KR100245318B1 - 헤르페스 프로테아제 억제제의 동정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헤르페스 프로테아제 및 2개의 단백질에 대해 암호화하는 핵산 단편의 동정 및 정제 방법에 관한 것이다. 제 1 단백질은 그 자체가 절단될 수 있고 또한 제 2 단백질을 절단시킬 수 있는 헤르페스 프로테아제이다. 상기 프로테아제는 헤르페스 바이러스 캡시드의 배열에 필요하며, 따라서 복제에 필수적이다. 제 2 단백질은 이미 ICP 35로, 바이러스 감염 세포중의 단백질 족으로 표시되어 있다. 본 프로테아제 및 이의 기질은 중복 핵산 단편에 의해 암호화된다. 본 발명은 또한 제 2 단백질에 대한 프로모터 서열에 관한 것이다. 바이러스 프로테아제 생산방법, 헤르페스 질환 치료용으로 고안된 약물, 헤르페스 및 캡시드 생산을 위해 헤르페스 프로테아제와 거의 유사한 프로테아제를 이용하는 기타 바이러스 감염증 치료 방법에 사용될 수 있는 프로테아제 억제제 스크리닝 방법이 제공된다. 헤르페스 감염증 및 기타 바이러스 감염증 감지 방법이 또한 기술되어 있다.

Description

헤르페스 프로테아제 억제제의 동정 방법
제 1 도는 HSV-1 게놈의 서열 배열, UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임의 위치 및 이들의 전사물, 및 본 발명에서 사용하기 위해 작제된 시험 플라스미드의 구조를 도시한 것이다.
제 2 도는 UL26 개방 판독 프레임의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한 것이다. +1 부위는 UL26 개방 판독 프레임의 해독 개시 부위와 상응한다.
제 3 도는 HSV-1 게놈성 DNA, UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임(ORF) 사이의 관계 및 이 유전자 시스템의 해독 및 해독 후 산물을 도시한 것이다.
제 4 도는 모의(mock)-감염시킨 세포 및 12시간 감염시킨 Vero 세포로부터의 총 세포질성 RNA와 하이브리드화하고 S1 뉴클레아제를 분해한 DNA 프로브 1(A) 및 프로브 2(B)의 자동방사선사진 상을 도시한 것이다.
제 5 도는 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 바이러스로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, HSV-1 ICP35에 대한 염소의 모노클로날 항체 H725(HSV Ab)와, 반응시킨, 세포의 용해질로부터 수득한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 6 도는 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 바이러스로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시킨, 세포 용해질로부터 수득한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 7 도는 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 HSV-1으로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시킨, 세포 용해질로부터 수득한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 8 도는 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 바이러스로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시킨, 세포 용해질로부터 수득한 폴리펩티드의 자동방사선사진 상 및 사진 상을 도시한 것이다.
제 9 도는 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 해독되고 9.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기 영동으로 분리한,35S-메티오닌으로 표지된 폴리펩티드의 자동 방사선사진 상을 도시한 것이다.
제 10 도는 34℃(34°) 또는 39℃(39°)에서 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 HSV-1(F)으로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, 모노클로날 항체 H725 내지 HSV-1 ICP35(HSV Ab)와 반응시킨 다음 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 염색시킨, 세포로부터 전기 영동으로 분리시킨 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 11 도는 34℃, 39℃, 또는 37℃에서 플라스미드로 형질감염시키고 HSV-1(F) (HSV-1)으로 모의-감염 또는 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트로 전기적 이동시켜 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시킨 다음 퍼옥시다제에 결합된 염소항-마우스 IgG 항체로 염색시킨, 세포로부터 전기영동으로 분리한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 12 도는 34℃, 39℃, 또는 37℃에서 플라스미드로 형질감염시키고 HSV-1(F) (HSV-1) 또는 HSV-2(G) (HSV-2)로 중복감염시킨 다음, 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시킨 다음 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 염색시킨, 세포로부터 수득한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 13 도는 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리한 UL26 개방 판독 프레임에 의해 암호화된35S-메티오닌으로 표지된 폴리펩티드의 자동방사선사진 상을 도시한 것이다.
제 14 도는 플라스미드 U 또는 Y 내에서 암호화된 서열로부터 시험관내 합성하거나 플라스미드 X 또는 Y를 사용하여 형질감염시키고 HSV-1(F) 또는 HSV-1(G)로 중복감염시킨 세포들의 용해질중에 함유된 폴리펩티드의 자동방사선사진 상 및 사진 상을 도시한 것이다.
제 15 도는 프로테아제 억제제로서 PMSF의 작용을 나타내기 위해 변성 겔내에서 전기영동으로 분리한 UL26 개방 판독 프레임에 의해 암호화된35S-메티오닌 표지된 폴리펩티드의 자동방사선사진 상을 도시한 것이다.
제 16 도는 34℃(34°) 또는 39℃(39°)에서 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 HSV-1(F)로 중복감염시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜 우선 HSV-1 ICP35 에 대한 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CMV 에피토프에 대한 CH28-2 (CMV Ab)와 반응시키고, 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 염색시킨, 세포의 용해질로부터 전기영동으로 분리한 폴리펩티드의 사진 상을 도시한 것이다.
제 17 도는 플라스미드 작제물 Y 내에서 클로닝된 UL26 ORF로부터 시험관내 전사된 합성 RNA로부터의 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 시험관내 해독된, 전기영동으로 분리된 폴리펩티드의 자동방사선사진 상을 도시한 것이다.
제 18 도는 돌연변이유발의 연구 결과를 간략하게 도시한 것이다.
본 발명는 헤르페스 프로테아제(Herpes protease)의 동정 및 정제 방법 및 헤르페스 프로테아제를 암호화하는 핵산 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 프로테아제의 작용을 억제시킬 수 있는 후보 물질의 선별법 및 바이러스성 감염증의 검출 및 치료를 위한 이러한 억제제의 용도에 관한 것이다.
바이러스성 감염증의 치료 및 예방은 의학계의 주요 목표다. 바이러스성 감염증의 치료 및 예방법을 개발하는데 있어서 당해 기술분야의 상태를 이해하기 위해서는 감염성 바이러스의 구조 및 기능을 이해하는 것이 중요하다. 바이러스는 일 분쇄 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA를 함유하며 2개의 별개의 상태, 즉 세포내 및 세포와 상태를 교대할 수 있는 작은 유전 요소이다. 바이러스는 그 자체에 의해서는 복제할 수 없는 필수적인 세포내 기생물이다. 실제로, 바이러스는 숙주세포의 생합성 기관 전체에서 발견되며 바이러스 합성을 위해 이를 이용한다. 바이러스 DNA의 단백질 생성물중 몇몇은 숙주 세포의 대사를 중단시키는 특히 효소 또는 억제 인자이지만, 대부분의 바이러스-암호화된 단백질은 새로운 비리온(virion)의 작제에 사용된다. 단백질 합성은 바이러스의 복제 및 패키징(packaging)에 필수적인 성분, 예를들면 캡시드(capsid)를 생산하기 위해 바이러스에 의해 유도된다. 이들 성분은 바이러스에 따른 순서대로 조립되어야 하며, 새로운 입자는 이들이 다른 세포를 감염시킬 경우 세포로부터 탈출해야 한다.
세포내 바이러스의 일반적인 복제 단계(용균 사이클)은 다음과 같다:
1. 숙주세포에 바이러스의 부착(흡착);
2. 숙주세포로 바이러스 또는 이의 핵산의 침투;
3. 바이러스 헥산의 복제;
4. 바이러스 단백질과 기타 필수성분의 생산;
5. 바이러스 핵산과 단백질 성분의 조립 및
6. 숙주 세포로부터 성숙 비리온 입자의 방출.
바이러스가 숙주의 생명력을 전유하기 때문에 용균 사이클을 거친후 새로운 바이러스 입자와 죽은 숙주 세포가 존재한다. 헤르페스가 유발시키는 감염증과 같이 특정 타입의 감염증에서는, 바이러스가 숙주 세포내에 거주하는 잠복기가 있을 수 있다.
바이러스 유전 시스템을 밝힘으로써, 단순한 학문적 관심에서가 아니라, 바이러스 원인 질환의 검출, 예방 및 치료를 위한 바이러스성 감염증의 메카니즘 및 복제에 대한 연구의 장이 열린다. 바이러스성 감염증에 대한 숙주 내성은, 숙주세포에 바이러스의 부착을 방지하기 위한 바이러스-수용체 부위의 부재; 바이러스가 숙주 세포내로 주입된 후, 예를 들어 숙주 효소에 의한 바이러스 핵산의 절단과 같은 바이러스 핵산의 파괴; 필수적인 바이러스 단백질 합성의 억제; 또는 숙주 세포내에서 바이러스 단백질이 형성된후 바이러스 단백질의 파괴를 통해 발생할 수 있다.
자연 내성을 보충하기 위한 항바이러스 약물의 개발이 주요 상업적 목적이며, 이의 목표는 사람에 있어서 수많은 바이러스성 감염증의 파괴 효과를 방해하는 것이다. 불행하게도, 현재 이용되는 치료방법은 바이러스의 대부분의 유형에 대해 적합치 못하다. 예를 들면, 인터페론은 바이러스 증식을 억제하는 저분자량의 세포성 항바이러스 단백질이다. 그러나, 인터페론은 바이러스 특이적이 아니라 숙주 특이적인 경향이 있으며, 이미 감염된 숙주 세포에 대해서는 효과가 없다. 또한, 이들은 고농도에서 독성이 있을 수 있다.
항바이러스 약물의 표적은 바이러스에 대해 독특하게 특정화된 효소일 수 있다. 예를 들어, AIDS를 일으키는 HIV 감염증의 퇴치를 위한 주요 표적은 역전사효소이다. 상기 효소를 억제하는 것이 바이러스 복제 차단에 효과가 있다. 불행하게도, 이들 약물, 예를 들면 AZT에 대한 내성이 전개되어 상기 치료의 주요 제한요인이 된다. 현재 시판되고 있는 항-헤르페스 심플렉스 바이러스 약물은 바이러스 DNA를 합성하는 효소에 관한 것이다(예 : acyclovir). 바이러스가 이들 약물에 대해 내성을 형성하기 때문에, 새로운 표적에 상당한 관심이 쏠리고 있다.
바이러스 단백질의 생산 단계가 바이러스를 공격할 수 있는 단계로서 특히 관심의 대상이 된다. 세포외 또는 감염성 상태에서, 바이러스의 기본 구조는 단백질로 둘러싸인 핵산 코어(뉴클레오캡시드)로 이루어져 있다. 일부 바이러스는 또한 상기 뉴클레오캡시드 외부에 위치하고 지질과 단백질을 함유하는 외막을 갖는다. 단백질 피복물을 통상 캡시드(capsid)라 칭한다. 수많은 상이한 단백질이 바이러스에 따라 캡시드를 구성할 수 있다. 일부 바이러스는 3 내지 10개의 단백질을 암호화하고, 일부 바이러스는 200개 이상을 암호화한다. 바이러스 입자를 비리온(virion)이라 한다; 이들의 역할은 바이러스가 복제된 세포로부터 새로운 숙주세포로 옮겨갈때 바이러스 핵산을 보호하는 것이다. 숙주 세포로 옮겨간 후, 바이러스의 세포내 상태가 시작되며, 바이러스 복제가 가능해진다. 수많은 비-헤르페스 바이러스가, 치료 조정을 위한 잠재적 대상인, 절단 부위 특이성을 갖는 프로테아제를 발현시킨다. 그러나, 특히 만연된 감염제로서 이에 대한 예방 및 치료법이 상당히 부적합한, 헤르페스 바이러스에 대한 상기와 같은 프로테아제가 동정된 바 없다.
헤르페스 바이러스 부류에는 수많은 질환의 원인제로서 임상적 관심이 높은 동물 바이러스가 있다. 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스는 암 개시와 관련되어 있고, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)는 AIDS 환자에 가장 큰 감염위협이 되며, 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)는 수두 및 대상 포진이 심각한 건강상의 문제가 되고 있는 세계의 일부 지역에서 큰 관심의 대상이 되고 있다. 성적으로 전파되는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)의 감염 빈도가 신생아 헤르페스 증가와 함께 지난 10년간 크게 증가했다. 활성 궤양 병소 또는 임상적인 징후가 없는 환자와 접촉시에는 감염성 제제가 전파될 수 있다. 점액성 표면 및 탈피 피부가 바이러스에 노출되어 전파되며, 이는 바이러스의 침투를 가능케하고 표피 및 피부 세포에서 바이러스 복제가 개시되도록 한다. 임상적으로 뚜렷한 병소외에, 잠복성 감염증이 특히 신경 세포에 존재할 수 있다. 다양한 자극으로 HSV 감염이 재활성화될 수 있다. 따라서, 이것이 감염증을 박멸시키는데 어려운 점이다. 이 난제들은 치료 양상이 부적합하여 대부분 점검되지 않았다.
헤르페스 심플렉스 바이러스(Herper simplex virus) 아유형 1 및 2(HSV-1, HSV-2)는 사람이 직면하게 되는 가장 흔한 감염제인 헤르페스 바이러스이다[참조: Corey and Spear, 1986; Whitley, 1990]. 이들 바이러스는 재발성 헤르페스 심플렉스 구순염과 같은 비교적 경미하고 귀찮은 감염증에서부터 청소년 및 성인의 헤르페스 심플렉스 뇌염(HSE), 또는 신생아의 전염된 감염증과 같이 심각하고 생명을 위협하는 질병까지 광범위한 질병의 원인이 되고 있다. 헤르페스 감염증의 임상결과는 조기 진단 및 항바이러스 치료의 신속한 개시에 따른다. 그러나, 몇몇 성공적인 치료에도 불구하고, 피부 및 표비 병소가 재발하며, 신생아의 HSV 감염증 및 뇌 감염증은 높은 이환율 및 사망율과 관련되어 있다. 현재 가능한 것보다 빠른 조기의 진단은 치료 성공율을 향상시킨다. 또한, 개선된 치료방법이 절실하게 요구되고 있다.
부대적인 보조인자가 감염 세포에, 특히 화학 물질의 형태로 제공되었다. 예를 들면, 헤르페스 바이러스 복제의 화학적 억제는 5-플루오로데옥시우리딘(FUDR), 5-요오도데옥시우리딘, 5-요오도데옥시우리딘, 티민 아라비노시드 등과 같은 여러가지 뉴클레오시드 동족체에 의해 수행되었다.
동물 실험 모델에서 다중특이적 또는 단일특이적 항-HSV 항체, HSV-프라임된 임파구, 및 특성 바이러스 항원에 대한 클론된 T 세포에 의해 일부 보호방법이 제공되었다[참조 : Corey and Spear, 1986]. 그러나, 만족스러운 치료방법은 발견된바 없다.
헤르페스 바이러스에서 프로테아제는 동정된 바 없으나, 헤르페스 바이러스 부류의 생물학에 대해서는 어느 정도의 지식이 축적되어 있다. 헤르페스 바이러스는 숙주 세포 핵내에서 복제하는 이본쇄 DNA 바이러스이다, 헤르페스 비리온은 숙주 세포내에서 조립되는 30개 이상의 상이한 단백질로 구성되어 있다. 약 6 내지 8개가 캡시드에 사용된다. 헤르페스 바이러스에 바람직한 숙주 세포는 척추 동물 세포이다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 1(HSV-1) 게놈은, 변성 겔내에서 성분 단백질의 상이한 분자량에 기인하여 다중 밴드를 형성하는 수많은 캡시드 단백질 복합체를 정의한다. 이들 단백질의 예비 동정이 일부 보고된 바 있다. 한 세트의 헤르페스 심플렉스 바이러스 1(HSV-1) 캡시드 단백질이 깁슨과 로이즈만[Gibson and Roizman, 1972, 1974]에 의해 보고된 바 있다. 변성 겔중에서 이들의 이동 밴드에 의해 동정된 바이러스 캡시드 단백질의 유전적 및 면역학적으로 관련된 부류를 감염된-세포 단백질 35(ICP 35)로 지칭한다[참조 : Braun et al., 1983, 1984]. 1차원적 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 적어도 4개의 주요 밴드와 수많은 부수적 밴드, 및 2차원 겔에서 수많은 점(spot)이 보고되었다.
H745에 의해 예시된 모노클로날 항체의 패널을 사용하여 브라운 등[Braun et al., 1984]은, ICP35 단백질이 SDS 폴리아크릴아미드 겔상의 전기영동적 이동성면에서 상이한 적어도 6가지 종류(ICP35a, b, c, d, e, f)로 해독후 프로세싱된다고 보고하였다. 상이한 분자량으로 특징화되지만, 이런 그룹의 바이러스 폴리펩티드는 동일한 모노클로날 항체로 검출되며 HSV-1 게놈중의 하나의 영역에 의해 암호화된다. 비어 있는 캡시드는 이들 폴리펩티드를 함유하지 않는다. ICP35와 어느 정도 유사한 한 세트의 단백질이 프레스톤 등 [Preston et al.(1983)]에 의해 보고되었다.
HSV-1 게놈에 대한 뉴클레오티드 서열 분석이 수행되었으며, 다양한 캡시드 단백질을 게놈 서열과 관련시키는 시도가 이루어졌다(일반적으로 성공적이지 못했다). 예를 들면, ICP35 단백질이 UL26으로 지정된 개방 판독 프레임에 의해 암호화 되는 것이 제안된 바 있다[참조 : McGeoch, et al., 1988]. 본 발명에서는 이러한 예측이 부정확하거나 적어도 불완전하다는 것을 밝힌다. ICP35를 암호화하는 영역의 대략적 매핑이 브라운 등[Braun et al., (1984)]에 의해 HSV-1 ×HSV-2 중간형(intertypic)재조합체의 분석을 기본으로하여 시도되었다. 이들은 ICP35가 티미딘 키나제(UL23)와 당단백질 B(UL27)을 특정화하는 유전사 사이에 위치한 영역에 의해 암호화된다고 제시하였다. 이는 현재 4개의 유전자를 포함하는 것으로 공지된 영역을 포함하기 때문에 매우 특이적인 예측이 아니다.
본 발명에 따라 치료를 위한 신규한 바이러스 표적을 찾아내었다. 이러한 연구는 기질로서 HSV-1 ICP35 단백질 부류를 선택함으로써 시작되었다. 특히, 헤르페스 바이러스 감염증에 적용되는 것과 같이, 항바이러스 화학 치료를 위한 프로테아제 표적이 이러한 방법으로 확인되었다. 프로테아제의 제조 및 검출방법, 프로테아제 억제제의 선택 방법뿐만 아니라, 프로테아제의 억제를 기본으로 한 검출 및 치료 프로토콜이 또한 본 발명의 양태이다. HSV-1중 헤르페스 프로테아제에 대한 유전자와 사람의 사이토메갈로바이러스중 상기 유전자 간에 유사성이 밝혀짐으로써, 본 발명은 HSV, CMV, EBV 및 VZV를 포함하는 모든 헤르페스 바이러스에 광범위하게 적용될 수 있다.
본 발명은 바이러스 감염의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물을 개발하기 위한 바이러스 프로테아제의 동정, 정제 및 조작에 관한 것이다. 본 발명의 프로테아제는 상기 범주의 프로테아제의 예측된 특성을 갖는 세린 프로테아제로서 추가 정의될 수 있다. 세린 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이고, 전형적으로 활성 부위에 세린 잔기를 갖는다[참조 : White, Handler and Smith, 1973]. 세린 프로테아제는 또한 전형적으로 아미노산의 선형 배열에서는 서로 약간 이동될 수 있지만 적절하게 폴딩된 프로테아제에서는 서로 ＆quot;단백분해적 중렬(cleft)＆quot;로 되는 촉매적 잔기의 3주징(triad) 배열을 포함한다. 프로테아제마다 상기 촉매적 3주징에서 여러가지 차이점이 관찰된다. 예를 들면, 트립신과 서브틸리신 세린 프로테아제 둘다에서는 Asp, His 및 Ser이 촉매적 3주징의 아미노산이다. 그러나, 트립신-유사 세린 프로테아제에서는 이들이 His, Asp, Ser 순으로 배열되는 반면, 서브틸리신-유사 프로테아제에서는 Asp, His, Ser 순으로 배열된다. 이들 주요(key) 잔기의 상대적 공간화에 있어서도 차이점이 있다. 또한 이들 프로테아제가 세린 프로테아제로 동정되어 분류되도록 하는 다른 진화적 보존 특징이 있다. 그러나, 촉매적으로 중요한 Asp, His 및 Ser 잔기의 존재가, 세린 프로테아제의 구성 및 분류에 있어서 중요한 테스트이다.
본 발명의 프로테아제는 바이러스의 캡시드 전개에 있어 필수적인 것으로 보인다. 결과적으로, 프로테아제 작용을 억제시키면 바이러스의 용균 사이클이 파괴된다. 상기와 같은 프로테아제가 항바이러스 치료에 있어서 최적의 표적인 점은 명백하다. 특히, 상기 표적은 지금까지 프로테아제가 보고된 바 없는 헤르페스 바이러스에 대한 공격에 유용하다. 본 발명은 더욱 특히 헤르페스 세린 프로테아제의 동정, 정제 및 조작, 및 헤르페스 감염을 검출하고 치료하기 위한 프로테아제 억제제의 용도에 관한 것이다.
예시적 양태에 있어서, 프로테아제는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 아유형인 HSV-1으로부터 정제된다. SDS-폴리아크릴아미드 PAGE 겔 전기영동법으로 측정한 본 프로테아제의 겉보기 분자량은 대략 75 내지 85kd, 일반적으로 약 80kd이다. 헤르페스 프로테아제는 또한 대략 450 내지 635개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 것으로 특징된다. 그러나, 이들 범위는 유동적이다. 예를 들어, 635개의 아미노산 서열은 이의 카복실 말단으로부터 제거된 적어도 329개의 아미노산을 가질 수 있으며 여전히 세린 프로테아제 활성을 보유한다. 635개 아미노산 양태에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 카복실 말단으로부터 약 18 내지 25번 아미노산, 바람직하게는 카복실 말단으로부터 약 20번 아미노산 위치에 존재한다. 상기 프로테아제는, HSV-1 및 2가 주입된 세포, 상기 프로테아제를 암호화하는 DNA 서열로 형질감염시킨 세포로부터, 시험관내 또는 세포-비함유 시스템 중에서, 예를 들어 토끼로부터의 망상적혈구 용해질을 사용하여 합성함으로써 정제 형태로 수득된다. 단백질 합성후, 상기 단백질은 변성 겔 상에서 단일 밴드로 이동하고35S 표지된 메티오닌에 의해 용이하게 검출된다. 단백질 합성 약 5시간 경과후, 2개의 밴드가 나타난다. 이후 입증되는 바와 같이, 제 2 밴드는 제 1 산물의 자가-분해 산물이다.
이러한 프로테아제의 특징은 다음과 같다: (i) 4개의 도메인(이중 몇개는 촉매 활성에 필요하지 않다)을 함유하고; (ii) 활성 부위가 프로테아제의 아미노 말단 근처에 있다. 아미노산 치환, 결실, 종결 코돈 또는 20개 아미노산 스트레치의 프로테아제의 삽입을 포함하는 돌연변이는 유전자의 아미노 및 카복실 도메인에서 없어도 되는 도메인(I)및 (IV)를 기술한다. 필수적인 카복실-인접 도메인(III)은 적어도 20개의 아미노산에 의해 필수적인 아미노-인접 도메인(II)로부터 분리될 수 있고, 상기 프로테아제는 기능성을 유지한다.
아미노-인접 도메인은 바리셀라-조스터 바이러스와 UL26의 사람 사이토메갈로 바이러스 동족체간의 가장 보존된 영역이다. 상기 도메인중에서 시험된 보존된 아스파르트산, 히스티딘, 또는 세린 아미노산 코돈중에서, 히스티딘 잔기 61과 148만은 프로테아제의 단백분해 활성의 손상없이 대체시킬 수 없었다. 3차원 결정 구조 분석으로 활성 부위의 구조에 대한 추가의 정보가 제공될 수 있다[참조 : Skalka, 1989).
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 헤르페스 프로테아제를 암호화할 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다. 예시적 양태에 있어, HSV-1 게놈내의 핵산 서열의 광범위한 조작으로 바이러스 메카니즘의 비밀이 밝혀졌으며, 유용한 핵산 단편과 이의 발현 산물의 분리 및 정제를 가능케 했다. 그러한 조작의 예에는, 핵산 서열의 선택된 단편을 적합한 프로모터 및 트레이서와 함께 플라즈미드내로 혼입시켜 유전 영역의 작용과 상호작용, 이의 발현 산물, 및 이의 발현에 대한 조절 메카니즘을 측정하는 것이 포함된다. 이들 특수 작제된 플라스미드가 본 발명의 양태이다.
본 발명의 다른 양태는 ICP35로 지칭된 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 캡시드 단백질 부류에 대한 핵산 단편중의 암호화 도메인에 관한 것이다. 이러한 새로이 정의된 암호화 영역은 UL26.5로 지칭되었다. ICP35 단백질에 대한 암호화 서열의 예시적 양태에서, 이 단편을 Hpa-I 및 Pst-I의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위로 분리시켰다. 이들 2개의 절단 부위들은 맵 위치 +832 및 +2761에 위치한다. 이들 맵 위치는 HSV-1 게놈내에서 UL26 개방 판독 프레임의 전사 개시 부위로부터의 거리로 정의된다. 이 위치는 +1로 지칭되었다. ICP35 단백질을 암호화하는 유전자는 맵 위치가 +2104인 KpnI 부위로부터 하향으로 위치하는 서열들을 또한 포함하며, +2138 위치에서 폴리 A 부위에 연결되어져 있다.
추가로, 본 발명의 핵산 단편은 프로테아제 및 ICP35 단백질에 대한 중첩된 개방 판독 프레임을 가진 것으로 정의된다(제 2 도). 이들 중첩된 단편들은 ＆quot;3' 공동 말단＆quot; 부위이다. 두개의 중첩된 단편중 보다 긴 첫번째 단편은 첫번째 단백질을 암호화한다. 이러한 첫번째 단백질의 분자량은 대략 75 내지 85kd이다. 두개의 중첩된 개방 판독 프레임 서열중 보다 짧은 두번째 개방 판독 프레임은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기양동법에 의해 측정된 겉보기 분자량이 대략 40 내지 55kd이며, 바람직하게는 45kd이다. 첫번째 단백질은 세린 프로테아제 작용에 따라 아미노산을 절단할 수 있는 단백 분해성 모듈을 암호화하는 것으로 정의된다. 절단 될 수 있는 기질은 UL26 유전자에 의해 암호화된 프로테아제 서열 자체이거나, 일차원 및 이차원 겔내에서 이동하는 것을 기준으로하여 ICP35c, d로 치칭되는 ICP35 전구체 단백질들일 수 있다. 20개 아미노산 에피토프의 삽입으로 절단이 방해되진 않는다.
두번째 단백질은 암호화하는 핵산 단편 DNA 또는 RNA는 HSV-1 양태에서 대략 990개의 염기쌍을 포함한다. 특정의 적용에 있어서, 암호화되는 단편은 절단시 ICP35 e 및 f를 생성하는 서열들만을 포함해야 한다. 다른 적용에 있어서, 단지 절단 부위 자체는 예를 들면 이후에 기술된 후보 억제제 검정에서 암호화되는 것이 바람직할 수 있다. 예시적 양태에서, 이러한 핵산 단편은 본원의 제1도 5열에 기술된 단편들, 또는 이들의 기능적 등가물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 기능적 등가물은, 특정한 구조적 변화가 있음에도 불구하고 ICP35를 절단할 수 있는 촉매적으로 활성인 프로테아제이거나 이들을 암호화하는 효소 및 이의 암호화 핵산 서열을 언급한다. 단백질 구조에 변형 및/또는 변화를 일으켜 유사하거나 달리 바람직한 특성을 지닌 분자를 수득할 수 있음이 당해 분야에 공지되어 있다. 즉, 특징의 아미노산을, 예를 들어 기질 분자 또는 특히 항체와의 상호 결합하는 능력을 감지할 수 있을 정도로 상실시키지 않으면서, 단백질 구조내에서 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 이것이 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하는 단백질의 상호작용 능력 및 특성이므로, 특정의 아미노산 서열 치환이 단백질 서열(또는, 물론 이의 기본적인 DNA 암호화 서열)내에서 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 헤르페스 프로테아제 DNA 또는 단백질 서열 내에서 이들의 생물학적 이용성 또는 활성의 감지 가능한 상실없이 다양하게 변화시킬 수 있음을 주지하였다.
이와 같은 변화를 이루기 위해, 아미노산의 수치료성 지표(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질상에서 상호작용하는 생물학적 기능을 고려할때, 수치료 아미노산 지표, 즉 소수성 및 하전 특성의 중요도가 일반적으로 당해 분야에서 인지되어 있다[참조 : Kyte et al., 1982]. 예를 들면, 특정의 아미노산은 비교가능한 수치료 지표 또는 수치료 스코어, 즉 일반적으로 +/1 정도인 다른 아미노산으로 치환되어도 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있다. 아미노산의 상대적인 수치료성 특성은 수득된 단백질의 이차 구조를 결정하여 결국 단백질과 기질 분자의 상호작용을 규정하는 것으로 믿어진다. 따라서, 예를 들면, 수치료성 지표가 +4.5인 이소루이신로 발린(+4.2) 또는 루이신(+3.8)을 치환해도 생물학적 활성이 유사한 단백질을 수득할 수 있다. 달리는, 스코어의 다른 말단에서, 라이신(-3.9)으로 아르기닌(-4.5)을 치환시키는 것도 제안된다.
따라서, 아미노산 치환은 일반적으로 측쇄 치환제의 상대적인 유사성, 예를 들면, 크기, 친전자성, 하전등에 기준한다. 다양한 상기한 특성을 고려한 예시적 치환이 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 알라닌, 글라이신 및 세린; 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파테이트; 세린 및 트레오닌; 및 발린, 루이신 및 이소루이신이 포함된다.
본 발명의 핵산 서열은 적용분야가 많은 하이브리드화 포브브로서 또한 유용하다. 하이브리드화 프로브는, 예를 들어 안티센스 분자(예; 안정화된 안티센스 RNA 분자)의 제조시, PCR 프라이머 또는 프로브로서, 라이브러리로부터 돌연변이체 유전자 클론을 선별하고, 단백질 암호화 능력에 적용하기 위한 것으로서(또는 추가하여) 하이브리드화를 포함하는 많은 적용분야에 사용할 수 있다. 물론, 유용한 하이브리드화 프로브는 적용 목적 및 하이브리드화 조건에 따라서 실질적으로 어떠한 길이로도 제조될 수 있다. 하이브리드화 조건이 프로브와 주형 사이의 서열 상동성 수준에 적합하다면, 예를 들면 10 내지 14 뉴클레오티드 길이의 짧은 프로브도 주형 분자와 함께 안정한 하이브리드를 형성하는 것으로 예상될 수 있다. 마찬가지로, 하나의 유전자를 암호화하거나, 심지어 여러개의 유전자들을 암호화하기에 충분한 길이를 지니는 분자들도 하이브리드화 프로브로서 사용할 수 있다.
어떠한 경우에도, 바람직한 양태에서 하이브리드화 프로브 또는 프라이머로서 유용한 핵산 분자의 크기는 적용 목적 및 하이브리드화 조건에 따라서, 예를 들면 10-14개 내지 20, 30, 40 또는 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로부터 100, 200, 500 개 또는 심지어 1000 또는 2000개 이하의 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 핵산 단편은 제 1 도에 나타낸 것보다 짧거나 긴 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 엄격한 조건하에서 제 1 도의 핵산 단편과 하이브리드화할 수 있는 대략 14개 뉴클레오티드 염기쌍에 상응할 수 있다. 이와 같이 짧은 단편들은 프로테아제 암호화 영역의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
핵산 단편은 또한 프로테아제 또는 ICP35 단백질에 대한 mRNA 서열일 수 있다. 후자에 대한 mRNA는 대략 뉴클레오티드 위치 +1000(+1로 지정된 헤르페스 UL26의 전사 개시 부위로부터의 지정된 거리) 내지 +2138 위치에서 전사된다. mRNA는 +1099에 위치하는 메티오닌 개시 코돈으로부터 해독된다. 보다 짧거나 긴 단편들 또한 사용되는 단편의 용도에 따라 고려될 수 있다 . 이들 mRNA 단편들은 ICP35 절단 부위를 합성하는데 유용하다.
헤르페스 게놈내의 다양한 핵산 단편이 분리 및 클로닝되었다. 헤르페스 프로테아제를 암호화하는 핵산 단편은 UL26 헤르페스 개방 판독 프레임의 맵 위치에 상응하는 영역으로부터의 헤르페스 게놈에서 수득할 수 있다. 프로테아제 암호화 단편내에 함유된 보다 짧은 단편은 티미딘 키나아제 유전자와 당단백질 gB 유전자 사이에 위치하며, +832 내지 +2138 위치의 DNA 서열을 포함한다. 이러한 암호화 서열은 단지 ICP35 헤르페스 캡시드 부류 단백질로서만 발현될 수 있는 것이 아니라, ICP35 암호화 서열을 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
ICP35 프로모터가 분리되었으며, 보다 긴 UL26 개방 판독 프레임으로부터의 프로테아제 제조와 비교하여 ICP35 암호화 단위에 의해 기질의 카피수 증가가 관측됨으로써 입증되는 바와 같이, 매우 활성인 프로모터인 것으로 밝혀졌다. 이것은 135 내지 168개의 염기쌍들을 포함하며, UL26의 첫번째 개방 판독 프레임내 +832 내지 +1000 위치 사이에 위치된다. 이러한 프로모터 영역은 ICP35 단백질의 발현을 개시할 수 있다. 또한, 다른 핵산 서열, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 유전자 US5 및 UL10을 증가된 비율로 발현을 유도시키는 데도 유용하다.
ICP35 단백질에 대한 암호화 서열의 분리 및 조작은, 이들 단백질이 헤르페스 바이러스 캡시드의 작제시에 사용되므로 본 발명의 수행에 중요하다. 캡시드의 기능원이 되기 위해서는, ICP35 단백질 전구체 ICP35c, d가 UL26 암호화 서열에 의해 생성된 헤르페스 프로테아제에 의해 절단되어 e 및 f를 생성해야 한다. 이러한 프로테아제는 프로테아제 및 전구체를 암호화하는 두 유전자들이 트랜스 위치에 있는 경우에서도 전구체 단백질을 효과적으로 절단할 수 있다.
암호화 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 단편은 암호화된 바이러스 세린 프로테아제를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 백터내에 포함될 수 있다. 이와 같은 핵산 단편의 예들은 본 명세서에서 A 내지 Z, AA 내지 NN으로 지정한 제 1 도의 헤르페스 바이러스 HSV-1에 대해 나타낸 것들로서 이들 핵산 단편 또는 이들의 기능적 등가물은, 임의로, 선별된 프로모터 및/또는 조절 요소뿐만 아니라 종결 부위, 폴리-A 부가 부위와 같은 다른 요소 및 적절한 또다른 요소에 작동적으로 연결할 수 있다(예: 플라스미드 A 내지 Z, AA 내지 NN). 이러한 성분들은 헤르페스 α4, ICP35 유전자를 조절할 수 있는 프로모터 또는 선택된 숙주 세포내에서 발현을 유도할 수 있는 다른 어떠한 프로모터를 포함할 수 있다. 재조합체 발현 벡터는 프로모터로서 원핵세포 또는 진핵세포 프로모터를 포함할 수 있으며, 카복실 말단 아미노산의 3' 위치에 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 이 프로모터는 암호화된 단백질의 전사 단위내에 있을 수 있다. 벡터들은 또한 본원에 제시된 분석에 사용된 마커를 포함할 수 있다. 숙주 세포의 예들로는 본 발명에 따라서 형질전환된 벡터를 발현시키는 당해 분야 숙련가들에게 공지된 BHK 세포. Vero, 이. 콜라이(E. coli) 또는 다른 원핵 또는 진핵세포들이 있다.
추가로, 본 발명은 헤르페스 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
(1) 헤르페스 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열을 제조하는 단계 및
(2) 단백질을 생성시키기 위해 단편을 발현시키는 단계를 포함한다.
예시적 양태에서 프로테아제를 제조하는 방법은 핵산 단편이 절단된 숙주 세포의 사용을 포함한다. 숙주 세포를 발현에 적합한 조건하에서 배양하여, 단백질을 발현시킨다. 이 방법은 또한 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법에 의해 단백질을 분리하고 정제하는 단계를 또한 포함한다. 필요한 정제 정도는 해당 단백질의 적용 목적에 의존한다. 달리, 핵산 서열은 토끼의 망상 적혈구 용해물과 같은 세포 유리 시스템내에서 발현시키거나, 본원에서 참조한 자동 단백질 합성기에 의해 합성할 수 있다.
헤르페스 프로테아제 또는 ICP35 단백질을 암호화하는 핵산 단편은 헤르페스로 감염된 세포들로부터 바이러스 게놈성 DNA를 수득하고, 관심 있는 핵산내에 핵산 서열 영역을 함유하는 단백분해 부위를 증폭시키며, 이와 같이 증폭된 핵산 서열을 포함하는 재조합체 클론을 제조함으로써 제조할 수 있다. 이어서, 적어도 프로테아제의 단백분해 도메인을 암호화하는 영역 또는 이와 같은 클론을 선별하기 위해 ICP35 단백질의 절단 부위에 대한 모노클로날 항체를 사용함으로써 목적하는 증폭된 핵산 단편을 함유하는 클론들을 선별할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 알려진 다른 클로닝 및 클론 선별 기술도 또한 적합하다[참조 : Sambrook et al., 1989].
또한, 본 발명은 절달시키기에 효과적인 조건하에 프로테아제로 분자로 처리하는 단계를 포함하는 헤르페스 분자의 절단 방법에 관한 것이다. 이와 같은 조건에서는 일반적으로 세린 프로테아제가 작동한다.
예시적 양태에서, 조직 샘플 중의 헤르페스 프로테아제를 검출하기 위한 방법은, 프로테아제 대해 지시된 항체의 제조, 이들 항체의 표지화, 표지된 항체와 조직 샘플의 접촉, 및 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 표준 기술로써 표지된 항체 단백질 이형접합체(heteroconjugate)를 검출하는 단계로 이루어진다. 이들 표지는 형광성 표지 또는 방사성 표지일 수 있다.
생물 샘플중의 핵산 단편을 검출하기 위한 한가지 방법은, 실질적으로 제 1 도 5 또는 6열에 기술되거나 헤르페스 프로테아제 또는 ICP35 단백질을 암호화하는 것으로 본 명세서의 다른 부분에서 기술되는 핵산 서열과 하이브리드화가능한 뉴클레오티드 프로브를 제조하는 것이다. 이 뉴클레오티드 프로브는 표지될 수 있다. 이어서, 이 프로브를 시험할 생물 샘플과 함께 특이적 하이브리드가 형성되기에 적절한 선별 조건하에서 항온처리한다. 이어서, 프로브와 생물학적 샘플의 핵산 사이에 형성된 특이적 하이브리드를 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 프로브상에서 방사성 표지를 검출하는 방법에 의해 검출한다. 이와 같은 하이브리드의 형성은 처음에 추구된 핵산 단편의 존재를 나타낸다.
바이러스 감염증의 치료 방법은 바이러스 생활 주기에 치명적인 본원에 기술된 표적 프로테아제를 사용하는 것이다. 이와 같은 방법의 예에는 유효량의 프로테아제 억제제를 제조하는 것이 포함된다. 이 양은 치료 경로에 의존한다. 이 경로는 피부에 직접 적용하는 국소용 크림, 연고 또는 스프레이, 또는 전신 감염증을 위해 정맥내 주사일 수 있다. 억제제는 적용 경로에 따라서 사람에 사용하기에 적절한 약리학적으로 허용되는담체와 배합시키는 것이 고려된다. 최종적으로, 억제제의 치료량은 헤르페스 바이러스 자체의 재생성은 억제되지만, 숙주 세포가 파괴되지 않는 정도에서 결정된다. 본원에 기술된 치료 방법은 특히 헤르페스 심플렉스 아유형 1 또는 2에 적용 가능하지만, 일반적으로 광범위한 DNA 상동성을 가진 것으로 알려진 다수 헤르페스 부류에도 적용할 수 있다. 다른 유기체, 예를 들면 사이토메갈로바이러스(UL80), 바리셀라-조스터 바이러스(ORF 33), 엡스테인-바르 바이러스에서 HSV-1 UL26에 대한 광범위한 서열 상동성으로 인해, 이와 같은 치료법은 모든 헤르페스 바이러스에 대해 광범위하게 적용할 수 있다.
이러한 억제는 전사, 해독, 또는 단백질 작용 수준에서 이루어질 수 있다. 전사 단계에서의 방해는 DNA 주형상에서 mRNA 형성의 방해가 필요하다. 해독 단계에서의 방해는 mRNA 주형상에서 단백질 합성의 방해가 필요하다. 달리, 프로테아제 작용 자체는 프로테아제 구조, 특히 단백분해 도메인의 파괴, 이에 대한 기질의 절단 부위 변경, 또는 프로테아제를 불활성화시키는 가성 기질의 제공에 의해 차단될 수 있다. 억제제의 다른 형태는 헤르페스 프로테아제의 암호화 서열과 하이브리드하지만, 프로테아제가 해독될 mRNA의 전사를 억제시키는 하이브리드를 형성하는 핵산 단편을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해 적합한 여러 억제제가 존재한다. 키모스타틴 및 디이소프로필 플루오로포스페이트가 시험관내 검정에서 프로테아제를 100% 억제함이 밝혀졌다. 페닐메탄설포닐 플루오라이드는 50% 이상 억제하며, 이러한 저하는 억제제가 시간이 경과함에 따라 불안정하기 때문이다. 다양한 프로테아제 억제제의 연구 결과는 UL26 프로테아제가 세린 프로테아제 억제제에 의해 억제되지만, 시스테인, 아스파트산 또는 메탈로프로테아제 억제제에 의해서는 억제되지 않음을 보여준다. 다른 고려되는 억제제는 안티파인, 아프로티닌, 루펩틴, (4-아미노-페닐)-메탄 설포닐 플루오라이드, 및 본원에 기술된 후보 선별 검정에서 양성으로 시험된 다른 세린 프로테아제 억제제가 포함된다. 특정 양태에서는, 본원에 기술된 억제제의 무독성 유도체도 고려할 수 있다.
다른 억제제를 측정하기 위해 관심있는 후보 물질을 바이러스 프로테아제의 제조, 이 프로테아제와 후보 억제제 물질의 조합, 및 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 기질의 선별에 의해 스크리닝한다. 이 검정은 기질을 프로테아제-후보물질 배합물과 접촉시키고, 후보물질이 기질상에서 프로테아제 작용을 억제하는지의 여부를 측정함으로써 수행한다. 예시적 양태에서, 후보물질을 시험하기 의해 사용된 바이러스 프로테아제는 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 토끼의 망상 적혈구 용해물로 시험관내에서 합성된 정제된 헤르페스 프로테아제이다.
이 프로테아제는 시험관내 실험적 검정 또는 시험 미생물내에서 후보 억제제 물질과 조합한다. 프로테아제에 의해 절단될 수 있도록 선택된 기질은 프로테아제 자체이거나, 적어도 ICP35 단백질 전구체, c, d의 절단 부위일 수 있다. 기질을 프로테아제 및 후보 억제제 물질과 접촉시킨후, 이 기질이 절단되었는지의 여부를 측정함으로써 물질이 기질상에서 프로테아제의 작용을 억제했는지를 측정할 수 있다. 한가지 양태에서, 이는, SDS 겔 전기영동에 의해 측정되는 것으로써, ICP35 c, d 단백질들이, 프로테아제에 의한 c, d의 절단에 의해서만 형성되는 ICP35 아단위 e 및 f를 생성하는지의 여부를 관측함으로써 측정할 수 있다. 단백질이 절단되지 않은 경우, 후보 물질이 확실히 바이러스 프로테아제를 억제하는 것으로 추정된다. 이어서, 이 억제제를 치료 시도에서 사용할 수 있다.
후보 억제제 물질 검정시 사용된 바이러스 프로테아제는 유전자 재조합 기술을 통해 제조할 수 있는데, 예를 들어 발현 벡터는 적어도 프로테아제의 단백분해 모듈을 포함한다. 이어서, 이 발현 벡터는 암호화 서열을 발현시킬 수 있는 조건하에서 적절한 숙수 세포로 전달된다. 프로테아제 또는 프로테아제 단편의 형태로 서열이 발현된 후, 이 프로테아제는 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 방법에 의해, 세포로부터 수집될 수 있으며 필요한 경우 추가로 정제될 수 있다.
헤르페스 프로테아제를 제조하기 위한 다른 방법은 프로테아제를 함유하는 샘플, 예를 들면, 헤르페스로 감염된 조직 단편 또는 삼출물을 함유하는 샘플을 수득하는 것이다. 이어서, 이 샘플을 균질화시키고, 분별하여 프로테아제 단편을 수득한다. 이어서, 이 프로테아제 단편을 특정 용도에 따라 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 방법으로 추가로 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 상이한 헤르페스 종, 다른 비-헤르페스 바이러스 또는, 모든 유기체에서 본원에 기술된 것과 동등한 기능이 있는 세린 프로테아제를 선별하는 방법에 관한 것이다. 이 프로테아제를 선별하기 위해, 적어도 본 명세서에서 기술된 프로테아제의 절단 부위를 함유하는 아미노산 서열을 제조한다. 이어서, 이 후보 바이러스 프로테아제를 바이러스 세린 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 아미노산 서열을 함유하는 절단 부위와 접촉시킨다. 최종적으로 절단이 ICP35 기질을 사용함으로써 발생했는지를 측정하고, ICP35c, d가 e 및 f로 변경되었는지를 측정한다. 이 방법에 의해, HSV-2 프로테아제가 ICP35c, d를 e 및 f로 절단할 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 방법 및 조성물로 다른 종에서의 필수적인 세린 프로테아제를 동정하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법은 단지 게놈원이 변경될 때만 일반적으로 적용가능하다. 이들 세린 프로테아제는 보존된 단편에 의해 암호화되며 광범위한 것으로 여겨진다. 헤르페스 바이러스에 있어서, 6종류의 바이러스 DNA 서열중의 4개(HSV-1, EBV, VZV, CMV)가 보고되어 있고, 당해 분야의 숙련가들이 이용하는 컴퓨터의 데이타 베이스에 기록되어 있다. 아미노산 서열의 상동성 및 기능은 세린 프로테아제의 보존된 특성, 및 관련된 종, 즉 헤르페스 부류중에서 이미 검출된 상동성에 근거하는 것으로 여겨진다[참조; Davison et al., 1986; McGeoch et al., 1988]. 따라서, HSV-1의 UL26, EBV의 BVRF2, CMV의 UL80, VZV의 유전자 33이 캡시드 성숙에 있어서 동일하거나 유사한 역할을 하며 프로테아제를 암호화하는 것으로 여겨진다. 추정된 프로테아제 및 HSV-1 UL26 사이에 광범위한 서열 상동성이 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이들 프로테아제의 작용 또는 절단 메카니즘은 HSV-1 UL26과 동일한 것으로 여겨진다. 따라서, 기술된 억제제를 포함하는 본 발명이 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV-1 및 HSV-2)에 대한 것이고 다른 헤르페스 바이러스(EBV, VZV, CMV 및 사람 헤르페스 바이러스 6)의 치료에 적용 가능하다는 것은 놀라운 일이 아니다.
본 발명의 세린 프로테아제가 헤르페스 부류에 대해서만 한정되지 않는다는 제시로써, 다른 미생물에서도 캡시드 조립이 보고되었다. 박테리오파아지 T4 및 λ는 캡시드 조립에 있어서 가장 일반적으로 연구되어 있다. 이러한 파아지에서, 먼저 미리 형성된 캡시드는 외부 외피 단백질과 내부 구조 단백질(scaffolding protein)의 상호작용에 의해 조립된다. 이어서, 이 골격 단백질은 파아지-암호화된 프로테아제에 의해 절단되어 캡시드로부터 제거된다. 동시에, 파아지 DNA는 캡시드 내로 팩키징되어 성숙 캡시드를 제공한다. 골격 단백질의 절단은 성숙 캡시드를 생산하는데 있어 필수적이다. 최근에, HSV 및 λ 파아지 사이에서 캡시드 구조의 유사성이 한냉 전자현미경 연구로 밝혀졌다. 사람 CMV 균주 AD169의 서열이 결정되었으며, HSV UL26과 상동성인 유전자도 동정되었다. ICP35는 HSV 캡시드 성숙 과정에서 골격 단백질 또는 조립 단백질로서 작용하는 것으로 제안되었다. 본 발명의 프로테아제에 의한 ICP35의 절단은 캡시드의 성숙에 필요하며, 바이러스 복제에 필수적이다. 본원에 기술된 프로테아제는 ICP35 단백질을 절단하여 DNA 팩키지화를 개시하는 파아지의 프로테아제에 대해 상대물로서 작용한다. 따라서, 본원에 기술된 후보 프로테아제 억제제 검정 및 치료 방법은 헤르페스 부류만이 아니라 광범위하게 적용된다.
도메인(domain)은 폴리펩티드 또는 단백질내 아미노산 서열로써 정의된 단백질 부위 또는 영역을 말하며, 본 발명의 경우, 도메인은 서열내 아미노산 결실 또는 치환에 의한 단백질 기능 또는 치환 효과의 기능적인 면에서 정의된다.
하향(downstream)은 핵산 분자를 따라 지정 부위로부터 3' 방향에서 관측되는 핵산 서열을 언급한다.
에피토프(epitope)는 항원성 결정인자인 아미노산 서열이다.
개방 판독 프레임(open reading frame, ORF)는 종결 코돈없이 아미노산을 암호화하는 일련의 삼중자(triplet)을 함유한다. 이러한 형태의 서열들은 잠정적으로 단백질로 해독된다.
DNA와 관련하여 언급한 ＆quot;실질적으로 정제된＆quot;이란 용어는 유기체 게놈내 존재할 수 있는 자연 상태에서 유리되도록 분리한 DNA 단편을 말하며, 예를 들어 재조합 벡터내로 삽입시킴으로써 유전공학적으로 존재할 수 있는 단편을 포함한다.
전자 단위는 RNA 폴리머라제에 의한 개시 및 종결 부위 사이의 거리이다.
상향(upstream)은 핵산 분자를 따라 지정 부위로부터 5' 방향에서 관측되는 핵산 서열을 말한다.
바이러스 프로테아제는 특이 부위에서 바이러스 전구체 단백질을 절단할 수 있는 효소이다.
HSV 헤르페스 심플렉스 바이러스
CMV 사이토메갈로바이러스
ORF 개방 판독 프레임
ICP 감염된 세포의 폴리펩티드
DFP 디이소프로필 플루오로포스페이트
TPCK L-1-토실아미도-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤
TLCK N-α-p-토실-L-라이신 클로로메틸 케톤
PMSF 페닐메틸설포닐 플루오라이드
EGTA 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)N,N,N',N' 테트라아세트산
본 발명은 헤르페스 프로테아제 및 이와 같은 프로테아제를 암호화하는 핵산 단편이 관한 것이다. 이러한 프로테아제를 암호화하는 단편은 또한 바이러스 복제시에 캡시드 생산에 사용되는 단백질에 대한 하나 이상의 암호화 도메인을 함유한다. 프로테아제의 기질은 자체 아미노산 서열 및 바이러스 캡시드 단백질의 전구체를 포함한다(제19도). 프로테아제의 억제제는 바이러스 생활 주기를 억제시킴으로써, 치료학적 간섭 수단을 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물의 예시적 양태에서는 프로테아제 공급원으로서 HSV-1을 사용한다.
신규의 헤르페스 프로테아제가 HSV-1 내에서 동정되어 정제되었고 ＆quot;Pr＆quot;로 약칭했다. 바이러스 생산을 직접적으로 공격하도록 제조된 억제제는 Pr 프로테아제의 작용을 억제함으로써 제공된다. 프로테아제가 바이러스 캡시드내로 DNA를 팩키징하는데 필수적이므로, 프로테아제의 억제는 바이러스의 복제 주기를 파괴한다. 프로테아제 억제제를 처리함으로써 임상 효과가 완화되고 전파의 위험이 감소된다.
헤르페스 프로테아제는 HSV 게놈 영역인 UL26 개방 판독 프레임의 산물이다. 이 프로테아제는 자체 절단을 수행하기에 충분한 필수적이고 유일한 바이러스 단백질이며, 이의 UL26.5 개방 판독 프레임(ORF) 영역의 산물이 본 발명 의 양태로서 동정되고 정제되었다. Pra로 지칭된 단백질인 UL26 ORF의 산물은 이미 기술한 헤르페스 프로테아제이며, 헤르페스 바이러스로부터 이미 정제된 첫번째 프로테아제이다. 세포 유리 시스템에서, Pra는 자체적으로 Prb로 절단되었으며, 이는 Pra의 해독 산물이 프로테아제로서 작용할 수 있음을 입증한다(제1도). Pra의 자동촉매적 절단산물로 지칭된 Prb는 대략 Pra 보다 20개 아미노산이 짧다.
본 발명의 프로테아제 특성은, 이것이 자체의 절단을 촉매하는 것 뿐 아니라, 놀랍게도 이 프로테아제가 작용하는 보다 풍부한 두번째 기질이 프로테아제를 암호화하는 유전자내에 전적으로 함유된 서열에 의해 암호화된다는 것이다. 이러한 프로테아제 및 두번째 기질은 이들의 카복실 말단에서 아미노산 서열을 공유한다. 놀라운 예기치 못한 발견은, 두번재 기질에 대한 암호화 단편이 ICP35로 지칭된 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하며, UL26.5로 지칭된 최근에 동정된 유전자라는 것이다.
UL26 유전자의 프로테아제 형태의 발현은 바이러스 성숙에 필수적이다. 이에 대한 증거는, UL26 개발 판독 프레임에서 문헌[참조:Preston et al.(1983)]에 의해 보고된 온도-민감성 돌연변이가 캡시드 성숙에 치명적인 영향을 갖는다는 것이다. 따라서, 프로테아제의 작용의 파괴는 바이러스 성숙을 방해하며, 이는 치료 방법을 제시한다.
본 발명자들은 헤르페스 프로테아제를 동정하고 특성화하기 위해 3개의 일반적인 접근을 사용하였다. 이것에는 1) 시험 플라스미드로 세포를 형질감염시킨 후 헤르페스로 이들을 감염시키는 것; 2) 두개의 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 것; 3) 시험관내에서 해독하는 것이 포함된다. 이러한 연구 결과, 본 발명자들은 두개의 유전자(독립된 전사 단위)를 포함하는 두개의 중첩된 헤르페스 심플렉스 바이러스 1(HSV-1) 핵산 서열을 동정하였다. 보다 긴 서열은 UL26이라 지칭되며, SDS-PAGE에 의해 측정시 겉보기 분자량이 대략 75 내지 85kd인 단백질을 암호화한다. 이 단백질은 자체를 프로세싱할 수 있는 세린 프로테아제 및 카복실-말단 단백분해성 절단에 의해 ICP35 단백질 전구체들이다. 보다 짧은 서열은 UL26.5라 지칭되며, 이들은 SDS-PAGE에 의해 측정시 겉보기 분자량이 대략 35 내지 50kd인 단백질을 암호화한다. 두 유전자 모두는 클로닝되었다.
본 발명의 프로테아제를 성공적으로 분리하고 정제했던 이유중의 하나는, 중요한 시험 기질인 ICP35 단백질의 선택 때문이다. 헤르페스 게놈을 보다 잘 이해하기 위해, 또다른 생산 단계에서는 헤르페스의 유전 경로의 메카니즘에 대한 특정 의문에 답하도록 고안된 특정 작제 계획을 갖는 다수의 플라스미드를 작제하였다. 일부 플라스미드내로, 마커 서열을 삽입시켜 유전 작용의 경로를 추적한다. 일련의 플라스미드 작제물중의 마커는 α4-프로모터 또는 마우스의 모노클로날 항체와 반응할 수 있는 사이토메갈로바이러스 에피토프를 암호화하는 서열의 결실물 또는 삽입물이다. 상기 작제물은, 헤르페스 게놈 영역의 유전 작용에 있어서, UL26 ORF의 구조 및 작용에 대한 선행 연구로부터 예견되는 것과는 대단히 놀라운 차이를 드러냈다.
선행 연구에 있어서, McGeoch 등 (1988)은 UL26 프레임은 ICP35를 암호화하는 것으로 예측했다. 그러나, UL26 개방 판독 프레임의 뉴클레오티드 서열로부터 예측된 UL26의 생성물은, ICP35 보다 상당히 큰 것으로 밝혀졌다. 계층적인(hierarchical) 유전 복합성이 헤르페스 캡시드 단백질의 생산에 관여되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서 기술된 것은, UL26으로 지칭된 도메인을 아미노산 서열의 일부를 공유하는 단백질을 제공하는 두개의 중첩된 전사 단위로 분류한 것이다. 이미 ICP35로 지칭된 것은 단지 UL26 개방 판독 프레임의 일부에 의해서 암호화되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 목적상, 상기 단위는 UL26.5로 지칭되었다.
본 발명의 프로테아제는 일반적인 용도를 갖는다. ICP35 단백질을 형성하기 위해 전구체를 분해시키는 Pra 프로테아제의 기질 동족체가 다른 헤르페스 바이러스에서 검출되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 기타 바이러스 부류 및 기타 종에서의 프로테아제를 밝힐 것으로 보인다. 하나의 예로, CMV 프로테아제가 그러한 종에서는 아직 동정되지 않았으나, ICP35 단백질의 CMV 등가물이, 카복실 말단에서 절단되는 것으로 최근에 보고된 바 있다[참조: Gibson et al., 1990, Schenk et al., 1991]. 따라서, 헤르페스-절단된 프로테아제는 다른 헤르페스 바이러스에 대해서도 절단에 영향을 미칠 것으로 보인다. 아주 최근에는, 사이토메갈로바이러스의 프로테아제가 보고된 바 있다. 활성 프로테아제는 아미노산 248에서 완전한 길이의 프로테아제가 절단된 후 방출되는 것으로 알려졌으나, 본 발명은 상기한 절단 결과 프로테아제가 불활성일 것이라고 제시한다.
바리셀라-조스터 바이러스(VZV) 게놈[참조: Davison and Scott. 1986; Davison and McGeoch, 1986] 중 ICP35에 상동성 개방 판독 프레임의 존재는, ICP35 등가물 및 상응하는 프로테아제가 각종 헤르페스 바이러스에서 보호된다는 것을 제시한다. ICP35의 아미노산 서열은 Pr의 카복실 말단에 전적으로 포함되어 있으며 ICP35는 단백분해 활성을 나타내지 못하기 때문에, Pr에 의해 나타나는 단백분해활성은 단백질의 아미노 말단 도메인에 의해 나타나는 것으로 예측된다. VZV 게놈[참조: Davison and Scott. 1986] 중에서, UL26에 상응하는 개방 판독 프레임은 아미노산 서열중 카복실 말단에서 보다는 오히려 아미노 말단에서 상동성이 크다는 것에 주목된다.
헤르페스 실플렉스 바이러스(HSV) 게놈의 조작
치료표적으로서 바이러스성 프로테아제의 중요성은 바이러스 복제 메카니즘을 고려해볼 때 명백해진다. 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스는 7개의 상이한 유전자 산물을 암호화하기에 충분히 큰 선형의 이본쇄 DNA 분자(분자량 : 약 100×106)를 포함하는 게놈을 갖는다. 두개의 독특한 뉴클레오티드 서열이 역위의 (inverted) 반복 서열에 의해 플랭킹된다는 점에서 게놈 구조는 DNA 바이러스중에서도 독특한 것이다.
바이러스 게놈은 162개 캡솜(capsome)으로 이루어진 일정한 정20면체 단백질쉘(캡시드)내에 패키징된다. 상기 바이러스의 외막은 변형된 세포막으로부터 유도된 지질을 함유하는 엔벨로프막이다. 세포 단백질은 비리온 엔벨로프중에서는 검출되지 않는다. 엔벨로프의 지질 이층중의 당단백질은 바이러스를 숙주 세포 표면에 부착시키고 바이러스를 세포내로 침투시키며 바이러스 성숙 및 배출을 중재한다. 외피(tegument)는 캡시드와 지질 이층 사이에 존재한다. 캡시드내에는 DNA 폴리아민 및 DNA-결합 단백질이 존재한다.
세포 감염후 바이러스가 복제 및 분산되었을때 임상적 문제가 발생한다. 바이러스 게놈이 세포의 핵에 도달한 후, 바이러스 유전자가 매우 규칙적인 방식으로 발현된다. 세포는 바이러스 감염 및 복재에 의해 사멸될 수 있다. 프로테아제를 억제시키면 복재가 차단될 것이다. 특정 세포, 특히 지각 뉴우론의 생체내 감염이 반드시 바이러스를 복제하고 세포를 사멸시키는 것은 아니다. 잠복상이 발생할 수도 있다.
HSV-1 게놈이 서열 배열, UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임의 위치 및 이들의 전사물, 및 본 발명의 양태로서 작제된 시험 플라스미드의 구조를 제1도에 도시하였다:
라인 1
HSV-1 게놈의 서열 배열을 도식적으로 나타낸 것이다. UL및 US는 직사각형으로 나타낸 말단 역위 반복 단위에 플랭킹된 특정한 장쇄 서열 및 특정한 단쇄 서열을 의미한다.
라인 2 및 라인 3
게놈 맵 위치, +1에서 문자 I로 표시된 UL26의 대략적인 전사 개시 부위에 대한 뉴클레오티드 번호, 및 HSV-1 EcoRI-PstI DNA 단편의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 나타낸 것이다. 라인 3은 또한 UL26 및 UL26.5 RNA를 둘다 제공하는 해독 말단 코돈(T) 및 단일 폴리(A) 시그날(A)의 위치를 나타낸다.
라인 4 및 5
충전된 직사각형(짙은색 막대)은 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임의 암호화도메인을 나타낸다. 수치는 전사 개시 부위, 해독 개시 및 말단 코돈의 위치 및 UL26의 뉴클레오티드 +1과 관련된 개방 판독 프레임 모두에 대한 폴리(A) 시그날의 위치를 의미한다.
라인 6
본원에 기술된 연구에서 사용된 플라스미드 작제물중에 함유된 HSV-1 서열의 도식적 표시인 라인 A에서 Z까지 및 AA에서 NN까지를 참고로 하여 크기에 따라 도시한 제한 엔도뉴클레아제 지도이다. 라인 A 내지 Z 및 AA 내지 NN에 도식적으로 나타낸 플라스미드의 작제를 실시예 1에 나타내었다. 플라스미드 B, D, H, J, K, L, M, P, W, X, Z, AA 내지 NN중에 나타낸 α4 프로모터 공급원(개방 직사각형)은 적합한 전사 배향으로 삽입된 BamHI Z DNA 단편이다[참조: Post et al., 1981]. CMV 에피토프를 충전된 타원으로 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 C와 이의 상보물을 충전된 직사각형으로서 나타내었고, 새롭게 생성된 PmlI 부위를 P*로 표시한다. 제한 엔도누클레아제 부위는 하기와 같이 약술된다: B. BamHI; Ba, BalI; Bs, BstII; E. EcoNi; H, HpaI; K, KpnI; Ms, MstII; P, PmlI; Ps, PstI; S, SalI; X, XamI, Me는 UL26.5 개방 판독 프레임의 메티오닌 해독 개시 코돈을 나타낸다.
UL26 및 UL26.5의 시험관내 해독을 동정하기 위해, ICP35의 개방 판독 프레임의 비프로세싱된 종인 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임 모두를 PGEM3Z-f(+)로 클로닝시켜 각각 플라스미드 T 및 U를 수득한다(참조 제1도), UL26 및 UL26.5의 mRNA에 상응하는 RNA는 Sp6RNA 폴리머라제에 의해 전사되며 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질중에서 해독한다. 그 결과, UL26 및 UL26.5는 각각 겉보기 분자량이 각각 80kd(Pra) 및 45kd(ICP35d,c)인 이중 밴드를 형성하는 단백질을 구체화 하는 것으로 나타났다. 시험관내에서 합성된 UL26.5 (ICP35) 단백질의 두가지 종은, HSV-1(F) 감염된 세포에서 시험관내에서 합성된 ICP35c, d와 함께 이동하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 비프로세싱된 형태의 UL26.5, 즉 ICP35c 및 d는 ICP35e 및 f로 프로세싱될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
ICP35c, d를 ICP35e, f로 프로세싱시키는데 필요한 바이러스 게놈중의 DNA 서열을 매핑(위치화)하고 정제할 수 있었다. BHK 세포를 각각 온전한 ICP35 유전자를 함유하는 상이한 길이의 HSV-1 DNA 서열을 함유하는 일련의 플라스미드로 형질감염시킨 후, 39℃에서 HSV-1(F)로 중복감염시킨다. 온전한 UL26 유전자(제1도)를 함유하는 플라스미드 A로 형질감염시킨 BHK 세포는 ICP35c, d 뿐만 아니라 ICP35e, f를 생성하는 반면, UL26 유전자의 프로모터 영역이 결실되고 UL26 암호화 서열만이 함유된 플라스미드 C(제1도)로 형질감염시킨 세포는 비프로세싱된 ICP35c, d만을 생성한다. 이러한 결과는 ICP35c, d를 e, f로 프로세싱시키는데 UL26의 유전자 산물이 필요함을 제시한다.
유전자 UL26의 산물은, 트란스 위치로 존재하는 경우, ICP35c, d를 e, f로 절단시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. UL26이 트란스 또는 시스로 작용하는지의 여부를 측정하기 위해, BHK 세포를 프로세싱용 기질로서 플라스미드 N 및 UL26 개방 판독 프레임중에 결실 부위를 함유하는 일련의 플라스미드로 형질감염시킨 후, HSV-1(F)로 감염시키고, 39℃에서 유지시킨다. 그 결과는 하기와 같다:
(i) 플라스미드 N 및 E로 공동-형질감염된 세포의 용해질이 CMV 모노클로날항체와 반응성인 ICP35 형태 e 및 f를 함유하지 않는한, ICP35c, d는 ICP35e, f로의 자체 프로세싱을 자동 촉진시키지 못했다.
(ii) ICP35c, d는 플라스미드 N 및 C 또는 I로 공동-형질감염시킨 BHK 세포에서 프로세싱되지 않았다. 플라스미드 C 및 I는 각각 UL26 개방 판독 프레임의 프로모터 영역 및 폴리아데닐화 부위에서 결실된 부위를 함유한다(제1도).
(iii) ICP35c, d는 플라스미드 N 및 A 또는 B로 공동-형질감염시킨 BHK 세포 중에서 e, f로 프로세싱되었다. 플라스미드 A 및 B는 각각 온전한 UL26 프로모터 및 개방 판독 프레임 및 α4 프로모터에 의해 유도된 UL26 암호화 서열을 함유한다. HSV-1(F) 중의 α-형질도입 인자는 39℃에서 α4 프로모터를 고수준으로 유도한다[참조 : Post et al., 1981; Battreson and Roizman, 1983]. 고도로 발현된 UL26은 플라스미드 N 및 B로 공동-형질감염시킨 세포의 용해질중에 ICP35(형태 e 및 f)의 프로세싱된 형태의 존재를 입증할 수 있다.
UL26에 의해 암호화된 프로테아제의 중요성은 이것이 ICP35c, d를 e, f로 프로세싱하는데 적합하다는 결과에 의해 입증된다. (UL26 ORF의 5' 말단) 영역에서의 돌연변이가 치명적인 것으로 보고되었으므로[참조 : Preston, et al., 1983] UL26 및 ICP35c, d의 e. f로의 프로세싱 모두가 캡시드 제조시 필수적이다.
헤르페스 감염시 공격 표적으로서의 프로테아제를 사용하는 견지로부터 보다 흥미로운 것은, 프로테아제가 캡시드 제조시 필요한, ICP35c, d를 e, f 단백질로 프로세싱시키는데 필요한 유일한 단백질인 것으로 보인다는 점이다. 이는 프로테아제가 캡시드 형성시 필수적임을 나타낸다. UL26이 상기한 프로세싱에 필요한 유일한 바이러스성 단백질인지의 여부를 결정하고 39℃에서 HSV-1(F) 게놈에 의해 발현된 바이러스 유전자가 ICP35의 촉매 작용에 기여한다는 가능성을 배제하기 위해, BHK 세포를 각각 기질 및 프로세싱용 효소를 암호화하는 유전자로서 일정량의 플라스미드 L 및 상이한 양의 플라스미드 B로 공동-형질감염시킨다. 플라스미드 L(제1도)에 있어서, UL26.5 개방 판독 프레임은 α4 프로모터에 의해 조절되고 CMV 에피토프는 MstII 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 삽입되는 반면, 플라스미드 B는 동일한 프로모터에 의해 유도되는 온전한 UL26 개방 판독 프레임을 함유한다. α4는 형질감염된 세포중에서 구성적으로 발현되는 강한 진핵성 프로모터이기 때문에[참조 : Post et al., 1981; Kristie and Roizman, 1984], 플라스미드 L 및 B로 형질감염된 세포중에서 UL26 및 UL26 단백질의 발현은 HSV-1(F)에 의한 중복감염을 필요로 하지 않는다. 그 결과는 하기와 같다:
(i) 바이러스성 감염의 부재하에서, ICP35c 및 d는 플라스미드 L로 형질감염된 세포중에서 발현된 유일한 두가지 종이다. 플라스미드 L에 의해 발현된 에피토프적으로 표시된 ICP35는 허용가능한 온도에서 HSV-1(F)로 중복감염된 세포중에서 완전히 프로세싱되었다. 예상되는 바와 같이, 플라스미드 B는 항-CMV 항체와 반응성이 있는 산물을 생성하지 못했다.
(ii) UL26을 함유하는 플라스미드 B의 존재하에서, 플라스미드 L에 의해 발현된 에피토프적으로 표시된 ICP35c, d는 ICP35e, f로 프로세싱되었다. 저농도의 플라스미드 B에 있어서, ICP35e, f의 축적 정도는 플라스미드 L과 함께 BHK 세포로 공동 형성감염된 UL26 플라스미드 DNA의 양에 직접 비례하였다. 최고량의 플라스미드 B의 존재하에서 관찰된 ICP35e, f의 양의 감소는 두개의 플라스미드 사이의 경쟁 또는 다량의 DNA가 사용된 독성의 결과로서 감소된 수율을 반영할 수 있다.
상기한 연구 결과로부터, UL26의 산물은 ICP35c, d를 ICP35e, f로 프로세싱 시키기에 적합하고 충분한 유일한 바이러스 인자임이 입증되었다. 따라서, 프로테아제는 캡시드 전개에 필수저이며, 이는 또한 헤르페스 바이러스 복제 수명 주기에 필수적이다.
상기한 의약의 활성 제제는 프로테아제의 억제제를 포함한다. 이러한 억제제는 이미 이용가능한 프로테아제의 단백분해 작용을 억제하거나, 프로테아제 생산에 관여하는 핵산 단편의 해독 또는 전사의 개시를 방해할 수 있다. 이러한 억제제는 화학적 조성물의 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 경우에는 세포 삽입을 수행하는 조성물과 배합시켜야 한다.
억제제가 핵산 단편의 형태로 존재하는 경우, 이를 당해 분야의 전문가들에게 공지된 각종 방법에 의해 감염된 세포내로 혼입시킬 수 있다. 이러한 방법은 본원에 상세히 기술되어 있으며, 재조합 벡터의 형질감염, 전기영동 또는 기계적으로 가속화된 핵산 입자를 감염된 세포내로 삽입시키는 ＆quot;유전자 건(gene gun)＆quot;을 사용하는 방법을 포함한다.
[실시예 1]
플라스미드의 작제 및 HSV 게놈과의 관계
특정 폴리펩티드의 생산을 조절하는 HSV 게놈의 핵산 서열 부위를 동정하고 이들 단편을 분리하고, 이의 산물을 정제하기 위해 조작될 수 있는 핵산 서열의 단편을 함유하는 한 세트의 플라스미드를 작제하다.
바이러스 감염에 수반되는 핵산 서열을 동정하고 조작하기 위해 상기한 바와 같은 특정 도구를 작제한다. 몇몇 플라스미드에 있어서, 절단 산물을 추적하고 각종 감염 과정에 사용되는 뉴클레오티드 서열을 규명하기 위해 특정 위치에 마커를 삽입시킨다. CMV 에피토프튼 제1도에서 충전된 타원으로서 나타내었다. 상보물을 갖는 올리고뉴클레오티드 C는 충전된 직사각형을 나타내었다. 새롭게 생성된 PmlI 부위를 P*로 표시한다. 제한 엔도뉴클레아제 부위는 하기와 같이 약칭한다: B. BamHI: Ba. BalI; Bs, BstElI; E, EcoNI; H, HpaI; K. KpnI: Ms, MstII; P. PmlI; Ps, PstI; S, SalI; X. XmaI.
전체적으로서, 플라스미드 A 내지 Z. AA 내지 NN내에 함유된 HSV-1 서열은 UL26 개방 판독 프레임의 전 도메인을 포함하는 결실을 포함한다. 몇가지 예로, 예를 들어 플라스미드 작제물 B 및 D에 있어서, α4 유전자이 프로모터는 BamHI Z 단편 형태로 병렬 배치되어 고도로 전사된다.
제1도에서 J 내지 N으로 표시되는 플라스미드 작제물은 HSV DNA내에 이들 단편의 유일한 MstII 부위로 삽입된 CMV 에피토프를 암호화하는 서열을 포함한다. 하나의 플라스미드 작제물을 제외한 모든 플라스미드 작제물에 있어서, 상기 단편에 함유된 α4 프로모터에 의한 전사를 증가시키기 위해 BamHI Z 단편을 삽입시킨다. 그 예외는 플라스미드 작제물 N이다.
플라스미드 O 및 P에 있어서, CMV 에피토프를 특정 HpaI 부위에 삽입시키고, P 플라스미드만이 BamHI Z 단편의 형태로 α4 프로모터를 함유한다.
하기 플라스미드를 작제한다: A (pRB4057), B (pRB4060). C(pRB4058), D(pRB4089), E(pRB4093), F(pRB4056), G(pRB4087), H(pRB4088), I(pRB4026), J(pRB4092), K(pRB4094), L(pRB4096), M(pRB4095), N(pRB4102), O(pRB4079) 및 P(pRB4080), Q(pRB4140), R(pRB4184), S(pRB4185), T(pRB4103), U(pRB4090), V(pRB4186), W(pRB4188). X(pRB4213), Y(pRB4214), Z(pRB4215). HSV-1 단편을 pUC18의 KpnI 부위로 삽입시켜 pRB4026을 작제한다. pRB4057은 유전자의 해독 개시 부위에 대해 3' 뉴클레오티드 -900으로부터 폴리아데닐화 부위로부터 하향의 약 650 뉴클레오티드까지 연장된 UL26 개방 판독 프레임의 전체 암호화 서열을 함유한다. pRB4057 중의 UL26 개방 판독 프레임의 해독 개시 부위로부터 상향의 바이러스 DNA 서열 23bp를 HSV-1 DNA BamHI Z 단편으로 대체함으로써 pRB4060을 작제한다. BamHI Z 단편은 하나의 말단에서 뉴클레오티드 +33에서 출발되는 α4 유전자의 5' 전사 비암호화 서열 부위 및 상기한 유전자의 상향 비전사 도메인을 함유한다. UL26 개방 판독 프레임의 온전하고 절단된 도메인에 대해 적합한 전사 배향으로 α4 프로모터를 병렬 배치하는 배향으로 BamI Z 단편을 삽입시킨다. pRB4056, pRB4058, pRB4087 및 pRB4093은 pRB4057로부터 유도하고, pRB4088 및 pRB4089은 Sambrook 등 (1989)에 의해 보고된 서브클로닝 기술에 의해 결실시킴으로써 pRB4060으로부터 유도한다.
두쌍의 올리고뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드 A(5'-AAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGGTACCGACAC-3') 및 이의 상보물, 올리고뉴클레오티드 B (5'-AAAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGGTACCGACACGA-3') 및 이의 상보물, 및 올리고뉴클레오티드 C(5'-TCGACGTTGACACGGCCCGCGCCGCCGATTTCTTCGTCTCTCAGATGATGGGGGCCCGCCACGTGTGA-3')은 Applied Biosystems DNA Synthesizer 380A(Foster City, Calif)로 합성시킨다.
올리고뉴클레오티드 A, B 및 이들의 상보물은 CH28-2 모노클로날 항체의 에피토프를 암호화시키고, 플라스미드중에 삽입된 올리고뉴클레오티드를 편리하게 스트리닝 하기 위해 3' 말단에 KpnI 부위를 함유한다. 올리고뉴클레오티드 A 서열을 각각 pRB4057 및 pRB4060의 유일한 HpaI 부위로 삽입시킴으로써 pRB4079 및 pRB4080을 유도한다. 올리고뉴클레오티드 B 서열을 pRB4060의 유일한 MstII 부위로 삽입시킴으로써 pRB4092를 유도한다. 통상의 서브클로닝 기술[참조: sambrook 등, 1989]을 이용하여 결실을 발생시킴으로써 pRB4092부터 pRB4094, pRB4095, pRB4096 및 pRB4102를 유도한다. 상기한 플라스미드들의 모든 삽입 부위를 서열분석하여, CMV 에피토프가 UL26 개방 판독 프레임으로서 동일한 프레임내에 삽입되었음을 입증한다.
올리고뉴클레오티드 A 및 이의 상보물을 플라스미드 A의 유일한 PmII 부위로 삽입시킴으로써 플라스미드 Q(pRB4140)를 유도한다. 이 서열은 PmlI 부위로부터 해독 종결 부위까지의 정격 UL26 서열을 암호화하나, UL26 개방 판독 프레임의 신규한 PmlI 부위를 적합한 배향으로 부가하면 카복실 말단 아미노산과 UL26 개방 판독 프레임의 정지 코돈 사이에 신규한 PmlI 부위가 생성된다. 또한, 정격 PmlI 부위에서의 서열 'GTG'는 서열 'GTC'로 변화된다. 서열 C를 적합한 배향으로 UL26 개방 판독 프레임의 독특한 PmlI 부위로 삽입시킴으로써, 카복실 말단 아미노산과 UL26의 정지 코돈 사이에 신규한 PmlI 부위가 생성된다. 초기의 정격 PmlI 부위는 코돈 ＆quot;GTG＆quot; 및 ＆quot;GTC＆quot;가 동일한 아미노산을 암호화시키기 때문에 UL26 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 파괴된다. 따라서 올리고뉴클레오티드 C 및 이의 상보물을 UL26 개방 판독 프레임에 삽입시키는 순수 효과는 새롭게 생성된 PmlI 인식 서열에 의해 암호화된 정격 카복실 말단 아미노산 및 이이 정지 코돈 사이에 2개의 추가 아미노산을 갖는다는 것이다. 서열 C를 플라스미드 E(pRB4093)의 PmlI 부위에 삽입시킴으로써 플라스미드 R(pRB4184)을 유도하고, 올리고뉴클레오티드 A 및 이의 상보물을 플라스미드 R의 PmlL 부위에 삽입시킴으로써 플라스미드 S(pRB4185)를 유도한다. 플라스미드 T. U. V 및 W(pRB4103, pRN4090, pRB4186 및 pRB4188)는 플라스미드 B 및 S로부터 서브클로닝에 의해 유도된다. 플라스미드 X, Y 및 Z(pRB4213, pRB4214 및 pRB4215)는, CMV 서열의 3' 말단과 정지 코돈 사이의 부위에서 스타필로코커스성 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 5개 동족체를 포함하는 256개 아미노산을 암호화하는 서열 또는 상기한 2개의 영역을 포함하며 129개 아미노산을 암호화하는 서열을 UL26 개방 판독 프레임으로 프레임내에 삽입시킴으로써 형성된다. 상기한 서열은 각각 단백질 A 유전자 융합 벡터 pRIT5(Pharmacia. Piscataway. NJ)의 BclL-HincII 단편 및 HindIII-HincII 단편이다. 플라스미드 T. U. V 및 Y용 벡터는 PGEM3Zf (+)(Promega. Modison. WI)로부터 유도되고, 상기한 플라스미드는 T7 또는 Sp6 RNA 폴리머라제에 의한 시험관내 전사용 주형으로서 사용될 수 있다. 기타 모든 플라스미드용 벡터는 pUC18(New England Biolabs. MA)로 부터 유도된다. 올리고뉴클레오티드 서열 A 및 C 및 이의 상보물의 플라스미드내로의 모든 삽입 부위가 서열분석되고, 올리고뉴클레오티드 C 및 이의 상보물에 의해 암호화된 아미노산 서열 및 CMV 에피토프가 UL26 개방 판독 프레임으로 프레임내로 삽입된다는 것을 입증한다.
작제물 AA, BB, CC, DD 및 MM은 각각 PmlI, MstII, BssHII, HpaI 부위 및 ICP35의 해독 개시 코돈을 암호화하는 부위에서 각각 해독 정지 코돈을 pRB4060내로 삽입시킴으로써 제조한다. 작제물 NN은 ICP35 해독 개시 부위와 정지 코돈 사이의 서열을 결실시킴으로써 제조한다. pRB4245와 같이 pGEM3zf(+)에 클로닝된 BamHI Z에 융합된 UL26 ORF를 Muta-Gene Kit (Bio-Rad)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 돌연변이시켜 II, JJ, KK, LL, HH 및 GG를 생성한다. 이러한 목적에 사용되는 40머 올리고뉴클레오티드는 Applied Biosystems 모델 380B DNA 합성기로 합성된다. 플라스미드 EE 및 FF는 각각 Xbal로 절단시키고 작제물 GG 및 HH를 재연결시켜 UL26의 처음 10개 아미노산 및 33개 아미노산을 결실시킴으로써 작제한다. 제1도에 사용된 기호는 하기와 같다: 개방 사각형: α4 프로모터의 공급원으로서 사용되고 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임에 대해 적합한 전사 배향으로 삽입된 BamHI Z 단편; 충진된 타원: 상술된 20개 아미노산 CMV 에피토프; 충전된 직사각형; 단백질 A의 IgG 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열; P*: 단백질 A의 IgG 결합도메인을 삽입시킴으로써 형성된 새로운 PmlI. 시험관내 돌연변이에 의해 생성된 새로운 전사 개시 코돈은 ＆quot;ATG＆quot;로 나타낸다. 충전된 삼각형은 삽입된 정지 코돈을 나타낸다. 제한 엔도뉴클레아제 부위는 하기와 같이 약칭된다: B. BamHI; Ba, BalI; Bs, BstEII: E. EcoNI: H, Hpal: K, KpnI: Ms, MstII; P, PmlI; Ps, PstI; S. SalI; X, XcmI. Me는 UL26.5 개방 판독 프레임의 메티오닌 해독 개시 코돈을 나타낸다.
제한 엔도뉴클레아제 지도를 상술된 연구에서 사용된 플라스미드 작제물중에 함유된 HSV-1 서열을 도식적으로 나타낸 라인 A 내지 Z를 참고로 하여 제1도의 라인 9 상이 축적으로 나타내었다.
[실시예 2]
바이러스성 성분을 분리하고 정제하기 위한 플라스미드의 용도
숙주 세포를 제1도의 플라스미드 작제물로 형질감염시킨다. 또한, 프로테아제를 플라스미드를 포함하는 토끼의 망상 적혈구 용해질 시스템으로부터 시험관내에서 합성한다. 플라스미드 작제물에 의해 형질감염되고 바이러스에 의해 중복감염된 세포로부터의 폴리펩티드를 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동에 의해 분리하고, 니트로셀룰로오즈 시이트로 전기적으로 이동시키고, 이어서 퍼옥시다제와 결합된 염소의 항-마우스 면역 글로불린 향체와 반응시킨 후, 이러한 폴리펩티드의 사진 상을 이용하여 감염 메카니즘에 기인하는 핵산 서열을 분석한다. 폴리펩티드 정제의 실험적 세부사항을 재료 및 방법란에 상세히 기술하였다.
작제물 MM 및 NN을 사용하여 프로테아제중의 임의의 ICP35 암호화 서열이 ICP35 절단에 필수적인지의 여부를 측정한다.
[실시예 3]
전자 단위의 분석
UL26와 뉴클레오티드 서열은 놀랍고도 예기치 않게 두개의 전사 단위에 함유된 것으로 밝혀졌다. 두개의 프로브를 작제하여 UL26의 전사물을 매핑한다. RNA중의 UL26 의 5' 말단을 동정하기 위해 작제된 프로브 1은 BamHI 부위에서 표지된 EcoNI-BamH1 단편으로 이루어진 반면, 프로브 2는 BatEII 부위에서 표지된 XcmI-BstEII 단편으로 이루어져 있다.
모의-감염되고 12시간 감염된 Vero 세포로부터의 총 세포질 RNA에 하이브리드화되고 S1 뉴클레아제로 분해시킨 DNA 프로브 1(A) 및 프로브 2(B)의 자동방사선 사진의 상을 제4도에 도시하였다. RNA는 본원에 기술된 재료 및 방법란에 상세 기술하였다. 제4도에서, S1-분해된 프로브 1인 레인 1(PS)은 이것이 레인 Mock 및 HSV-1에 나타낸 바와 같은 하이브리드화 및 분해 조건하에 있는 것으로 보인다.
레인 2 및 8(Mock)는 모의-감염시킨 12시간 후의 세포로부터 추출된 RNA를 나타낸다. 레인 3 및 8(HSV-1)는 HSV-1(F)에 의해 감염되고 12시간 동안 유지된 세포로부터 추출된 RNA를 나타낸다.
레인 4 및 7(P)은 비분해된 프로브(프로브 1 또는 2)의 위치를 나타낸다.
레인 5 및 7(M)은 효소 MspI로 PGEM3Z DNA를 분해시켜 수득된 5' 말단-표지된 단편을 나타낸다.
제4도에서의 화살표는 UL26 (A) 및 UL26.5(B) RNA의 보호된 5'-말단을 나타낸다. 프로브 2에서 HSV-1 서열의 위치인 T는 UL26 RNA에 의해 보호된다.
제4도에 나타낸 S1 분석 결과는, 프로브 1에 하이브리드화된 세포질 RNA가 약 300개 뉴클레오티드 길이의 단편을 보호한다는 것이다(레인 3).
BamH1 부위로부터의 상향으로 300번 뉴클레오티드를 UL26의 +1료 표시하였다. 대략적인 전사 개시 부위 다음의 제1메티오닌 코돈은 위치 +180에 존재한다.
프로브 2에 하이드리드화된 세포질 RNA는 S1 분해로부터 보호된 2 세트의 단편을 제공한다(레인 9). 제1단편은 HSV-1 DNA 서열(밴드 T)을 모두 함유한다. 보호된 단편의 제2세트는 35 내지 40개 뉴클레오티드 길이 범위의 다수 밴드를 형성한다(레인 2. 밴드 UL26.5). 따라서, 상기한 전사물의 전사 개시 부위는 UL26의 뉴클레오티드 +1에 대해 뉴클레오티드 약 +1000에 존재한다. 상기한 RNA의 전사 개시 부위로부터 하향으로 제1메티오닌 코돈은 위치 +1099에 존재한다. 보다 긴 RNA는 UL26을 나타낸다.
[실시예 4]
ICP35 유전자의 위치 및 분리
ICP35를 구체화하는 유전자의 암호화 도메인의 위치를 결정하기 위하여, 개방 판독 프레임 UL26 중에서의 일련의 결실물을 ICP35를 발현시키는 이들의 능력에 대해 시험한다.
BHK 세포를 플라스미드 작제물 O, N 및 P로 형질감염시키고(제1도), 이어서 HSV-2로 감염시킨다(제4도). 제4도에 도시된 겔의 상단의 문자는 세포를 형질감염시킨 플라스미드 작제물을 나타낸다. - 또는 문자가 없는 것은 세포가 감염되었으나 형질감염되지 않은 것을 나타낸다. 수직선은 서서히 이동하는 밴드를 나타낸다. HSV-1 ICP35를 제공하는 가장 짧은 단편은 플라스미드 E(레인 2)이다. 상기한 플라스미드 작제물은 이의 내인성 프로모터로부터 발현된 것이므로, 결과적으로 HpaI-PstI 단편중에 함유된 서열은 ICP35를 암호화하는 유전자의 암호화 서열 및 프로모터를 함유한다. 플라스미드 E는 UL26.5 RNA 서열과 168개의 뉴클레오티드를 모두 함유한다.
[실시예 5]
개방 판독 프레임 분리 및 특징화
제6도는, 플라스미드 작제물로 형질감염되고 바이러스로 중복감염된 세포로부터 추출한 폴리펩티드를 폴리아크릴아미드 겔중에서 전기영동으로 분리시키고, 니트로 셀룰로오즈 시이트로 전기적으로 이동시키고, 모노클로날 항체 H725 (HSV Ab) 또는 CH28-2(CMV Ab)와 반응시킨 후, 이의 사진을 찍은 것이다. 겔의 상단의 문자는 세포를 형질감염시킨 플라스미드 작제물을 나타낸다. - 또는 문자가 없는 것은 세포가 감염되었으나 형질감염되지 않았음을 나타낸다. 수직선은 서서히 이동하는 밴드를 나타낸다.
제6도는 작제물 J. K 또는 L에 의해 형질감염된 BHK 세포가 항-HSV-1 ICP35(H725) 및 항-CMV(CH28-2) 모노클로날 항체와 모두 반응하는 단백질 부류를 생성한다는 것을 나타낸다. 플라스미드 작제물 L의 형질전환 산물에 의해 형성된 특징적인 4개의 ICP35 밴드는 ICP35에 대한 개시 메티오닌 코돈이 위치 1099에 존재한다는 것을 나타낸다.
이 결과는 ICP 35를 구체화하는 UL26.5 암호화 서열이 UL26의 일부를 구성하고 이의 프레임내에 존재함을 나타낸다. 전술한 단락에서 ICP35가 HpaI-PstI 단편내에 함유된 DNA 서열의 트랜스활성화에 의해 발현될 수 있다고 밝혀졌다. 플라스미드 작제물 E가 HSV-2에 의해 트랜스활성화될 수 있으므로, UL26의 암호화 서열이 ICP35를 구체화하는 유전자의 암호화 서열 및 프로모터 도메인 모두를 포함한다고 결론지을 수 있다.
[실시예 6]
항-CMV mAb의 용도
플라스미드 작제물로 형질감염되고 HSV-1으로 중복감염된 세포로부터 수득한 폴리펩티드의 사진은 SDS 폴리아크릴아미드 겔중에서 전기영동으로 분리시키고, 니트로셀룰로오스 시이트로 전기적으로 이동시킨 후, 모노클로날 항체 H725(HSV Ab) 또는 CH28-2(CMV Ab)와 반응시켜 찍은 것이다. 제19도에 나타낸 겔의 상단 문자들은 세포를 형질감염시킨 플라스미드 작제물을 나타낸다. - 또는 문자가 없는 것은 세포가 감염되었지만 형질감염되지 않았음을 나타낸다. 수직선은 서서히 이동하는 밴드를 나타낸다. 이 결과는 항-CMV 모노클로날 항체를 사용함으로써 세포를 이종 바이러스로 중복감염시킬 필요가 없음을 나타낸다.
[실시예 7]
UL26 ORF의 산물의 동정, 분리 및 특성화
제8도는, BHK 세포를 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 바이러스로 중복감염시킨 후, 이 세포를 폴리아크릴아미드 겔중에서 전기영동으로 분리시킨 후, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적으로 이동시키고, 모노클로날 항체 H725(HSV Ab) 또는 CH28-2(CMV Ab)와 반응시켜 수득한 폴리펩티드의 자동 방사선사진 상 및 사진을 나타낸다. 겔 상단의 문자들은 세포를 형질감염시킨 플라스미드 작제물을 나타낸다. 수직선 및 화살표는 UL26 단백질의 산물을 나타낸다.
제8도에서, 레인 1, 2 및 3은 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 [35S] 메티오닌으로 표지된 단백질의 자동방사선사진 상이다. HSV-2의 감염된 세포 단백질(ICP)를 문헌[참조: Morse et al. (1978)]에 따라 번호매긴다.
레인 8, 9 및 10은 CH28-2 모노클로날 항체가 아닌 H725로 염색한 레인 4, 5 및 6에 나타낸 것과 동일한 세포의 용해질을 나타낸다.
레인 7은, UL26을 α4 프로모터에 의해 유도시키고, HSV-1(F)로 감염시켜 39℃로 유지한, 플라스미드 작제물 J로 형질감염시킨 세포의 용해질을 나타낸다. 이 조건하에서, 단지 α 및 소수의 β 단백질들만이 발현되나, HSV-1(F)의 ICP35는 발현되지 않는다. HSV-1(F) 바이러스 게놈내 ICP35는 발현되지 않는다. 플라스미드 작제물에 의해 암호화된 ICP35는 형질감염된 유전자가 β 유전자로서 조절되는 한 발현된다.
선행 단락에서, ICP35를 암호화하는 서열이 UL26 ORF로 표시된 서열의 일부만이 중첩되어 있다고 밝혀졌다. 하기 단락에 나타낸 연구의 목적은 전체 길이의 UL26 개방 판독 프레임의 산물을 동정하는 것이다. BHK 세포들을 플라스미드 작제물 O, N 또는 P(제1도)로 형질감염시킨 다음, HSV-2로 감염시킨다. 플라스미드 O, N 및 P로 형질감염된 세포로부터 전기영동으로 분리된 단백질을 HSV-1(H725) 또는 CMV(CH28-2)에 대한 모노클로날 항체들(제19도에서 레인 4 내지 6 및 레인 8 내지 10)과 반응시킨 다음 자동방사선사진 처리하여 분자량 마커(레인 1 내지 3)를 제공한다. 이 결과의 현저한 특성은 하기와 같다:
(1) 프레임내에 삽입된 CMV 에피토프를 함유하는 플라스미드 작제물 O 및 P는 겉보기 분자량이 75,000 내지 78,000인 단백질에 대략 상응하는 전기영동적 이동성을 갖는 두개의 밴드를 형성하는 단백질을 구체화한다(제8도, 레인 4 및 6). CMV 모노클로날 항체는 플라스미드 O 및 P(레인 4 및 6)에 의해 생성된 ICP35 밴드와 반응하지 않는다. CMV 에피토프는 HpaI 제한 엔도뉴클레아제 부위(+832), 즉 +1099 위치에 있는 ICP35의 해독 개시 부위의 앞에 삽입된다.
(2) 모든 플라스미드 작제물은 HSV-1 ICP35에 대한 H725 모노클로날 항체와 반응하는 ICP35를 제조한다. 플라스미드 작제물 N 및 P에 의해 제조된 ICP35 단백질의 전기영동적 이동성에 있어서 불균형은 플라스미드 작제물 N내로 추가의 21게 아미노산을 암호화하는 올리고뉴클레오티드가 삽입되었음을 반영한다.
(3) ICP35 단백질과 비교하여 전체 UL26 ORF에 의해 구체화된 단백질이 풍부하다는 것은, 분자량이 75,000 내지 78,000kd인 단백질 및 ICP35 모두가 동일한 모노클로날 항체 CH28-2와 반응하지만, 거대 단백질의 반응성 또는 양이 ICP35에 대해 관측한 것보다 현저히 적다는 관찰로부터 추론할 수 있다.
두개의 단백질들이 아미노산 서열을 공유한다는 확실한 증거는, UL26의 과잉 생성 조건하에서 작제물 J가 거대 단백질 및 ICP35가 함께 이동하고 CH28-2 모노클로날 항체와 반응하는 단백질을 생성한다(화살표, 제19도, 레인 7)는 관측에 기초한다.
[실시예 8]
UL26 및 UL26.5 단백질의 특성
뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 해독시키고 9.5% 변성폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리시킨35S-메티오닌으로 표지된 폴리펩티드의 자동방사선 사진의 상을 제19도에 나타낸다.
레인 1은 위스콘신 소재의 프로메가 바이오테크(Promega Bitoec, WI)로부터 입수한 키트를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 제공된 브롬 모자이크 바이러스(brome mosaic virus) 주형의 해독 산물이다. 레인 2는 플라스미드 U내의 UL26 개방 판독 프레임의 해독 사물을 나타낸다. 레인 3은 플라스미드 T 내의 UL26.5 개방 판독 프레임의 해독 산물을 나타낸다. 이들 결과는 UL26 및 UL26.5가 각각 겉보기 분자량이 80.000kd(Pra) 및 45,000(ICP35c, d)인 이중결합을 형성하는 단백질을 구체화한다는 것을 나타낸다.
[실시예 9]
ICP35c, d를 전위의 e, f로 프로세싱하는데 요구되는 UL26의 유전자 산물
34℃(34˚) 또는 39℃(39˚)에서 플라스미드 작제물로 형질감염시키고 HSV-1(F)로 중복 감염시킨 후, 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트로 전기적 이동시키며 HSV-1 ICP35에 대한 모노클로날 항체 H725(HSV Ab)와 반응시키고 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 염색시킨, BHK 세포로부터 전기영동으로 분리한 폴리펩티드의 사진 상을 제19도에 나타낸다. 실험적인 세부사항은 본원의 재료 및 방법에서 기술되어 있다. 겔 상단의 횡축 문자들은 세포를 형질감염시킨 플라스미드 작제물을 나타낸다. -는 세포들이 감염되었으나 형질감염되지는 않았음을 의미한다. 측면상의 문자들은 문헌 [참조: Braun et al. (1984)]에 따른 상이한 종의 ICP를 나타낸다.
ICP35 밴드 e 및 f는 밴드 c 및 d의 단백질의 절단 생성물이다. 밴드 c', d', e' 및 f'에 이동하는 단백질은 CM 에피토프를 함유하므로 각각 밴드 c, d, e 및 f의 정격 단백질보다 서서히 이동한다.
앞서 실험에서는 ICP35c, d가 ICP35 e, f의 전구체라고 가정하였다[참조: Braun et al., 1984; Preston et al., 1983]. 이 가정을 시험하기 위해, BHK 세포를 UL26.5 유전자를 함유하는 플라스미드 E(제1도)로 형질감염시키고, 39℃에서 HSV-1(F)로 중복감염시킨다. 이 바이러스는 온도에 민감하여 39℃에서 자체의 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임을 발현하지 않는다. 이 결과(제19도)를 하기에 나타낸다:
(1) 바이러스 게놈내에 존재하는 ICP35 유전자는 34℃에서 발현하나(레인 1) 39℃에서는 발현하지 않으며(레인 2), 이것은 각각 ICP35에 대한 H725 모노클로날 항체와 반응성인 ICP35 밴드의 존재 및 부재로써 입증된다.
(2) ICP35c, d는 39℃에서 플라스미드 E의 하나의 판독 프레임으로부터 발현된 단지 2종류의 ICP35 단백질들이나(레인 4), 하나 이상의 ICP35c, d, e 및 f 가 34℃로 유지된 다량 감염된 세포의 용해질중에서 검출될 수 있다(레인 1).
이들 결과로부터 다음과 같이 결론지을 수 있다:
(a) ICP35c, d는 ICP35 단백질의 비프로세싱된 형태이고;
(b) 이들은 ICP35e, f로 프로세싱될 수 있으며;
(c) 프로세싱은 HSV-1(F) 후기 유전자 발현의 부재하에서는 발생하지 않으므로 상호작용 인자를 필요로 한다.
[실시예 10]
트랜스로 작용하여 ICP35c 및-d를 ICP35e 및-f로 프로세싱 할 수 있으며 경쟁적이고 ICP35c 및-d를 ICP35e 및-f로 프로세싱하는데 필요한 적격의 유일의 바이러스 단백질인 UL26
UL26이 트랜스 또는 시스중 어떤 형태로 작용하는지 측정하기 위해, BHK 세포들을 프로세싱하기 위한 기질로서 플라스미드 N 및 UL26 개방 판독 프레임내에 결실을 갖는 일련의 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고, HSV-1(F)로 감염시켜 39℃에서 유지시킨다. 이 결과(제10A도)는 하기와 같다 :
(i) ICP35c 및-d는 플라스미드 N 및 E를 사용하여 공동형질감염시킨 세포의 용해질이 CMV 모노클로날 항체와 반응성인 ICP35e 및-f를 함유하지 않는 한(레인 8), ICP35e 및 -f로 프로세싱을 자동촉매하지 않는다.
(ii) ICP35c 및 -d는 플라스미드 N 및 C 또는 I로 공동형질감염시킨 BHK 세포내에서 프로세싱되지 않는다(레인 7 및 6). 플라스미드 C 및 I는 각각 프로모터 영역내 및 UL26 개방 판독 프레임이 폴리아데닐화 부위에 결실 부위를 함유한다(제 1도).
(iii) ICP35c 및 -d는 플라스미드 N 및 A 또는 B로 공동형질감염시킨 BHK 세포내에서 ICP35e 및 -f내로 프로세싱된다. 플라스미드 A 및 B는 각각 온전한 UL26 프로모터 및 개방 판독 프레임 및 α4 프로모터에 의해 유도되는 UL26 암호화 서열을 함유한다(레인 5 및 4). α-형질도입 인자는 39℃에서 α4 프로모터를 높은 수준으로 유도시키는 HSV-1(F)이다. UL26의 높은 수준의 발현은 플라스미드 N 및 B을 사용하여 공동형질감염시킨 세포들의 용해질중에 ICP35의 프로세싱된 형태(e 및 f형)가 존재하는 것으로 해석될 수 있다(레인 4).
이 결과는 UL26이 ICP35c 및 -d를 ICP35e 및 -f로 프로세싱하는데 관여하는 단백질은 암호화한다는 것을 나타낸다.
UL26이 39℃에서 HSV-1(F) 게놈에 의해 발현된 바이러스 유전자들이 ICP35의 촉매작용에 기여한다는 가능성을 배제시킨 당해 프로세싱에 요구되는 유일한 바이러스 단백질인가를 결정하기 위해, 각각 프로세싱하기 위한 기질 및 효소를 암호화하는 유전자들로서 일정량의 플라스미드 L 및 상이한 양의 플라스미드 B를 사용하여 BHK 세포를 공동형질전환시킨다. 플라스미드 L(제1도)중, UL26.5 개방 판독 프레임은 α4 프로모터에 의해 조절되고 CMV 에피토프는 MstII 제한 엔도뉴클레아제 부위에 삽입되고, 한편 플라스미드 B는 동일한 프로모터에 의해 유도되는 온전한 UL26 개방 판독 프레임을 함유한다. α4 프로모터는 형질가염된 세포내에서 구성적으로 발현되는 강력한 진핵세포 프로모터이고[참조: Kristie ＆amp; Roizman, 1991; Post et al., 1981], 플라스미드 L 및 B로 형질감염시킨 세포내에서 UL26.5 및 UL26 단백질의 발현시 HSV-1(F)을 사용한 중복 감염은 필요치 않다. 이 결과(제11B도)는 하기와 같다;
(i) 바이러스 감염의 부재하에서, ICP35c 및 -d는 세포내에서 플라스미드 L을 사용하여 형질감염시킨 세포내에서 발현된 단지 2개의 종이다(레인 17). 플라스미트 L에 의해 발현된 에피토프적으로 표지된 ICP35는 허용되는 온도에서 HSV-1(F)를 사용하여 중복감염시킨 세포내에서 충분히 프로세싱된다(레인 18). 예상대로, 플라스미드 B는 항-CMV 항체와 반응성인 산물을 생성하지 않는다(레인 11).
(ii) UL26을 함유하는 플라스미드 B의 존재하에, 플라스미드 L에 의해 발현된 에피토프적으로 표지된 ICP35c 및 -d를 ICP35e 및 -f내로 프로세싱된다. 플라스미드 B의 저 농도에서, ICP35e 및 -f의 축적 정도는 BHK 세포를 플라스미트 L과 함께 공동 형질감염시킨 UL26 플라스미드 DNA의 양에 직접적으로 비례한다(레인 12 내지 16). 최대량의 플라스미드 B의 존재하에서 관측된 ICP35e 및 -f 양의 감소는 두 플라스미드 사이에서의 경쟁 또는 다량의 DNA에 의해 유발된 독성의 결과로서의 수율 감소를 반영한다.
이들 연구로부터 UL26의 산물이 ICP35c 및 -d를 ICP35e 및 -f로 프로세싱하기에 적합하고 충분한 유일한 바이러스 인자라고 결론지어진다.
[실시예 11]
카복실 말단을 절단하는 프로테아제
34℃(34˚, 레인 1 및 4), 39℃(39˚, 레인 2 및 5), 또는 37℃(레인 3 및 6 내지 14)에서 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고 HAS-1(F) (HSV-1) 또는 HSV-2(G)(HSV-2)를 사용하여 모의-감염 또는 중복감염시키고, 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하며, 니크로셀룰로오스 시이트를 전기적 이동시키고, 모노클로날 항체 H725(HSV-Ab) 또는 CH28-2(CMV Ab)와 반응시켜 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 염색시킨, 세포로부터 수득한 폴리펩티드의 사진을 제19도에 나타낸다. 겔의 상단의 문자들은 세포를 형질감염시킨 플라스미드의 작제물을 나타낸다. -는 세포들이 감염되었으나 형질감염되지 않았음을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 프로테아제에 의해 수행된 절단 형태이다. ICP35c, d에서 e, f로의 프로세싱은 카복실 말단 단백분해 절단을 포함한다.
플라스미드 N에 의해 구체화된 ICP35e, f가 변성 겔내에서 HSV-1 감염된 세포내에서 생성된 ICP35c, d와 함께 이동하는 한(제19도, 패널 A, 레인 1 및 5), 프로세싱 중에 절단된 ICP35의 부위는 대략 플라스미드 N내로 삽입된 CMV 아미노산 서열의 크기와 동일하다고 유추될 수 있다. ICP35 프로세싱에 카복실 말단 단백분해절단이 포함되는지를 측정하기 위해, BHK 세포를 플라스미드 J, R, S 및 W를 사용하여 형질감염시키고, HSV-2로 중복감염시킨다. 플라스미드 R은 UL26.5의 PmlI내에 삽입된 CMV 에피토프(서열 A)를 함유하는 반면, 플라스미드 S 및 W에서 삽입부는 카복실 말단 아미노산에 위치한다. 전기영동으로 분리하고 폴리펩티드를 전기적으로 이동시킨 후 항 HSV-1(H725) 및 항 CMV(CH28-3) 모노클로날 항체와 반응시켜 분석한 결과는 하기와 같다(제19도):
(1) CMV 에피토프가 UL26 정지 코돈으로부터 상향으로 122번째 아미노산의 MstII 부위에 삽입된 플라스미드 J로 형질감염시킨 세포는 전구체 ICP35c, d 및 CMV 항체와 반응하는 산물 ICP35e, f 모두를 생성한다(레인 8). 야생형 단백질에 비해 ICP35c, d,e 및 f의 전기영동에 의한 이동의 감소는 CMV 에피토프의 삽입에 의한 분자량의 증가에 기인한다.
(2) ICP35c, d는 단지 플라스미드 Q로 형질감염시킨 세포내에서 제조된다(레인 3 및 6). 이 플라스미드에서 CMV 에피토프는 UL26의 PmlI 부위에 삽입되며, 이는 UL26 정지 코돈으로부터 상향으로 21번째 아미노산이다. ICP35c, d의 확인은 이들이 형질감염된 세포내에서 ICP35c, d만을 발현시키는 플라스미드 L에 의해 구체화된 상응하는 형태와 함께 이동한다는 관찰에 기초한다(제19도. 패널 B, 레인 17).
(3) 서열 C의 플라스미드 R의 PmlI 제한 엔도뉴클레아제 부위에서의 삽입으로 이 부위가 파괴되고 UL26 또는 UL26.5의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 UL26의 카복실 말단 아미노산 및 정지 코돈사이에 새로운 PmlI 절단 부위가 생성된다. H725 모노클로날 항체로 검출되는(레인 11) ICP35c, d, e 및 f는 정격 단백질과 함께 이동되며, 이것은 서열 C의 삽입으로 ICP35의 발현 및 프로세싱이 영향받지 않음을 나타낸다.
(4) 플라스미드 S 및 W에서 CMV 에피토프를 UL26.5의 카복실 말단에서 플라스미드 R의 새로운 PmlI 부위내로 삽입시킨다. 이들 플라스미드로 형질감염시킨 세포들은 HSV-1 H725 모노클로날 항체와 반응성인 ICP35c, d,e, 및 f(레인 10, 14)를 축적하지만, 단지 ICP35c 및 d형만이 CMV CH28-2 모노클로날 항체와 반응했다(레인 9, 14). 중요한 발견은 플라스미드 S의 ICP35c 및 d 형태들이 플라스미드 J의 상응하는 형태와 함께 이동한다는 것, 즉 야생형인 ICP35e, f 보다 21개의 아미노산이 길다는 것이며, 이는 CMV 에피토프를 암호화하는 삽입된 아미노산 서열이 제거되었음을 나타낸다(레인 9 및 10). 플라스미드 W에 의해 구체화된 산물도 동일한 방식으로 작용한다(제19도). 아마도 플라스미드 W내의 전체 UL26 개방 판독프레임이 재구성되어 더욱 많은 단백질 산물이 발현되고 ICP35를 프로세싱하는데 이용할 수 있기 때문에, 플라스미드 W에 의해 구체화된 ICP35e 및 f가 플라스미드 S 및 R에 의해 구체화된 것들보다 다량이다.
전구체 ICP35 단백질의 절단 부위는 카복실 말단 코돈으로부터 대략 20번째의 아미노산이다. 이러한 결론은
(1) 말단으로부터 21번째 아미노산에 CMV 에피토프의 삽입으로는 절단이 방해된 반면, 카복실 말단에서 에피토프의 삽입으로는 절단이 수행되었고;
(2) ICP35e' 및 f'(CMV 에피토프와 함께) 및 ICP35c, d가 함께 이동하며, 이러한 공동 이동은 CMV-삽입된 e 및 f를 정격 프로테아제인 c, d와 동일한 겔 위치에 둔다는 것으로부터 입증된다.
ICP35 아단위를 제조하고 UL26 프로테아제를 자동 프로세싱하는데 사용된 절단 메카니즘간의 예기치 않은 상관 관계는, 둘다 카복실 말단 단백분해 절단을 수반한다는 것이다. 앞서의 단락에서, UL26이 ICP35의 카복실 말단 단백분해 프로세싱에 관여하는 유일한 바이러스 인자임이 증명되었다. 프로테아제를 암호화하는 UL26 및 ICP35를 암호화하는 UL26.5는 또한 카복실 말단 아미노산 서열을 공유한다. UL26이 자체 절단될 가능성은, 34℃ 또는 39℃에서 플라스미드 P(제1도)로 형질가염시키고 HSV-1(F)로 중복감염시킨 BHK 세포가 CH28-2 모노클로날 항체와 반응하는 UL26의 이중밴드(제19도, 레인 4 및 5)로 나타난다는 관찰에 따른다. 이 관찰은 HSV-1(F)가 39℃에서 주로 α유전자를 발현시키기 때문에 UL26이 자체의 절단을 촉매할 수 있다는 가능성을 제시한다.
[실시예 12]
자체를 절단하는 프로테아제
UL26 개방 판독 프레임에 의해 암호화되고, 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리시킨35S-메티오닌으로 표지된 폴리펩티드의 자동 방사선을 사진을 제19도에 나타낸다. 플라스미드 U 및 V(제1도)에 함유된 UL26 개방 판독 프레임을 시험관내에서 전사시키고, 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 해독한다. 레인은 해독 개시 10, 20, 90 및 360분후에 해독 혼합물로부터 제거된 위치를 나타낸다. 레인 4 내지 7 및 12 내지 15에 나타낸 샘플에 대해, 해독 개시 10분 후 사이클로헥시이미드를 해독 혼합물에 가하여 더 이상의 해독을 억제시킨다. 레인 1 내지 3의 경우, 해독 개시 10분 후의 해독 혼합물을 사이클로헥시이미드(100㎍/㎖)를 함유하는 인산염-완충된 염수내에서 10배 희석시킨다.
시험관 연구로부터 UL26이 자체 절단을 촉매한다는 추가의 사실이 밝혀졌다. 시험관내에서 Sp6 RNA 폴리머라제 T7에 의해 플라스미드 U 또는 V(제1도)로부터 전사된 RNA를 [35S]-메티오닌 존재하에 뉴클레아제 처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 해독시킨다. 해독 반응의 생성물을 전기영동으로 분리한 분석 결과는 하기와 같다(제13도):
(1) 사이클로헥시이미드의 존재하에서 U 플라스미드의 해독 산물의 항온처리로 UL26 단백질의 절단 산물(Prb)이 점진적으로 축적된다. 축적되는 절단 산물의 양은 항온처리 기간에 비례한다(레인 16 내지 19).
(2) 플라스미드 V의 해독 산물에서도 동일한 결과가 수득된다. 이 실험의 중요성은 UL26의 카복실 말단에 CMV 에피토프가 존재한다는 사실에서 유래한다. 예상한 바와 같이, 플라스미드 V로부터 제조된 UL26의 전구체 형은 플라스미드 U로부터 유래한 정격 단백질보다 서서히 이동한다. 그러나, 플라스미드 V로부터 합성된 UL26으로부터 프로세싱된 단백질은 플라스미드 U로부터의 정격 단백질의 것과 함께 이동하므로, 이는 UL26 자동 프로세싱에 카복실 말단 단백분해 절단이 수반된다는 것을 나타낸다.
[실시예 13]
서열 특이적이며 동일한 부위에 존재하는 ICP35c, d 및 Pra의 절단
플라스미드 U 또는 Y에서 암호화되는 서열로부터 시험관내 합성되거나 플라스미드 X 또는 Z로 형질감염시키고 HSV-1(F) 또는 HSV-1(G)를 사용하여 중복감염시킨 세포의 용해질내에 함유된 폴리펩티드의 자동방사선상(제14도, 패널 A) 및 사진상(제19도, 패널 B)을 제19도에 나타낸다. 시험관내에서 합성된 폴리펩티드 및 세포 용해질내 함유된 폴리펩티드를 동일한 변성 12% 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트에 전기적 이동시켜, 단지 양고추냉이 퍼옥시다제(항-IgG)에 결합된 모노클로날 항체 항-마우스 IgG와 반응시키거나, 이러한 항-IgG 항체와 모노클로날 항체 H725(HSV Ab) 또는 CH28-2(CMV Ab)와 반응시킨다. -는 세포가 감염되었으나 형질감염되지 않았음을 나타낸다. 패널 A에 나타낸 폴리펩티드는35S-메티오닌으로 표지되었다. 밴드 표시는 하기와 같다: 프라임이 없는 문자 c, d, e, f는 UL26.5 개방 판독 프레임의 정격 ICP35 산물을 나타낸다. Pra 및 Prb는 UL26 개방 판독 프레임의 프로테아제 산물의 해독 프로세싱된 형이다. 이중 및 삼중 프라임은 각각 단백질이 CMV 에피토프 및 2개의 IgG 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 단백질 A의 5개의 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열을 함유함을 나타낸다. PA＆quot; 및 PA＆quot;'는 CMV 에피토프 및 IgG 결합 도메인의 삽입물을 함유하는 ICP35c, d 및 Pra 단백질의 절단 카복실 말단 산물이다.
ICP35c, d 및 Pra의 절단은 서열 특이적이며 동일한 부위에 존재한다. 본원에 나타낸 실험 결과는, UL26 및 UL26.5 산물의 절단/프로세싱이 단백질의 카복실 말단으로부터 대략 18 내지 25번째 아미노산 부위에서 발생했음을 제시한다. 이들 단백질들의 프로세싱이 예견한 부위에서 발생함을 증명하기 위해서는, 절단 반응의 산물 모두를 동일한 겔 상에 입증해야 한다. 2개의 산물 모두를 관찰하기 위해서는 CMV 모노클로날 항체에 대한 에피토프 및 스타필로코커스 단백질의 A의 IgG 결합 도메인을 암호화하는 서열 모두를 추정된 카복실 말단에서의 암호화 서열내로 삽입시켜야 한다. 플라스미드 X 및 Z는 프라임내에 각각 단백질 A의 IgG 결합 도메인 2개 및 5개를 포함하는 129 및 256개 아미모산을 암호화하는 서열을 프라임내로 삽입하거나, 프라임내 CMV 에피토프의 3' 말단 및 UL26의 정지 코돈 사이에 삽입시킴으로써 작제된다(제1도).
2개의 실험이 수행되었다. 제1 실험에서는, 플라스미드 U 및 Y 내 HSV-1 개방 판독 프레임을 6시간 동안 전사 및 해독한다. 이어서, 시험관내에서 해독된 단백질을 변성 겔 내에서 전기영도으로 분리한다(제14도, 패널 A). 제2 실험에서는, BHK 세포를 플라스미드 Z 또는 X로 형질감염시킨 다음 HSV-2(G)로 중복감염시킨다. 세포 용해질을 시험관내에서 해독된 단백질의 분리시 사용된 것과 동일한 겔 내에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로오스 시이트로 전기적 이동시키며, CMV, HSV에 대한 항체 또는 단백질 A의 IgG 결합 도메인에 결합하는 항-IgG 항체와 반응시킨다(제14도, 패널 B). 이 결과는 하기와 같다 :
(i) 시험관내에서 전사되고 해독된 플라스미드 U내의 HSV-1 서열의 자동 촉매적 프로세싱으로 예상된 바와 같이 Pra 및 Prb로서 지정한 단백질 밴드가 수득된다. Z 밴드의 산물의 유사한 자동촉매적 프로세싱으로 세개의 밴드가 수득된다. 제1 밴드는 완전한 전구체 Pra 밴드보다도 더 늦게 이동하므로, 단백질 A의 추가의 256개 아미노산 및 CMV 에피토프를 구성하는 21개 아미노산이 존재하는 것으로 예상된다. 제2 배드는 Prb 밴드와 함께 이동하므로 이것은 해독 산물이 자동 촉매적으로 절단된 산물이다. 제3 밴드는 후술된 밴드와 함께 이동하며, CMV 뿐만 아니라 항-IgG 항체와 반응한다.
(ii) 플라스미드 X의 예상된 해독 산물은 ICP35c, d 및 Pra이다. 짧은 단백질 A 서열의 삽입으로 인하여, 이들 단백질들이 플라스미드 X의 단백질보다 더 빠르게 이동한다는 것 외에는, 플라스미드 Z의 해독 산물이 유사하다고 예측할 수 있다. 이것은 사실 레인 3, 5 및 8과 4, 6 및 9를 비교한 경우이다. ICP35c, d의 절단이 완전한 단백질의 카복실 말단으로부터 예상된 20번째 아미노산에서 발생한다면, 절단 반응의 아미노 말단 산물은 완전한 ICP35와 함께-이동하며 HSV-1 모노클로날 항체와만 반응한다고 또한 예측할 수 있다. 이것은 플라스미드 Z 및 X에 의해 제조된 ICP35e 및 f(레인 5 및 6)가 완전한 ICP35e 및 f(레인 7)와 함께 이동하고 HSV-1 특이적 모노클로날 항체에 의해 유일하게 검출되는 경우이다. 역으로, 절단 반응의 카복실 말단 산물은 자체의 크기에 따라 이동하며, 항 IgG 및 CMV 항체와 반응한다고 예측할 수 있다. 제19도의 패널 B에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 X로 형질감염된 세포의 분해질로부터 수득한 항 IgG 항체와 반응성인 밴드는 상응하는 Z 밴드보다 느리게 이동한다. 그러나, 카복실 말단의 절단 산물 모두가 단백질 A의 IgG 결합 도메인을 함유하기 때문에, 모든 단백질 산물은 면역 글로블린의 특이성과는 상관없이 IgG와 반응할 것으로 기대된다(예 : 밴드 5 및 6).
모든 산물이 검출되므로, 이 결과는 ICP35c, d 및 Pra, UL26.5 및 UL26의 산물 각각이 절단에 의해 해독되어 프로세싱되었음을 나타낸다. 2개의 단백질이 완전한 길이의 ICP35c, d에 대한 아미노산 서열을 공유하고 2개의 단백질의 절단 산물이 함께 이동하기 때문에, 이 두개의 단백질은 동일한 부위에서 절단된 것이다. 최종적으로, 시험관내에서 개방 판독 프레임 모두의 해독 산물을 이중 밴드로 나타난다. ICP35(c 및 d형)의 경우 이 이중 밴드가 특히 두드러진다. 제12도에 나타낸 것들을 포함하여 현재까지 행해진 모든 실험에서 카복실 말단 산물의 절단으로 단일 밴드가 생성된다. 이 관찰은 이중 밴드를 형성하는 단백질들의 차이점은 단백질의 카복실 말단이 아닌 아미노산에 있다는 가설과 일치한다.
[실시예 14]
검정물로서의 프로테아제 발현 시스템
제15도는 변성 겔내에서 전기영동으로 분리한 UL26개방 판독 프레임에 의해 암호화된35S-메티오닌으로 표지된 폴리펩티드의 자동방사선 사진의 상이다. 플라스미드 U 및 Y(제1도)내에 함유된 UL26 개방 판독 프레임을 시험관내에서 전사시키고 뉴클레아제 처리된 토끼의 망상적혈구 용해질내에서 해독한다. 레인 1은 해독개시 360분후 해독 혼합물로부터 제거된 위치를 나타낸다. 레인 2 내지 5는 해독개시 10분(9) 또는 360분(360)후 해독 혼합물로부터 제거된 위치를 나타낸다. 레인 2 내지 5에 나타낸 샘플에 있어서, 해독개시 10분 후 동일한 양의 해독 혼합물을 사이클로헥시미드(100㎍/㎖) 및 나트륨 도데실 설페이트(SDS) (0.4%) (레인 3) 또는 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)(500㎍/㎖)(레인 4)를 함유하는 인산염-완충된 염수로 20배로 희석한다.
제15도에 나타나 있는 바와 같이, PMSF는 프로테아제 자체-절단을 부분적으로 억제할 수 있다. 레인 5는, 정상적인 자체 절단을 나타낸 것이다. 레인 3에서는 SDS에 의해 100% 억제되었다. 제 14도로부터 1) 변성시키는 세정제 SDS는 프로테아제 활성을 완전히 억제하고(레인 3); 2) 프로테아제는 프로테아제 억제제의 부재하에서 자체-절단할 수 있으며; 3) PMSF, 세린 프로테아제 억제제에 의해 프로테아제가 부분 억제되는 것으로 해석된다.
[실시예 15]
프로테아제 단백질의 도메인의 특성
프로테아제 단백질의 특성에는 (i) 프로테아제 단백질이 자체의 촉매 활성에 필요하지 않은 여러개의 도메인을 포함하고, (ii) 활성 부위가 프로테아제의 아미노 말단 근초에 있음이 포함된다.
이러한 특성을 관측하는데 사용한 실험 계획은 2가지 관측에 기준한다. 첫째로, 스타필로코커스 단백질 A로부터의 IgG 결합 도메인을 포함하는 추가의 아미노산 서열을 프로테아제의 카복실 말단에 삽입하는 것이 프로테아제의 자체 절단을 방해하지 않으며, 용이하게 검출가능한 반응 산물이 수득된다. 둘째로, 사람의 사이토메갈로바이러스 모노클로날 항체의 20개 아미노산 에피토프를 암호호하는 서열을 UL26 ORF 및 UL26.5 ORF의 암호화 도메인의 프레임내로 삽입시킴으로써 2개의 목적이 달성된다. 우선, 이것은 상기한 ORF 들의 생성물을 특이하게 동정하는데 사용된다. 둘째로, 프로테아제의 다양한 도메인을 분리시킴으로써, 촉매 작용을 위해 인접해야만 하는 프로테아제의 영역이 동정된다.
A. UL26 단백질의 기능적 도메인의 기술(delineation)
UL26 프로테아제의 3개의 돌연변이체(표 1)를 사용하여 프로테아제 도메인을 조사한다. 돌연변이체 1은 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임을 맵화하기 위해 제조하며, 이것은 다양한 부위, 20개의 아미노산의 CMV 에피토프를 암호화하는 DNA 서열에서 프레임내에 삽입된 3개의 UL26 유전자들로 이루어진다.
돌연변이체 2는 정지 코돈 또는 유전자의 다양한 영역에 걸쳐 결실부가 있는 10개의 U 6 유전자 작제물로 이루어진다(표 I).
돌연변이체 3은 7 내지 215번의 아미노산 영역에서 출발하는 예견된 아미노산 서열내부가 치환된 6개의 UL26 유전자로 이루어진다. 하기 단락에 기술한 바와 같이, 이 플라스미드 각각에서 UL26 유전자는 α4 프로모터 영역으로부터 발현된다. 이 프로테아제의 표적 부위는 일반적으로 플라스미드 L(제1도)내에 클론되고 프레임내에 CMV 에피토프 삽입부를 함유하는 UL26.5 유전자이다. 예외로, 클론 P 및 J는 UL26 및 UL26.5 유전자 모두의 암호화 서열(플라스미드 J) 또는 단지 UL26 암호화 도메인(플라스미드 P)내에 CMV 에피토프를 함유하는 UL26 유전자를 함유한다.
통상적으로, BHK 세포를 플라스미드 L 및 프로테아제를 암호화하는 플라스미드 1개로 형질감염시키고, 39℃에서 HSV-1(F)로 중복감염시킨다. 이 세포 용해질을 변성 겔에서 전기영동으로 분리하여 니트로셀룰로오스 시이트로 이동시키고, UL26.5 산물 모두와 반응하는 HSV 모노클로날 항체 H725 및 CMV 에피토프를 함유하는 UL26.5 산물과 유일하게 반응하는 CMV 모노클로날 항체 CH28-2와 반응시킨다(참조 : 제 15도). HSV-1(F)가 주요한 HSV-1 조절 단백질을 정의하는 α4 유전자내에서 온도에 민감한 병변부위를 함유하기 때문에, 이는 39℃에서 자체의 UL26 프로테아제 또는 기질을 발현하지 않는다. 그러나, α-유전자 트랜스형-유도인자(VP 16)은 고온에서 작용하며(참조: Post et al., 1981; Batterson et al., 1983), 프로테아제(UL26) 및 기질(UL26.5) 모두를 정의하는 유전자의 발현을 상호 활성화시킨다. 이 결과(제16도)는 하기와 같다 :
(1) 바이러스 게놈내 존재하는 UL26.5 유전자는 34℃에서 HSV 모노클로날 항체와 반응(레인 1 및 14)하지만 39℃에서는 반응하지 않는 레인( 2 및 15) 단백질 밴드가 수득된다. 더우기, 단백분해 절단 산물의 존재(밴드 e 및 f)는 UL26에 의해 암호화된 바이러스 프로테아제가 또한 34℃에서도 작용함을 의미한다.
(2) 바이러스 게놈내에서 암호화된 UL26 프로테아제는 39℃에서 발현되지 않는다(레인 3). 즉, 프로테아제를 암호화하는 플라스미드의 부재하에서, 플라스미드 L에 의해 암호화된 기질이 제조되지만(밴드 c, d), 절단되어 밴드 e, f를 생성하지 않으므로 바이러스 게놈내에서 암호화된 프로테아제는 비허용되는 온도에서 발현되지 않음을 의미한다.
(3) 플라스미드 L로부터 유도된 ICP35c, d의 전구체 형태만이 플라스미드 H(레인 4), G(레인 5), CC(레인 7), D(레인 9), DD(레인 11), FF(3개의 레인 13), 및 II(레인 21), 및 JJ(레인 23)내에서 돌연변이된 UL26 유전자로 형질감염시킨 세포내에서 축적된다. 이들 플라스미드에서는 유전자 식물의 프로테아제 활성이 불활성화된다.
(4) 플라스미드 L로부터 유도된 ICP35의 전구체 및 산물 형태 모두는 돌연변이된 UL26 유전자 AA(레인 6), B(제19도, 레인 8), BB(레인 10), EE(레인 12), GG(레인 20), HH(3개의 레인 19), 및 KK(레인 22), P(레인 25), MM(레인 26) 및 NN(레인 27)형질감염시킨 세포내에 축적된다.
(5) 상기로부터 알 수 있듯이, 플라스미드 P내에서 20개 아미노산의 에피토프가 218번째 아미노산 다음, 즉 UL26.5에 의해 암호화된 기질 단백질의 암호화 도메인으로부터 상향 위치에 삽입된다. 플라스미드 P에 의해 암호화된 프로테아제는 자체(레인 16, 17) 및 ICP35(레인 25)를 절단한다. 플라스미드 J는 514번째 아미노산 다음에 CMV 삽입부를 함유한다(제1도). 검정시(레인 18), 이것은 자체가 플라스미드 J내에서 암호화된 UL26의 산물을 절단시킨다. 이 검정에서 검출된 유일한 절단 산물은 밴드 e이다. 에피토프가 또한 UL26.5 단백질내로 삽입되기 때문에, 삽입된 20개 아미노산의 에피토프는 절단을 방해하여, 절단 효율을 감소시키는 것으로 생각할 수 있다. 플라스미드 Q에 의해 암호화된 프로테아제(제1도 및 표 I)는 다른 플라스미드에 의해 정의된 UL26유전자 산물을 절단하지만 아미노산 615번 이후에 삽입된 에피토프가 절단을 간섭하기 때문에 자체 도메인내에서 암호화된 유전자에 의해 절단되지 않는 프로테아제를 암호화한다.
[표 1]
UL26 프로테아제를 암호화하는 유전자중의 돌연변이체 목록
야생형 유전자내로 도입된 돌연변이 명칭
삽입 돌연변이체(20개 아미노산 CMV 에피토프)
P 218번 아미노산 다음에 삽입
J 514번 아미노산 다음에 삽입
Q 615번 아미노산 다음에 삽입
결실 돌연변이체의 작제
D 1 내지 220번 아미노산의 결실
G 219 내지 615번 아미노산의 결실
EE 1 내지 9번 아미노산의 결실
FF 1 내지 32번 아미노산의 결실
AA 615번 아미노산 이후에 정치 코돈의 삽입
BB 514번 아미노산 이후에 정지 코돈의 삽입
CC 287번 아미노산 이후에 정지 코돈의 삽입
DD 218번 아미노산 이후에 정지 코돈의 삽입
MM 306번 아미노산 이후에 정지 코돈의 삽입
NN 307 내지 635번 아미노산의 결실
아미노산 치환
GG Gly7AspArg이 SerArgThr로 치환(새로운 XbaI 부위)*
HH Asp31SerGly이 LeuAspMet로 치환(새로운 XbaI 부위)
II His61이 Val로 치환(새로운 AatII 부위)
JJ His148이 Ala로 치환(새로운 PstI 부위)
KK Ser215이 Ala로 치환(새로운 NheI 부위)
LL Asp34이 Ala로 치환(새로운 NheI 부위)
*치환된 서열은 다음과 같다: 플라스미드 GG :
CCGGGAGACCGATG이 CCGTCTAGAACCATG로 치환; 플라스미드 HH:
TATGACAGCGGGGAC이 TATCTAGACATGGAC로 치환; 플라스미드 II :
GACCACCGC이 GACGTCCGC로 치환; 플라스미드 JJ : GCGCACGTC이 GCTGCAGTC로 치환; 플라스미드 KK : ACGCTTTCCACC이 ACGCTAGCCACC로 치환; 플라스미드 LL : GGGGACTCGGGG이 GGGGCTAGCGGC로 치환.
제 16 도는 돌연변이 유발 연구의 결과를 요약해서 나타낸 것이다. 수는 문헌 [참조 : McGeoch et al. (1988)]에 보고된 UL26 ORF의 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 아미노산 수를 의미한다. 삽입을 위해 나타낸 아미노산은 삽입 부위의 직전 부위이다. 이 아미노산은 단일 문자 코드로 확인된다. 개방된 기호는 프로테아제가 작용함을 나타낸다. 밀폐된 기호는 프로테아제가 돌연변이 유발에 의해 불활성화됨을 의미한다. 도면 하부의 선은 프로테아제의 도메인(I 내지 IV)을 나타낸다. 제한 엔도뉴클레아제 부위는 하기와 같이 약술한다: B: BstEII. H: HpaI, M: MstII. P: PmlI. Me는 UL26.5 개방 판독 프레임의 메티오닌 해독 개시 코돈을 나타낸다.
B. UL26 프로테아제의 도메인의 특성
제 16 도에 나타내고 제 17 도에 요약한 결과는 UL26 프로테아제가 없어도 되는 2개의 도메인과 반드시 있어야 하는 2개의 도메인의 4개 도메인으로 이루어져 있음을 나타낸다. 없어도 되는 도메인 I 및 IV는 각각 1번 아미노산에서 9번 아미노산에 이르며, 32번 아미노산까지는 아니고, 카복실 말단(635번 아미노산)에서 307번 아미노산 이상까지이지만 287번 아미노산까지는 아니다. 도메인 III은 218번 아미노산에서 306번 아미노산까지 이르는 것으로 보인다. 이 도메인은 프로테아제의 아미노 말단 부위와 관련된 20개 이상의 아미노산(218번 아미노산 이후의 CMV 에피토프 삽입)에 의해 치환될 수 있다. 도메인 II는 또한 반드시 있어야 하며, 10번 내지 218번 아미노산 사이에 위치한다.
C. UL26 프로테아제의 촉매적 도메인
프로테아제 억제제를 사용한 연구는 UL26이 키모트립신 또는 세린 프로테아제의 섭틸리신 상족에 포함된다고 예견할 수 있음을 제시하고 있다[참조; Kraut, 1977; Neurath, 1983]. 2개의 세린 프로테아제 상족의 공유 특성은 히스티딘, 아스파트산 및 세린 아미노산을 함유하는 활성 부위가 있다는 것이다.
프로테아제, ICP35의 기질은 HSV 캡시드의 조립에 있어서 기본 단백질로서 중요한 역할을 한다고 보고되어 왔다[참조 : Newcomb et al., 1991]. 다른 헤르페스 바이러스의 복제에 있어서 서열은 유사하며, ICP35 동족체가 보고되어 있다[참조: Robson and Gibson, 1989]. 특히 흥미있는 것은 3개의 보존된 히스티딘, 아스파트산 및 세린 아미노산을 함유하는 다른 헤르페스 바이러스내 UL26 ORF의 동족체가 UL26 프로테아제의 단백분해 활성에 있어 중요한 역할을 하는지의 여부이다.
뉴클레오티드 서열 비교는 바리셀라 조스터 바이러스의 ORF 33 및 사람의 사이토메갈로바이러스의 CMV UL80 ORF가 HSV-1의 UL26 ORF의 동족체를 암호화함을 나타낸다[참조 : McGeoch et al., 1988; Chee et al., 1990; Davison and Scott, 1986]. HSVU 26, CMV UL80 및 VZV 유전자 33 단백질사이의 아미노산 서열 비교는 이 아미노 말단이 UL26 프로테아제의 가장 보존된 도메인임을 나타낸다. UL26 ORF의 아미노 인접 도메인내 프로테아제의 맵은 UL26.5 ORF의 산물 ICP35의 효소 활성이 상실되어 있다는 관찰과 일치한다고 결론지을 수 있다. UL26의 아미노 인접 도메인내의 보존된 아미노산을 조사한 결과, 플라스미드 GG, II, JJ, KK 및 LL내에서 암호화된 아미노산의 치환부위는 Asp31, Ser32, Asp34, His61, His148및 Ser215이다. 이 결과는 효소 활성이 없어진 유일한 아미노산 치환체가 61 및 148 위치에서 보존된 히스티딘임을 나타낸다. 더욱 정의된 맵 연구에서, 프로테아제의 촉매적 도메인은 UL26 프로테아제의 도메인 II의 맵과 가장 유사한 것으로 여겨진다.
D. UL26 프로테아제의 다른 도메인의 기능
도메인 I, II 및 III의 기능은 알려지지 않았다. 기질 ICP35는 응집되어 HSV 캡시드의 골격을 형성하기 때문에, 프로테아제는 또한 골격내에 포함되며 하나 이상의 도메인 III 및 I 및 IV가 또한 ICP35를 합성시키는데 필요한 것으로 여겨진다.
[실시예 16]
세린 프로테아제를 암호화하는 UL26 유전자
본원에 기술한 20개 아미노산 CMV 에피토프 및 단백질 A의 256개 아미노산 IgG 결합 도메인(플라스미드 Y, 제 1 도)을 UL26 ORF의 말단 아미노산 및 정지 코돈 사이에 삽입시킨다. Sp6 RNA 폴리머라제에 의한 플라스미드 Y의 암호화 도메인의 전사물을 [35S]-메티오닌의 존재하에 10분간 뉴클레아제 처리된 토끼의 망상적혈구내에서 해독한다. 사이클로헥시미드를 가하여 더이상 해독되는 것을 중지시키고, Y 플라스미드의 해독 산물을 추가의 6시간 동안 배양하여 프로테아제 억제제의 존재하에 자체-절단되도록 한다. 이어서, 반응 산물을 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동으로 분리한다. 플라스미드 작제물 Y내에서 클론된 UL26 ORF가 시험관내에서 전사된 합성 RNA로부터 시험관내 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구내에서 해독된 폴리펩티드를 전기영동시켜 분리한 자동방사선사진 상을 제 17 도에 나타낸다. 제시한 레인은 합성후 10분 경화한 직후 전기영동하기 위해 변성시킨 부위(레인 15, 28) 또는 사이클로헥시미드(10㎍/㎖) 단독 또는 제시한 프로테아제 억제제(μM)의 존재하에 반응의 6시간 경과후 즉시 전기영동하여 변성시킨 부위(레인 1 내지 4, 16 내지 27 및 29 내지 47)를 나타낸다. 모든 프로테아제 억제제는 사용전에 디메틸 설폭시드(DMSO)에 용해시킨다.
이 결과(제 18 도)는 하기와 같다:
(1) 10분간의 해독산물은 절단되지 않은 프로테아제(Pra)를 함유하는 단일 방사선 표지된 폴리펩티드 밴드를 형성한다(레인 15 및 28).
(2) 사이클로헥시미드(100㎍/㎖)의 존재하 및 프로테아제 억제제의 부재하에 6시간 반응시킨 후, 해독 혼합물은 완전한 해독 산물(Pra), 아미노 말단(Prb) 및 해독 절단 산물의 카복실 말단(PA) 부위에 상응하는 3개의 밴드를 형성한다(레인 9, 10, 21, 22 및 33).
(3) 절단 산물, Prb 및 PA의 양은 사이클로헥시미드 및 저농도의 세린 프로테아제 억제제 디이소프로필 플루오로 포스페이트[DFP, 시그마 제조원(Sigma, St. Louis, MI 소재)], L-1-토실아미도-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤(TPCK, 시그마 제조원), N-a-p-토실-L-라이신 클로로메틸 케톤(TLCK, 시그마 제조원), 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF, 시그마 제조원) 및 키모스타틴[베링거 멘하임 제조원(Boebringer Manneheim, Indianapolis, IN 소재)]의 존재하에 반응한 해독 혼합물내에서 감소된다. 고 농도에서 실험할 때 분해 산물은 검출되지 않았다(레인 1, 29, 34, 39 및 44).
(4) 해독 산물(Pra)의 절단은 시스테인 프로테아제 억제제 요오도아세트산(시그마 제조원) 및 시스타틴(베링거멘하임 제조원 ; 레인 5 내지 9, 22 내지 27)에 의해, 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르), N, N,N',N'-테트라아세트산(EGTA). 킬레이터 및 메탈로프로테아제 억제제(레인 12 내지 14)에 의해, 또는 아스파트산 프로테아제 억제제 펩스타틴(베링거 멘하임 제조원ㅣ; 레인 15 내지 21) 에 의해 영향받지 않는다.
이 결과는 UL26 유전자 산물이 세린 프로테아제라는 가설과 일치한다.
[실시예 17]
후보 억제제 물질의 검출
다른 양태에서, 본 발명은 ＆quot;후보 물질＆quot;로서 지칭할 수 있는, 새로운 헤르페스 바이러스 프로테아제 억제 화합물을 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 선별 기술은 헤르페스 프로테아제를 억제하기 위해 사용된 특정 화합물을 일반적으로 동정하는데 유용한 것으로 여겨진다. 이와 관련된 유용한 혼합물은 단백질성 또는 펩티드 화합물로만 제한되지 않을 것으로 여겨진다. 사실, 선별 검정의 적용을 통한 동정을 위해 가장 유용한 약제학적 화합물은 그 특성이 비-펩티드성, 즉 효소에 의해 인식되고 결합되어, 강력한 결합 또는 다른 화학적 상호 작용을 통해 효소를 불활성화시키는 경우에 증명될 수 있다.
따라서, 이러한 양태에 있어서 본 발명은 헤르페스 프로테아제를 억제하는 후보 물질의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에는 일반적으로 (a) 자체의 아미노산 서열을 절단할 수 있거나 이 프로테아제에 대한 절단부위를 함유하는 ICP35 단백질 또는 어떠한 단백질도 절단할수 있는 헤르페스 프로테아제를 포함하는 조성물을 수득하는 단계; (b) 후보 물질을 프로테아제 조성물과 혼합하는 단계; (c) 후보 물질의 존재하에서 절단할 수 있는 프로테아제의 능력을 측정하는 단계가 포함된다.
후보 물질 선별 검정의 중요한 양태는 예를 들면, 본원에 기술된 방법으로 비교적 순수한 형태의 프로테아제 조성물을 제조하는 능력이다. 이것은 상대적으로 순수한 제제 없이도 후보 물질을 선별하는 검정의 중요한 양태이며, 프로테아제에 영향을 미칠 수 있는 추출물중의 다른 물질에 대한 억제 효과에 반대되는 것으로서, 프로테아제 억제에 대해서 특수하게 검정할 수는 없다. 어떠한 경우에도, 프로테아제의 성공적인 분리로 이제 이 헤르페스와 관련된 단백질을 억제시키는데 사용할 수 있는 새로운 화합물을 동정할 수 있게 되었다.
이 후보 물질을 선별하는 검정은 매우 간단하여 고정적으로 수행할 수 있으며, 프로테아제 활성을 측정하기 위해 상기 기술한 검정과 여러 방법으로 관련되어 있다. 이것은 프로테아제의 상대적으로 정제된 제제를 수득한 후, 바람직하게는 프로테아제가 자체의 절단 기능을 수행하고 억제물질을 포함하는 조건하에서, 후보물질을 프로테아제 제제와 단순히 혼합하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 예를 들면, 혼합물내에 UL26.5 암호화 서열 또는 프로테아제가 ICP35c, d를 e 및 f로 절단하는 절단 부위 하나 이상에 의해 암호화된 아미노산 서열과 같은 공지된 프로테아제 물질의 양이 포함되는 것이 통상적으로 바람직하다. 이러한 양태에서, 후보 물질의 존재하에 상대적으로 헤르페스 프로테아제 물질의 절단을 감소시키거나 변경시키는 후보 물질의 능력을 측정할 수 있다.
따라서, 후보 물질의 상대적인 억제 능력을 평가하기 위해 검정된 후보 물질의 존재하의 능력과 비교하여 상대적으로 정제된 프로테아제의 능력을 후보 물질의 부재하에 측정하거나 결정하는 것이 바람직할 것이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 상술한 펩티딜 화합물의 일족과 같은 유효 농도의 프로테아제 억제제에 프로테아제를 적용시켜 프로테아제를 억제하는 방법, 또는 후보 물질을 선별하는 검정양태에 따라 동정된 후보 물질에 관한 것이다. 물론, 본 발명의 중요한 일면은 헤르페스 프로테아제로 억제함으로써 다양한 양태의 헤르페스 감염증을 치료할 수 있다는 것이다. 이와 같이 캡시드 단백질을 생성하는 프로테아제 작용을 차단하는 억제제는 감염을 치료하거나 완화시킬 것으로 여겨지므로, 자체 또는 다른 헤르페스 치료요법과 병행시 유용할 수 있다.
1. 마커(트레이서)
2개의 모노클로날 항체를 마커(트레이서)로서 사용하는데, 하나는 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임 모두에 의해 암호화된 정지상의 에피토프이고 또다른 하나는 ＆quot;이동성 에피토프＆quot;와 반응하는 것이다. 후자는 단백질의 기능을 측정하고 절단 부위를 맵화하는데 있어서, 2개의 개방 판독 프레임의 산물을 동정하는데 필수적인 물질이다. ＆quot;이동상 에피토프＆quot;가 없을 경우, 분석은 단지 방사선 활성 트레이서 또는 유전자의 다양한 도메인에 상응하는 올리고펩티드에 대한 모노클로날 항체에 의존한다. 이동상 에피토프는 모든 개방 판독 프레임의 산물에 대한 일정한 항체를 제공하며, 본 발명에서 사용될 경우 삽입된 유전자 산물의 기능을 동정하는데 매우 편리하다.
사이토메갈로바이러스 모노클로날 항체 및 스타필로코커스 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 동족체와 반응하는 에피토프의 암호화 서열을 2개의 개방 판독 프레임의 암호화 도메인의 3' 말단내로 삽입시킴으로써, 프로테아제 절단 산물은 Prb, 및 ICPe 및 f로 지명된 절단된 프로테아제로 동정된다. 이러한 방법에 의해 또한 ICP35 단백질에 대한 절단 부위 및 전체 프로테아제 서열을 Pra 및 Prb로 분리하는 부위가 프로테아제 및 ICP 전구체 모두의 카복실 말단으로부터 대략 20개 아미노산임이 측정된다.
마커가 있는 플라스미드를 사용하는 헤르페스 게놈의 실험 예로써, 헤르페스 게놈의 부위를 사용하여 세포를 형질감염시키는데 사용된 마커-삽입된 플라스미드 S(제1도)중 한개의 효과를 나열한다. 이 플라스미드에서 CMV 에피토프는 ICP35의 서열의 카복실 말단에 삽입된다. 이어서, 이 방법으로 헤르페스 게놈 부위를 사용하여 감염시킨 세포를 수집하여 파괴시킴으로써 세포내 단백질들을 분석할 수 있다. 이어서, 이 단백질들은 전기영동에 의해 분자량에 따라 밴드로 분리된다. ICP35는 HSV 항체에 의해 면역학적으로 동정할 수 있다. CMV 에피토프는 에피토프에 대한 항체를 적용시키고 항원-항체 복합체의 생성을 나타내는 신호를 검출함으로써 밴드 중에서 발견된다. 이 면역학적 분석 결과는 CMV 에피토프가 밴드 c 및 d에서 검출되지만, e 및 f에서는 검출되지 않음을 보여준다. 이것은 c 및 d의 카복실 말단이 절단되어 e 및 f를 형성함을 나타낸다.
2. 세포 유리된 단백질의 합성
다른 유용한 기술은 세포와 유리된 단백질을 합성하는 시스템이다. UL26 및 UL26.5인 mRNA에서 상응하는 RNA는 Sp6 RNA 폴리머라제에 의해 전사되고, 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질, 세포-유리된, ＆quot;리보소옴 머신(ribosome machine)＆quot;내에서 해독된다. 시험관내에서 세포와 유리된 시스템내에서 해독된 단백질들을 방사활성 표지물로 표지하고, 겔 전기영동으로 분리하여 방사선 표지된 물질을 함유하는 밴드의 위치를 알기위해 자동방사선 사진술에 적용한다. 이 일반적인 방법에 사용하는 실험법이 2가지 있다 :
(i) 사이클로헥시미드의 존재하에 U 플라스미드의 해독 산물을 항온처리함으로써 UL26 단백질의 절단 산물(Rrb)이 점진적으로 축적된다. 축적된 절단 산물의 양은 항온처리 시간에 비례한다(제13도, 레인 12 내지 15).
(ii) 플라스미드 V의 해독 산물을 사용하여 동일한 결과를 수득한다(레인 4 내지 7). 이 실험은 UL26의 카복실 말단에 CMV 에피토프가 존재함을 확실하게 지지한다. 예상한 바와 같이, 플라스미드 V로부터 제조된 UL26의 해독 산물 Pra는 플라스미드 U로부터 유도된 완전한 단백질보다 서서히 이동한다. 그러나, 플라스미드 V로부터 합성된 UL26의 프로세싱된 형태 Prb는 플라스미드 U로부터 합성된 완전한 단백질의 프로세싱된 형태와 함께 이동하며, 이것은 UL26 자동 프로세싱에 카복실 말단 단백분해 절단이 포함됨을 나타낸다.
3. HSV-1(F). 온도 민감성 돌연변이체
HSV 게놈 분석에서 사용된 또다른 물질은 HSV-1(F)이며, 온도 민감성 돌연변이체는 39℃에서 자체의 UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임을 발현하지 않는다. 오히려, 비-허용적 온도에서 HSV-1(F)는 α-유전자 프로모터를 유도하며(참조: Post et al., 1981). 주로 α형 유전자를 발현한다.
4. 프로테아제 억제의 동정 및 용도
프로테아제의 작용이 억제될 경우, 캡시드는 생성될 수 없으며 바이러스는 복제할 수 없다. 이 억제는 전사, 해독 또는 단백질 작용 단계에서 일어날 수 있다. 전사 단계에서의 방해는 DNA 주형상에서의 mRNA 형성을 방해하는데 필수적이다. 해독 단계에서의 방해는 mRNA 주형상에서의 단백질 합성을 방해하는데 필수적이다. 한편, 프로테아제의 작용으로 특히 자체의 단백분해 모듈에서, 프로테아제 구조를 파괴하고 기질의 절단 부위를 변경시키거나 프로테아제를 비가역적 억제제에 결합시킴으로써 파괴될 수 있다.
프로테아제의 기능을 차단하는 특수하게 설계된 펩티드는 헤르페스 감염증을 방지 및 치료하는데 매우 유용하다. 이들 차단제의 양태에는 모든 기질 동족체 또는 세린 프로테아제 억제제, 즉 올리고펩티드 또는 프로테아제에 의해 인식된 절단 부위의 아미노산 서열을 함유하는 이들의 유도체를 포함한다. 후보 물질로부터 적합한 프로테아제 억제제를 동정하는 방법은 실시예 17에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 억제제를 검출하는데 사용하기 위한 바이러스 프로테아제를 생산하는 용이한 방법을 제공하고, 치료 방법을 개발하며, 바이러스 감염의 검출을 위한 항체를 개발하고 프로테아제의 불활성 돌연변이체를 개발하는 것이다.
프로테아제 단백질을 제조하기 위한 양태의 예는 목적한 프로테아제 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산 단편을 제조하는 것이다. 이 단편은 전체 프로테아제 또는 이의 단지 일부분, 예를 들면 프로테아제의 단백분해 도메인을 암호화하는 것일 수 있다. 이 단편은 항체와의 양성 시그날을 유발함으로써, 바이러스 감염의 존재여부를 동정할 수 있는 것보다 작을 수 있다. 본 발명에서 개발된, 제1도에 나타낸 서열과 기능이 동일한 서열은 또한 제조하고자 하는 목적한 폴리펩티드에 따라 선택할 수 있다. 후보 물질로부터 프로테아제 억제제를 검출하기 위해 본원에 기술된 기술을 사용하여, 단편이 ICP35 전구체 또는 Pr 프로테아제를 절단할 수 있는지를 시험함으로써 기능적으로 동일함을 결정할 수 있다.
선별된 핵산 단편은 폴리펩티드로서 서열을 발현시키기에 적절한 환경으로 이동시킨다. 이 환경은 발현을 유도할 수 있는 혼합물, 예를 들어 토끼의 망상 적혈구 용해질을 함유하는 용기일 수 있다. 다른 한편으로, 단편은 형질전환, 재조합 발혁 벡터를 통한 형질감염, 전기투석, 또는 ＆quot;유전자 건(gun)＆quot;에 의해 숙주 세포로 이동시킬 수 있다. 숙주세포는 BHK 세포, Vero, Hela, 이. 콜라이 등에서 선택할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 프로모터를 포함한다. 프로모터의 양태는 α4 프로모터. UL26.5의 음성 프로모터, 및 기타 원핵 또는 진핵 세포의 프로모터이다.
다른 양태에서, 핵산 단편은 헤르페스 세포로부터 게놈성 핵산을 수득하고, 게놈성 핵산내의 단백분해 부위-보존된 핵산 서열을 증폭시키며, 상기 증폭된 핵산 서열을 포함하는 재조합체 클론을 제조하고, 목적한 증폭된 핵산 서열을 포함하는 클론을 선별함으로써 제조할 수 있다.
바이러스 프로테아제는 프로테아제를 함유하는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 균질화하며, 균질물을 단편화하여 프로테아제 단편을 수득함으로써 제조할 수 있다. 프로테아제를 함유하는 샘플에는 생물 샘플, 예를 들면 바이러스로 감염된 조직이 포함된다.
5. 헤르페스 감염증의 치료
고려되는 치료 양상에는 국소 및 전신 약물을 포함한다. 피부 및 표피 병변에 있어서는, 프로테아제 억제제를 함유하는 크림, 연고 또는 분무가 고려된다. 한편, 정맥주사 또는 섭취에 의한 전신 치료는 숙주 세포에 서식하는 잠복성 바이러스가 활성화됨에 따른 바이러스의 대량의 복제를 방지하는 것이다.
6. 바이러스 및 세포
본 발명에 사용된 HSV-1(F) 및 HSV-2(G), 표현형 HSV-1 및 HSV-2 균주 각각의 특성 및 어린 햄스터 신장(BHK) 세포에서 추출한 티미딘 키나제의 유지 및 증식은 이미 기술되어 있으며, 본원에서 참조로 인용하였다[참조 : Arsenakis et al., 1986; Ejercito et al., 1968; Roizman and Spear, 1968].
7. 모노클로날 항체
ICP35에 대한 모노클로날 항체 H725 및 CH28-2 CMV 당단백질 B 각각은 이미 기술되어 있다(참조 : Braun et al., 1983, 1984; Zweig, 1980, Liu and Roizman, 1991). 모노클로날 항체 H725는 HSV-1의 ICP35와 반응하지만, HSV-2 단백질과는 반응하지 않는다(참조: Braun et al., 1983, 1984). CH28-2는 엘. 페레이라(L. Pereira)로부터 수득했다(참조 : Liu and Roizman, 1991a; Braun et al., 1984). 치환체로서, 모든 공지된 에피토프에 대한 시판되는 어떠한 항체도 사용될 수 있다. CH28-2는 사람 사이토메갈로 바이러스(CMV) 당단백질 B에 대해 유도된 모노클로날 항체이다. 이 항체의 에피토프는 단백질의 예상된 뉴클레오티드 서열에 따라 합성된 일련의 중첩된 펩티드의 반응성을 검정함으로써, 20개-아미노산 펩티드, 즉 N-KGQKPNLLDRLRHRKNGYRH-C로 맵화되어 있다.
8. 시험관내 전사 및 해독
EcoRI 또는 HundIII를 사용하여 선형화시킨 플라스미드 DNA 주형 5㎍을 제조하고, 캡 동족체 GppG(New England Biolabs 제조원. MA 소재)와 Sp6 또는 T7 RNA 폴리머라제(Promega Biotec사 추천, Madison, WI 소재)의 존재하에 전사시킨다. RNA 1㎍양을 뉴클레아제-처리된 토끼의 망상적혈구 용해질(Promega Biotech사 제조원. WI 소재) 및 [35S]-메티오닌(Dupont, NEW Research Product 제조원)을 함유하는 반응 혼합물 50㎕중에서 10분간 해독시킨 다음, 파괴 완충용액(pH 7.0의 트리스 0.05M, 슈크로오즈 5% vol/vol, β-머캅토에탄올 5%vol/vol 및 나트륨 도데실설페이트 2% vol/vol)을 첨가하거나 사이클로헥시미드(최종농도 100㎍/㎖) 및 다양한 농도의 프로테아제 억제제를 함유하는 인산염-완충된 염수로 20배 희석시켜 해독을 종결시킨다. 사이클로헥시미드의 존재하에 반응 6시간 후 혼합물은 파괴 완충용액중에서 변성되며, 이것을 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기 영동하고 본원에 기술된 바와 같이 니트로셀룰로오스 시이트로 전기적 이동시키고 코닥 X-오마트 필름(Kdak X-Omat film)에 노출시킨다.
9. 플라스미드 DNA로 형질감염시킨 세포의 형질감염 및 중복감염
일반적으로, 플라스미드 DNA 10㎍을 사용하여 웰을 형질감염시키는 것외에는, 문헌[참조:Kristie and Roizman(1984)]에 기술된 바와 같이 형질감염시킨다. 6개 웰의 코스타(Cambridge, Mass) 디쉬의 BHK 세포 배양물은 웰당 대략 106개의 세포를 함유한다. 대부분의 실험에서, 형질감염된 세포들을 형질감염 후 18 내지 20시간 동안 결과에서 기술한 바와 같이 HSV-1(F) 또는 HSV-2(G) 10pfu/세포 양에 노출시킨다. 10℃에서 바이러스에 세포를 2시간 노출시킨 후, 접종물을 10% 태아소 혈청이 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 교체하고, 이 세포를 34℃, 37℃, 또는 39℃에서 20시간 동안 배양한다. 바이러스를 감염시키지 않은 실험에서, 세포를 형질감염 후 40 내지 42시간 경과하여 수거한다. 감염 20시간 후, 세포를 배지(1% 송아지 혈청이 보충된 메티오닌이 없는 199 배지) 1㎖중의 35S 메티오닌 50μCi를 사용하여 2시간 동안 방사선 표지한다. 수거한 세포를 인산염-완충된 염수로 1회 세척하고, SS34 소발로터스펀(SS34 Sorvall rotor spun, Dupon 원심분리기내에서 회전)내에서 5분 동안 약 4.000rpm으로 원심분리하여 펠렛화한 다음, 파괴 완충용액중에 현탁시키고, 얼음중에서 20초 동안 초음파 처리하고 변성 겔내에서 전기영동으로 분리하기 전에 1분 동안 비등시킨다[참조:Liu and Roizman, 1991a and b; Ejercito et al., 1968].
10. 모노클로날 항체를 사용한 감염 세포 단백질의 전기영동 분리 및 염색
세포 용해질 또는 시험관내 해독물로부터 변성되고 용해된 폴리펩티드를 문헌[참조:Gibson and Roizman (1972, 1974), 및 Braun et al., (1984)]에 기술된 바와 같이 N, N'-디알릴타르타르디아미드와 가교결합된 9.5% 또는 12%(vol/vol) SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한다. BHK 세포로부터 분리한 폴리펩티드를 니트로셀룰로오스 막에 전기적 이동시키고, 고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase. Amersham 제조원, Arlington Heights. IL 소재)와 결합된 항-마우스 IgG만을 사용하거나 이 항-마우스 IgG외에 전술한 바와 같이 (Braun et al., 1984) HSV-1에 대한 모노클로날 항체 H725, CMV 에피토프에 대한 ICP35 또는 CH28-2를 사용하여 효소-연결된 면역검정으로 반응시킨다. 망상 적혈구 용해질로부터 해독된 분리된 폴리펩티드를 함유하는 겔을 건조시키고, 코닥 X-오마트 필름에 노출시킨다.
11. 세포질 RNA의 분리 및 S1 분석
원형질 RNA를 문헌[참조: Jenkins and Howett (1984)]에 기술된 바와 같이 HSV-1(F) 20PFU/세포로 모의 감염 또는 감염시킨 베로 세포로부터 정제하여 12시간 동안 유지한다. HSV-1 DNA 프로브(0.02pmol)는5'말단을 [γ32P]ATP(Dupont, NEW Research Products 제조원)으로 방사선 표지하고, 전체 원형질 RNA 50㎍과 하이브리드한 다음. S1 뉴클레아제로 분해하여, 8M 우레아의 존재하에 7% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리한다(Jenkins and Howett, 1984).
12. 본 발명의 단백질 제조방법
재조합체 벡터는 프로테아제 또는 ICP35를 암호화하는 DNA 자체의 양을 제조하기 위한 방법, 또는 암호화된 단백질을 제조하기 위한 방법 모두에 유용하다. 이것은 본 발명의 단백질을 재조합 방법에 의해 제조하는 경우, 원핵세포 또는 진핵세포 발현 시스템에서 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
진핵 숙주 세포내에서 헤르페스 핵산 서열을 발현시키는 경우, pCMV4와 같은 pCMV 시리즈의 벡터에 의해 예시되는 바와 같이 진핵세포의 복제 오리진을 혼입시킨 플라스미드와 같은 벡터를 사용함이 바람직할 수 있다. 더우기, 진핵세포 시스템내에서 발현시키기 위해서는 프로테아제 또는 ICP35를 암호화하는 서열을 SV40 또는 CMV 프로모터와 같은 강력한 진핵세포 프로모터 근처 또는 이의 조절내에 위치시킴이 바람직하다. 암호화 서열을 프로모터의 조절하에 있도록 하기 위해서는 원핵세포 또는 진핵세포의 프로모터이든 간에, 선택한 프로모터의 하향으로 약 1내지 50개 뉴클레오티드 사이에서 단백질의 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위 5'말단을 위치시키는 것이 일반적으로 요구된다.
더우기, 진핵세포에서 발현시킬 경우, 전사 단위가 목적한 펩티드 또는 단백질, 적절한 폴리아데닐화 부위(예:5'-AATAAA-3')를 포함하도록 하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 폴리 A부위는 전사 종결 전의 위치에서 단백질의 종결부위의 ＆quot;하향으로＆quot; 약 30 내지 2000개 뉴클레오티드에 위치한다.
앞서의 모든 것을 포함하며, 본 발명의 헤르페스 유전자가 용이하게 삽입될 수 있는 유용한 진핵세포 벡터는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 적합한 벡터에는 pCD 및 pCMV가 포함되며, pCMV가 가장 바람직한 시스템이다. pCD 및 pCMV 벡터외에, 다른 바람직한 진핵세포 발현 벡터에는 파마시아 LKB 테크놀로지(Pharmacia LKB Technology, Piscataway, N. J. 소재)에서 입수가능한 pMSG 및 pSVL가 포함된다. 이들은 각각 MMTV 및 SV40 레이트 프로모터를 이용한다. 제1도에 나타낸 바와 같이, 헤르페스 단백질의 전체 판독 프레임이 혼입된 cDNA는 암호화된 ICP35 전구체의 해독이 시작되는 개시 코돈(ATG)의 ＆quot;상향으로＆quot;(즉 개시 코돈의 5' 배향) HindIII 제한 부위(AAGCTT)를 경유하여 상기 벡터들중의 하나에 용이하게 삽입시킬 수 있다.
통상 진핵 숙주세포를 사용하는 모든 것을 본원에 따른 헤르페스 유전자 발현과 관련하여 사용할 수 있다. 이러한 세포주의 예에는 AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7 RIN 및 MDCK 세포주와 같이 진핵세포의 발현에 통상적으로 사용된 것이 포함된다. 본 발명의 진핵세포 발현 양태에 사용하기 위한 바람직한 세포주는 BHK 시스템이다.
원핵세포내 발현은 경우에 따라 사용할 수 있는 또다른 방법이다. 필요치 않다해도. 원핵세포내 발현이 가능할 경우, 일반적으로 제1도에 나타낸 양태로써 목적한 펩티드 자체에만 상응하는 판독 프레임이 혼입된 전사 단위를 사용하는 것이 바람직하며, 추가의 프로세싱은 필요하지 않다. 통상적으로, 사용가능한 원핵 세포 프로모터에는 PL, T7및 lac 프로모터가 포함되며, 일반적으로 T7이 바람직하다. 다른 바람직한 세균 발현 벡터에는 파마시아 LKB 테크놀로지에서 입수가능한 플라스미드 PKK233-2 및 PKK233-3이 포함된다. 이것들은 각각 tac 및 trc 프로모터를 이용한다.
물론, 진핵세포의 구균(hook-up) 및 발현을 이용한다해도, 발현의 원핵세포 오리진뿐만 아니라 진핵세포 시스템에서 작동하는 선별 마커를 포함시켜, 원핵세포에서 작제하여 진핵 세포에서 발현되도록 서열의 ＆quot;셔틀화(shuttling)＆quot;가 허용되어야 할 것이다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 헤르페스 단백질 또는 펩티드를, 펩티드의 화학적 합성 또는 세포-유리된 리보소옴의 ＆quot;머신(maching)＆quot;과 같은 비-재조합 합성 방법을 사용하여 단순히 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 펩티드 합성기는 시판되고 있으며(Applied Biosystems사 제조원), 사용 가능하다.
본 발명의 특정 양태에서 제1도의 혼입시킨 다소 짧거나 긴 DNA 단편은 예를 들면 클론 뱅크의 선별시, 짧은 활성 펩티드 또는 심지어 아주 짧은 DNA 단편 하이브리드화 프로브의 제조시의 용도를 포함하여, 기타 용도에 이용할 수 있음이 자명하다. 심지어, 14 내지 20개 뉴클레오티드와 같이 짧은 스트레치를 위한 제1도의 서열에 상응하는 단편 또는 이러한 뉴클레오티드는 이러한 양태 또는 다른 양태에 따라 용도가 밝혀질 것이다. 일반적으로, 제1도의 핵산 단편과 같은 약 14개 이상의 뉴클레오티드 또는 이들의 보체의 스트레치화에 의해, DNA 단편은 특히 0.15M NaCl 및 0.02M 시트르산나트륨 pH 7.4, 50℃와 같은 매우 까다로운 조건하에서 헤르페스종 DNA의 바람직한 하이브리드 형성 능력을 지니게 될 것이다. 약 14개 뉴클레오티드의 상보성 또는 통상의 스트레치는 안정한 하이브리드를 형성할 수 있으므로, 특정 용도에 있어서는 상보적으로 긴 스트레치가 더욱 바람직한 것으로 증명될 수 있다. 즉, 특정 용도를 위해서는 예를 들면 순서대로 18개, 22개 또는 25개 또는 그 이상의 염기상에서 상보적으로 긴 스트레치를 혼입시킨 DNA 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
13. 본 발명의 단백질에 대한 항체
다른 양태로서, 본 발명은 헤르페스 또는 이들로부터 유래된 종들의 프로테아제에 대한 항체를 재조합 또는 비재조합적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 제1도의 헤르페스 프로테아제, 또는 소 또는 돼지와 같은 사람이 아닌 종의 헤르페스 프로테아제에 대해 제조된 항체는 사람 종에 대해 제조한 항체보다도, 특히 감소된 면역 결합력이 요구되는 양태에서 확실히 유리하다.
본 발명의 모노클로날 항체를 포함하는 조성물은 비장 세포를 제공하는 설치류를 헤르페스 펩티드, 전구체 또는 관련 펩티드를 사용하여 면역화시켜 이 설치류의 비장 세포와 동일한 설치류 종으로부터 입수한 골수 세포를 우선 융합시켜 제조할 수 있다. 사용된 설치류종은 일반적으로 마우스일 수 있으며, 특히 제1도의 헤르페스 프로테아제에 대한 항체를 확인할 수 있는 것이어야 한다. 물론 하나 이상의 구조적 변이체를 혼입한 프로테아제를 제조하는 경우, 목적하는 종류에 따라 하이브리도마 시스템을 성공적으로 사용할 수 있을 것이다.
더우기, 본 발명은 HSV-1의 프로테아제와 항원적으로 가교-반응할 수 있는 것으로 알려진 다른 종으로부터 프로테아제를 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 프로테아제에 대한 항체가 부착되어 있는 면역흡수성 물질을 제조함을 포함한다. 다수의 면역흡수성 물질은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 예를 들면 아피-겔(Affi-gel), Cn-세파로오스, 단백질 A=세파로오스, 및 다수의 기타 공지된 면역흡수성 기술이 포함된다. 이와 같은 기술 모두는 본 발명에 적용 가능하며, 면역 가교-반응성 종을 분리하는데 유용한 것으로 입증되었다[참조; Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, John G. Hurrell, ed.. CRC Press, 1982, 본원에서 참조로 인용].
더우기, 본 발명에 따라서 생물 샘플내에서 헤르페스 프로테아제, 및 관련된 프로테아제를 임상적으로 검출할 수 있는 키트가 제공된다. 이와 같은 키트는 면역 검출 시약과 배합하여 프로테아제 또는 면역학적으로 관련된 프로테아제에 대해 특이성이 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함한다. 면역검출 시약은 항체/항원 복합체의 형성을 검출 또는 적량하기 위한 모든 시약으로 정의된다. 통상적인 면역검출 시약은 방사선 표지되거나 효소-표지된 항원 또는 항체의 사용이 포함된다. 표지된 항체를 혼입시키는 기술은, 예를 들면 RIA(방사선 면역 검정법) 및 ELISA(효소-결합된 면역 검정법)을 포함한다. 그러나, 공지된 다수의 다른 기술을 본 발명에 따른 면역검출 키트에 사용할 수 있다. 적합한 기술이 교시된 특허는 예를 들면 미합중국 특허 제4,446,232호; 제4,407,943호; 제4,399,299호; 및 제454,233호가 포함된다.
즉, ELISA 기술을 기본으로 하는 통상적인 헤르페스 프로테아제 검출 키트는 항-헤르페스 프로테아제 모노클로날 항체 또는 정제된 프로테아제 항원(환상의 항체를 검출하고자 할 경우) 및 둘째로 정제된 항원 또는 항-프로테아제 항체와 특이하게 면역반응할 수 있는 ＆quot;면역검출＆quot; 항체가 포함된다. 두번째 항체는 자체와 관련한 색-형성 효소 활성, 예를 들면 부착된 퍼옥시다아제 분자를 포함할 수 있다. 두번째 ＆quot;면역검출＆quot; 항체를 이러한 방식으로 사용할 경우, 우선 일반적으로 시험할 생물 샘플, 예를 들면 혈청, 혈장, 뇨 또는 조식 샘플과 항체 사이에 면역 복합체를 형성시킨다. 이와 같은 면역 복합체가 생성된 후, 면역검출 항체를 가하여 항체와 결합한 프로테아제와 적량적으로 반응시킨다. 이어서, 복합체 형성을 비색계 퍼옥시다아제 검정을 통해 정량한다.
상기 이중-항체 기술을 사용하는 것과는 달리, 항-프로테아제 항체상에 직접적으로 효소 또는 방사선-리간드를 혼입시킬 수 있으며, 이 직접 표지된 항체를 사용하여 직접 정량할 수 있다.
상술한 형태의 키트 및 방법은 잘 알려져 있으며, 일반적으로 환자로부터 생물 샘플을 획득하고, 생물 샘플을 항체/항원 복합체의 형성을 증진시키는 조건하에서 항-헤르페스 프로테아제 모노클로날 항체와 접촉시켜 모노클로날 항체와 샘플 사이의 특히 면역 반응의 형성을 검출하는 것으로 요약할 수 있다.
항체를 중화하는 것은 또한 항체가 프로테아제 또는 이의 단편과 결합할 경우, 비-기능성 프로테아제가 단백분해 가능하도록 하는 것이다.
14. 숙주세포 배양 및 벡터
일반적으로, DNA 서열을 초기에 클로닝하고 본 발명에 유용한 벡터를 작제하는데는 원핵세포가 바람직하다. 예를 들면, 이. 콜라이 K12-균주 294(ATCC 기탁 번호 314460)가 특히 유용하다. 사용할 수 있는 다른 미생물 균주로는 이.콜라이 B, 및 이.콜라이 X 1776(ATCC 기탁 번호 31537)과 같은 이.콜라이 균주를 포함한다. 이러한 예들은 본원에 예시된 것으로한정되는 것이 아니다.
원핵세포 또한 발현에 사용할 수 있다. 상기 균주와 이. 콜라이 W3110(F-, lambda-, 기본유기 영양균, ATCC 기탁번호 제273325호), 바실러스 서브틸루스와 같은 바실러스, 또는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans)와 같은 기타 엔테로박테리아, 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)종이 사용될 수 있다.
일반적으로, 레플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터 및 숙주세포와 양립하는 종으로부터 유래한 조절 서열을 이들 숙주와 관련하여 사용한다. 근원적으로 이 벡터는 복제 부위 뿐만 아니라, 형질전환된 세포내에서 표현형 선별이 가능한 마커서열을 지닌다. 예를 들어, 이.콜라이는 pBR322를 사용하여 형질전환시키며, 이.콜라이종으로부터 유래한 플라스미드 pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성유전자를 함유하므로 형질전환된 세포를 동정하는 용이한 방법을 제공한다. pBR 플라스미드, 또는 기타 생물 플라스미드 또는 파아지는 또한 자체 단백질을 발현시키기 위해 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.
재조합 DNA 작제시 사용된 가장 일반적인 프로모터들은 β-락타마제(β-lactamase, 페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템이 포함된다. 이들이 가장 일반적으로 사용되는 반면에, 다른 미생물 프로모터들이 발견되어 사용되어져 왔으며, 이들의 뉴클레오티드 서열과 관련된 사항은 숙련가들이 이들을 플라스미드 벡터와 기능적으로 결합시킬 수 있도록 공개되어 있다.
원핵세포외에, 효모 배양물과 같은 진핵세포 미생물이 또한 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharamyces cerevisiase), 또는 일반적인 빵 효모가 진핵세포 미생물중에서 가장 일반적으로 사용된다. 기타 다수의 균주를 통상적으로 이용할 수도 있다. 사카로마이세스내에서 발현시키기 위해서는 예를 들면 플라스미드 Yrp7이 일반적으로 사용된다. 이 플라스미드는 이미 트립토판에서 성장하는 능력이 상실된 효모의 돌연변이체 균주(예: ATCC 기탁 번호 제44076호 또는 PEP 4-1)에 대해 선택성 마커를 제공하는 trp1을 함유한다. trp1 병변이 존재하는 효모 숙주세포 게놈의 특징은 트립토판 부재하에서 성장시킴으로써 형질전환을 검출하는 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터중의 적합한 프로모터 서열은 3-프로포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들면 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 이소머라아제, 포스포글루코오스 이소머라아제 및 글루코키나아제를 포함한다. 적합한 발현 플라스미드를 작제하기 위해, 이 유전자들과 관련된 종결 서열들을 mRNA 종결의 폴리아데닐화를 제공하기 위해 발현시키고자 하는 서열의 발현 벡터 3'에 연결시킨다. 성장 조건에 의해 조절된 전사의 추가의 장점을 갖는, 다른 프로모터는 알코올 디하이드로게나아제 2, 이소사이토크롬 C. 산 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 및 상술한 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제 및 말토오즈 및 갈락토오즈 이용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모-양립성 프로모터, 복제 오리진 및 종결 서열을 함유하는 모든 플라스미드 벡터가 적합하다.
미생물외에, 다세포 미생물로부터 유래한 세포의 배양물도 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 이러한 세포 배양물은 척추동물 세포 또는 무척추동물 세포의 배양에 모든 가능하다. 그러나, 척추동물 세포 배양에 대한 관심이 증대되어 왔고, 배양시(조직배양) 척추 세포의 증식이 최근 통상의 방법이 되어졌다. 이와 같은 숙주 세포주로 유용한 것의 예는 AtT-20 VERO 및 Hela 세포. Chinese hamster 난소(CHO) 세포주, 및 W138. BHK, COS-7 293 및 MDCK 세포주이다. 근원적으로, 이와 같은 세포에 대한 발현 벡터는 (필요할 경우) 복제 오리진, 발현시키고자 하는 유전자 앞에 위치한 프로모터와 함께, 필요한 모든 리보소옴 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다.
포유동물 세포에 사용하기 위해, 바이러스 물질을 사용하여 발현 벡터상에서 기능을 조절한다. 예를 들어, 일반적으로 사용된 프로모터들은 폴리오마. 아데노 바이러스 2. 사이토메갈로바이러스 및 가장 흔한 시미안 바이러스 40(SV40)에서 유래한 것들이다. SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터들은 SV40 바이러스의 복제 오리진을 또한 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 수득될 수 있기 때문에 특히 유용하다. 보다 작거나 큰 SV40 단편들이 사용될 수 있으며, 바이러스 복제 오리진내에 위치한 Bgl 부위를 향하여 Hind III 부위에서부터 대략 250bp의 서열이 연장되어 있도록 제공된다. 더우기, 목적하는 유전자 서열과 일반적으로 연결된 프로모터 또는 숙주세포의 시스템과 양립하도록 제공된 조절 서열을 사용함이 또한 가능하며, 바람직하다.
복제 오리진은 SV40으로부터 유래된 것과 같이 외래 유전자 오리진 또는 다른 바이러스원(예; 폴리오마, 아데노, HSV, BPV, CMV 공급원)을 포함하도록 벡터를 작제하거나 숙주세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내부로 융합될 경우, 흔히 후자로써도 더 충분하다.
15. 세린 프로테아제, ICP35 단백질 또는 이들의 생물학적 기능의 등가물을 암호화할 수 있는 서열을 검출하기 위한 핵산 하이브리드화
본 발명에 의해 제공된 핵산 서열 정보로 적어도 프로테아제의 단백분해 도메인 또는 ICP35 문제의 절단 부위를 암호화할 수 있는 유전자 서열과 특이하게 하이브리드화하는 능력을 지닌 상대적으로 짧은 DNA(또는 RNA) 서열을 제조할 수 있다. 이러한 면에서, 적절한 길이의 핵산 프로브는 제1도에 나타낸 서열을 고려하여 제조한다. 프로테아제 또는 ICP35 유전자 서열과 특이하게 하이브리드화하는 이와 같은 핵산 프로브의 능력은 다양한 양태에서 특히 이들을 이용하도록 한다. 가장 중요하게는, 이 프로브들을 주어진 샘플내에 존재하는 상보 서열을 검출하기 위한 다양한 검정에 사용할 수 있다. 돌연변이체 종 프라이머를 제조하기 위한 서열 정보, 또는 다른 유전자 작제물을 제조하는데 사용하기 위한 프라이머들의 사용을 포함하는 기타 용도들이 밝혀졌다.
본 발명과 관련하여 특정의 장점을 제공하기 위해서, 하이브리드화 연구 또는 검정에 사용된 바람직한 핵산 서열에는 제1도에 나타낸 서열의 14개 염기 이상의 뉴클레오티드 시트레치에 상보적인 서열이 포함된다. 길이가 14개 뉴클레오티드 이상인 것은 단편의 길이가 충분해서 안정하고 선택성인 이중 분자를 형성하기에 충분하다. 이와 같은 단편은, 예를 들면 핵산 재생산 기술(예; PCR 기술, 미합중국 특허 제4,603,102호)적용에 의한, 화학적 방법으로써 서열의 직접적인 합성, 또는 재조합체 생산을 위해 재조합체 벡터내로 선택된 서열의 도입에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 18 내지 25개 또는 심지어 30 내지 40개 염기들의 단편, 완전한 유전자 또는 유전자들을 암호화하기에 충분한 길이로 제조하는 모든 방법이 또한 본 발명의 영역에 속한다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 유전자의 상보적인 스트레치와 함께 이중 분자들을 선택적으로 형성하는 능력으로 인해 중요하다. 계획한 적용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브를 다양하게 선택하기 위해 변화된 하이브리드화 조건을 사용할 수 있다. 고도의 선택성을 요구하는 경우, 하이브리드를 형성시키기 위해 상대적으로 까다로운 조건, 예를 들면 상대적으로 저염 및/또는 고온 조건(예: 50℃ 내지 70℃의 온도에서 0.02M 내지 0.15M의 NaCl 제공)을 사용할 수 있다. 이러한 조건들은 프로브 및 주형 또는 표적 스트랜드 사이에서 조화가 이루어지지 않는 경우, 특히 선택적이며, 매우 까다로와 진다.
물론, 예를 들어 기본 주형에 대해 하이브리드화된 돌연변이체 프라이머 스트랜드를 사용하는 돌연변이체의 제조, 또는 관련된 종으로부터 프로테아제 또는 ICP35 암호화 서열, 기능적 등량체를 분리하기 위한 일부 적용시에, 이형복제물이 형성되도록 하기 위해서는 덜 까다로운 하이브리드화 조건이 요구된다. 이러한 환경하에서, 사용된 조건은 예를 들어 0.15M 내지 0.9M 염, 20℃ 내지 55℃ 범위의 온도일 수 있다. 가교-하이브리드화 종은 여기서 하이브리드화를 조절하는 것과 관련하여 양성적 하이브리드화 시그날로서 용이하게 동정할 수 있다. 어떤 경우에든, 온도 증가와 마찬가지 방식으로 하이브리드 복제를 불안정하게 하는 포름아미드 증가량을 첨가함으로써 조건들을 더욱 까다롭게 할 수 있음이 일반적으로 인정되어져 있다. 즉 ,하이브리드화 조건은 쉽게 조정할 수 있으므로, 목적하는 결과에 따라서 방법을 선택할 수 있다.
특정 양태에서, 하이브리드화를 측정하기 위해서는 표지와 같이 적절한 수단과 배합하여 본 발명의 핵산 서열을 사용함이 유리하다. 다양한 종류의 적절한 지시제 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 검출가능 시그날을 제공할 수 있는, 아비딘/바이오틴과 같은 방사선, 효소 또는 기타 리간드가 포함된다. 바람직한 진단 양태에서, 우레아제, 알칼린 포스파타아제 또는 퍼옥시다아제와 같은 효소 테그(tag)를 방사선 또는 기타 환경상 바람직하지 않은 시제 대신 사용할 수 있다. 효소 테그의 경우, 공지되어 있는 비색 지지세 기질을 가시적 또는 분광광도계로 가시화되는 방법을 제공하는데 사용하여, 상보적인 핵산-함유 샘플에서 특이한 하이브리드화를 동정할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 하이브리드화 프로브들은 용액 하이브리드화 뿐만 아니라 고체 상을 사용하는 양태에서 모두 시제로써 유용함이 밝혀졌다. 고체상을 포함하는 양태에서, 시험 DNA(또는 RNA)는 흡수되거나, 선택된 매트릭스 또는 표면에 고정된다. 이 고정된, 일본쇄 핵산은 바람직한 조건하에서 선택된 프로브와 특이적 하이브리드화시킨다. 이 선택된 조건들은 요구되는 특수 범주(예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산의 형태, 핵산원, 하이브리드화 프로브의 크기등)를 기준으로 하는 특수 환경에 의존한다. 비특이적으로 결합한 프로브 분자를 제거하기 위한 하이브리드화된 표면을 세척한 후, 표지 방법에 의해서 특이적 하이브리드화를 검출하거나 정량한다.
세포 추출물을 검출하기 위해 분자를 제조하는 방법은 형광성 프로브를 사용하는 것이다. 형광성 프로브는 당해 분양의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 방법의 한가지 예는 플루오레스세인-표지된 아비딘(Vector Laboratories 제조원, Burlingame. Ca 소재)을 바이오틴-표지된 단백질에 결합시키는 것이다. 이 시그날은 증가될 수 있다.
본 발명은 본 발명자들에 의해 밝혀지거나 제안된 특수 양태로써 기술되어졌으며, 본 발명을 실행하기 위한 바람직한 방식이 포함된다. 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고도 다수의 변형 및 변화가 특수한 양태에서 이루어질 수 있음이 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 코돈 중복에 의해, 단백질 서열에 영향을 미치지 않고도 기본적인 DNA 서열내에서 변화가 이루어질 수 있다. 더우기, 생물학적 기능의 등량체를 고려할 때, 단백질 구조내에서 변화시킬 수 있으며, 유용한 프로테아제 또는 항원성 부단편을 수득할 수 있다. 이와 같은 변형 모두는 첨부된 본 발명의 청구범위 영역내에 포함된다.
참조 문헌
후술한 참조 문헌들은 본원에서 사용한 방법, 기술, 및/또는 조성물을 보충하고, 설명하여, 이에 대한 배경을 제공하고, 교시하는 수준에서 참조로 인용하였다.

Claims (11)

  1. (a) 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)의 UL26 유전자의 도메인 II 및 III를 포함한 도메인에 의해 암호화되는 정제된 HSV 프로테아제를 수득하고;
    (b) 상기 프로테아제의 절단 부위를 포함하는 단백질 기질을 이러한 물질의 단백분핵적 절단을 수행하기에 적합한 조건하에 상기 프로테아제에 가하며;
    (c) 억제제 후보 물질을 상기 프로테아제에 가하고;
    (d) 단백질 기질의 절단 유무를 측정하는 단계를 포함하여, 헤르페스 바이러스 프로테아제를 억제시킬 수 있는 물질을 동정하는 검정방법.
  2. 제1항에 있어서, 도메인 II 및 III가 제19도의 아미노산 잔기 10 내지 306의 서열을 갖는 검정 방법.
  3. 제2항에 있어서, HSV 프로테아제가 UL26 전체 유전자에 의해 암호화 되는 검정방법.
  4. 제1항에 있어서, HSV 프로테아제가 재조합 효소인 검정방법.
  5. 제1항에 있어서, 기질이 HSV ICP35인 검정방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계(d)가 기질 단편을 전기영동으로 검출하는 단계를 포함하는 검정방법.
  7. 제6항에 있어서, 기질 단편이 ICP35e 및 ICP35f인 검정방법.
  8. 제4항에 있어서, 단계(a)가 (i) UL26 유전자를 포함한 발현 벡터를 제조하고;
    (ii) 암호화 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 적합한 숙주세포에서 상기 발현 벡터를 위치시키는 단계를 포함하는 검정방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계(a)가 (iii) 숙주 세포로부터 프로테아제를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 검정방법.
  10. 제8항에 있어서, UL26 유전자가 진핵세포성 프로모터의 조절하에 있는 검정방법.
  11. 제8항에 있어서, 숙주 세포가 진핵세포성 숙주 세포인 검정방법.
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