RU2058391C1 - ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI - Google Patents
ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI Download PDFInfo
- Publication number
- RU2058391C1 RU2058391C1 SU5057408A RU2058391C1 RU 2058391 C1 RU2058391 C1 RU 2058391C1 SU 5057408 A SU5057408 A SU 5057408A RU 2058391 C1 RU2058391 C1 RU 2058391C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- dna
- escherichia coli
- galactosidase
- protein
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологиии и иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что получен полипептид HC86, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена NS4 вируса гепатита C и предназначенный для определения антител к вирусу гепатита C, синтезируемый в штамме бактерий Escherichia coli HC86, трансформированном рекомбинантной плазмидой рН C270 или рН C270F, содержащей нуклеотидную последовательность гена белка NS4, слитую с последовательностью нуклеотидов гена бета-галактозидазой Е. coli. 3 с. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для проведения серодиагностики гепатита С.
Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит Д, а также гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение ВГС, как правило, осуществляется при переливании крови. ВГС при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В. Однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени.
Поэтому для проведения противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного выявления ВГС-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выяв- лять инфицированных ВГС.
Многочисленные исследования ВГС позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. ВГС имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Данная последовательность нуклеотидов содержит единственную большую открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010-3011 аминокислотных остатков, который является предшественником индивидуальных вирусных структурных и неструктурных вирусных белков. Данный белок процессируется под действием клеточных и вирусспецифической протеаз. К структурным белкам ВГС относят кор(ядерный)-антиген размером 19 кДа. Кор-антиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид ВГС. Два других структурных белка ппредставлены гликопротеинами размером около 32 кДа и 72 кДа, которые процессируются, как и кор-антиген с N-концевой области вирусспецифического полипротеина. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона ВГС, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком ВГС (NS1). Белок NS2 ВГС размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает, во-первых, нуклеотидтрифторфосфат-связывающей, геликазной активностью и, по-видимому, участвует в репликации генома ВГС; во-вторых, ферментативной активностью сериновой протеазы, которая, по-видимому, обеспечивает процессирование неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, NS4 очень гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, которая используется при репликации вирусного генома.
Большинство методов диагностики ВГС-инфекции основано для определения антител к белкам ВГС в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков ВГС, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВГС вместо вирусных антигенов, не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВГС и, в частности, гена белка NS4 ВГС (патенты ЕР 0 388 232, C 12 N 15/51, 1990; ЕР 0 406 511, C 12 N 15/51, 1990; ЕР 0 416 725, C 12 N 15/51, 1990 и др.).
В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток-продуцентов (ЕР 0 388 232), так и в направлении выбора наиболее антигенно-активных детерминант (ЕР 0 445 423, C 12 N 15/51, 1990), а также создания рекомбинантных полипептидов, продуктов генов ВГС (ЕР 0 377 303, C 12 N 15/51, 1989).
Сущность данного изобретения состоит в том, что предложены оригинальный гибридный полипептид НС86, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома ВГС (86 аминокислотных остатков белка NS4 ВГС, аминокислотные остатки 1674-1760), свободный или слитный с бета-галактозидазой E.coli, связывающий антитела к продукту гена белка NS4 ВГС, отличающийся от известных, во-первых, размером, например полипептиды 5-1-1 (патент ЕР 0 388232) соответствует 1694-1735 аминокислотным остаткам белка NS4 ВГС, р1684 (патент ЕР 0 445 423) соответствует 1684-1750 аминокислотным остаткам белка NS4 ВГС; во-вторых, наличием аминокислотных замен (например, I-V в 1685-1686-м положении, R-K в 1690-м положении, V-I в 1694-м положении и др.) по сравнению с пептидом р1684 (патент ЕР 0 445 423), фрагмент ДНК, кодирующий полипептид НС86; сущность изобретения состоит также в штамме E.coli ВКПМ N В-6256, который трансформирован рекомбинантной плазмидой рНМ270, содержащей фрагмент ДНК НС270 и экспрессирующей белок НС86.
Штамм-продуцент НС86 характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32оС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1 х 10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4оС в течение 3-4 месяцев.
Рекомбинантный полипептид С86, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена кор-антигена ВГС в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов под N В-6256.
П р и м е р 1.
Получение фрагмента ДНК НС270.
Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды
cr1 5'-CCTCGGATCCTТGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTATCTTGTCCGGAAGG 3'
cr2 5' CCGGCCATTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3'
cr3 5' CCAGGAATTCGATGAGATGGAAG AGTGCGCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGG 3'
cr4 5' AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3'
cr5 5' CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCACCAAGCAAGCGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3'
cr6 5' GAGTCCAAGTGGCGCACTTGAGACATTCTAACTGCAGGTCCGC 3'
rc1 5' CTACCTACAATGACCACACTGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3'
rc2 5' CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAATGGCCGGCCTTCCGGACAAGATAATC 3'
rc3 5' AAGGTGCGAGGCGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc5 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5' GCGGACCTGCAGTTAGAATGTCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTAGCAGCAG 3'
Олигонуклеотиды cr1, 2, 3, 4, 5, 6 и rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмоль каждого из олигонуклидов, 50 мкл десятикратного буфера для иназы (0,5М трис-HCl, рН 7,6, 0,1М MgCl, 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмоль (150 мкКи) [гамма-p] АТФ (удельная активность 3000 и/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т и бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 мин при 37оС. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98оС, охлаждают до 16оС. 100 мкл смеси, обработанных киназой олигонуклеотидов, смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при оС в течение 5 ч. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65оС в течение 5 мин для инактивации фермента.
cr1 5'-CCTCGGATCCTТGACAACAGGCAGTGTGGTCATTGTAGGTAGGATTATCTTGTCCGGAAGG 3'
cr2 5' CCGGCCATTGTTCCAGACAGAGAGCTTCTCTA 3'
cr3 5' CCAGGAATTCGATGAGATGGAAG AGTGCGCCTCGCACCTTCCTTACATCGAGCAAGG 3'
cr4 5' AATGCAGCTCGCCGAGCAATTCAAG 3'
cr5 5' CAGAAGGCGCTCGGCTTACTGCAAACAGCCACCAAGCAAGCGGAGGCTGCTGCTCCAGTGGTG 3'
cr6 5' GAGTCCAAGTGGCGCACTTGAGACATTCTAACTGCAGGTCCGC 3'
rc1 5' CTACCTACAATGACCACACTGCCTGTTGTCAAGGATCCGAGG 3'
rc2 5' CATCGAATTCCTGGTAGAGAAGCTCTCTGTCTGGAACAATGGCCGGCCTTCCGGACAAGATAATC 3'
rc3 5' AAGGTGCGAGGCGCACTCTTCCATCT 3'
rc4 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc5 5' CCTCCGCTTGCTTGGTGGCTGTTTGCAGTAA 3'
rc6 5' GCGGACCTGCAGTTAGAATGTCTCAAGTGCTCGCCACTTGGACTCCACCACTAGCAGCAG 3'
Олигонуклеотиды cr1, 2, 3, 4, 5, 6 и rc 1, 2, 3, 4, 5, 6 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмоль каждого из олигонуклидов, 50 мкл десятикратного буфера для иназы (0,5М трис-HCl, рН 7,6, 0,1М MgCl, 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмоль (150 мкКи) [гамма-p] АТФ (удельная активность 3000 и/ммоль), 150 единиц активности полинуклеотидкиназы фага Т и бидистиллированную воду до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 мин при 37оС. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98оС, охлаждают до 16оС. 100 мкл смеси, обработанных киназой олигонуклеотидов, смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66М трис-HCl, рН 7,6, 50 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при оС в течение 5 ч. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65оС в течение 5 мин для инактивации фермента.
10 мкл раствора, обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 270 п.н.).
100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 м NaCl, 10 ммМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол) в течение 5 ч при температуре 37оС. Ферменты инактивируют нагреванием при 70оС.
10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12%-ном полиакриламидном геле (после радиоавтографии виден фрагмент размером около 270 п.н.).
ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами BamHI и PstI.
Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм DH5альфа по обычной методике (Molecular cloning, New York, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина; Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12%-ном полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма НСВК на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 270 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС270.
Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НС270.
C C T C G G A T C C T T G A C A A C A G G C A G T G T G G T C A T T G T A G G
T A G G A T T A T C T T G T C C G G A A G G C C G G C C A T T G T T C C A G A
C A G A G A G C T T C T C T A C C A G G A A T T C G A T G A G A T G G A A G A
G T G C G C C T C G C A C C T T C C T T A C A T C G A G C A A G G A A T G C A
G C T C G C C G A G C A A T T C A A G C A G A A G G C G C T C G G C T T A C T
G C A A A C A G C C A C C A A G C A A G C G G A G G C T G C T G C T C C A G T
G G T G G A G T C C A A G T G G C G A G C A C T T G A G A C A T T C T A A C T
G C A G G T C C G C
Данный фрагмент ДНК НС270 также был получен путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc6.
T A G G A T T A T C T T G T C C G G A A G G C C G G C C A T T G T T C C A G A
C A G A G A G C T T C T C T A C C A G G A A T T C G A T G A G A T G G A A G A
G T G C G C C T C G C A C C T T C C T T A C A T C G A G C A A G G A A T G C A
G C T C G C C G A G C A A T T C A A G C A G A A G G C G C T C G G C T T A C T
G C A A A C A G C C A C C A A G C A A G C G G A G G C T G C T G C T C C A G T
G G T G G A G T C C A A G T G G C G A G C A C T T G A G A C A T T C T A A C T
G C A G G T C C G C
Данный фрагмент ДНК НС270 также был получен путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc6.
П р и м е р 2.
Получение плазмиды рНС270.
Синтезированный фрагмент ДНК НС270 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI. ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды 10 мкл фрагмента ДНК лигируют с ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5A.
Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1% LB-агаром, содержащим 50 мкл/мл ампициллина. Колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, ДНК обрабатывают ее рестриктазами PstI и BamHI и гидролизат исследуют электрофорезом в 2%-ной агарозе.
Отбирают штамм НС86, имеющий на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 270 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС270. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что фрагмент ДНК в плазмиде рНС270 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС270 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности NS4 белка ВГС, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.
Аналогичным образом получена плазмида рНС270F, в которой фрагмент ДНК НС270 находится непосредственно под контролем промотора бактериофага лямбда croLacZ. Данная плазмидная ДНК обеспечивает синтез рекомбинантного кор-антигена ВГС, свободного от аминокислотных последовательностей бета-галактозидазы E.coli.
П р и м е р 3.
Штамм E.coli НС86, содержащий плазмиду рНС270, выращивают в 100 мл среды LB при 30оС до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).
Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 20 до 160 кДа. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLТ90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий плазмиду рНС270. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E.coli ПС270, содержащий плазмиду рЕС270, экспрессирует гибридный полипептид с мол.м. 120-130 кДа. Этот полипептид назван С86. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность β-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS4, представлена ниже
L T T G S V V I V G R I I L S G R P A I V P D R E L
L Y Q E F D E M E E C A S H L P Y I E Q G M Q L A E
Q F K Q K A L G L L Q T A T K Q A E A A A P V V E S
K W R A L E T F
П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.
L T T G S V V I V G R I I L S G R P A I V P D R E L
L Y Q E F D E M E E C A S H L P Y I E Q G M Q L A E
Q F K Q K A L G L L Q T A T K Q A E A A A P V V E S
K W R A L E T F
П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.
Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят процедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2% Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15М NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05% Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5% -ного обезжиренного сухого молока, приготовленным на 0,1М Nа-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37оС обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к ВГС, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран TBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37оС в течение 1 ч. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1М трис-HCl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид С86 связывается с антителами к вирусу гепатита С.
Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, обладающий свойствами белка NS4 ВГС, взаимодействующий с антителами белка NS4 ВГС, позволяющий определять антитела к ВГС.
Claims (3)
1. Полипептид, полученный в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном плазмидной ДНК, содержащей фрагмент ДНК со следующей нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, и аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, где R и R1 0 или R - нуклеотидная последовательность, кодирующая β- галактозидазу, а R1 аминокислотная последовательность β- галактозидазы, и обладающий способностью связывать антитела к белку NS 4 вируса гепатита С.
2. Фрагмент ДНК НС 270, полученный с помощью химического синтеза или цепной полимеразной реакции с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, содержащий на 3′ конце стоп-кодон.
3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ N В-6256-продуцент полипептида НС86, слитого с β галактозидазой Echerichia coli.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5057408 RU2058391C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5057408 RU2058391C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2058391C1 true RU2058391C1 (ru) | 1996-04-20 |
Family
ID=21610941
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5057408 RU2058391C1 (ru) | 1992-07-31 | 1992-07-31 | ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2058391C1 (ru) |
-
1992
- 1992-07-31 RU SU5057408 patent/RU2058391C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Европейский патент N 0388322, кл. C 12N 15/51, 1990. Европейский патент N 0406511, кл. C 12N 15/51, 1990. Европейский патент N 0416725, кл. C 12N 15/51, 1990. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tai et al. | The helicase activity associated with hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3) | |
Young et al. | Efficient expression of influenza virus NS1 nonstructural proteins in Escherichia coli. | |
US6194140B1 (en) | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility | |
US5712145A (en) | Hepatitis C virus protease | |
Boulain et al. | Mutagenesis by random linker insertion into the lamB gene of Escherichia coli K12 | |
KR0181517B1 (ko) | 비-에이 비-비형 간염-특이 항원 및 간염 진단에서 그의 용도 | |
JP2679973B2 (ja) | 免疫学的に反応性のウイルス蛋白質の発現 | |
Hennecke et al. | A specialized transducing λ phage carrying the Escherichia coli genes for phenylalanyl-tRNA synthetase | |
KR100317509B1 (ko) | C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법 | |
RU2058391C1 (ru) | ПОЛИПЕПТИД, ФРАГМЕНТ ДНК НС270, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА НС86, СЛИТОГО С β ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ ESCHERICHIA COLI | |
RU2052504C1 (ru) | Полипептид, фрагмент днк hc 256 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида нс 80, слитого с бета-галактозизадой e.coli | |
RU2052503C1 (ru) | Полипептид, фрагмент днк нс 360, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида, слитого с бета-галактозидазой e.coli | |
RU2073719C1 (ru) | Фрагмент днк нс 250, полученный с помощью химического синтеза, рекомбинантный полипептид нс 250 молекулярной массы 120 - 130 кда, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка ns3 вируса гепатита с, полученный при культивировании штамма бактерий escherichia coli и штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного полипептида нс 250, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка ns3 вируса гепатита с | |
RU2073718C1 (ru) | Фрагмент днк нс 280, полученный с помощью химического синтеза, рекомбинантный полипептид нс 280 молекулярной массы 120-130 кда, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с, полученный при культивировании штамма бактерий escherichia coli - штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного полипептида нс 280, обладающего способностью связывать антитела к продукту гена белка ns4 вируса гепатита с | |
RU2041949C1 (ru) | Фрагмент днк нс365, полипептид, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида, обладающего способностью связывать антитела к вирусу гепатита c | |
JPH08196282A (ja) | サイトメガロウイルスの読み枠UL57およびテグメント蛋白質pp150のC端領域に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび融合蛋白質、これらを含む診断検査キット、サイトメガロウイルスおよびDNAオリゴヌクレオチドに対する抗体の検出法 | |
RU2085586C1 (ru) | Полипептид 1106, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, фрагмент днк н 1106, кодирующий полипептид 1106, рекомбинантная плазмидная днк рн 1106, кодирующая полипептид 1106, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида 1106 | |
IE911130A1 (en) | Hepatitis c protease inhibitors | |
JPH04179482A (ja) | C型肝炎ウイルス由来の遺伝子 | |
EP0600018B1 (en) | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens to c-100 region | |
RU2071502C1 (ru) | Полипептил р102, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, фрагмент днк нр 102, кодирующий полипептид р102, рекомбинантная плазмидная днк рн а102, кодирующая полипептид р102, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида р102 | |
KR100291102B1 (ko) | 씨형간염바이러스의단백질분해효소유전자및대장균에서의발현 | |
RU2043413C1 (ru) | ПОЛИПЕПТИД E 117, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК HE 117, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД E 117, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHE 117, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД E 117, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА E 117 | |
RU2043414C1 (ru) | ПОЛИПЕПТИД G 103, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА, ФРАГМЕНТ ДНК HG 103, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД G 103, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHG 103, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД G 103, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА G 103 | |
RU2043412C1 (ru) | Полипептид е 206, предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека второго типа, фрагмент днк не 206, кодирующий полипептид е 206, рекомбинантная плазмидная днк рне 206, кодирующая полипептид е 206, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида е 206 |