な機能酵素に再生し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ２／３プロテアーゼに由来のポリペプ
チドに基づくアッセイ、スクリーニング方法、ポリペプチド、模擬体及び使用方
法に関する。

【０００２】肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）は非経口的に伝達される散発性の非Ａ、非Ｂ肝炎（
ＮＡＮＢ−Ｈ）の主要な病原因子である。地球上の人口のほぼ１％が該ウイルス
に感染していると考えられる。ウイルス感染の結果として、慢性肝炎及び肝硬変
になり、肝臓癌につながることもある。組換えインターフェロン−αによる単独
治療またはリバビリンとの併用治療によって少数の症例で部分的な成功は得られ
ているものの、ワクチンも確立された治療方法も全く存在していないのが現状で
ある。従って、広い範囲で有効な新規な治療薬が差し迫って要望されている。

【０００３】推定される治療介在ターゲットは、オートプロテアーゼ（ＮＳ２−３）、セリ
ンプロテアーゼ（ＮＳ３）、ヘリカーゼ（ＮＳ３）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼ（ＮＳ５Ｂ）のような、ウイルスにコードされた幾つかの酵素である。

【０００４】ＮＳ３プロテアーゼドメインはＮＳ３タンパク質のＮ末端に局在しており、Ｎ
Ｓ３／４Ａ部位での分子内開裂及び下流のＮＳ４Ａ／４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／５Ａ及び
ＮＳ５Ａ／５Ｂなどの接合の分子間プロセシングを担当している。

【０００５】ＮＳ３は前駆体分子ＮＳ２／３のタンパク質分解性開裂によって形成され、Ｎ
Ｓ３の成熟Ｎ末端を形成する。この反応はＮＳ２／３前駆体分子自体によって自
己触媒される。

【０００６】ＮＳ２／３プロテアーゼの自己触媒的活性はＨＣＶの複製に必須であると考え
られており（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４２０４６−２０５１）、従って、ＨＣＶ感染の治療において重要な治療ターゲ
ットを表す可能性が高い。

【０００７】ＮＳ２／３の正確な開裂メカニズムは未解明であるが、ＮＳ２／３のタンパク
質分解活性によって触媒される分子内の同時翻訳的な反応であるらしいことは解
っている（Ｗｕら，ＴＩＢＳ２３，９２−９４，１９９８）。ｉｎｖｉｔｒ
ｏ翻訳アッセイでは該活性がＺｎまたはＣｄのような金属イオンの添加によって
刺激されるので、該酵素は暫定的にメタロプロテアーゼに分類されている。ＮＳ
２／３前駆体が自己タンパク質分解活性、不溶性及び不安定性を有することが原
因でこの前駆体の研究は困難を極めていた。

【０００８】精製したＮＳ２／３プロテアーゼを使用するｉｎｖｉｔｒｏアッセイが文献
に報告されたことはない。プロテアーゼの不溶性と不安定性及びその自己触媒活
性がこのようなアッセイの開発の妨げになっていた。

【０００９】無細胞翻訳系及び形質転換細胞におけるＮＳ２／３プロテアーゼ活性はＧｒａ
ｋｏｕｉら（１９９３）ＰＮＡＳ９０，１０５８３−１０５８７及びＨｉｊｉ
ｋａｔａら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６７，４６６５−４６７５によって
記載されていた。これらの研究グループは、ＮＳ２／３プロテアーゼの開裂部位
がＨＣＶポリペプチドの残基１０２６と１０２７との間に存在することを知見し
、開裂が亜鉛依存性であることを証明した。Ｃｙｓ９９３及びＨｉｓ９５２が開
裂に必須であると決定され、また、活性には残基８２７から１１８６−１２０７
までの配列も必要であった。トランス開裂活性も同定された。これらの研究グル
ープはすべての研究を細胞または細胞抽出物で行った。

【００１０】Ｒｅｅｄら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，４１２７−４１３６は、細胞
ベースの系におけるＮＳ２／３プロテアーゼのトランス開裂活性及びトランス開
裂阻害を報告し、また、開裂反応の配列特異性を記載した。

【００１１】Ｐｉｅｒｏｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，６３７３−６３８０は
、無細胞翻訳系における潜在形態のＮＳ２／ＮＳ３前駆体の産生を記載し、また
、界面活性剤の添加によるその再活性化を記載した。しかしながら、記載された
系は精製された酵素を含んでいなかった。

【００１２】ＮＳ２／３部位の開裂には、（そのセリンプロテアーゼ活性をもたない）ＮＳ
３プロテアーゼドメイン及びＨＣＶＮＳ２／３前駆体の残基８１０を起点とす
るＮＳ２タンパク質の双方が必要である。ＮＳ２の最初の１００個以下の残基は
極めて疎水性であり、感染細胞のＥＲ膜に会合するであろう。この疎水性部分が
タンパク質の難溶性の原因である。Ｎ末端領域が残基９２３まで欠失すると活性
が消滅することが判明した。

【００１３】本文中に記載したような実験的処理及びその検討を根拠として、様々な局面で
本発明は、９０３−９１３の範囲に含まれる１つの残基、即ち、残基９０３、９
０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２また
は９１３を起点とし、残基１２０６、残基１６５７または１２０６−１６５７の
範囲に含まれる１つの残基で終結するＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドが得
られたことに基づく。

【００１４】意外にもこれらの欠損ポリペプチドは、全長プロテアーゼの自己タンパク質分
解活性を維持しているが、自己開裂を生じることなく前駆体形態で精製処理し得
る。更に、自己タンパク質分解活性の原因はポリペプチドのダイマー形態である
ことが判明した。従って、活性ポリペプチドはダイマー化して自己タンパク質分
解活性を生じ得る。

【００１５】活性前駆体分子が得られたことによって、ＮＳ２／３前駆体の自己タンパク質
分解活性を調節、特に阻害できる薬剤、従ってＨＣＶの治療に有効性を発揮し得
る薬剤のアッセイ及びスクリーニング方法が得られる。

【００１６】本発明は様々な局面で、自己タンパク質分解活性を有しており自己開裂するこ
となく不活性形態で発現されることができ、後で活性化され得るポリペプチドを
提供する。ポリペプチドの自己タンパク質分解性形態はホモダイマーであろう。

【００１７】本発明は、残基９０３と９１３との間にＮ末端境界を有しており、残基１２０
６と１６５７との間（両端を含む）にＣ末端境界を有しているポリペプチドまた
はポリペプチドフラグメントを提供する。従って、ポリペプチドまたはポリペプ
チドフラグメントは、Ｃ末端に欠損があってもよく、または完全ＮＳ３配列を含
んでいてもよい。好ましくは、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントが
、ＮＳ３の完全プロテアーゼドメインを含む。好ましい実施態様では、Ｃ末端境
界が残基１２０６に存在する。

【００１８】本文中で使用したＨＣＶポリタンパク質配列及び該配列中の残基という用語は
、以下のデータベースから得られる１つまたは複数のＨＣＶポリタンパク質配列
を意味する：ＨＣＶＪ株ポリタンパク質、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔＡｃｃＮｏ
：Ｐ２６６６２；ＨＣＶＨ株ポリタンパク質、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔＡｃｃ
Ｎｏ：Ｐ２７９５８；Ｈ７７株ポリタンパク質、Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ−Ｇｅｎ
ｂａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＢ６６３２４またはＴＲＥＭＢＬＡｃｃ．Ｎｏ
．０３６５７９。しかしながら、別のＨＣＶ株及び遺伝子型の単離物も本発明に
使用し得る。

【００１９】ＨＣＶ単離物は、Ｔｏｋｉｔａ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９
６）７７，２９３−３０１及びＭｙａｋａｗａ，Ｙ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ（１９９５）１，２０−２５に記載されているような１ａ、
１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、
３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、５ａ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、
８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａまたは１１ａ遺伝子型のＨＣＶに由来してもよ
く、または、Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９９３）９０，１０５８３−１０５８７に記載されているようなＨ−ＦＤ
Ａ、Ｈ−ＡＰ、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ６、ＨＣＶ−
Ｔ、ＨＣ−Ｊ８またはＨＣＶ−ＪＴ株のＨＣＶに由来してもよい。

【００２０】本発明はまた、残基９０３、９１３またはこれらの残基間に位置する１つの残
基を起点とし残基１２０６、１６５７またはこれらの残基間に位置する１つの残
基で終結するアミノ酸配列から本質的に構成されたポリペプチドまたはポリペプ
チドフラグメントを提供する。従って、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグ
メントはＣ末端に欠損があってもよくまたは完全ＮＳ３配列を含んでいてもよい
。好ましくはポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントがＮＳ３の完全プロ
テアーゼドメインを含む。

【００２１】ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは例えば、ＨＣＶポリタンパク
質の残基９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、
９１１、９１２または９１３にＮ末端境界を有しており、残基１２０６と残基１
６５７との間（両端を含む）、例えば残基１２５０、１３００、１３５０、１４
００、１４５０、１５００、１５５０、１６００または１６５０にＣ末端を有し
得る。

【００２２】ポリペプチドは、単離及び／または精製された形態、別のポリペプチドのよう
な会合物質を含まないかまたは実質的に含まない形態、あるいは、（例えば原核
細胞中で発現することによって産生したときは）天然型グリコシル化の欠如した
形態、例えば非グリコシル化形態でよい。

【００２３】本発明はまた、アミノ酸配列の変異体、誘導体または突然変異体から成るポリ
ペプチドを提供する。変異体、誘導体または突然変異体から成るポリペプチドは
、ＨＣＶポリタンパク質（例えば前出のＳｗｉｓｓｐｒｏｔＡｃｃＮｏ：Ｐ
２６６６２）の対応する配列に比べて１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、
欠失及び挿入に起因する違いを有しているがダイマー形態で自己タンパク質分解
活性を有しており、不活性形態で発現され後で活性化されることが可能なアミノ
酸配列を有している。

【００２４】アミノ酸配列は、残基２９３−７５４から成り、天然型ＨＣＶプロテアーゼの
残基９０３と９１３との間（両端を含む）を起点とし残基１２０６と１６５７と
の間（両端を含む）で終結する配列に対応する。より好ましくは配列は、残基２
９３−３０３から成り、これは天然型ＨＣＶプロテアーゼの残基９０３と９１３
との間（両端を含む）を起点とし残基１２０６まで伸びる配列に対応する。

【００２５】ＨＣＶポリタンパク質配列の対応する領域のアミノ酸配列の変異体、誘導体ま
たは突然変異体であるポリペプチドは、ＨＣＶＮＳ２／３ポリタンパク質のア
ミノ酸配列に対して約６０％を上回る類似性、約７０％を上回る類似性、約８０
％を上回る類似性、約９０％を上回る類似性、約９５％を上回る類似性を有する
か、または実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。アミノ酸類似性は一般に、
上記のようなＧＡＰアルゴリズム（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒ
ｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＴＢＬＡＳＴＮプログラムに基づいて
定義される。類似性は、“保存性変異”、即ち、イソロイシン、バリン、ロイシ
ンもしくはメチオニンのような１つの疎水性残基が別の疎水性残基で置換される
こと、または、１つの極性残基が別の極性残基で置換されること、例えば、リシ
ンがアルギニンで、アスパラギン酸がグルタミン酸で、アスパラギンがグルタミ
ンで置換されることを許容する。アミノ酸配列の特定の変異体は、本文中に記載
の配列に比べて、１、２、３、４、５−１０、１０−２０、２０−３０、３０−
５０、１００−１５０、または１５０よりも多いアミノ酸の挿入、付加、置換ま
たは欠失から成る違いを有し得る。

【００２６】本文中に示した適正配列の全長に対して配列比較を行うとよい。

【００２７】アミノ酸レベルの相同性が一般的にアミノ酸の類似性または一致として表され
ることは了解されるであろう。類似性は、“保存性変異”、即ち、イソロイシン
、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１つの疎水性残基が別の疎水性
残基で置換されること、または、１つの極性残基が別の極性残基で置換されるこ
と、例えば、リシンがアルギニンで、アスパラギン酸がグルタミン酸で、アスパ
ラギンがグルタミンで置換されることを許容する。相同性は２０、３０、４０、
５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００個の連続ヌク
レオチドまたはアミノ酸の配列の全長または一部について測定する。２つのヌク
レオチド配列は配列比較に基づいて“相同性”を有すると言われるかまたは“相
同である”と言われる。系統的な縁故関係は相同性に重要でない。ヌクレオチド
配列間の相同性を問題にするときに進化上の起源を全く考察しないことは当業者
の常識である。相同な２つのヌクレオチド配列はまた、“類似”である、即ち、
あるパーセンテージの類似またはあるパーセンテージの一致を有しているといっ
てもよい。

【００２８】一般的に、２つのヌクレオチド配列が互いにどの程度相同であるかを決定する
ために種々の標準アルゴリズムのうちのどれを使用するかということは特に重要
な問題ではない。好ましいアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃ
ｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８，４４３−４５３）の位置合せ法
を使用し、ＰｒｏｇｒａｍＭａｎｕａｌまたはＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋ
ａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に含まれているＧＡＰであろう。
否定の指示がないときは、位置合せを最大にするために、デフォルトパラメータ
ーをギャップ作成ペナルティ＝１２及びギャップ拡大ペナルティ＝４で使用する
ことを当業者は理解している。

【００２９】類似性もしくは相同性（これらの用語は互換的に使用されている）または一致
は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−
１０のＴＢＬＡＳＴＮプログラム、または、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇ
ｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１９９４（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ５３７１１）の
一部であるＢｅｓｆＦｉｔによって定義及び決定され得る。好ましくは、ＦＡＳ
ＴＡ及びＦＡＳＴＰ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８３：６３−９８参照）を使用して配
列比較を行う。パラメーターはデフォルトマトリックスを使用して以下のように
設定するのが好ましい。ギャップ開設（ギャップ内の第一残基のペナルティ）：
タンパク質では−１２／ＤＮＡでは−１６；ギャップ拡大（ギャップ内の追加残
基のペナルティ）：タンパク質では−２／ＤＮＡでは−４；ＫＴＵＰ語長：タン
パク質では２／ＤＮＡでは６。

【００３０】核酸配列の相同性は緊縮性条件下の分子間の選択的ハイブリダイゼーションに
よって測定するとよい。

【００３１】予備実験は低緊縮性条件下のハイブリダイゼーションによって行う。プロービ
ングのために好ましい条件は、陽性であると同定され以後の研究対象となり得る
少数のハイブリダイゼーションが単純なパターンで存在するために十分に緊縮な
条件である。

【００３２】ハイブリダイゼーションは例えば、５×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５Ｍの塩化ナ
トリウム；０．１５Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７）、５×デンハルト試薬、
０．５−１．０％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡフラグメン
ト、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び５０％以下のホルムアミドから成る
ハイブリダイゼーション溶液を使用してＳａｍｂｒｏｏｋら（後出）の方法に従
って行う。３７−４２℃でハイブリダイゼーションを少なくとも６時間継続する
。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下の順序で洗浄する：（１）２×
ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、
室温で１５分間；（３）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分−１時間
；（４）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、３０分毎に溶液を交換しながら４２−６
５℃で２時間。

【００３３】特定の配列相同性をもつ核酸分子間のハイブリダイゼーションを得るために必
要な緊縮性条件の計算に常用の公式は（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３
（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の＃ｂｐである。

【００３４】上記公式の代表例では、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミド
、ＧＣ含量４２％、平均プローブサイズ２００塩基を使用し、Ｔ_ｍは５７℃であ
る。二重鎖ＤＮＡのＴ_ｍは相同性が１％減少する毎に１−１．５℃低下する。従
って、約７５％を上回る配列一致をもつターゲットは４２℃のハイブリダイゼー
ション温度で観察されるであろう。このような配列は本発明の核酸配列に実質的
に相同であると考えられよう。

【００３５】陽性クローンが数個しか残存しないようになるまでハイブリダイゼーションの
緊縮性を次第に強化することは当業界で公知である。別の適当な条件として、例
えば約８０−９０％一致する配列を検出するためには、０．２５ＭのＮａ_２ＨＰ
Ｏ_４，ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２℃で一夜
ハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で最終
洗浄する。約９０％を上回る一致をもつ配列の検出に適当な条件は、０．２５Ｍ
のＮａ_２ＨＰＯ_４，ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、
６５℃で一夜のハイブリダイゼーション、及び、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ中、６０℃の最終洗浄を含む。

【００３６】当業者は、例えばコーディング核酸から発現させることによって大量のポリペ
プチドを産生させるために、本文中に記載の技術及び当業界で公知の別の技術を
使用し得る。

【００３７】本発明の別の局面によれば、上記のようなアミノ酸配列をもつポリペプチドを
コードする核酸配列を有している核酸分子が提供される。

【００３８】コーディング配列はＨＣＶＮＳ２／３遺伝子のコーディング配列（ＨＣＶ
Ｊ株、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｄ９０２０８；ＨＣＶＨ株、Ｇｅｎｂ
ａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６７４６３；ＨＣＶＨ７７株、ＧｅｎｂａｎｋＡ
ｃｃ．ＡＦ００９６０６）でもよく、または、この配列の突然変異体、変異体、
誘導体でもよい。これらの配列はＨＣＶＮＳ２／３ヌクレオチド配列に比べて
違いを有しており、この違いは、配列の１つまたは複数のヌクレオチドの付加、
挿入、欠失及び置換が１つまたは複数存在するという変化によって生じる。ヌク
レオチド配列の変化はタンパク質レベルでアミノ酸変化を生じることも生じない
こともある。アミノ酸変化の有無は遺伝コードによって決まる。

【００３９】従って本発明の核酸は、ＨＣＶＮＳ２／３の核酸配列とは異なる配列であり
ながら同じアミノ酸配列のポリペプチドをコードしている配列を包含する。

【００４０】一般に、本発明の核酸は、単離物として、単離及び／または精製された形態で
、または、核酸が天然に会合している物質を含まないかもしくは実質的に含まな
い形態で、例えば、場合によっては１つまたは複数の発現調節配列を含む以外は
ウイルスゲノム中で遺伝子にフランキングしている核酸を含まないかもしくは実
質的に含まない形態で提供される。核酸は完全合成でも部分合成でもよく、ゲノ
ムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡでもよい。本文中に示したコーディング配列は
ＤＮＡ配列である。本発明の核酸がＲＮＡを含む場合、このＲＮＡ配列に関する
記載は、ＴがＵで置換された等価のＲＮＡに関する記載を包含することを理解さ
れたい。

【００４１】核酸は複製可能ベクターの一部として提供されてもよく、従って本発明はまた
、上記のような核酸を含むベクター、特にコードされたポリペプチドを適当な条
件下で発現させ得る発現ベクターを提供し、更に、このようなベクターまたは核
酸を含む宿主細胞を提供する。この場合の発現ベクターという用語は、有益なポ
リペプチドをコードしている核酸と、ｉｎｖｉｔｒｏ発現系例えば網状赤血球
溶解液あるいはｉｎｖｉｖｏ発現系例えばＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞のよ
うな真核細胞または大腸菌のような原核細胞中でポリペプチドを発現させるため
の適当な調節配列とを含む核酸分子を意味する。本発明の別の目的は上記のよう
なベクターを含む細胞を提供することである。

【００４２】一般に、本発明の核酸は、単離物として、単離及び／または精製された形態で
、または、核酸が天然に会合している物質を含まないかもしくは実質的に含まな
い形態で、例えば、場合によっては１つまたは複数の発現調節配列を含む以外は
（例えばウイルス）ゲノム中で遺伝子にフランキングしている核酸を含まないか
もしくは実質的に含まない形態で提供される。核酸は完全合成でも部分合成でも
よく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡでもよい。

【００４３】当業者は、本文中に示した情報及び参考文献と当業界で公知の技術とを使用し
て本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を容易に作製し得る（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９及
びＡｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９２）
。これらの技術は、（ｉ）例えばゲノムソースからこれらの核酸のサンプルを増
幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、また
は、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の作製、などを含む。ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは当業者に公知の任意の適当な方法で作製及び使用され得る。例えば、コー
ディングＤＮＡを採取し、発現させる部分の両側の適当な制限酵素認識部位を同
定し、該部分をＤＮＡから切り出す。次いで、該部分を標準的な市販の発現系中
で適当なプロモーターに作動可能に結合させる。別の組換え方法では、ＤＮＡの
適正部分を適当なＰＣＲプライマーによって増幅させる。

【００４４】核酸配列の修飾は、例えば核酸の発現に使用した宿主細胞中のコドン優先度を
配慮し、修飾ポリペプチドに導く部位特異的突然変異誘発を使用して行ってもよ
い。

【００４５】本発明の核酸配列の発現を得るためには、核酸の発現をコントロールすべく核
酸に作動可能に連結された１つまたは複数のコントロール配列を有しているベク
ターに核酸配列を組込むとよい。ベクターは、プロモーター配列、ターミネータ
ーフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子など
の適当な調節配列を含み、また、別の配列、例えば、ポリペプチドまたはペプチ
ドを融合物として産生させる核酸配列及び／または宿主細胞中で産生されたポリ
ペプチドを細胞から分泌する分泌シグナルをコードする核酸を適宜含むように選
択または構築される。ベクターは適宜、プラスミド、ウイルス例えばファージ、
またはファージミドでよい。より詳細な部分については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ：２ｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照するとよい。例えば、核
酸構築物の作製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞内導入と遺伝子発現及
びタンパク質の分析などにおける核酸の操作に関して公知の多くの技術及びプロ
トコルがＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。

【００４６】次に、ベクターを機能性に維持し得る宿主細胞をベクターによって形質転換さ
せ、宿主細胞を培養してポリペプチドを産生させ、宿主細胞または周囲媒体から
ポリペプチドを回収し得る。

【００４７】本発明の別の目的は本文中に開示したような異種核酸を含む宿主細胞を提供す
ることである。

【００４８】様々の異なる宿主細胞中でポリペプチドをクローニング及び発現する系は公知
である。適当な宿主細胞は、細菌、哺乳類及び酵母のような真核細胞、並びに、
バキュロウイルス系である。異種ポリペプチドを発現させるために当業界で利用
し得る哺乳類細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞
、ベビーハムスタ−腎細胞、ＣＯＳ細胞及び他の多くの細胞がある。常用の好ま
しい細菌宿主は大腸菌である。

【００４９】本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組込まれる。ゲノムとの
組換えを促進する配列を標準技術で取込ませることによって組込みを促進し得る
。核酸は細胞内部の染色体外ベクターに存在してもよく、あるいは、別のやり方
で同定可能な細胞に異種または外来の核酸であってもよい。

【００５０】本発明の別の目的は、本発明の核酸分子を宿主細胞に導入する方法を提供する
ことである。（特にｉｎｖｉｔｒｏ導入の場合）導入は非制限的に“形質転換
”と総称され、導入には利用可能な任意の技術を使用し得る。真核細胞の場合、
適当な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、及び、レトロウイルスま
たはその他のウイルス例えばワクシニアウイルスを使用する形質導入である。昆
虫細胞にはバキュロウイルスを使用する。細菌細胞の場合には、適当な技術は、
塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、バクテリオファージを使用するトランスフ
ェクションである。代替方法として、核酸の直接注入も使用できる。

【００５１】抗生物質抵抗性または感受性の遺伝子のようなマーカー遺伝子は、当業界で公
知のように、目的の核酸を含むクローンを同定するために使用し得る。

【００５２】導入後、例えば、宿主細胞（この細胞は実際に形質転換された細胞でもよいが
より多くの場合に形質転換細胞の後代細胞である）を遺伝子発現条件下で培養す
ることによって核酸の発現を惹起または許容し、コードされたポリペプチドを産
生させる。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合されて発現し
たときは、ポリペプチドが細胞から培養培地に分泌され得る。発現によってポリ
ペプチドを産生させた後、ポリペプチドを場合に応じて宿主細胞及び／または培
養培地から単離及び／または精製し、次いで所望の用途に、例えば、１つまたは
複数の追加成分を含む組成物、例えば１種または複数の医薬として許容される賦
形剤、ビヒクルまたは担体（後記参照）を含む医薬組成物に配合するために使用
し得る。

【００５３】上記の観点から本発明はまた、本発明の欠失ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ
ポリペプチドの製造方法を提供する。方法は、ポリペプチドをコードする核酸か
ら発現させる段階を含む。簡便な発現方法としては、自己タンパク質分解作用を
最小に抑制しながらＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの発現を惹起
または許容する適当な条件下で培養することによって核酸を含む宿主細胞を増殖
させる。好ましい条件は、Ｚｎ欠失培地または低Ｚｎ培地を含む。これによって
前駆体分子のＮＳ３部分のフォールディングが阻害され、そのためオートプロセ
シングが妨害され、不溶性タンパク質の形成が促進されて封入体として蓄積する
。

【００５４】封入体として発現された不溶性タンパク質の精製方法は当業者に公知である。
簡便な方法としては、ゲル濾過を変性条件下で使用し、次いで逆相クロマトグラ
フィー処理する。

【００５５】変性した精製タンパク質は、精製後にリフォールディング可能な条件に調整す
ることによって再生し得る。再生は、カオトロピック試薬（グアニジン）濃度を
透析によって０．７５Ｍの残留濃度に低下させ、イオン強度が２００ｍＭのＮａ
Ｃｌを上回る値であり、タンパク質濃度が１００μｇ／ｍｌ未満の値であるよう
なリフォールディングバッファ中で行うのが好ましい。再生した可溶性タンパク
質は、再生サンプルの限外濾過後の上清を分析することによって測定し得る。

【００５６】再生した可溶性タンパク質は、バッファ条件を変更することによって活性化し
得る。プロテアーゼを活性化する適当なバッファは以下の要素を含む：イオン強度は少なくとも５０ｍＭ、好ましくは少なくとも１００ｍＭまたは少な
くとも１５０ｍＭのＮａＣｌに等価、例えば２００ｍＭ、２５０ｍＭまたは３０
０ｍＭのＮａＣｌ；１０−６０％のグリセロール、好ましくは２０−５０％のグリセロール、例えば
３０％、４０％または５０％のグリセロール；０．５％−３％のＣＨＡＰＳ、好ましくは１−２％のＣＨＡＰＳ、例えば１％、
１．５％または２％のＣＨＡＰＳ；ｐＨ６．５−８．５、好ましくはｐＨ７−８、例えばｐＨ７、７．５または８；
１−１００ｍＭの還元剤（システインまたはＤＴＴ）、好ましくは１−１０ｍＭ
の還元剤、例えば１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの還元剤；１−１００μＭのＺｎ^＋＋、好ましくは５−５０μＭのＺｎ^＋＋、例えば３０μ
Ｍ、４０μＭまたは５０μＭのＺｎ^＋＋。

【００５７】１つの活性化方法では、５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、５０％グリセロール、
２％ＣＨＡＰＳ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＤＴＴ、３０μＭのＺｎ^＋＋を含有するバッファ中のタンパク質濃度を２．５μｇ／ｍｌ以下に減少させる（
実施例７参照）。

【００５８】様々な局面で本発明の目的は、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節
、例えば、阻害、抑制または干渉する物質のスクリーニング及び／または作製／
同定に役立つアッセイ及び方法を提供することであり、これらのスクリーニング
方法及びアッセイに本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを使
用することである。プロテアーゼの活性はダイマー化の促進または阻害によって
調節し得る。

【００５９】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節し得る薬剤を同定するスクリー
ニングまたはアッセイ方法は、（ａ）被験薬剤を本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに接触
させる段階と、（ｂ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ活性を測定する段階とから成る。

【００６０】被験薬剤に接触させるＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドはモノマ
ー形態でもダイマー形態でもよい。ポリペプチドがモノマーのとき、被験薬剤は
ダイマー形態の形成を調節するかまたはダイマーのタンパク質分解活性を調節す
るかまたは双方を調節し得る。ポリペプチドがダイマーのとき、被験薬剤はモノ
マー形態の形成を調節するかまたはダイマーのタンパク質分解活性を調節するか
または双方を調節し得る。

【００６１】ダイマー形態またはモノマー形態の形成の調節は、２つの形態間の動的平衡に
影響を及ぼすことによって行う。

【００６２】スクリーニングまたはアッセイ方法は更に、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ
を活性化する段階を含み得る。この活性化はバッファ条件を変更することによっ
て得られる。

【００６３】本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドはホモダイマーを形成
し得るので、ポリペプチドのダイマー化に影響を与える薬剤は自己タンパク質分
解活性を調節し得る。

【００６４】本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性は、活性ダイマ
ー形態中のポリペプチドの割合を算定することによって測定できる。

【００６５】従って、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節し得る薬剤を同定する
スクリーニングまたはアッセイ方法は、（ａ）被験薬剤を本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに接触
させる段階と、（ｂ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダイマー化を測定する段
階とから成る。

【００６６】ダイマー化は当業界で公知の標準方法、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー
、抗体、または、タンパク質濃度に対する開裂速度の依存度、などを使用して測
定し得る。

【００６７】これに関連した本発明の目的は、被験サンプル中で天然型ＨＣＶＮＳ２／３
プロテアーゼの活性を調節する能力をもつ薬剤の存在を測定するために本発明の
ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを使用することである。

【００６８】被験サンプル中で天然型ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能
力をもつ薬剤の存在を測定する方法は、（ａ）被験サンプルを本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに
接触させる段階と、（ｂ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性を測定する段階とから成る。

【００６９】該方法は更に、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを活性化する段
階を含み得る。この活性化はバッファ条件を変更することによって得られる。

【００７０】ポリペプチドの活性化は、ポリペプチドのホモダイマー形成の促進であっても
よい。

【００７１】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節し得る薬剤が活性ダイマー形態
の形成に影響を及ぼしてもよい。

【００７２】被験サンプル中でＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのダイマー化を調節する能
力をもつ薬剤の存在を判定する方法は、（ａ）被験サンプルを本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに
接触させる段階と、（ｂ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ活性を測定する段階とから成る。

【００７３】被験物質の存在下の活性を、被験物質の非存在下の同等の反応媒体中及び反応
条件下のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性に比較するとよい
。これによって活性を調節し得る被験物質を同定し得る。処理した状態及び未処
理の状態のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性の差が、（１つ
または複数の）適正な被験物質の調節作用の指標となる。活性はポリペプチドの
ダイマー化の程度に関連し得る。

【００７４】適正な被験物質は本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダ
イマー化を操作する（即ち減少または増加させる）ことによって調節作用を果た
し得る。調節作用の存在は、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダ
イマー化を算定することによって判定し得る。

【００７５】被験サンプル中でＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのダイマー化を調節する能
力をもつ薬剤の存在を判定する方法は、（ａ）被験サンプルを本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに
接触させる段階と、（ｂ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダイマー化を測定する段
階とから成る。

【００７６】活性は任意の適当な方法で測定し得る。このような方法の例としては、ＨＰＬ
Ｃに基づく方法があり、活性化酵素を一定時間インキュベートし、ＨＰＬＣカラ
ムで未開裂の前駆体を産生物から分離し、蛍光によって測定した産生物の量を活
性に関連付ける。別の方法では、５′タグを用いてＮＳ３開裂産物をＮＳ２／３
前駆体及びＮＳ２産生物から分離し、ＮＳ３の量を標準的な蛍光定量アッセイま
たは放射測定アッセイによって定量する。

【００７７】被験サンプル中でＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力をも
つ薬剤の存在を判定する方法は、本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリ
ペプチドの活性の定量及び／またはサンプル中の該薬剤の量の測定及び／または
ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダイマー化の量の測定を含み得
る。

【００７８】本文中に記載のアッセイ及び方法では１つまたは複数の対照を適宜使用し得る
。当業者は適当な対照を容易に使用できよう。

【００７９】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節、例えば増加もしくは増強する
薬剤は、陽性被験薬剤の非存在下では活性が破壊または減少する条件を使用して
同定し得る。

【００８０】被験サンプル中でＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力をも
つ薬剤の存在を判定し場合によってはその量を定量する方法は、診断目的、例え
ば、ＨＣＶ感染に付随する疾患を治療する治療方法を評価する目的で使用し得る
。

【００８１】スクリーニングまたはアッセイ方法は、被験物質（例えば、ＨＣＶプロテアー
ゼ活性を調節する能力が試験される薬剤）を混合物または抽出物から精製及び／
または単離する段階、即ち、混合物または抽出物の少なくとも１つの成分、例え
ば被験物質に天然に会合している成分の含量を減少させる段階を含み得る。スク
リーニングまたはアッセイ方法は、被験混合物または抽出物の１つまたは複数の
画分が有しているＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ活性調節能力を測定し得る。
精製及び／または単離には当業者に公知の任意の方法を使用し得る。

【００８２】本発明のスクリーニングまたはアッセイ方法のいずれかの詳細なフォーマット
は当業者が平均的な技能及び知識を用いて変更し得る。当業者は適当な対照実験
を使用する必要があることも熟知している。

【００８３】本発明の任意のアッセイ方法において、本発明のアッセイに加える被験物質ま
たは化合物の量は通常は、使用される化合物の種類に基づいて試行錯誤で決定す
る。推定される調節／阻害化合物を典型的には、約０．００１ｎＭ−１ｍＭまた
はより高い濃度、例えば０．０１ｎＭ−１００μＭ、例えば約１０μＭのような
０．１−５０μＭの濃度で使用する。被験物質がペプチドであるときは、より高
い濃度も使用し得る。弱い作用をもつ分子であっても以後の研究開発に役立つ先
導的化合物になり得る。

【００８４】本発明方法のいずれかによって同定される化合物または薬剤は単離及び／また
は精製及び／または更に研究及び／または製造され得る。このような化合物につ
いて種々の方法及び使用を本文中の別の箇所で検討した。従って本発明は、ＨＣ
ＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力をもつ薬剤の同定方法を提供
する。

【００８５】本発明方法に使用される薬剤または物質は天然または合成の化学的化合物でよ
く、有機、無機、ペプチド、核酸またはその他の分子でよい。スクリーニングさ
れる適当な化合物としては薬剤スクリーニングプログラムで使用される天然また
は合成の化学的化合物がある。特性が決定されたかまたは未決定の幾つかの成分
を含む植物エキス、微生物またはその他の生物も使用し得る。

【００８６】組合せライブラリー技術が潜在的に膨大な数の種々の物質についてそれらの相
互作用調節能力を試験する効率的な方法を提供することは注目に値する。あらゆ
る種類の天然産物、特に小分子及びペプチドに関するこのようなライブラリー及
びそれらの使用は当業界で公知である。幾つかの状況ではペプチドライブラリー
の使用が好ましい。

【００８７】推定されるモジュレーターの１つのクラスは、本発明のＨＣＶＮＳ２／３プ
ロテアーゼポリペプチドに由来のペプチドフラグメントまたはこのようなフラグ
メントの対立遺伝子、突然変異体もしくは誘導体を含む。開裂が生じたポリペプ
チドの領域または活性の原因となるポリペプチドの領域の５−４０個のアミノ酸
、例えば６−１０個のアミノ酸から成るペプチドフラグメントについて自己タン
パク質分解阻害能力を試験し得る。

【００８８】別の適当なペプチドは、５０−５５、５５−６０、６０−６５、６５−７０、
７０−７５、７５−８０、８０−８５、８５−９０、９０−９５、９５−１００
アミノ酸の長さまたは１００よりも多いアミノ酸から成る長さを有しており本発
明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性を調節するペプチドで
ある。

【００８９】別の適当なペプチドは、５０−５５、５５−６０、６０−６５、６５−７０、
７０−７５、７５−８０、８０−８５、８５−９０、９０−９５、９５−１００
アミノ酸の長さまたは１００よりも多いアミノ酸から成る長さを有しており本発
明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドのダイマー化を阻害するペプ
チドである。

【００９０】このようなフラグメントをコードする核酸、このような核酸を含むベクター及
び宿主細胞、このようなフラグメントをコードしている核酸を発現させる方法は
本発明の別の局面である。

【００９１】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの三次元構造のモデル化、並び
に、特定の分子形状、サイズ及び電荷特性をもつ有力な阻害化合物を提供する合
理的なドラッグデザインの使用に基づいて阻害化合物の別の候補を得ることもで
きよう。

【００９２】プロテアーゼ活性を調節するかまたは該活性に作用する物質を同定した後、該
物質をより詳細に試験し得る。その後で、該物質が医薬品、製剤または原薬のよ
うな組成物の製造、即ち製薬または製剤化の目的で製造及び／または使用できる
ようになる。また、該物質が個体に投与できるようになる。

【００９３】様々な局面で本発明は、本発明のスクリーニング方法によって同定されたモジ
ュレーター、例えば、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を阻害または削減
するか、増進または強化する物質を提供する。

【００９４】モジュレーターは同定された後、精製されてもよく及び／またはより詳細に研
究されてもよく及び／または製造されてもよい。例えば本文中で説明した当業界
で公知の方法によってペプチジルまたは非ペプチジルの模擬体を得るためにモジ
ュレーターを使用してもよい。以下に説明するような治療的情況でモジュレータ
ーを使用してもよい。

【００９５】本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに対する抗体は別のク
ラスの推定される阻害化合物を形成する。阻害抗体候補を特性決定しそれらの結
合領域を決定することによって、プロテアーゼ活性に作用する一本鎖抗体及びそ
のフラグメントを提供し得る。

【００９６】抗体は当業界の標準的な技術を使用して得られる。抗体の産生方法では、哺乳
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を本
発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドで免疫感作する。当業界で
公知の種々の技術のいずれかを使用して免疫動物から抗体を採取し、本発明のＨ
ＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを使用してＨＣＶＮＳ２／３活性
の調節に基づいて抗体をスクリーニングする。例えば、ウェスタンブロット法ま
たは免疫沈降を使用し得る（Ａｒｍｉｔａｇｅら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３
５７：８０−８２）。動物を殺す段階を伴って、動物から抗体及び／または抗体
産生細胞を単離する。

【００９７】ペプチドによる哺乳動物の免疫感作に代替してまたは付加して、例えば、表面
に機能性免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージまたは糸
状バクテリオファージを使用し、組換えによって産生した発現免疫グロブリン可
変ドメインライブラリーから本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプ
チドに特異的な抗体を得ることも可能である。例えば国際特許ＷＯ９２／０１０
４７参照。該ライブラリーは、本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペ
プチド（またはそのフラグメント）で免疫感作していない生物から得られた配列
から構築される天然型でもよく、または、目的の抗原に接触した生物から得られ
た配列を使用して構築されたライブラリーでもよい。抗体候補は、ＮＳ２／３プ
ロテアーゼポリペプチドを使用しＨＣＶＮＳ２／３活性の調節に基づいてスク
リーニングし得る。

【００９８】本発明の抗体は種々の方法で修飾され得る。実際、“抗体”という用語が、必
要な特異性の結合ドメインをもつ任意の結合物質を包含することを理解されたい
。従って本発明は、抗体のフラグメント、誘導体、機能等価物、及び、抗体ホモ
ローグを包含しており、抗体ホモローグとしては、合成分子、抗体の形状を模倣
した形状であるため抗原またはエピトープに結合できる分子がある。

【００９９】抗原またはその他の結合相手に結合し得る抗体フラグメントの例は、ＶＬ、Ｖ
Ｈ、Ｃ１及びＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント、ＶＨ及びＣＨ１ドメ
インから成るＦｄフラグメント、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから
成るＦｖフラグメント、ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ
領域及びＦ（ａｂ′）２フラグメント、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって
結合された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、である。一本鎖
Ｆｖフラグメントも包含される。

【０１００】本発明によるモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマは、遺伝的突然
変異またはその他の変化を生じ得る。原抗体の特異性を維持している別の抗体ま
たはキメラ分子を産生させるためにモノクローナル抗体を組換えＤＮＡテクノロ
ジーの技術で処理できることも当業者には理解されよう。このような技術では、
１つの抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコード
するＤＮＡを別の免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋骨格領域に導入す
る。例えば、欧州特許ＥＰ１８４１８７Ａ、英国特許ＧＢ２１８８６３８Ａまた
は欧州特許ＥＰ−Ａ−０２３９４００参照。キメラ抗体のクローニング及び発現
は欧州特許ＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載され
ている。

【０１０１】所望の結合特性をもつ抗体を産生し得るハイブリドーマは本発明の範囲に包含
される。また、抗体（抗体フラグメントを含意）をコードする核酸を含んでおり
該抗体を発現させ得る真核性または原核性の宿主細胞も本発明の範囲に包含され
る。本発明はまた、抗体が産生され好ましくは分泌される条件下で抗体を産生し
得る細胞を増殖させる段階から成る抗体産生方法を提供する。

【０１０２】抗体はまた、例えばポリペプチドのコーディング核酸から発現によって産生さ
れた後の本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを精製及び／ま
たは単離するために使用され得る。抗体は治療（予防も含意）的観点から、ＨＣ
Ｖの複製を阻害しこれによってＨＣＶ感染を抑制または防止する目的でＨＣＶ
ＮＳ２／３プロテアーゼの活性を破壊するために役立つであろう。抗体は例えば
細胞もしくは組織に微量注入するかまたは深在投与できる。抗体は本文中の別の
場所で説明した別の治療目的または非治療目的で本発明に従って使用され得る。

【０１０３】別の局面では本発明は、化合物のペプチドまたは非ペプチジル模擬体を設計す
る方法に本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの活性を調節し
得る薬剤を使用することを提案する。このような模擬体はＨＣＶＮＳ２／３プ
ロテアーゼの活性を調節する能力を有している。このような方法に使用される薬
剤が本発明方法を使用して同定された薬剤であってもよい。

【０１０４】本発明はまた、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのペプチドまたは非ペプチジ
ル模擬体を設計する方法に本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチ
ドを使用することを提案する。このような模擬体はＨＣＶＮＳ２／３プロテア
ーゼの活性を調節する能力を有している。

【０１０５】従って本発明は、本発明方法によってＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性
を調節する生物活性を有すると判定された化合物の模擬体を設計する方法、また
は、本発明方法によってＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する生物
活性を有すると判定された本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチ
ドの模擬体を設計する方法を提供する。該方法は、（ｉ）活性に重要な必須アミノ酸残基を決定するために生物活性を有する物質を
分析して薬作用発生団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を定義する段階と、（ｉｉ）生物活性を有する模擬体候補を設計及び／またはスクリーニングするた
めに薬作用発生団をモデル化する段階と、から成る。

【０１０６】適当なモデル化技術は当業界で公知である。このような技術によって本発明の
ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドと調節化合物との相互作用を研究
することができ、該相互作用を再現できるように編成された機能基を含む化合物
を設計し得る。

【０１０７】既知の医薬活性化合物の模擬体の設計は“先導的”化合物に基づく公知の医薬
開発方法である。活性化合物の合成が難しいかもしくは高コストになる場合また
は特定の投与方法に不適である場合にはこのような模擬体が望ましい。例えば、
ペプチドの形態である本発明の化合物は、消化管でプロテアーゼによって速やか
に分解されるので経口組成物の活性薬剤としては不適当である。

【０１０８】所与のターゲット特性を有する化合物から模擬体を設計する場合、幾つかの常
用段階が存在する。最初に、ターゲット特性を決定するために不可欠の及び／ま
たは重要な化合物の特定部分を決定する。この決定のためにペプチドの場合には
、ペプチド中のアミノ酸残基を、例えば各残基を順番に置換することによって系
統的に変更する。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は“薬作
用発生団”という呼称で知られている。

【０１０９】薬作用発生団が判明すると、例えば質量分析法、Ｘ線回折データ及びＮＭＲの
ような一連のソースから得られたデータを使用してその構造をその物理的特性、
例えば立体化学、結合、サイズ及び／または電荷に従ってモデル化する。このモ
デル化プロセスには、コンピューター解析、類似性マッピング（原子間の結合で
なく薬作用発生団の電荷及び／または体積をモデル化する）及びその他の技術も
使用できる。

【０１１０】上記方法の変形方法では、リガンドとその結合相手との三次元構造をモデル化
する。該方法は、リガンド及び／または結合相手が結合によってコンホメーショ
ン変化を生じる場合に特に有用である。模擬体設計中にこの変化を考慮に入れて
モデルを作製できるからである。

【０１１１】次に、薬作用発生団を模倣する化学基がグラフトできる鋳型分子を選択する。
鋳型分子及びこれにグラフトさせる化学基は、模擬体を容易に合成でき、薬理学
的に容易に許容され、ｉｎｖｉｖｏで分解しないが、先導的化合物の生物活性
を保持しているように選択されるのが都合がよい。この方法で見出された１つま
たは複数の模擬体を次に、ターゲット特性を有しているか否か、または、どの程
度までターゲット特性を示すかを判断するためにスクリーニングする。次いで、
更に最適化または修飾を行って、ｉｎｖｉｖｏ用または臨床試験用の１つまた
は複数の最終模擬体に到達できる。

【０１１２】本文中に記載の方法のいずれかによって見出された１つまたは複数の模擬体を
、これらがＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力を有している
か否かを判断する本発明のアッセイ方法に使用し得る。

【０１１３】本発明方法によって得られた模擬体は本発明のまた１つの目的を構成する。

【０１１４】本文中で使用した所定のアミノ酸配列の変異体という用語は、１つまたは複数
のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失及び置換が１回または複数回行われたことに
よって所定のアミノ酸配列に比べて１つまたは複数のアミノ酸残基が異なってい
るような配列を意味する。所定のアミノ酸配列に比べて１、２、３、４、５個ま
たはそれ以上のアミノ酸残基が例えば置換によって異なっていてもよい。

【０１１５】本文中に開示した配列を有している本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ
ポリペプチドのこのような変異体は、幾つかの実施態様では原配列と同じ長さで
もよくまたは原配列よりも短くてもよい。別の実施態様では、本発明のＨＣＶ
ＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチド（またはその変異体）は、特にＨＣＶＮ
Ｓ２／３プロテアーゼポリペプチドが異種または外来の配列に融合している場合
には、原配列よりも長いポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、特定のＨ
ＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドの天然型形態に異種の１、２、３、
４または５、１０、２０個またはそれ以上の追加のアミノ酸残基がＨＣＶＮＳ
２／３プロテアーゼポリペプチドの一端または両端に含まれていてもよい。

【０１１６】ポリペプチドの誘導体という用語は、結合相手に結合したポリペプチド、例え
ばエフェクター分子、ラベル、薬物、毒素及び／または担体もしくは輸送分子及
び／またはターゲッティング分子例えば抗体もしくはその結合フラグメントもし
くはその他のリガンドに結合したポリペプチドを意味する。ペプチジル及び非ペ
プチジルの双方の結合相手に結合させる技術は当業界で公知である。１つの実施
態様では、担体分子が、アンテナペディア（例えば“Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ”と
いう名称で販売されている）のホメオドメインに由来の１６アミノ酸のペプチド
配列である。これは末端Ｃｙｓ残基を介してペプチドに結合できる。“Ｐｅｎｅ
ｔｒａｔｉｎ”分子及びその特性は国際特許ＷＯ９１／１８９８１に記載されて
いる。

【０１１７】本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチド及び／またはペプチド
調節剤は全面的または部分的に、標準的な液相または好ましくは固相ペプチド合
成法のような確立された技術に従って化学合成によって作製し得る。このような
技術の全容は入手容易な多くの文献に記載されている（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅ
ｗａｒｔａｎｄＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉ
ｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）
，Ｍ．ＢｏｄａｎｚｓｋｙａｎｄＡ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，ＴｈｅＰｒａ
ｃｔｉｃｅｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８４）；及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ４３０ＡＵｓｅｒｓＭａｎｕａｌ，ＡＢＩＩｎｃ．，Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。または、液相法によって、もし
くは、固相、液相及び溶液化学の任意の組合せによって溶液中で作製してもよい
。

【０１１８】本発明は更に、多様な治療方法、及び、（ｉ）本発明方法によってＨＣＶＮ
Ｓ２／３プロテアーゼの活性を調節できると同定された化合物、（ｉｉ）ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節できる上記物質のいずれかの模擬体、か
ら選択された１つまたは複数の物質の使用を提案する。

【０１１９】治療的／予防的なこのような方法または使用の目的は、ＨＣＶＮＳ２／３プ
ロテアーゼの活性を調節、例えば破壊または干渉し、これによってＨＣＶの複製
を破壊し、その結果としてＨＣＶ感染を抑制または防止することである。

【０１２０】従って様々な別の局面では本発明は、医薬組成物、医薬品、薬物またはかかる
目的のその他の組成物、１つまたは複数のこのような物質を含む組成物を提供し
、医療方法におけるこのような物質の使用、このような物質または組成物を患者
に投与することから成る臨床症状例えばＨＣＶ感染に付随する症状の治療（予防
処置も含む）方法、このような目的例えばＨＣＶ感染に付随する症状を治療する
目的で投与する組成物、医薬品または薬物を製造するためのこのような物質の使
用、このような物質を医薬として許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体及び任
意にその他の成分と混合する段階を含む医薬組成物の製造方法、を提案する。

【０１２１】このような物質は単独活性薬剤として使用されてもよく、またはこのような物
質を相互に組合せてもしくは別の任意の活性物質と組合せて使用してもよい。

【０１２２】どの物質を本発明の医療方法に使用する場合にも、これらの物質が個体に効果
を表すに十分な“予防有効量”または“治療有効量”（場合によっては予防も治
療に含まれると考える）で投与されるのが好ましい。実際の投与量並びに投与の
速度及び時間クールは治療される症状の特質及び重篤度に従属するであろう。治
療の処方、例えば用量などの指示は一般開業医及びその他の医師の責任範囲であ
る。

【０１２３】１つの物質または組成物を単独で投与してもよくまたは治療すべき症状次第で
は同時にまたは順次に別の治療と併用してもよい。

【０１２４】本発明の医薬組成物及び本発明に従って使用される医薬組成物は、有効成分に
加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、バッファ、安定剤または当業者に
公知のその他の材料を含有し得る。このような材料に対しては無毒であること、
及び、有効成分の薬効を妨害してはならないことが要求される。担体または別の
材料の正確な特質は、投与経路が経口であるか注入例えば皮膚、皮下もしくは静
脈内への注入であるかに依存する。

【０１２５】経口投与される医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤または液剤の形態で
よい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含み得る。液状医
薬組成物は一般に、水、石油、動物または植物の油、鉱油または合成油のような
液体担体を含む。生理的塩類溶液、デキストロースもしくはその他の糖溶液、ま
たは、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのようなグリコールも
使用し得る。

【０１２６】静脈内、皮膚もしくは皮下に注入する場合または患部に注入する場合には、有
効成分が発熱物質非含有で適正なｐＨ、等張性及び安定性を有している非経口的
に許容される水溶液の形態であろう。適正な当業者は、例えば塩化ナトリウム注
射液、リンゲル注射液、乳酸化リンゲル注射液のような等張性ビヒクルを使用し
て適当な溶液剤を調製できる。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファ、抗酸
化剤及び／または別の添加剤を含有させ得る。

【０１２７】担体配合物にはリポソーム、特にカチオン性リポソームを使用するとよい。

【０１２８】上記の技術及びプロトコルの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．
（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。

【０１２９】物質または組成物は、所望の部位に局在的に投与してもよくまたは特定細胞を
ターゲットするようにデリバリーしてもよい。

【０１３０】ターゲッティング療法は、抗体または細胞特異的リガンドのようなターゲッテ
ィング系の使用によって活性物質をある種の細胞により特異的にデリバリーする
ために使用され得る。ターゲッティングが望ましい理由は多様であり、例えば、
薬剤が許容できない毒性を有していたり、ターゲッティングでなければあまりに
も高い用量が必要であったり、ターゲッティングでなければターゲット細胞に侵
入できなかったりする場合がある。

【０１３１】調節用物質がポリペプチドである場合にはこのような物質を直接投与する代わ
りに、例えばウイルスベクターから細胞に導入されたコーディング核酸配列から
このような物質を発現させることによってターゲット細胞中で産生させてもよい
。治療すべき特定細胞にベクターをターゲットさせてもよく、または、ベクター
が、ターゲット細胞によって多少とも選択的にスイッチオンされる調節要素を含
んでいてもよい。

【０１３２】従って、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節し得るポリペプチドの
ような物質をコードしている核酸は、遺伝子治療の方法で、例えば、ＨＣＶ感染
に付随する障害を予防または治療（全面的または部分的）する目的で使用され得
る。

【０１３３】ウイルスベクターのようなベクターは異なる種類の様々なターゲット細胞に核
酸を導入するために従来技術で使用されてきた。典型的には、所望のポリペプチ
ドの発現によって有効な治療効果または予防効果を与えるべく十分な割合のトラ
ンスフェクションが生じるようにベクターをターゲット細胞に接触させる。トラ
ンスフェクトされた核酸が各ターゲット細胞のゲノムに永久的に取込まれて長期
持続効果を与えるようにしてもよく、あるいは、治療の定期的な反復を要するよ
うにしてもよい。

【０１３４】ウイルスベクター及びプラスミドベクターを含む様々なベクターが当業界で公
知である。米国特許ＵＳ５，２５２，４７９及び国際特許ＷＯ９３／０７２８２
参照。特に、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ
及びＥＢＶのようなヘルペスウイルス、レトロウイルスなどの多くのウイルスが
遺伝子導入ベクターとして使用されてきた。従来技術では多くの遺伝子治療プロ
トコルが失活させたネズミのレトロウイルスを使用してきた。

【０１３５】遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に代替して細胞に核酸を導入する
別の公知方法としては、マイクロインジェクション、リポソーム媒介導入、及び
、レセプター媒介ＤＮＡ導入、のような機械的技術がある。

【０１３６】ターゲット細胞の表面に存在するレセプターに特異的なリガンドを使用しポリ
リシンを介してタンパク質リガンドに核酸を結合させるレセプター媒介遺伝子導
入は、核酸を特定細胞に特異的にターゲッティングする技術の一例である。

【０１３７】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力を有している薬剤もし
くは物質、または、このような能力を有しているポリペプチドをコードする核酸
分子は、例えば内容物を外部環境から保護する適当な容器に封入されたキットの
形態で提供され得る。このようなキットには使用説明書が添付されている。

【０１３８】更に別の局面では、本発明は、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節
する能力を有しているポリペプチド、タンパク質またはその他の物質の精製方法
を提供する。本発明はまた、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する
能力を有している精製タンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質を提供する
。精製タンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質は、約１０％、より好まし
くは約２０％、より好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、より好まし
くは約５０％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約７０％、より好まし
くは約８０％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％の純度を有し
ているかまたは実質的に純粋である。

【０１３９】別の局面では、本発明は、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する
能力を有している精製タンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質の精製方法
を提供する。方法は、タンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質を本発明の
ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドに接触させる段階を含む。

【０１４０】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力を有しているタンパク
質、ポリペプチドまたはその他の物質を含む材料の混合物を、固定化した（スト
レプトアビジンまたはビオチンのような特異的結合分子を介して共有結合的また
は非共有結合的に固定化する）本発明のＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼポリペ
プチドに接触させ、ポリペプチドに結合しない分子を洗浄によって除去する。

【０１４１】本発明の精製方法では、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能
力を有しているタンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質は、例えば細胞抽
出物のような分子の混合物中のヒトのような生物の正常細胞でもよく、バキュロ
ウイルス発現系中でコードされたＤＮＡからタンパク質もしくはポリペプチドも
しくはその非リン酸化形態を発現する組換え宿主細胞、例えば細菌細胞、真核細
胞（例えば哺乳類または酵母）または昆虫細胞でもよい。

【０１４２】精製後、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する能力を有している
タンパク質、ポリペプチドまたはその他の物質を所望に応じて例えば治療関連に
使用し得る。

【０１４３】図１は、ＮＳ２／３プロテアーゼインヒビターの高スループットスクリーニン
グアッセイのスキームを示す。段階１でＮＳ２／３を再生させる。前駆体を適当
なバッファ中で活性化して開裂を生じさせる（段階２）。次に未開裂の前駆体を
捕獲し（段階４）、溶液中の遊離ＮＳ３の量を測定する（段階５）。

【０１４４】図２は、ＨＰＬＣによって以下の手順で分離したＮＳ２／３の開裂反応生成物
を示す。６Ｍのグアニジン塩酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ８．７、１００ｍＭの
ＤＴＴ中の５μＭのＨ_６−９０７−１２０６−ＡＳＫ４プロテアーゼの溶液を、
５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴ、５０％のグリセロール、１％の
ＣＨＡＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む温度４℃のバ
ッファで５０倍に希釈した。５分後、温度を２３℃に上げ、これによって開裂反
応を開始させた。サンプルを９０％Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（バッファＡ）及び
１０％アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ（バッファＢ）で平衡させたＰｏｒｏ
ｓＲ１／Ｈ還流クロマトグラフィーカラム（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）で分析し
た。蛍光デテクタを備えたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉの高性能液体クロマトグ
ラフを使用し、２．５ｍｌ／分の流速でカラムを作動させた。前駆体を開裂フラ
グメントから分離するために１５分で１０％−９０％Ｂの勾配を使用した。トリ
プトファン蛍光（励起２８０ｎｍ、発光３５０ｎｍ）をモニターすることによっ
てタンパク質ピークを検出し、ピーク積分によって定量した。一番上のグラフは
再生されたＮＳ２／３、真ん中のグラフは活性化されたＮＳ２／３Ｏ．Ｎ．、
一番下のグラフは精製されたＮＳ３を表す。

【０１４５】図３は、３００ｎＭのＨ_６−９０７−１２０６−ＡＳＫ４プロテアーゼの開裂
反応のＨＰＬＣによる分析を示す。左パネル：ＮＳ２／３開裂反応の経時的進行
の分析。ＮＳ２／３開裂産物に対応するＨＰＬＣピークの面積をピーク積分によ
って算定し、インキュベーション時間の関数としてプロットした。観察された反
応の一次速度定数の値を算出するためにデータを単指数方程式に適合させた。右
パネル：２３℃のＮＳ２／３自己開裂の濃度依存性。開裂反応の一次速度定数を
タンパク質濃度の関数として決定した。

【０１４６】図４は、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ２／３領域をコードするｃＤＮＡのフラ
グメントのクローニングに使用した２つの発現プラスミドベクターｐＴ７．７（
上部のプラスミド）及びｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）（下部のプラスミド）の概略図
である。

【０１４７】実験実施例１発現ベクター中のＮＳ２／３プロテアーゼのサブクローニングＮＳ２−３構築物のＰＣＲ増幅ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ２／３領域をコードしているｃＤＮＡのＰＣＲ増
幅フラグメントを適当な制限部位にクローニングすることによって、活性、野生
型または不活性のＮＳ２／３突然変異体の異種発現に適したプラスミドを作製し
た。

【０１４８】タンパク質を真核細胞及び原核細胞で異種発現させる幾つかの発現プラスミド
は当業界で公知である。この実施例では、原核（大腸菌）細胞中の異種発現にｐ
Ｔ７．７ベクターの主鎖を使用し、真核細胞（Ｈｅｐ３ｂ）またはｉｎｖｉ
ｔｒｏ転写／翻訳系中の異種発現にはｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）を使用する。原則
として別の発現系も同じ目的に使用できた。

【０１４９】ＨＣＶのＪ株またはＨ株に対応する単離物の非構造領域をコードするｃＤＮＡ
をＰＣＲ増幅用鋳型として使用した（ＨＣＶＪ株、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．
Ｎｏ．Ｄ９０２０８；ＨＣＶＨ株、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６７４
６３；ＨＣＶＨ７７株、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．ＡＦ００９６０６）。６０
ｍＭのトリス−ＳＯ_４（２５℃のｐＨ９．１）中の２０Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼミックス、１８ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｍＭのＭｇＳＯ_４、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２０
０μＭのｄＴＴＰ及び安定剤から成る増幅反応混合物（ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉ
ｘＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：１０７
９０−０２０）を調製することによってＤＮＡを常用の手順で増幅した。この手
順を以後の実施例でＰＣＲプロトコル１と呼ぶ。

【０１５０】あるいは、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５０ｍＭの
ＫＣｌ，ｐＨ８．３（２０℃）、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μＭのｄＡＴＰ
、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＴＴＰ及び２．５ＵのＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
ＭａｎｎｈｅｉｍＣａｔ．Ｎｏ．：１１４６１７３）から成る増幅反応混
合物を調製することによってＤＮＡを増幅した。この手順を以後の実施例でＰＣ
Ｒプロトコル２と呼ぶ。

【０１５１】幾つかの場合には、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣ
ｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．００１％のゼラチン、２００μＭのｄＧＴＰ
、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＴＴＰ及び２
．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ｔｍ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．：Ｎ８０８−０２４１）から成る別の増幅反応混合物を使用した。
この場合を以後の実施例でＰＣＲ法３と呼ぶ。

【０１５２】すべての場合に、反応容量は２５μｌとし、特異的プライマーは各々２００−
５００ｎＭ（最終濃度）、鋳型ＤＮＡは常用量の２０−１００ｎｇ（反応あたり
の総量）であった。反応物を氷上に集め、十分に混合し、９５℃のサーモサイク
ラーに導入した。９５℃で６０秒のサイクルを２０−３０回繰返してＰＣＲ増幅
を行った。アニーリングは通常はプライマーの最低融解温度（Ｔ_ｍ値）よりも５
℃低い温度で１５秒間行った。Ｔ_ｍ値をオリゴヌクレオチド配列から算出する方
法は当業界で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載されてい
る。

【０１５３】伸長処理は、７２℃（ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）または６８℃（ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘＨｉ
ｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で１Ｋｂのターゲット長さあたり
６０秒間行った。

【０１５４】すべてのＰＣＲ反応の前に、９５℃で１−２分間（またはＴａｑＧｏｌｄを
用いる反応では７分間）の変性サイクルを１回行って最後に温度を４℃まで急激
に降下させるかまたは７２℃で７分間の変性サイクルを１回行った後で温度を４
℃まで急激に降下させる前処理を行った（個々の条件に関しては後記参照）。Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのサーモサイクラー（ＧｅｎｅＡＭＰＰＣＲＳｙｓ
ｔｅｍ９７００）を使用した。

【０１５５】増幅に使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下の表に示す。

【０１５６】

【表１】

【０１５７】突然変異誘発突然変異は概して、突然変異誘発プライマーを使用するｃＤＮＡ配列のＰＣＲ
増幅によって導入した。この方法は当業者に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＰｒｅｓｓ，Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，（１９８９）ＰＣＲＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．及びＺｈａｏ
ら，（１９９３）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２１７，２１
８．に記載されている。上述のＰＣＲ条件を使用した。

【０１５８】突然変異はまた、Ｕ．Ｓ．Ｅ．突然変異誘発キット（ＰｈａｒｍａｃｉａＢ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：２７−１６９９−０１）を用いるＤｅｎｇ，Ｗ
．Ｐ．ａｎｄＮｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．，（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２００，８１のＵ．Ｓ．Ｅ．（ＵｎｉｑｕｅＳｉｔｅＥｌｉｍｉ
ｎａｔｉｏｎ）法を使用して導入してもよく、または、所望の（１つまたは複数
の）突然変異を含むフラグメントの制限酵素サブクローニングによって導入して
もよい。

【０１５９】突然変異誘発に使用したプライマーを以下の表に示す。

【０１６０】

【表２】

【０１６１】ｐＴ７．７中のＮＳ２−３のサブクローニングｐＴ７．７は、原核細胞中で異種タンパク質を発現させるために必要な構築物
の作製に好適なベクターであった（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ，Ａ．Ｈ．，Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．＆Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．１９
８９．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，６０）。ＣｓＣ
ｌ_２品質のＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９：前出、に従って作製）をＮ
ｄｅＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で３７℃で３時間制限し、
クレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を製
造業者の指示通りに用いて、即ち、プラスミド１μｇあたり３３μＭのＮＴＰと
１Ｕの酵素とを添加し２５℃で１５分間維持することによって埋め戻した。埋め
戻したプラスミドを１％ＴＡＥアガロースゲルに載せ、５μｇ／ｍｌの臭化エチ
ジウムで染色し、電気泳動させた。

【０１６２】電気泳動後、プラスミドＤＮＡに対応するバンドを切り出し、Ｑｕｉａｅｘ
ＩＩキット（Ｑｕｉｇｅｎ，ＣａｔＮｏ．：２００２１）でゲル精製した。溶
出後、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ）を製造業者の指示通りに使用してプラスミドを脱リン酸化し、Ｑｕｉａ
ｅｘＩＩキット（Ｑｕｉｇｅｎ，ＣａｔＮｏ．：２００２１）で溶液精製し
た。

【０１６３】ＰＣＲプロトコル１で得られたインサートは、ＰＣＲミックスに５ｍＭのＡＴ
Ｐ及び７．９ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃａｔ
．Ｎｏ．：２７−０７３６−０２）を加えて３７℃で３０分間維持することによ
って直接にリン酸化された。リン酸化後、ＰＣＲ産物を１％ＴＡＥアガロースゲ
ルに載せ、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、電気泳動させた。電気泳動
後、目的のバンドをゲルから切り出し、ＱｕｉａｅｘＩＩキット（Ｑｕｉｇｅ
ｎ，ＣａｔＮｏ．：２００２１）で溶出させた。

【０１６４】５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴ
Ｐ及び２５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンに４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：２０２５）を加
えた結合混合物中でプラスミドとインサートとを１：３のモル比で混合し１６℃
で少なくとも１時間維持することによって結合を生じさせた。代替手順としては
、高速ＤＮＡ結合キットを製造御者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
，Ｃａｔ．Ｎｏ．：１６３５３７９）の指示通りに使用した。場合によっては
制限によって突然変異が一方の構築物から他方の構築物にシャトルした。

【０１６５】ｐＴ７．７中で作製し実施例に使用した構築物を以下の表に示す［全部のｐＴ
７．７構築物でクローニング部位はＮｄｅＩである］。

【０１６６】

【表３】

【０１６７】ｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）中のＮＳ２−３のサブクローニングｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：６９２９１−１
）は真核細胞発現実験またはｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイに使用する構築物の
作製に好適なベクターであった。ＣｓＣｌ_２品質のＤＮＡをＮｃｏＩで３７℃
で３時間制限し、クレノウＤＮＡポリメラーゼを製造業者の指示通りに用いて、
即ち、プラスミド１μｇあたり３３μＭのＮＴＰと１Ｕの酵素とを添加し２５℃
で１５分間維持することによって埋め戻した。埋め戻したプラスミドを１％ＴＡ
Ｅアガロースゲルに載せ、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、電気泳動さ
せた。電気泳動後、プラスミドＤＮＡに対応するバンドを切り出し、Ｑｕｉａｅ
ｘＩＩキットでゲル精製した。溶出後、仔ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼを製造業者の指示通りに使用してプラスミドＤＮＡを脱リン酸化し、溶液精
製した。

【０１６８】代替手順では、プラスミドをＭｌｕＮＩで制限し、上記プロトコルで処理後
に脱リン酸化した。別の幾つかの場合には、ｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）をＭｌｕＮＩ、ＥｃｏＲＩで制限し、上記のごとく脱リン酸化した。

【０１６９】ＰＣＲプロトコル１及び２で得られたインサートは、ＰＣＲミックスに５ｍＭ
のＡＴＰ及び７．９ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて３７℃で３０分
間維持することによって直接にリン酸化された。リン酸化後、ＰＣＲ産物を１％
ＴＡＥアガロースゲルに載せ、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、電気泳
動させた。

【０１７０】電気泳動後、目的のバンドをゲルから切り出し、ＱｕｉａｅｘＩＩキットで
溶出させた。インサートがＰＣＲプロトコル３で得られたときは、クローニング
戦略が、ｐＣＲＩＩ．Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｋ２０００
−０１）中の第一クローニング段階を含んでいた。クローニングしたフラグメン
トを次にＭｌｕＮＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素によって捕獲（ｒｅｓｃｕｅ）し、
ｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）にサブクローニングした。クローニング戦略上の必要が
ある場合には、ＰＣＲプロトコル２または３で作製したインサートを製造業者の
指示通りに用いたＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：２０３Ｓ）によって完成（ｐｏｌｉｓｈ）し、上記
同様に精製した。

【０１７１】５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴ
Ｐ及び２５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンに４００ＵのＴ４ＤＮＡを加えた
結合混合物中でプラスミドとインサートとを１：３のモル比で混合し１６℃で少
なくとも１時間維持することによって結合を生じさせた。代替手順としては、高
速ＤＮＡ結合キットを製造御者の指示通りに使用した。

【０１７２】場合によっては制限によって突然変異が一方の構築物から他方の構築物にシャ
トルした。

【０１７３】ｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）中で作製した構築物を以下の表に示す。

【０１７４】

【表４】

【０１７５】コンピテント細胞の形質転換クローニング及びＤＮＡ増殖の目的で全部の構築物を用いて大腸菌Ｔｏｐ１０
細胞を形質転換させた。形質転換はＳａｍｂｒｏｋｋらのＣａＣｌ_２法（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９
８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａ
ｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ．）。

【０１７６】欠失突然変異体はすべてＨＣＶＪ株の関連で作製し、次いでｐＣＩＴＥベク
ターにクローニングして、共役的ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（後記参照）で
試験した。残基９０３及び９０７を起点とする欠失突然変異体は、残基８１０を
起点とする野生型構築物に比較して十分な開裂活性を示したが、ＮＳ２／３９
１３−１２０７は不活性であった。

【０１７７】全部の構築物が大腸菌中で高いレベル（＞５ｍｇ／リットル）の異種タンパク
質発現を生じた。２３℃で３時間誘発後に５０−８０％の範囲の高レベルのオー
トプロセシングが観察された。

【０１７８】実施例２ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（ＩＶＴ）中のＮＳ２／３プロテアーゼ構築物の発現ウサギ網状赤血球溶解系またはＴｎＴＴ７高速共役的転写／翻訳系（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｌ４１５１及びＬ１１７０）を製造業者の指示通り
に使用することによってｉｎｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）アッセイを実施した。

【０１７９】ＩＶＴに適したＤＮＡをＣｓＣｌ_２によって、またはＷｉｚａｒｄＰｌｕｓＳＶＤＮＡ精製系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ａ１４６０）によっ
て作製した。ＤＮＡを適当な制限酵素で３時間処理してほぼ直鎖化し、ＣＨ_３Ｃ
ＯＯＮａ／ＥｔＯｈで沈降させた。幾つかの場合、ＥｔＯｈ沈降の前にＤＮＡを
溶液からフェノール抽出した。次いで沈降したＤＮＡを水に再懸濁させ、少量の
アリコートを１％ＴＡＥアガロースゲルに載せ、臭化エチジウムで染色して制限
及び濃度を検証した。直鎖状ＤＮＡをｉｎｖｉｔｒｏＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼに推進される転写の鋳型として使用した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．
Ｎｏ．：６００１２４）。

【０１８０】転写されたＲＮＡをフェノール抽出し、ＣＨ_３ＣＯＯＮａ／ＥｔＯｈで沈降さ
せた。次にＧ−５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：１７
−００４３−０１）で遠心することによってＲＮＡを鋳型ＤＮＡから分離した（
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．
，（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ．）。精製したＲＮＡを上記の手順で沈降させ水に再懸濁さ
せた。

【０１８１】３０ｍＭのＣＨ_３ＣＯＯＫ、３６０μＭのＭｇＣｌ_２、３０μＭのメチオニン
除去アミノ酸ミックス、１μｇのＲＮＡ、１０μｌの網状赤血球溶解液、９０ｍ
ＭのＤＴＴ、２μｌの放射性標識メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ
．：ＳＪＱ００７９）、１μｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ
．：Ｎ２５１１）及び総量を３３μｌにする量の水から成る反応混合物を調製す
ることによって常法でＲＮＡを翻訳した。ＴｎＴ系は、１０μｌの網状赤血球溶
解液、３０ｍＭのＣＨ_３ＣＯＯＫ、３６０μＭのＭｇＣｌ_２、３０μＭのメチオ
ニン除去アミノ酸ミックス、１μｇのＤＮＡ、２１ｍＭのＤＴＴ、２μｌの放射
性標識メチオニン、１μｌのＲＮａｓｉｎ及び総量を３３μｌにする量の水から
成る反応混合物中で直鎖状ＤＮＡと共に使用した。

【０１８２】放射性標識されたタンパク質をＳＤＳ−ｐａｇｅで分離した（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，（１９８９）
．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕ
ａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓ．）。脱色用溶液中でゲルを３０分間固定し、次いでＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＮＡＭＰ１００）に浸漬させて３０分間穏やか
に撹拌し、３ＭＭペーパーで乾燥し、オートラジオグラフィー処理した。

【０１８３】ＩＶＴ方法を使用し、それぞれアミノ酸９０３、９０７、９１３及び９１９を
起点としいずれもアミノ酸１２０６で終結するＨＣＶＪ株から得られたＮＳ２
／３のＮ末端欠損形（実施例１の構築物２５、２８、３１及び３３）をＩＶＴ中
で天然型Ｎ末端を有する構築物１９に比較した。

【０１８４】ＮＳ２／３から発現された標識産物のオートラジオグラムが得られた。オート
ラジオグラムは以下の手順で作成した。^３５Ｓ標識メチオニンの存在下、ＴｎＴＴ７高速共役的転写／翻訳系を使用したｉｎｖｉｔｒｏ翻訳によってＮＳ２
／３構築物を産生させた。２３℃で１時間のインキュベーション後、ＳＤＳサン
プルバッファを加えて反応を停止させ、ＳＤＳ１２．５％ＰＡＧＥによって分析
した。ゲルをＡｍｐｌｉｆｙＴＭに浸漬させ、オートラジオグラフィーによって
分析した。

【０１８５】この実験は、残基９０７までのＮ末端欠失がＮＳ２／３プロテアーゼの触媒活
性を損傷することなく許容されることを示した。欠損構築物は、異種発現中にタ
ンパク質の凝集体を生じさせる大きい疎水性Ｎ末端部分が除去されているという
利点を有している。

【０１８６】実施例３真核細胞中のＮＳ２／３プロテアーゼ構築物の一過性発現ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性及びその阻害を真核細胞中の一過性発
現を用いて試験した。

【０１８７】この目的にはＨｅｐ３Ｂ細胞またはＨｅＬａ細胞が好適である。ＨｅＬａ細胞
を６×１０^５細胞／プレートの密度で播種し、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３
を細胞あたり５ＰＦＵの感染多重度で感染させる。この感染によってＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼが細胞中で発現し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのコ
ントロール下のタンパク質を発現させるために使用できる。この方法は、Ｔｏｍ
ｅｉら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４０１７及びＫｏｈａｒａら（１９
９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：２３１３−２３１８に十分に記載されている
。

【０１８８】３７℃で３０分間吸着させた後、１０％のウシ胎仔血清を補充した３ｍｌのダ
ルベッコ改質イーグルＭＥＭを添加した。細胞を３７℃で更に３０分間インキュ
ベートした。構築物番号１６−３５で示されるＮＳ２／３プロテアーゼ構築物を
含有する２０μｇの組換えプラスミドをＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載
されているようにリン酸カルシウム中で沈降させ、５００μｌの容積の各プレー
トに直接加えた。

【０１８９】トランスフェクションの４時間後に、培地をメチオニン欠失ＭＥＭ（Ｇｉｂｃ
ｏＣａｔＮｏ．：３１９００−０２０）で交換し、細胞を３７℃で１時間飢
餓状態に維持した。次に、２％の透析ウシ胎仔血清を補充した２ｍｌのメチオニ
ン欠失ＭＥＭ中、４００μＣｉのＴｒａｎ^３５Ｓラベル（ＩＣＮＣａｔＮｏ
．：５１００６）で細胞を３時間放射性標識した。細胞を採取し、２０ｍＭのト
リスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、１ｍＭの
フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍＭのジチオト
レイトールに再浮遊させた。

【０１９０】特異的抗血清によって免疫沈降させると細胞抽出物中のＮＳ２／３プロテアー
ゼの発現及び活性を測定できる。この目的で、ドデシル硫酸ナトリウム及びジチ
オトレイトールをそれぞれ最終濃度２％及び１０ｍＭになるように細胞抽出物に
加える。次いで溶解液を室温で１時間インキュベートし、９５℃で１０分間加熱
する。４００μｌの量の２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、
１％のトリトンＸ−１００中、１０μｌの抗血清に、ニトロセルロースフィルタ
ーにスポットしたｖＴ７Ｆ３感染ＨｅＬａ細胞抽出物を４℃で１時間プレ吸着さ
せた。

【０１９１】次に抗体懸濁液を６０μｌのプロテインＡセファロースと共に４℃で１時間イ
ンキュベートした。樹脂を遠心によってペレット化し、２０ｍＭのトリスｐＨ８
．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００で３回洗浄し、４００
μｌの同じバッファに再懸濁させた。２０μｌの細胞溶解液を樹脂に添加し、４
℃で１時間インキュベートした。

【０１９２】次に、プロテインＡセファロース懸濁液を０．９ｍｌの５ｍＭのトリスｐＨ７
．４、１６．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．
２５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、３０％（ｗ／ｖ）のショ糖の上に層状に流
し、微量遠心機で室温で遠心することによってペレット化した。ペレットをショ
糖が存在しない同じバッファで２回、水で１回洗浄した。サンプルをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで分析した。

【０１９３】実施例４Ｚｎイオンの存在下及び非存在下の大腸菌の発現活性ＮＳ２／３プロテアーゼを異種発現させる複数の系が当業界で公知である
。この実施例では、ＮＳ２／３プロテアーゼの発現に大腸菌を使用した。また、
以下に概説する手順に従ってこれらの細胞に未開裂形態のＮＳ２／３タンパク質
を発現させた。細菌性または真核性の別の発現系を同じ目的に使用し得る。

【０１９４】構築物番号１−１５の欠損ＮＳ２／３プロテアーゼ配列を含むｐＴ７−７ベク
ターを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。５０μＭのビオチ
ン、２．４μｇ／ｍｌのチアミン、３．４μｇ／ｍｌのＦｅＳＯ_４及び２００μ
ＭのＺｎＣｌ_２を補充したＭ９培地中、３７℃で細胞を５００ｎｍの光学密度０
．８まで増殖させた。温度を２３℃に下げ、２００μｌのＩＰＴＧを加えてタン
パク質誘発を開始させた。３時間後、遠心によって細胞を収集した。

【０１９５】細胞抽出物を変性条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動処理によって分析
し得る。この実験は、ＮＳ３及びＮＳ２の開裂産物の予想見掛け分子量で泳動す
る２つのタンパク質に加えて、ＮＳ２／３前駆体タンパク質が効率的に誘発され
ることを実証した。

【０１９６】ＮＳ２／３前駆体はその誘発中に実質的なセルフプロセシングを生じるので、
これらの条件下で純粋な未開裂の前駆体タンパク質を大量に得ることは明らかに
不可能である。従って、タンパク質誘発中のセルフプロセシング反応を抑制また
は阻害する２つの戦略を試験した。

【０１９７】１．低温誘発１５℃で誘発するとタンパク質の総産生量は減少したが、相対的なセルフプロ
セシングの程度は僅かしか変化しなかった。温度を更に下げると、タンパク質の
産生がかなり妨害された。従って、潜在的に精製可能な前駆体の相対量を誘発中
の温度調節によって増加させることはできないと考えられた。

【０１９８】２．低亜鉛含量の最小培地中の誘発ＮＳ３タンパク質がその変性及び安定性に必要な化学量論的量の亜鉛を含有し
ていることは公知である（ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏら，１９９６）。添加亜鉛
の存在しない最小培地中で増殖させた大腸菌中でＮＳ３タンパク質が誘発される
とき、該タンパク質は適正に変性せず、封入体として知られた凝集体を形成する
であろう。欠損ＮＳ２／３プロテアーゼ構築物は、亜鉛イオンを補充しないＭ９
最小培地中で増殖させた大腸菌中で発現したときには、不溶性タンパク質の形成
を推進するであろう。これらの条件下では、殆どのＮＳ２／３タンパク質が未開
裂の前駆体として見出され、クーマシー染色したゲルで可視化されるＮＳ３開裂
産物の量は極めて少ない。従ってこの手順がＮＳ２／３プロテアーゼを潜在的な
未開裂形態で発現させる方法を提供する。

【０１９９】要約すると、触媒的にコンピテントなＮＳ２／３前駆体を容易に精製可能な潜
伏性不活性形態で得るために、タンパク質の誘発を亜鉛の非存在下の最小増殖培
地中で行った。

【０２００】実施例５封入体からの非プロセス型ＮＳ２／３プロテアーゼの精製細菌細胞から純粋形態のＮＳ２／３プロテアーゼを得るために、大腸菌細胞を
添加亜鉛イオン非存在下の最小培地中で増殖させ、上記に概説した手順で構築物
１−１５（実施例１）を使用してＮＳ２／３タンパク質の産生を誘発した。

【０２０１】細胞を遠心によって収集し、細胞ペレットをＰＢＳバッファ（２５ｍＭのリン
酸ナトリウムｐＨ７．５，１４０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。次に、洗浄した
ペレットを、２５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５、３ｍＭのＤＴＴ、５００
ｍＭのＮａＣｌ、０，５％のＣＨＡＰＳ及び１５％のグリセロールを含む溶菌バ
ッファ（増殖培地１リットルあたり４０ｍｌ）に再懸濁させた。フレンチ圧力セ
ルを使用して細菌細胞壁を破壊し、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２をホモジェネートに添
加し、次いで６Ｕ／μｌのＤＮアーゼの存在下で４℃で３０分間インキュベート
した。ホモジェネートを１２０００×ｇで１５分間遠心した。

【０２０２】遠心ペレットは別の細菌性タンパク質夾雑物に加えてＮＳ２／３タンパク質を
含んでいた。これを溶菌バッファで２回、１％のＮＰ−４０を補充した溶菌バッ
ファで１回、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴで１回洗
浄した。採集ペレットは典型的には８０％純粋なＮＳ２／３タンパク質を含有し
ていた。

【０２０３】タンパク質を以下の手順を使用して更に精製し得る。ペレットを７Ｍのグアニ
ジン塩酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ８．７、１００ｍＭのＤＴＴに再懸濁させ、
６Ｍのグアニジン塩酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴ、１５
０ｍＭのＮａＣｌで平衡させ流速２ｍｌ／分で作動する２６／６０Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ７５のゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。ＮＳ２／３を
含有する画分をプールし、９０％Ｈ_２Ｏ、０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１０％
アセトニトリル、０．０８％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）で平衡させた０．５×２０ｃｍの
Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ逆相クロマトグラフィーカラムに充填する。

【０２０４】流速４ｍｌ／分で１時間で１０％Ｂから９０％Ｂになる勾配を使用して純粋形
態のＮＳ２／３をカラムから溶出させた。ＮＳ２／３を含有する画分をプールし
、凍結乾燥し、タンパク質を７Ｍのグアニジン塩酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ８
．７、１００ｍＭのＤＴＴに再溶解させた。

【０２０５】典型的には、タンパク質は９５％を上回る純度を有しており、細菌培養物１リ
ットルあたり２ｍｇを上回る収率で得られた。精製タンパク質をエレクトロスプ
レー質量分析法によって特性決定し、発現手順または精製手順中にタンパク質の
修飾が全く生じないことを確認した。

【０２０６】この技術によって測定されたＮＳ２／３Ｈ６−９０７−１２０６−ＡＳＫ４
の質量は３３６９４Ｄａであり、アミノ酸組成から算出した理論的質量に一致す
る。これは、この精製手順中に検出可能なタンパク質の修飾が全く生じなかった
ことを実証する。気相シークエンサーを用いたエドマン分解を使用して行ったＮ
末端アミノ酸配列解析がこの見解に確証を与える。この解析では予想したＮ末端
配列Ｍ−Ｈ−Ｈ−Ｈが得られた。

【０２０７】得られた純タンパク質の収率は実施例１で示した種々の構築物１−１５の間で
かなりばらつきがあった。大腸菌ＢＬ−２１細胞を使用したとき最高レベルの細
菌タンパク質発現は、Ｈｉｓ＋Ｌｙｓタグで標識した構築物によって得られた。
ＮＳ２／３９０７−１２０６ＡＳＫ_４−ベースの突然変異構築物の発現は極
めて少なく、最適化の必要があった。

【０２０８】これらの構築物については、大腸菌Ｂ８３４細胞及び最小培地を使用したとき
に最高レベルの発現が得られた。

【０２０９】実施例６精製ＮＳ２／３プロテアーゼのリフォールディング以下のパラメーターを変化させながらリフォールディング条件の系統的な選抜
を行った：リフォールディング方法（透析、高速希釈、段階希釈）、タンパク質
濃度（１０−１００μｇ／ｍｌ）、ｐＨ（６−９）、イオン強度（２５−２７５
ｍＭ）、極性添加剤（０．５Ｍのアルギニン）、非極性添加剤（２０％グリセロ
ール、１％ショ糖）、残留カオトロープ濃度（０−０．７５Ｍのグアニジン）、
界面活性剤（２％ＣＨＡＰＳ）、ＰＥＧ４０００（０．０５％）、温度（４−２
３℃）及びＺｎ^＋＋濃度（３０−１００μＭ）。全部の実験で、限外濾過による
可溶性前駆体の回収をモニターした。

【０２１０】この方法を使用して、リフォールディング後の可溶性タンパク質の回収には以
下の要因が重要であることを確認した：透析によるカオトロープの除去、タンパ
ク質濃度＜１００μｇ／ｍｌ、リフォールディングバッファ中の残留カオトロー
プ濃度は０．７５Ｍグアニジン、イオン強度は＞２００ｍＭのＮａＣｌ。適正な
リフォールディング条件下では１２０Ｋ×ｇで限外濾過後の上清中に再生前駆体
が８０％を上回る割合で見出される。

【０２１１】異なる目的に使用できる２つの方法を上記に基づいて開発した。方法Ａは、開
裂反応を持続させ得る適当なバッファに移入しなければ開裂を生じない再生タン
パク質をマイクロモル濃度で産生し得る。方法Ｂは開裂反応を同時に持続させる
バッファ中で変性ＮＳ２／３タンパク質をリフォールディングし得る。

【０２１２】方法Ａ．３μＭのＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを６Ｍのグアニジン塩
酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ８．７、１００ｍＭのＤＴＴ中に含有する２００μ
ｌの溶液を、２０ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０ｍＭのＺｎＣｌ_２、３
ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、７５０ｍＭのグアニジン塩酸塩に、カッ
トオフ分子量１０ｋＤａのＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ透析膜を用いて透析する。透析
を４℃で行う。２時間後、タンパク質溶液を取り出し、アリコートに分け、液体
窒素中でショックフリーズする。この透析中には開裂が全く生じない。以下に概
説するように開裂反応を活性化するバッファに添加するとタンパク質が活性化さ
れて開裂を生じる。

【０２１３】方法Ｂ．５μＭのＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを６Ｍのグアニジン塩
酸塩、２５ｍＭのトリスｐＨ８．７、１００ｍＭのＤＴＴ中に含有する溶液を、
５０ｍＭトリスｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴ、５０％グリセロール、１％ＣＨＡ
ＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭのＮａＣｌを含有する４℃のバッファ
で５０倍に希釈する。５分後、温度を２３℃に上昇させて開裂反応を開始させる
。

【０２１４】方法Ａ及び方法Ｂの双方で、バッファ組成及びタンパク質濃度の変更が可能で
あり、それらの結果をより詳細に以下に説明する。再生された活性タンパク質の
収率は３０％−８０％の範囲であり、この収率は、バッファ組成、ＮＳ２／３タ
ンパク質のアミノ酸組成及びその純度に依存する。

【０２１５】実施例７精製されたＮＳ２／３プロテアーゼのｉｎｖｉｔｒｏ活性の検出方法Ａに従って再生したタンパク質を以下の組成をもつバッファ（活性バッフ
ァ）で少なくとも５倍に希釈した：５０ｍＭトリスｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴ
、５０％グリセロール、１％ＣＨＡＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭの
ＮａＣｌ。

【０２１６】定期的な間隔毎に、再生ＮＳ２／３プロテアーゼを含有する活性バッファのア
リコートを採取し、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを加えて反応を停止させ、
サンプルを１２．５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルに載せて
電気泳動させ、銀染色またはウェスタンブロットによって分析した。

【０２１７】方法Ｂに従って再生させたタンパク質は２３℃で２時間近くインキュベートす
るだけで同様にして分析した。

【０２１８】これらの条件下で２時間インキュベーション後、欠損ＮＳ３の分子量で泳動す
る濃いバンドが抗ＮＳ３抗体で染色したウェスタンブロットに検出された。

【０２１９】銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では、未開裂前駆体に加えて、欠損ＮＳ２及び
ＮＳ３タンパク質のＭｗに対応する２つのバンドが検出された。この実験で前駆
体タンパク質の約３０％がプロセシングされたと推定した。

【０２２０】ＮＳ２／３プロテアーゼアッセイのもっと簡便な定量的フォーマットでは前駆
体と産生物とをＨＰＬＣによって分離する。以下の方法を開発した。方法Ａまた
はＢに従って再生したタンパク質を活性バッファ中、２３℃でインキュベートし
た。定期的な間隔毎に、２００μｌのアリコートを採取し、２０μｌの１０％Ｔ
ＦＡを加えて反応を停止させた。溶液を、９０％Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（バッ
ファＡ）及び１０％アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ（バッファＢ）で平衡さ
せたＰｏｒｏｓＲ１／Ｈ還流クロマトグラフィーカラム（４．６ｍｍ×５０ｍ
ｍ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣａｔＮｏ．：１−１０
１４−２４）に注入した。

【０２２１】蛍光デテクタを備えたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ高性能液体クロマトグラフ
を使用してカラムを流速２．５ｍｌ／分で作動させた。１５分で１０％−９０％
Ｂの勾配を使用して前駆体を開裂フラグメントから分離した。トリプトファン蛍
光（励起２８０ｎｍ、発光３５０ｎｍ）のモニタリングを使用すると、５ｎＭ未
満のタンパク質を確実に検出し、ピーク積分によって定量できる。

【０２２２】図２は活性バッファ中のＮＳ２／３Ｈ６−９０７−ＡＳＫ４（構築物３）の
インキュベーション時点０及び一夜インキュベーション後に記録した２つの典型
的クロマトグラムを示す。“ＮＳ３”のピークは、アミノ酸１０２７−１２０６
を包含しＣ末端延長部ＡＳＫＫＫＫを有しているタンパク質標準と同時に泳動し
た。自己開裂中の精製ＮＳ２／３プロテアーゼのプロセシング反応が正しい開裂
部位で生じたことを検証するために、ＮＳ３開裂産物を単離し、エドマン分解に
よるＮ末端配列解析を使用して特性決定した。得られた配列はＡ−Ｐ−Ｉ−Ｔで
あり、これはＨＣＶポリタンパク質の残基１０２７−１０３０に対応し、開裂が
正しいＮＳ２／３部位で生じたことを疑う余地なく示す。

【０２２３】我々は、開裂反応の一次速度定数が０．０６分^−１でｔ／２が１１．５分であ
ると推定した。これらのデータはｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系における全長Ｎ
Ｓ２／３の開裂反応に関して発表されているデータに矛盾しない。該系では、２
／ｔが１０−１５分及び最大開裂率７０％を測定した。

【０２２４】異なる幾つかの酵素調製物を使用すると、１５−８０％の開裂率及び０．０３
分^−１−０．０７分^−１の速度が得られた。開裂が正しい開裂部位で生じたこと
を検証するために開裂フラグメントのＮ末端配列解析を行った。

【０２２５】再生されたＮＳ２／３Ｈ_６−９０７−１２０６−ＡＳＫ_４前駆体のＮＳ３プ
ロテアーゼ活性も試験した。自己開裂反応中にはＮＳ３プロテアーゼ活性の有意
な変化は観察されず、２時間のインキュベーション後に３０％のプロセシングが
生じていた。ＮＳ３プロテアーゼ活性の程度は約２５％の活性分子の存在に匹敵
し、このことからＮＳ３プロテアーゼの特異的活性がＮＳ２／３Ｈ_６−９０７
−１２０６−ＡＳＫ_４前駆体で変化しないと推測できる。

【０２２６】これらの実験は、回収できる量の触媒としてコンピテントなタンパク質がＮＳ
２及びＮＳ３の双方のプロテアーゼ活性を有することを示す。タンパク質の残り
の部分はミスフォールディングされた公算が大きい。

【０２２７】実施例８ＮＳ２／３プロテアーゼ活性のキャラクタリゼーション精製及び再生されたＮＳ２／３プロテアーゼを活性バッファ中でインキュベー
ションしたときに生じた開裂産物を検出するＨＰＬＣ方法は、反応の動的パラメ
ーターを定量し、反応速度に対する種々の物理化学条件の影響を判断するために
使用できる。

【０２２８】図３は開裂の典型的な開裂の時間的経過を示す。３０ｎＭのＮＳ２／３プロテ
アーゼを５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、３ｍＭのＤＴＴ、５０％のグリセロール
、１％のＣＨＡＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭのＮａＣｌ中でインキ
ュベートし、形成されたＮＳ３開裂産物の量を経時的に測定することによって開
裂反応を追跡した。これはＮＳ３ＨＰＬＣピーク面積を積分することによって
行った。

【０２２９】図３の左側のパネルは、ＮＳ３ピーク面積対時間のプロットを示す。データ点
は単指数方程式に最適に適合し、見かけ速度定数を決定できる。この速度定数は
、イオン強度、グリセロール濃度、ｐＨ、界面活性剤濃度のような幾つかのパラ
メーターの影響を受けることが判明した。

【０２３０】予想外の知見は、速度定数がタンパク質濃度依存性も示すことである（図３、
右側パネル）。これは、活性種であるマルチマーの存在を示す指標となる。実際
、ゲル濾過クロマトグラフィーは、溶液中にダイマー種が形成されていることを
証明した。ダイマー化はＮＳ２／３プロテアーゼの新しい特性であり、この特性
は、ダイマー形成を妨害するＮＳ２／３のインヒビターを発見する戦略を開発す
るために使用できる特性であった。

【０２３１】実施例９ＮＳ２／３プロテアーゼのインヒビターアッセイ本発明はまた、開裂反応のインヒビターを同定するために使用できる方法を提
供する。このようなインヒビターは、ＮＳ２／３プロテアーゼ阻害活性に基づい
て化合物コレクションまたは組合せライブラリーをスクリーニングすることによ
って発見できる。簡便には、小さい有機分子をＤＭＳＯに可溶化し、アッセイに
加える。以下のすべてのアッセイにおいて、１０％までのＤＭＳＯの添加はＮＳ
２／３プロテアーゼ開裂活性を実質的に害することなく許容される。

【０２３２】以下の方法は使用し得るアッセイ方法の例である。Ａ．細胞ベースのアッセイ真核細胞中でのＮＳ２／３プロテアーゼの一過性発現に適した発現プラスミド
（ｐＣＩＴＥ構築物１６−３５；実施例１）は本文中に記載されている。これら
のプラスミドはＮＳ２／３プロテアーゼをＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ーのコントロール下に含んでいる。真核細胞中での異種タンパク質の発現をモニ
ターするため、より特定的にはウイルスプロテアーゼの活性をモニターするため
にこの系を使用することは当業界で公知であり（Ｔｏｍｅｉ，Ｌ．ら，（１９９
３）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４０１７）、この使用は実施例３に記載した。

【０２３３】外部から加えた分子によってＮＳ２／３プロテアーゼ活性を阻害すると、開裂
産物のレベルが低下する。このレベル低下は、当業界で公知の確立された方法を
使用して、タンパク質を放射性標識し、ＮＳ２／３プロテアーゼを単離し、その
ＮＳ３開裂産物を抗ＮＳ３抗血清で免疫沈降させることによって測定できる。

【０２３４】Ｂ．ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイ上述したように（実施例２）、共役的ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用し
て、または、適当なＲＮＡ分子のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳によって、活性ＮＳ２／
３プロテアーゼを作製できる。

【０２３５】本発明は、当業者に公知の手順に従ってＮＳ２／３プロテアーゼをコードする
ＲＮＡ分子をＴ７ＲＮＡポリメラーゼの作用で産生させるための適当なプラス
ミドを提供する。インヒビターを反応混合物に添加し、それらの力価を滴定実験
によって測定する。

【０２３６】放射性標識アミノ酸の添加によってタンパク質を放射性標識し、次いでＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによって分析すると、ＮＳ２／３プロテ
アーゼ活性の阻害を放射性開裂産物の減量によってモニターできる。

【０２３７】Ｃ．ＳＤＳＰａｇｅまたはＨＰＬＣによる開裂検出本発明によって提供されたＮＳ２／３プロテアーゼを本発明の方法に従って精
製及び再生し、２００μｌの活性バッファ（５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、３ｍ
ＭのＤＴＴ、５０％のグリセロール、１％のＣＨＡＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭのＮａＣｌ）中または開裂活性の維持に適した別のバッファ中でイ
ンキュベートする。典型的には、３０ｎＭ−３００ｎＭのＮＳ２／３プロテアー
ゼをアッセイに使用し、適当なバッファ中、１０％（ｖ／ｖ）以下の有機化合物
を含むＤＭＳＯ溶液の非存在下または存在下でインキュベートする。タンパク質
濃度が低いとき、ＮＳ２／３プロテアーゼが活性ダイマー及び不活性モノマーの
双方の形態で溶液中に存在する。このため総反応速度が遅くなる。

【０２３８】ダイマー形成インヒビターを発見したいときは、ダイマーの平衡解離定数と同
程度またはより低いタンパク質濃度を使用するのが有利であろう。また、極めて
強力なインヒビターの活性を測定するためにも低タンパク質濃度が必要であろう
。１００ｎＭよりも高いタンパク質濃度では大抵のタンパク質が活性ダイマーと
して存在し、開裂反応が低タンパク質濃度のときよりも速い（同じく図３参照）
。

【０２３９】アッセイに使用したタンパク質濃度次第で、反応を１０−３０分間進行させ、
２０μｌの１０％ＴＦＡ（開裂をＨＰＬＣで検出する場合）またはＳＤＳサンプ
ルバッファ（開裂をＳＤＳＰＡＧＥで検出する場合）を加えてＮＳ２／３プロ
テアーゼを失活させることによって反応を停止させる。どの場合にも、反応は時
間的経過曲線の直線範囲で停止する（図３）。線形性から逸脱すると添加したイ
ンヒビターの力価が測定不能になるのでこれは重要である。

【０２４０】次に、インヒビターの非存在下で形成された開裂産物の量を、添加インヒビタ
ーの存在下で形成された同じ開裂産物の量に比較する。この比較から阻害％を算
出し、種々のインヒビター濃度で阻害％を決定し、阻害化合物の力価の正確な測
定値を得る。この目的ではＮＳ３またはＮＳ２のどちらの開裂フラグメントの形
成をモニターしてもよい。

【０２４１】検出方法としてＳＤＳＰＡＧＥを使用するとき、感度を改善するためにＮＳ
２またはＮＳ３−特異的抗血清で染色したウェスタンブロットを行うのが便利で
ある。バンドの濃さを濃度計または当業界で公知の別の造影技術によって評価で
きる。

【０２４２】好ましい検出方法は、未開裂のＮＳ２／３とＮＳ２及びＮＳ３の双方の開裂フ
ラグメントとを数分以内に定量的に検出できるＨＰＬＣである。アッセイは、ロ
ボットによるサンプルの集合及び分析を使用して化学的化合物のコレクションを
スクリーニングするために使用できる。ＮＳ２／３、ＮＳ２及びＮＳ３の分離及
び定量を証明するＨＰＬＣ処理の一例を図２に示す。

【０２４３】Ｄ．高性能スクリーニングアッセイしばしば＞１０^５の独立化学物質を含有する大きい化合物コレクションまたは
組合せライブラリーは新薬開発プログラムのリード化合物として有望である。こ
のような多数の化合物の処理にはロボット技術及びマイクロプレートフォーマッ
トで実施できるアッセイが必要である。従って本発明はまた、マイクロプレート
アッセイでＮＳ２／３プロテアーゼ活性を検定する方法を提供する。

【０２４４】図１に概略的に示すアッセイを以下のごとく行った。ＮＳ２／３プロテアーゼ
ポリペプチドのＮ末端を６−ヒスチジンタグで標識した。標識タンパク質を上述
のように精製し、リフォールディング手順ＡまたはＢに従って再生した。簡便性
の面からリフォールディング手順Ｂが好ましかった。手順Ｂでは、変性したヒス
チジン標識ＮＳ２／３プロテアーゼポリペプチドを１００μｌの活性バッファ（
５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、３ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０％のグ
リセロール、１％のＣＨＡＰＳ、５０μＭのＺｎＣｌ_２、２５０ｍＭのＮａＣｌ
）で最終濃度５０ｎＭに希釈した。

【０２４５】２３℃で１５分間インキュベーションすると、ＮＳ２／３の部分プロセシング
が生じた。約１０％のプロセシングが得られるようにインキュベーション時間を
選択した。ＮＳ２開裂フラグメント及び未開裂のＮＳ２／３前駆体だけがヒスチ
ジンタグを有している。金属親和性樹脂を加えてこれらのヒスチジンを捕獲する
。従って、インキュベーション期間後、５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、２５０ｍ
ＭのＮａＣｌに平衡させたＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａ
ｔＮｏ．：８９０１−３）の５０％（ｖ／ｖ）スラリー１００μｌを加えた。
樹脂はヒスチジン標識種を封鎖し、標識のないＮＳ３分子を溶液中に残した。

【０２４６】ＮＳ２／３プロテアーゼのプロセシング反応中に産生したＮＳ３分子はセリン
プロテアーゼ活性を有している。この活性は、ＮＳ２とＮＳ３との間のプロセシ
ング反応の読出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として使用し得る。実際、ＮＳ３の触媒活
性は、ＮＳ２／３プロセシングイベントの各々を、例えば蛍光発生ＮＳ３基質の
代謝回転を介して増幅するであろう。

【０２４７】樹脂の沈降後、４０μｌの上清アリコートを採取し、２００μｌの５０ｍＭの
トリスｐＨ７．５、０．１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのＤＴＴ、１５％
のグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び配列ＫＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬ
ＳＧＲ−ＮＨ２をもつ２０μＭのＰｅｐ４ＡＫを入れた第二の９６ウェルマイク
ロプレートのウェルに加えた。Ｐｅｐ４ＡＫはＮＳ３プロテアーゼの補因子であ
り、最大活性を得るために添加した。

【０２４８】この時点で、配列Ｍｃａ−ＤＤＩＶＰＣＳＭＳＫ［ＤＮＰ］を有する５μＭの
内部消光蛍光性ＮＳ３基質を加えた。蛍光マイクロプレート読取り装置（励起３
２５ｎｍ、発光３９３ｎｍ）を使用して反応を追跡した。

【０２４９】このアッセイに必要な全部の段階はロボット操作が可能であり、多数の化合物
を短時間でスクリーニングし得る。更に、ＮＳ３プロテアーゼの阻害を原因とし
て生じる疑陽性は、ＮＳ３プロテアーゼアッセイ中に初期溶液を１０倍希釈する
ことによって最小になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＳ２／３プロテアーゼインヒビターの高性能スクリーニングアッセイのスキ
ームを示す。

【図２】ＨＰＬＣによって以下の手順で分離したＮＳ２／３の開裂反応生成物を示す。

【図３】３００ｎＭのＨ_６−９０７−１２０６−ＡＳＫ_４プロテアーゼの開裂反応のＨ
ＰＬＣによる分析を示す。

【図４】ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ２／３領域をコードするｃＤＮＡのフラグメント
のクローニングに使用した２つの発現プラスミドベクターｐＴ７．７（上部のプ
ラスミド）及びｐＣＩＴＥ２ｂ（＋）（下部のプラスミド）の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:92 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/50 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パツラオーロ，ミケーレイタリー国、イ−00040・ポメツイア、ビア・ポンテイーナ、イステイトウート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジ・エレツテイ (72)発明者ラーム，アルミンイタリー国、イ−00040・ポメツイア、ビア・ポンテイーナ、イステイトウート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジ・エレツテイＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 4B050 CC03 DD01 LL01 4B063 QA18 QA20 QQ36 QR50 QS16 QX02 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA96Y AB01 BA02 BB31 CA33 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのフラグメントから成るポ
リペプチドであって、前記プロテアーゼがＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆
体として天然に産生され、前記フラグメントが、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアー
ゼ前駆体の残基９０３−９１３の位置のアミノ酸をそのＮ末端残基として有して
おり、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体の残基１２０６−１６５７の位置
のアミノ酸をそのＣ末端残基として有しており、前記ポリペプチドがホモダイマ
ーであるときは自己タンパク質分解活性を有していることを特徴とするポリペプ
チド。
【請求項２】フラグメントのＣ末端残基がＨＣＶＮＳ２／３プロテアー
ゼ前駆体の１２０６位のアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載のポリ
ペプチド。
【請求項３】フラグメントのＮ末端残基がＨＣＶＮＳ２／３プロテアー
ゼ前駆体の９０３位のアミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載のポリペ
プチド。
【請求項４】フラグメントのＮ末端残基がＨＣＶＮＳ２／３プロテアー
ゼ前駆体の９０７位のアミノ酸であることを特徴とする請求項２に記載のポリペ
プチド。
【請求項５】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのフラグメントに比較して
全長で９０％の配列一致を有しているアミノ酸配列から成るポリペプチドであっ
て、前記プロテアーゼがＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体として天然に産
生され、前記フラグメントが、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体の残基９
０３−９１３の位置のアミノ酸をそのＮ末端残基として有しており、ＨＣＶＮ
Ｓ２／３プロテアーゼ前駆体の残基１２０６−１６５７の位置のアミノ酸をその
Ｃ末端残基として有しており、前記ポリペプチドがホモダイマーであるときは自
己タンパク質分解活性を有しており、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体が
ＨＣＶＪ株（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｄ９０２０８）、ＨＣＶＨ株
（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６７４６３）またはＨＣＶＨ７７株（Ｇ
ｅｎｂａｎｋＡｃｃ．ＡＦ００９６０６）の内部の核酸によってコードされて
いることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】１つまたは複数の異種アミノ酸残基に融合していることを特
徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコー
ドしている単離された核酸。
【請求項８】前記ポリペプチドの発現調節配列に作動可能に結合されてい
ることを特徴とする請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】請求項８に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主
細胞。
【請求項１０】前記ポリペプチドを産生するために請求項８に記載の発現
ベクターから発現を生じさせることを特徴とするポリペプチドの産生方法。
【請求項１１】前記発現ベクターによって形質転換された細胞を前記ポリ
ペプチドが産生される条件下で培養する段階を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】産生されたポリペプチドが不溶性封入体として蓄積する条
件下で宿主細胞を培養することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】宿主細胞を亜鉛欠失培地で培養することを特徴とする請求
項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記ポリペプチドを単離及び／または精製する段階を含む
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】ポリペプチドの再生又はリフォールディング段階を含む請
求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】ポリペプチドを自己タンパク質分解活性をもつホモダイマ
ーに形成する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法で得られたホモダイマー。
【請求項１８】請求項１から６のいずれか一項に記載の２個のポリペプチ
ドから成るホモダイマー。
【請求項１９】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼのフラグメントから成る
ポリペプチドを得る方法であって、前記プロテアーゼがＨＣＶＮＳ２／３プロ
テアーゼ前駆体として天然に産生され、前記ポリペプチドがホモダイマーである
ときは自己タンパク質分解活性を有しており、方法が、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの１つまたは複数の欠損フラグメントを準備
する段階と、１つまたは複数の欠損フラグメントについて自己タンパク質分解活性をもつホ
モダイマー形成能力を試験して自己タンパク質分解活性をもつホモダイマーを同
定する段階と、から成る方法によって前記ポリペプチドが得られることを特徴とする方法。
【請求項２０】１つまたは複数の欠損フラグメントがＮ末端残基としてＨ
ＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体の残基９０３−９１３の位置のアミノ酸を
有しており、Ｃ末端残基としてＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ前駆体の残基１
２０６−１６５７の位置のアミノ酸を有していることを特徴とする請求項１９に
記載の方法。
【請求項２１】コーディング核酸から発現させることによって前記１つま
たは複数の欠損フラグメントを産生することを特徴とする請求項１９または２０
に記載の方法。
【請求項２２】前記コーディング核酸で形質転換させた宿主細胞を前記１
つまたは複数の欠損フラグメントの産生条件下で培養することによって生じた発
現によって前記１つまたは複数の欠損フラグメントを産生することを特徴とする
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】産生されたポリペプチドが不溶性封入体として蓄積する条
件下で宿主細胞を培養することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】宿主細胞を亜鉛欠失培地で培養することを特徴とする請求
項２３に記載の方法。
【請求項２５】請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法によって
得られた２個のポリペプチドから成るホモダイマー。
【請求項２６】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する薬剤の
能力を試験するアッセイ方法であって、（ａ）被験薬剤を請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドまたは２個の
前記ポリペプチドから成るホモダイマーに接触させる段階と、（ｂ）２個の前記ポリペプチドから成るホモダイマー及び／またはＨＣＶＮＳ
２／３プロテアーゼ活性の形成を判定する段階と、から成るアッセイ方法。
【請求項２７】前記ポリペプチドのダイマー化を判定する段階を含む請求
項２６に記載の方法。
【請求項２８】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ活性を測定する段階を含
む請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】被験薬剤をＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性調節物
質として同定する段階を含む請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】更に、ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼの活性を調節する
前記物質、または場合によっては前記物質がペプチジルであるときは前記物質を
コードしている核酸を、少なくとも１つの追加成分を含む組成物に配合する段階
を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】ＨＣＶＮＳ２／３プロテアーゼ活性を調節する物質を同
定または製造するための、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチド
または２個の前記ポリペプチドから成るホモダイマーの使用。