KR920021711A - 헤르페스 프로테아제의 제조 방법, 이의 조성물, 및 이의 용도 - Google Patents

헤르페스 프로테아제의 제조 방법, 이의 조성물, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

헤르페스 프로테아제의 제조 방법, 이의 조성물, 및 이의 용도
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1a도는 HSV-1 게놈(genome), UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임의 부위 및 이들의 전사부, 및 본 발명에서 사용하기 위해 작제된 시험 플라스미드의 구조의 서열 배열을 도시한 것이다.
제1b도는 UL26개방 판독 프레임의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한 것이다. +1부위는 UL26개방 판독 프레임의 해독 개시 부위와 상응한다.
제2도는 HSV-1게놈성 DNA, UL26 및 UL26.5 개방 판독 프레임(ORF) 사이의 관계, 및 이 유전자 시스템의 해독및 후-해독 산물을 도시한 것이다.
제3도는 모의-감염시킨 베로(Vero)세포 및 12시간 감염시킨 벨 세포로부터 총 세포질성 RNA로 하이브리드화하고 S1 뉴클레아제로 분해한DNA 소식자 1(A) 및 소식자 2(B)의 자동방사선사진 상을 도시한 것이다.

Claims (70)

  1. 헤르페스 프로테아제.
  2. 제1항에 있어서, 세린 프로테아제로 추가 정의되는 헤르페스 프로테아제.
  3. 제1항에 있어서, SDS-PAGE 겔 전기 영동법으로 측정한 바 외관상 분자량이 대략 75kd 내지 85kd인 헤르페스 프로테아제.
  4. 제3항에 있어서, 망상적혈구 용해질 리보솜 시스템으로 제조한 후 필수적으로 단일 밴드로 이동시킨 다음, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및35S-표지화로 추가로 정의된, 상기 밴드가 대략 75 내지 85kd의 외관상 분자량에 상응하는 헤르페스 프로테아제.
  5. 제4항에 있어서, 대략 306 내지 635개 이상의 아미노산 서열, 및 카복실 말단으로부터 약 18 내지 25번째 아미노산에 위치한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것으로 추가로 동정된 헤르페스 프로테아제.
  6. 제1항에 있어서, 각각 I, II, III 및 IV로 표시되며. 프로테아제를 특징화하는 아미노산 서열내에 포함된 아미노산 서열로 정의되는 4개의 도메인을 포함하는 것으로 추가로 정의된 헤르페스 프로테아제.
  7. 제6항에 있어서, 아미노산 서열이 II 및 III으로 표시되는 도메인을 포함하는 헤르페스 프로테아제.
  8. 제7항에 있어서. II 및 III으로 표시되는 도메인이 대략 10번 위치에서 부터 대략 306번 위치까지 확장되는 아미노산 서열(여기서 상기 위치는 원상태의 프로테아제의 아미노산 서열에 따라서 정의된다)을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 헤르페스 프로테아제.
  9. (a)대략 10번 위치에서 부터 대략 306번 위치까지 확장되는 아미노산 서열로 정의되는 도메인 또는 도메인들인, II 또는 III으로 표시되는 헤르페스 프로테아제의 도메인; 및 (b)61 및 148번 위치의 히스티딘 잔기를 포함하는, 헤르페스 프로테아제의 단백분해 도메인을 포함함을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항의 프로테아제에 대해 암호화할 수 있는 핵산 단편.
  11. 제10항에 있어서, ICP 35로 표시되는 헤르페스 총합체-바이러스 1족 캡시드 단백질에 대한 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 것으로서 추가로 동정되는 핵산 단편.
  12. 제11항에 있어서, 도메인을 암호화하는 유전자가 +832 및 +2761로 표시되는 헤르페스 게놈 위치중의 UL26 개방 판독 프레임의 전사 개시 부위로 부터 떨어져 있고, 도메인을 암호화하는 상기 유전자가 또한 +2138위치까지 KpnI부위(+2104)에서 부터 폴리(A)부위까지의 하향스트림 서열을 포함하는 핵산 단편.
  13. 제12항에 있어서, 중복되면서 3' 공말단인 제1 및 제2개방 판독 프레임을 포함하는 것으로, 상기 단편이 각각 제1 및 제2단백질에 대해 암호화하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 제1단백질의 외관상 분자량이 대략 75 내지 85kd이고 제2단백질의 외관상 분자량이 대략 40 내지 55kd이고, 제1단백질이 제1 또는 제2단백질을 절단할 수 있는 단백분해 모듈을 적어도 하나 포함하는 핵산 단편.
  14. 제13항에 있어서, 제2단백질에 대한 암호화 영역의 길이가 대략 990개의 염기쌍인 핵산 단편.
  15. 제14항에 있어서, 제2단백질에 대한 프로모터 서열을 포함하는 것으로서 추가로 정의되는 핵산 단편.
  16. 제10항에 있어서, DNA서열로써 추가로 정의되는 핵산 단편.
  17. 제10항에 있어서, 필수적으로 제1도, 제4열 또는 제5열에 나타낸 바와 같은 지도 영역을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 핵산 단편.
  18. 제10항에 있어서, +1로 표시되는 헤르페스 UL26 전사 개시 부위로 부터 떨어진, 대략 뉴클레오티드 위치 +1000에서 개시하는 전사 mRNA(상기 RNA는 UL26 전자 단위의 +1099 위치에 존재하는 메티오닌 개시 코돈으로 부터 해독된다)로서 추가로 정의되는 핵산 단편.
  19. 제1b도의 DNA 서열의 적어도 대략 14개의 뉴클레오티드 염기 장 단편에 상응하며, 엄격한 조건하에서 헤르페스 세린 프로테아제의 단편으로 하이브리드화될 수 있는 핵산 단편.
  20. 제19항에 있어서, 헤르페스 세린 프로테아제 암호화 서열의 적어도 대략 20개의 뉴클레오티드 염기 장 단편에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 핵산 단편.
  21. 제20항에 있어서, 헤르페스 세린 프로테아제 암호화 서열의 적어도 대략 25개의 뉴클레오티드 염기 장 단편에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 핵산 단편.
  22. 제21항에 있어서, 헤르페스 세린 프로테아제 암호화 서열의 적어도 대략 30개의 뉴클레오티드 염기 장 단편에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 핵산 단편.
  23. 적어도 대략 14개의 뉴클레오티드 염기 단편에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제1b도의 DNA서열의 헤르페스 lCP 35 단백질을 암호화할 수 있는 핵산 단편으로 하이브리드화할 수 있는 핵산 단편.
  24. 제23항에 있어서, 적어도 대략 20개의 뉴클레오티드 염기 장 단편을 포함하는 것을 추가로 정의되는 핵산 단편.
  25. 제24항에 있어서, 적어도 대략 25개의 뉴클레오티드 염기 장 단편을 포함하는 것을 추가로 정의되는 핵산 단편.
  26. 제25항에 있어서, 적어도 대략 30개의 뉴클레오티드 염기 장 단편을 포함하는 것을 추가로 정의되는 핵산 단편.
  27. (a) 티미딘 키나제 유전자와 당단백질 gB 유전자 사이의 UL6 헤르페스 개방 판독 프레임의 HpaI 절단 부위의 하향 스트림에 위치하고; (b)ICP 35 헤르페스 캡시드 단백질 족의 핵산 암호화 서열을 조절할 수 있는 프로모터 시열을 포함하며; (c)ICP 35 헤르페스 캡시드 족 단백질의 핵산 암호화 서열을 포함하고; (d)HSV-1 또는 HSV-2로 중복감염된(super-infected)형질감염 세포중에서 발현된 단백질을 암호화할 수 있는 특성을 갖는 헤르페스 게놈의 핵산 단편.
  28. (a)SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정한 바 대략적인 분자량이 75 내지 85kd이고; (b) 대략450 내지 635개의 잔기로 이루어진 아미노산 도메인; 및 (c)카복실 말단으로부터 약 18 내지 25번 아미노산에 위치하는 프로테아제 절단 부위를 가지며 적어도 하나의 단백분해 모듈을 포함함을 특징으로 하는 정제된 헤르페스 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 헤르페스 바이러스 캡시드를 생산하는데 사용되는 단백질을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 단백질.
  30. 전환 부위에서 프리커서 단백질을 절단하여 헤르페스 캡시드 족 ICP 35 e 및 f로 표시되는 단백질 생성물을 수득할 수 있도록 하는 인자.
  31. 헤르페스 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며 숙주세포중에서 헤르페스 프로테아제를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 핵산 서열이 헤르페스 프로테아제의 II 로 표시되는 도메인을 포함하며, 61및 148번 위치에 히스티딘 잔기를 갖는 재조합 발현 벡터.
  33. 제1A도에 따라서 A-Z 및 AA-NN으로 표시되는 재조합 플라즈미드중에 혼입된 단편과 기능적으로 등가인 핵산 단편.
  34. 제33항에 있어서, 제1A도이 플라즈미드 A-Z 및 AA-NN의 성분 또는 이들의 기능적 등가물로 부터 유도된 비-헤르페스에 사용가능하게 결합된 것으로 추가로 정의되는 핵산 단편.
  35. 제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 단편을 포함하는 재조합 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 발현 벡터로 추가로 등정되는 재조합 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 진핵성 프로모터를 포함하는 것으로 추가로 등정되는 재조합 발현 백터.
  38. 제37항에 있어서, α4, UL26.5 또는 UL26 프로모터를 포함하는 것으로 추가로 정의되는 재조합 발현 벡터.
  39. 제10항 내지 27항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 단편, 도는 제31항 내지 38항 중 어느 한 항에 따르는 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포.
  40. 제39항에 있어서, 진핵세포로 추가로 정의되는 숙주세포.
  41. 제40항에 있어서, 헤르페스 프로테아제 단백질 또는 펩타이드의 적어도 단백분해 도메인을 발현할 수 있으며, 상기 단백질 또는 펩타이드의 카복실 말단 아미노산의 3' 위치에서 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함하고, 상기 프로모터가 암호화된 단백질의 전사 유니트내에 위치하는 것으로 추가로 정의되는 재조합 숙주세포.
  42. (a) 제10항, 18항, 22항 또는 27항에 따르는 프로테아제를 암호화할 수 있는 핵산 단편을 재조하고; (b)상기 단편을 발현시켜 프로테아제를 생상하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는, 헤르페스 프로테아제의 제조방법.
  43. 제42항에 있어서, 단편을 숙주 세포중으로 전이시키고 숙주세포를 단편 발현에 적합한 조건하에서 배양시키는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 재조합 벡터를 숙주 세포내로 형질감염 또는 형질전환시켜 핵산 단편을 전이시키는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 추가로 단백질을 분리 및 정제시키는 방법.
  46. 세포 유리 시스템중에서 제10항, 18항, 22항 또는 27항에 따르는 핵산 단편을 전자 또는 해독함을 특징으로하여, 헤르페스 프로테아제를 합성하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 세포 유리 시스템이 토끼 망상적혈구 용해질을 포함하는 방법.
  48. 제13항의 제1개방 판독 프레임중의 HPaI-PstI절단 부위내에 위치하며, 제13항의 제2단백질의 발현을 개시할 수 있는, 대략 135 내지 168개의 염기쌍 길이의 프로모터.
  49. (a)헤르페스 감염된 세포로부터 핵산을 수득하고; (b)헤르페스 단백질의 단백분해 부위-보유 핵산 서열영역을 핵산내에서 증폭시키며: (c)상기 증폭된 핵산 서열을 포함하는 재조합 클론을 제조하고; (d)목적하는 증폭된 핵산 단편을 포함하는 클론을 선별함을 특징으로 하여, 제10항, 18항, 22항 또는 27항의 핵산 단편을 제조하는 방법.
  50. 절단에 효과적인 조건하에서 제1항의 프로테아제를 사용하여 헤르페스 분자를 처리함을 특징으로 하여, 헤르페스 분자를 절단하는 방법.
  51. (a)제1항의 프로테아제 또는 제28항의 단백질에 대한 항체를 제조하고; (b)상기 항체를 표지시키며; (c)표지된 항체를 조직 샘플과 접촉시키고; (d)표지된 항체-단백질(프로테아제)헤테로 접합체를 감지함을 특징으로하여, 조직 샘플중에서 제1항의 프로테아제 또는 제28항의 단백질을 감지하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 표지된 항체가 형광 표지물을 포함하는 것으로 추가로 정의되는 방법.
  53. (a)실실적으로 제1a도 5열 또는 6열, 제1b도, 또는 제10항, 18항, 22항 또는 27항에 나타낸 바와 같은 핵산 단편으로 하이브리드화시킬 수 있는 뉴클레오티드 소식자를 제조하고, (b)특정 하이브리드 형성에 적합한 선택적 조건하에서 시험할 생물학적 샘플과 함께 상기 소식자를 배양하며; (c)표지물인, 핵산의 존재를 나타내는 하이브리드의 형성을 감지하여 소식자와 생물학적 샘플의 핵산 간에 특정 하이브리드의 형성을 감지함을 특징으로 하여, 생물학적 샘플중 핵산 단편을 감지하는 방법.
  54. (a)제1항의 프로테아제, 또는 제28항의 단백질의 억제제 유효량을 제조하고; (b)상기 억제제와 약리학적으로 허용되는 담체를 혼합하여 약제학적 조성물을 형성시킨 다음; (c)치료량의 상기 조성물을 헤르페스 바이러스로 감염된 세포 또는 기관에 투여함을 특징으로 하여, 헤르페스 바이러스 감염증을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 헤르페스 바이러스가 헤르페스 총합체 바이러스 타입 I 임을 특징으로 하는 방법.
  56. 약제학적으로 허용되는 담체중에 치료학적 유효량의 헤르페스 프로테아제 억제제를 포함함을 특징으로하는 헤르페스 감염증 치료용 약제학적 조성물.
  57. (a)바이러스 프로테아제를 제조하고; (b)상기 프로테아제를 후보 억제 물질과 반응 혼합물로 합하여; (c)프로테아제에 의해 절단될 수 있는 기질을 상기 혼합물주에 혼입시키고; (d)예비 물질이 기질상의 프로테아제의 사용을 변형시키는지의 여부를 측정함을 특징으로 하여, 바이러스 프로테아제의 작용을 변형시킬 수 있는 예비물질을 결정하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 바이러스 프로테아제가 제1항에 따르는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 예비 물질이 키모스타틴, 디이소프로필 플루오로포스페이트 또는 페닐 메탄 술포닐 플루오라이드인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 바이러스 프로테아제를 재조합 유전자 조작법을 이용하여 제조하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, (a)바이러스 프로테아제의 단백분해 도메인에 대해 암호화하고 핵산서열을 적어도 하나 포함하는 발현 벡터를 제조하고; (b)암호화 서열의 발현을 허용하는 조건하에서 적합한 숙주세포에 상기 발현벡터를 위치시키고; (c)세포로 부터 프로테아제를 수거함으로써 바이러스 프로테아제를 제조하는 방법.
  62. 제57항에 있어서, 예비 물질이 기질상의 프로테아제 작용에 대해 억제효과를 발휘하는지 여부를 측정하는 방법.
  63. (a)헤르페스 바이러스를 함유하는 샘플을 수득하고; (b)상기 샘플을 균질화시키며: (c)상기 균질물을 분획화하여 프로테아제 분획을 수득함을 특징으로 하여, 헤르페스 프로테아제를 제조하는 방법.
  64. 헤르페스 프로테아제의 암호화 서열로 하이브리드화 시킬 수 있는 핵산 단편(상기 하이브리드 억제 전사의 mRNA로 부터 프로테아제가 해독된다).
  65. (a)제1항의 프로테아제 또는 제28항의 단백질의 절단 부위를 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열을 제조하고; (b)후보 바이러스 프로테아제를 수득하여;(c)상기 후보 프로테아제를 절단-부위 함유 아미노산 서열과 접촉시키고; (d)절단이 일어났는지의 여부를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 바이러스 프로테아제의 선별 방법.
  66. 제1항의 헤르페스 프르테아제와 억제제.
  67. 제66항에 있어서, 제57항의 방법에 따라 선별된 억제제.
  68. 제1항의 헤르페스 프로테아제에 결합될 수 있는 항체.
  69. 제67항에 있어서, 프로테아제의 단백분해 작용을 적어도 부분적으로 억제 또는 중화시킬 수 있는 것으로 추가로 동정되는 항체.
  70. 제6항에 있어서, 도메인 IV가 ICP 35를 포함하는 헤르페스 프로테아제.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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