KR101340649B1 - 융합 폴리펩타이드 ｈｐｖ 항원을 이용한 ｈｐｖ 항체 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 이용한 ＨＰＶ 항체 스크리닝 방법으로서, N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편 C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 이용하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 방법 및 상기 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 포함하는 비드 어레이용 HPV 항체 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면 HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않으면서도 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있어 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 6, 11, 16 및 18 항체를 복합적으로 검출할 수 있다. 항체 역가를 측정하여 HPV 백신의 접종시기를 결정하는데 활용될 수 있고, 백신 접종 후 방어 기간의 측정 등에 활용 가능하다.
Description
본 발명은 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 이용한 ＨＰＶ 항체 스크리닝 방법으로서, N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(SV 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 이용하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 방법 및 상기 융합 폴리펩타이드 HPV 항원을 포함하는 비드 어레이용 HPV 항체 검출 키트에 관한 것이다.
전세계적으로 매 2분마다 한 명의 여성이 자궁경부암으로 사망한다. 세계적으로 매년 발생하고 있는 자궁경부암은 전세계 여성에게 2번째로 빈번히 발생하는 암이며, 해마다 약 50만 명에게 발병하며 특히 여성에게는 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 주된 암 사망의 원인이다. 자궁경부암의 99% 이상에서 HPV (Human Papillomavirus) 감염이 발견되는데, 이러한 HPV는 100종이 넘으며 그 중 30 - 40 종은 점막조직(mucosal tissue) 감염을 유발하며 저위험성 HPV (low-risk HPV)와 발암성 HPV로 나뉜다. 무엇보다 중요한 것은, 자궁경부암과 직접 관련이 있는 15종 이상의 발암성 HPV이다. 이러한 발암성 HPV 중 16번, 18번이 가장 중요한데 이는 전세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다. 대부분의 HPV 감염은 보통 6개월에서 2년 내에 자연 치유되지만 발암성 HPV에 지속적으로 감염되면 자궁경부암으로 발전할 수 있다.
HPV의 아형의 종류는 인종적, 지형적, 환경적 특징을 갖기 때문에 백신개발에 있어 그 나라 고유의 아형 실정을 바로 알아야 하며, 한국에서 많이 발생하는 아형을 이용한 한국 고유의 백신 개발이 필요하며 나아가 이러한 백신의 개발시 필수적으로 백신의 면역원성(immunity)을 측정할 수 있는 기술 시스템이 확립되어야 한다. 현재까지 개발된 Gardasil (Merck사)와 Cervarix (GSK사)와 같은 HPV 예방백신 접종 후 항체의 유지기간과 효능 나아가 백신의 투여시기를 조사하기 위해서는 혈청 내 이들 HPV 아형에 대해 생성된 항체의 역가를 측정하는 것이 무엇보다 중요하다. 그러나 이러한 백신에 대한 면역원성을 동시에 측정할 수 있는 기법이 아직 확립되지 못했다.
이에, 본 발명자들은 백신의 면역원성을 측정할 수 있는 HPV 항체 스크리닝 기술을 확립하기 위해 노력한 결과, HPV 항원을 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편, C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편과 융합함으로써, HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않으면서도 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있어 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 항체를 스크리닝할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 비드 어레이용 비드에 결합시키는 단계; 상기 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드를 시료와 반응시키는 단계; 상기 시료를 표지자 표지된 2차 항체와 반응시키는 단계; 상기 2차 항체를 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계; 및 비드 유래의 형광값과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 측정하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 단계를 포함하는 시료 내 HPV 항체 검출 방법을 제공하는 것이다. 또한, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 비드 어레이용 HPV 항체 검출 키트를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서 본 발명은 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 11 내지 14로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열일 수 있다. 상기 활성단편의 길이는 제한되지 않으나 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 시미안 바이러스 40 대형 T 항원 활성단편 길이는 11개 아미노산일 수 있다.
HPV 항원을 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편, C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편과 융합함으로써, HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않으면서도, 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있으며, 시미안 바이러스 40 대형 T 항원을 통하여 재조합 HPV 항원이 비드에 잘 부착되었는지, 부착시킨 양이 항상 동일한지, HPV 항원 4종간에 비드에 부착된 정도가 균일한지 등을 판정할 수 있어, 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 항체를 스크리닝할 수 있다.
또한, 상기 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 각 부위를 암호화하는 유전자를PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터에 작동 가능하게 연결하여 클로닝하여발현시킬 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 시미안 바이러스 40 대형 T 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 SalI 및 NotI 제한효소로 절단한 것일 수 있다.
상기 HPV 6 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 HPV 6 게놈으로부터 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 폴리뉴클레오티드를 EcoRI 및 SalI 제한효소로 절단한 것일 수 있다.
상기 HPV 11 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 HPV 11 게놈으로부터 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 폴리뉴클레오티드 EcoRI 및 SalI 제한효소로 절단한 것일 수 있다.
상기 HPV 16 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 HPV 16 게놈으로부터 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 폴리뉴클레오티드 BglII 및 SalI 제한효소로 절단한 것일 수 있다.
상기 HPV 18 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 HPV 18 게놈으로부터 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 폴리뉴클레오티드 EcoRI 및 SalI 제한효소로 절단한 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 시미안 바이러스 40 대형 T 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단된 발현벡터 pGEX 4T-3에 삽입하여 mpGEX 4T-3 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX 4T-3 벡터를 제한효소 EcoRI, SalI으로 절단하여 HPV 6 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 도 2에 개시된 개열지도를 가지는 mpGEX4T-3/HPV 6 L1 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX4T-3/HPV6 L1 벡터를 Escherichia coli BL21 Gen-XTM에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환체로부터 HPV 6 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 통해 HPV 6 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예에서, 상기 시미안 바이러스 40 대형 T 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단된 발현벡터 pGEX 4T-3에 삽입하여 mpGEX 4T-3 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX 4T-3 벡터를 제한효소 EcoRI, SalI으로 절단하여 HPV 11 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 도 3에 개시된 개열지도를 가지는 mpGEX4T-3/HPV 11 L1 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX4T-3/HPV11 L1 벡터를 Escherichia coli BL21 Gen-XTM에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환체로부터 HPV 11 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 통해 HPV 11 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예에서, 상기 시미안 바이러스 40 대형 T 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단된 발현벡터 pGEX 4T-3에 삽입하여 mpGEX 4T-3 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX 4T-3 벡터를 제한효소 BamHI, SalI으로 절단하여 HPV 16 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 도 4에 개시된 개열지도를 가지는 mpGEX4T-3/HPV 16 L1 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX4T-3/HPV16 L1 벡터를 Escherichia coli BL21 Gen-XTM에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환체로부터 HPV 16 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 통해 HPV 16 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예에서, 상기 시미안 바이러스 40 대형 T 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단된 발현벡터 pGEX 4T-3에 삽입하여 mpGEX 4T-3 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX 4T-3 벡터를 제한효소 EcoRI, SalI으로 절단하여 HPV 18 L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 도 5에 개시된 개열지도를 가지는 mpGEX4T-3/HPV 18 L1 벡터를 제조하는 단계, 상기 mpGEX4T-3/HPV18 L1 벡터를 Escherichia coli BL21 Gen-XTM에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환체로부터 HPV 18 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 통해 HPV 18 L1 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
HPV 항원의 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편, C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편과 융합함으로써, 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있으며, 시미안 바이러스 40 대형 T 항원을 통하여 재조합 HPV 항원이 비드에 잘 부착되었는지, 부착시킨 양이 항상 동일한지, HPV 항원 4종간에 비드에 부착된 정도가 균일한지 등을 판정할 수 있는데, HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원성에 영향을 미치지 않기 위해서는 HPV 항원 부위의 선택, 결합 방향, 결합 위치가 모두 고려되어야 한다. 양 말단의 융합 부분의 존재로 인하여 항원성을 나타내는 부위가 분자 내부로 몰입되어 항원성이 감소하는 경우도 발생할 수 있기 때문이다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드가 시료 내 HPV 항체를 높은 민감도 및 정확도로 스크리닝할 수 있다는 것은 전혀 유추할 수 없는 효과이다.
상기 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현 조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
발현벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 다 사용할 수 있다. 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터로서 mpGEX4T-3/HPV6 L1 벡터, mpGEX4T-3/HPV11 L1 벡터, mpGEX4T-3/HPV16 L1 벡터, mpGEX4T-3/HPV18 L1 벡터를 제조하였다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 원핵 세포를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 에쉐리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스와 같은 주지의 원핵 숙주들이 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다. 펩타이드의 발현은 유도인자 IPTG를사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서, 재조합적으로 생산된 펩타이드는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 펩타이드 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리. 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교화크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
또다른 양태로서, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 비드 어레이용 비드에 결합시키는 단계; 상기 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드를 시료와 반응시키는 단계; 상기 시료를 표지자 표지된 2차 항체와 반응시키는 단계; 상기 2차 항체를 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계 및 비드 유래의 형광값과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 측정하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 비드 어레이용 비드는 글루타치온-카세인(Glutathione-casein ;GC) 비드일 수 있고, 상기 표지자는 비오틴이고 상기 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘일 수 있으며, 상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민일 수 있다. 상기 비드 어레이는 다중 비드 어레이일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 루미넥스 분석법을 이용하였다.
본 발명에 따른 방법은 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편; 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드인 재조합 HPV 항원을 비드 어레이용 비드에 결합시키는 단계를 포함한다.
상기 비드 어레이용 비드로 루미넥스 비드 (Luminex bead)를 사용할 수 있다. 상기 비드는 다중 비드 어레이 방법에 사용될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고 비드에 추가적으로 글루타치온-카세인(Glutathione-casein; GC)을 결합시킨 글루타치온-카세인(Glutathione-casein; GC) 비드를 사용할 수도 있다. 글루타치온-카세인 비드는 당업계 공지된 다양한 방법으로 제작할 수 있으며 또는 구입하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예 따르면, N-ethylmaleimide(NEM)로 카세인의 시스테인(cysteine) 잔기를 블로킹(blocking) 시킨 후 heterobifunctional cross-linker인 sulfo-succinimidyl-4-(P-maleimidophenyl)-butyrate(sulfo-SMPB)를 첨가하여 티올(thiol)기와 반응할 수 있는 casein-maleimidophenyl-butyrate을 형성시키고 글루타치온(glutathione)의 cystain의 티올 잔기와 반응하여 글루타치온-카세인(Glutathione-casein ;GC)이 형성되도록 하였다. 글루타치온-카세인(Glutathione-casein ;GC)의 말단 아민(terminal amines)과 비드의 카볼실 그룹(carboxyl groups)을 결합시켜 글루타치온-카세인 비드를 제작하였다.
상기 다중 비드 어레이용 비드는 색으로 100종류까지 구별할 수 있으므로 특정 색(번호)의 비드에 특정 항원을 붙여주고 여러 비드 세트를 섞어서 반응을 진행한 후 다중 비드 어레이 분석기(예를 들어, 루미넥스 분석기)로 각 비드의 색과 그 비드 표면의 항원 항체 반응량을 동시에 측정하면, HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 또는 HPV18 L1 항체를 포함하여 여러 항체를 동시에 측정할 수 있다. 따라서 소량의 시료만으로 분석이 가능할 뿐만 아니라 1회 실험으로 여러 번의 실험을 대신할 수 있으므로 시간과 노동력이 절약된다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드를 시료와 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 시료는 HPV에 의하여 감염될 수 있는 개체들[예, 포유 동물 예컨대, 인간, 가축(예, 소, 말, 돼지, 양 및 염소) 및 애완 동물(예, 고양이 및 개)]등을 포함하는 개체에서 유래한다. 시료는 혈청, 세포 등 HPV 항체를 포함할 수 있는 것이면 모두 포함된다. 융합 폴리펩타이드 항원은 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 및 HPV18 L1 항체와 항원-항체 반응을 한다.
또한 본 발명은 상기 시료를 표지자 표지된 2차 항체와 반응시키는 단계 상기 2차 항체를 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계 및 비드 유래의 형광값과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 측정하여 시료 내 HPV 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 표지자는 비오틴(biotin)일 수 있고, 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘일 수 있다.
상기 2차 항체는 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 및 HPV18 L1 항체와 특이적으로 결합하며 2차 항체에 결합된 비오틴은 스트렙타비딘(또는 아비딘)과 특이적으로 결합하므로 스트렙타비딘에 결합된 형광물질에서 형광을 발현하게 된다. 상기 형광물질은 예를 들어 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 당업계에 공지된 다양한 형광물질을 사용할 수 있다.
비드 유래의 형광값(각 비드의 색)과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 함께 측정하여 항원 항체 반응량을 결정함으로써 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 또는 HPV18 L1 항체의 존부 및 항체의 역가를 정확히 검출할 수 있다. 항체의 역가는 형광값의 판정 기준치(cutoff value) 설정하여 측정한다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 HPV 항원을 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편, C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편과 융합함으로써, HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않으면서도, 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있으며, 시미안 바이러스 40 대형 T 항원을 통하여 재조합 HPV 항원이 비드에 잘 부착되었는지, 부착시킨 양이 항상 동일한지, HPV 항원 4종간에 비드에 부착된 정도가 균일한지 등을 판정할 수 있어, 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV11 L1 항체, HPV16 L1 항체 또는 HPV18 L1 항체를 포함하는 HPV 항체를 스크리닝할 수 있었다.
다른 양태로 본 발명은 N 말단에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, GST)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편 C 말단에 시미안 바이러스 40 대형 T 항원(simian virus 40 large T-antigen)의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편 및 HPV 6 L1 항원, HPV11 L1 항원, HPV16 L1 항원 및HPV18 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 HPV L1 항원의 아미노산 서열 또는 이의 활성단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는 비드 어레이용 HPV 항체 검출 키트를 제공한다.
본 발명을 이용하면 HPV 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 활성에 영향을 미치지 않으면서도 재조합 HPV 항원을 고순도로 분리, 정제하고 비드 어레이용 비드에 효과적으로 균일하게 부착시킬 수 있어 높은 민감도 및 정확도로 시료 내 HPV 6, 11, 16 및 18 항체를 복합적으로 검출할 수 있다. 항체 역가를 측정하여 HPV 백신의 접종시기를 결정하는데 활용될 수 있고, 백신 접종 후 방어 기간의 측정 등에 활용 가능하다.
도 1은 SV40 대형 T 항원 올리고머가 발현벡터 pGEX4T-3 내에 정확히 삽입되어 있음을 확인하기 위해 SV40 대형 T 항원이 삽입된 pGEX4T-3 벡터로 형질전환한 대장균 E. coli DH5α로부터 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 SalI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 SalI으로 절단된 pGEX4T-3을 함께 전기영동한 것을 도시한 것이다.
도 2는 mpGEX4T-3/HPV6 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 3은 mpGEX4T-3/HPV11 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 4는 mpGEX4T-3/HPV16 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 5는 mpGEX4T-3/HPV18 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 6은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV 6L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV11L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV16L1 및 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV18L1으로부터 발현한 HPV 6 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 11 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 16 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 18 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를rabbit anti-GST항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV16L1 으로부터 발현한 HPV 16 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를 mouse anti-HPV16 L1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV18L1으로부터 발현한 HPV 18 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를 mouse anti-HPV18 L1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏한 것을 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 HPV 16 항체와 HPV18 항체를 차례로 희석하여 HPV 16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용한 표준 정량 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 2가 HPV 백신과 Placebo 백신을 접종한 그룹을 대상으로 백신 접종 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리 한 후 본 발명의 HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용하여 실제로 혈액 내 HPV 항체의 양을 측정한 결과이다.
도 2는 mpGEX4T-3/HPV6 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 3은 mpGEX4T-3/HPV11 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 4는 mpGEX4T-3/HPV16 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 5는 mpGEX4T-3/HPV18 L1 벡터를 나타낸 개열지도이다.
도 6은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV 6L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV11L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV16L1 및 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV18L1으로부터 발현한 HPV 6 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 11 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 16 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드, HPV 18 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를rabbit anti-GST항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV16L1 으로부터 발현한 HPV 16 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를 mouse anti-HPV16 L1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV18L1으로부터 발현한 HPV 18 L1 항원 포함 융합 폴리펩타이드를 mouse anti-HPV18 L1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏한 것을 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 HPV 16 항체와 HPV18 항체를 차례로 희석하여 HPV 16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용한 표준 정량 곡선을 나타낸 것이다.
도 11은 2가 HPV 백신과 Placebo 백신을 접종한 그룹을 대상으로 백신 접종 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리 한 후 본 발명의 HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용하여 실제로 혈액 내 HPV 항체의 양을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1: SV40가 태깅된 변형된 발현벡터의 구축
차후 마이크로비드와 융합 폴리펩타이드의 결합을 확인하기 위하여, 항원에 SV40 대형 T 항원의 11개의 아미노산이 태깅되도록 pGEX4t-3 발현벡터를 변형하였다.
먼저 SV40 대형 T 항원의 11개의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 1 센스 DNA 올리고머 (SV40S)와 그 염기에 상보적인 서열번호 2 안티센스 DNA 올리고머 (SV40AS)를 각각 제작하였다. 서열번호 1 올리고머는 제한효소 SalI 절단부위를, 서열번호 2 올리고머는 제한효소 NotI 절단부위를 각각 포함하도록 합성하였다. 합성된 각각의 올리고머를 어닐링 완충용액 하에서 90℃에서 4분간 반응시킨 후 70℃ 10분, 10℃에서 2시간 반응시켰다. 어닐링된 SV40 대형 T 항원 올리고머를 제한효소 SalI 및 NotI으로 절단된 발현벡터 pGEX4T-3에 삽입하여 T4 DNA 연결효소를 사용하여 실온에서 3시간 동안 연결반응을 시켜 연결시킨 후, 대장균 E. coli DH5α에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
서열번호 1 센스 DNA 올리고머 (SV40S) :
5'-TC GAC AAA CCT CCC ACA CCT CCC CCT GAA CCT GAA ACA GC-3'
서열번호 2 안티센스 DNA 올리고머 (SV40AS) :
5'-GGCCGC TGT TTC AGG TTC AGG GGG AGG TGT GGG AGG TTT G-3'
형질전환체들로부터 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 SalI으로 절단한 후, 1% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 SalI으로 절단된 pGEX4T-3을 함께 전기영동하여 SV40 대형 T 항원 올리고머가 발현벡터 내에 정확히 삽입되어 있음을 재확인하였다(도 1). 상기와 같이 구축된 SV40 대형 T 항원을 암호화하는 DNA 서열로 변형된 pGEX4T-3를 mpGEX4T-3으로 명명하였다.
실시예 2: HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1 및 HPV 18 L1 유전자의 발현을 위한 발현벡터의 구축
독일로부터 분양 받은 recombinant plasmid harboring full genome of HPV 6, HPV 11, HPV 16 및 HPV 18 로부터 얻은 L1 유전자를 발현벡터에 삽입한 재조합 플라스미드 (mpGEX4T-3/HPV 6 L1, mpGEX4T-3/HPV11 L1, mpGEX4T-3/HPV16 L1 및mpGEX4T-3/HPV18 L1)를 하기와 같이 구축하였다.
먼저 HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1 및 HPV 18 L1 유전자를 얻기 위해 HPV 6 L1 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 3 프라이머 (HPV6L1F) (5' 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기에 상보적인 서열번호 4 프라이머 (HPV6L1R) (3' 말단 프라이머) HPV 11 L1 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 5 프라이머 (HPV11L1F) (5' 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기에 상보적인 서열번호 6 프라이머 (HPV11L1R) (3' 말단 프라이머) HPV 16 L1 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 7 프라이머 (HPV16L1F) (5' 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기에 상보적인 서열번호 8 프라이머 (HPV16L1R) (3' 말단 프라이머) HPV 18 L1 유전자의 염기서열로부터 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 9 프라이머 (HPV18L1F) (5' 말단 프라이머)와 C-말단 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기에 상보적인 서열번호 10 프라이머 (HPV18L1R) (3' 말단 프라이머)를 각각 제작하였다.
제작한 프라이머를 이용하여 각각의 HPV L1 유전자를 증폭시켰다. 서열번호 3, 5, 7, 9 프라이머는 제한효소 EcoRI 또는 BglII 절단부위를, 서열번호 4, 6, 8, 10 프라이머는 제한효소 SalI 절단부위를 각각 포함하도록 합성하였다.
각각의 PCR은 0.2 ㎍ HPV 플라스미드 DNA와 10 pmole의 5'-말단 프라이머 및 3'-말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 10X Accuprime DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Accuprime DNA 중합효소 (invitrogen)로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 3분간 반응시킨 후 95℃ 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 90초의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 68℃에서 5분간 반응시켰다.
서열번호 3 프라이머 (HPV6L1F) :
5'-NNNNN GAATTC AATGTGGCGGCCTAGCGACAG-3'(EcoRI 절단부위 포함)
서열번호 4 프라이머 (HPV6L1R) :
5'-GCATGA GTCGAC CCTTTTAGTTTTGGCGCGC-3'(SalI 절단부위 포함)
서열번호 5 프라이머 (HPV11L1F) :
5'-GCAGTC GAATTC GTGGCGGCCTAGCGACAGCACA-3' (EcoRI 절단부위 포함)
서열번호 6 프라이머 (HPV11L1R) :
5'-NNNNN GTCGAC CTTTTTGGTTTTGGTACGTTTTCGTTT-3' (SalI 절단부위 포함)
서열번호 7 프라이머 (HPV16L1F) :
5'-NNNNN AGATCT ATGCAGGTGACTTTTATTTACATCCTA-3' (BglII 절단부위 포함)
서열번호 8 프라이머 (HPV16L1R) :
5'-GCATGA GTCGAC CAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3' (SalI 절단부위 포함)
서열번호 9 프라이머 (HPV18L1F) :
5'-NNNNN GAATTC AATGTGCCTGTATACACGGGTCCTG-3' (EcoRI 절단부위 포함)
서열번호 10 프라이머 (HPV18L1R) :
5'-GCATGA GTCGAC CTTCCTGGCACGTACACGGAC-3' (SalI 절단부위 포함)
DNA 사이즈 마커 (size marker)와 함께 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 1.5 kb 위치에 각각의 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. PCR이 끝난 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여, PCR을 통해 증폭된 약 1.5 kb의 DNA 산물을 PCR quick-spinTM PCR Product Purification Kit (Intron, Korea)을 사용하여 정제하여 회수하였다. 회수된 HPV 6, HPV 11, HPV 18 DNA를 제한효소 EcoRI 및 SalI으로, HPV 16 DNA를 제한효소 BglII 및 SalI으로 각각 절단한 다음, 유전자 절편을 각각 정제하고 회수하였다. 정제된 유전자 절편을 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 mpGEX4T-3에 각각 삽입하여 T4 DNA 연결효소를 사용하여 실온에서 3시간 동안 연결반응을 시켜 연결시킨 후, E. coli BL21 Gen-XTM 에 형질전환시켰다. (mpGEX4T-3/HPV16 L1을 제작하기 위하여 제한효소 BglII 와 BamHI은 annealing 서열이 동일함으로 mpGEX4T-3을 BamHI으로, HPV 16 L1을 BglII 로 절단하여 연결하였다.) 형질전환체들로부터 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 상기의 제한효소로 절단한 후, 1% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 각각의 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되어 있음을 재확인하였다. 상기와 같이 구축된 HPV 6 L1 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 mpGEX4T-3/HPV6L1으로 (도 2), HPV 11 L1 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 mpGEX4T-3/HPV11L1으로 (도 3), HPV 16 L1 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 mpGEX4T-3/HPV16L1으로(도 4) HPV 18 L1 유전자의 발현을 위해 구축된 발현벡터를 mpGEX4T-3/HPV18L1으로 명명하였다 (도 5).
실시예 3: HPV 6 L1, HPV 11 L1, HPV 16 L1, HPV 18 L1 포함 융합 폴리펩타이드의 발현과 정제
대장균에 형질전환 시킨 재조합 균주 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV 6L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV11L1, E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV16L1 및 E. coli BL21 Gen-XTM / mpGEX4T-3/HPV18L1으로부터 N 말단에 GST가, C말단에 SV40이 융합된 HPV 6 L1항원, HPV11 L1항원, HPV16 L1항원과 HPV18 L1항원으로 각각 발현시킨 후, rabbit anti-GST 항체, mouse anti-HPV6 L1 항체, mouse anti-HPV11 L1 항체, mouse anti-HPV16 L1 항체 또는 mouse anti-HPV18 L1 항체, KT3항체 각각을 첫번째 항체로 사용한 웨스턴 블랏을 시행하여 발현 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 6 내지 8을 통하여 확인하였다. 그 다음 발현된 단백질을 아래와 같이 정제하였다.
재조합 플라스미드를 가지고 있는 E. coli BL21 Gen-XTM 을 100 ㎍/㎕ 암피실린이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 다음 500ul를 100 ㎍/㎕ 암피실린이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 100㎖에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.4정도가 되었을 때, IPTG (isopropyl β-D-galactopyranoside)를 최종농도가 1.0 mM이 되도록 첨가하고 3시간 배양하여 단백발현을 유도하였다. 6,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 균체 (1.4 g/ wet weight)를 회수한 다음 CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Santa Cruz Biotechnology)이 포함된 5 ml의 초음파처리 완충액 (sonication buffer) (50 mM Tris-HCl [pH8.0], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA)에 현탁 한 다음 최종농도 0.1㎎/㎖ lysozyme을 첨가하고 4℃에서 1시간 lysis 시킨다. 초음파로 파쇄한 후1% triton x-100을 첨가하고 4℃에서 1시간 반응시킨 다음 14,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 다음으로 상기 상층액을 Glutathione SepharoseTM 4B (GE Healthcare)를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 최종적으로 정제하였다.
실시예 4: 정제된 융합 폴리펩타이드를 카세인(casein)이 커플링(coupling) 된 비드(bead)에 결합
4-1.Glutathione-casein (GC) 제조
N-ethylmaleimide(NEM)로 카세인의 시스테인(cysteine) 잔기를 블로킹(blocking) 시킨 후 heterobifunctional cross-linker인sulfo-succinimidyl-4-(P-maleimidophenyl)-butyrate(sulfo-SMPB)를 첨가하여 티올(thiol)기와 반응할 수 있는 casein-maleimidophenyl-butyrate을 형성시켰다. PD10 column을 이용하여 잔여 NEM과 sulfo-SMPB를 제거한 후, 글루타치온(glutathione)의 cystain의 티올 잔기와 반응하여 glutathione-casein이 형성되도록 하였다. 다시 PD10 column을 이용하여 잔여 glutathione을 제거하였다.
4-2. 루미넥스 비드(Luminex bead)와 GC와의 결합
GC의 말단 아민(terminal amines)과 비드의 카볼실 그룹(carboxyl groups)이 결합된 Glutathione-casein (GC) beads를 생산하기 위해서, 1.25ㅧ106 개의 비드를 200 ㎕의 활성화(activation) 완충용액 [0.1 mol/L sodium phosphate, pH 6.2]로 2번 씻은 후, 50 mg/mL의 N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) 와 N-hydroxysuccinimide(NHS)를 각각 25㎕씩 첨가하여 차광된 실온에서 20분간 비드를 활성 시켰다. 활성화된 비드는 1 ㎖의 커플링 완충용액 [2-morpholinoethanesulfonic acid, 50 mmol/L, pH 5.0]로 2 번 씻은 후, 상층을 제거한 후 250㎖의 250 ㎎/L, GC 용액으로 현탁시켜 차광한 후 실온에서 2 시간 동안 커플링하였다. 그 후 1㎖의 세척 완충용액[phosphate-buffered saline (PBS), 50 mmol/L Tris, 0.5 mL/L Tween 20, pH 7.4]으로 2번 씻은 후, 보관용액 [PBS, pH 7.4, containing 1 g/L casein and 0.5 g/L sodium azide]에 담아 4℃에서 차광하여 보관하였다.
4-3. 융합 폴리펩타이드와 GC 비드와의 결합
생산된 융합 폴리펩타이드는 1g/L로 카세인 완충용액 [1g/L casein in PBS, pH 7.4]로 희석한 후, 3000개의 GC 비드와 실온에서 차광하여 반응시켰다. 1시간 후 카세인 완충용액으로 3번 씻어서 보관하였다.
실시예 5 : 멀티플렉스 루미넥스 분석
HPV 16 항체(Abnova, MAB1616)와 HPV18 항체 (Ab31492)를 각각 4,000 - 500 배까지 차례로 희석하여 HPV 16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용한 표준 정량 곡선을 우선 확인하였다(도 9 및 도 10).
그 후, 2가 HPV 백신(서바릭스, GSK) 과 Placebo 백신을 접종한 그룹을 대상으로백신 접종 후 3개월 후에 혈액을 채취하여혈청을 분리 한 후 개발된 HPV16 L1 항원 및 HPV18 L1 항원을 이용하여 실제로 혈액 내 HPV 항체의 양을 측정하였다. 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드 혼합액을 희석된 혈청과 96 웰 플레이트에서 2시간 동안 차광하여 실온에서 반응시켰다. 100 ㎕ 카세인 완충용액으로 3번 씻어주고 비오틴(biotin)이 결합된 2차 항체[goat anti-human IgA, IgM, IgG (H+L)]를 1:1,000으로 희석하여 30분간 반응시킨다. 마지막으로 발색 시약인 스트렙타비딘-알-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin)을 첨가하여 30분간 반응시키고, Luminex analyzer로 median fluorescence intensity (MFI)를 측정하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다. 총 12명 (2가 HPV 백신접종자 7명, Placebo 백신 접종자 5명)을 대상으로실시하였으며, 접종자 모두 HPV 16 타입에 대한 항체가 형성되었으나 HPV 18에 대한 항체는 7명중 5명에서만 검출된 것을 확인할 수 있었다.
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- 서열번호 11로 표시되는 HPV 6 L1 항원의 융합 폴리펩타이드, 서열번호 12로 표시되는 HPV 11 L1 항원의 융합 폴리펩타이드, 서열번호 13으로 표시되는 HPV 16 L1 항원의 융합 폴리펩타이드 및 서열번호 14로 표시되는 HPV 18 L1 항원의 융합 폴리펩타이드를 각각 비드 어레이용 비드에 결합시키는 단계;
상기 융합 폴리펩타이드가 결합된 비드를 시료와 반응시키는 단계;
상기 시료를 표지자 표지된 2차 항체와 반응시키는 단계;
상기 2차 항체를 형광물질이 부착된 상기 표지자의 특이적 결합제와 반응시키는 단계; 및
비드 유래의 형광값과 표지자의 특이적 결합제 유래의 형광값을 측정하여 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV 11 L1 항체, HPV 16 L1 항체 및 HPV 18 L1 항체를 검출하는 단계를 포함하는,
멀티플렉스 루미넥스 분석법을 이용하여 시료 내 HPV 6 L1 항체, HPV 11 L1 항체, HPV 16 L1 항체 및 HPV 18 L1 항체를 동시에 검출하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 비드 어레이용 비드는 글루타치온-카세인(Glutathione-casein ;GC) 비드인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 표지자는 비오틴이고 상기 표지자의 특이적 결합제는 스트렙타비딘인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 또는 플루오레스카민인 것을 특징으로 하는 방법.
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